IBF 035 – Bioensaios

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA

Bioprospecção de Microrganismo

Profª. Drª. Spartaco Astolfi Filho

Aluno: Diego Pereira Guimarães Matrícula: 21601637

24 / 05 / 2018
BIOPROSPECÇÃO

Diego Pereira Guimarães

Relatório solicitado como requisito para

obtenção de nota parcial na disciplina
Bioensaios do curso de Biotecnologia da
Universidade Federal do Amazonas
(UFAM).

MANAUS - AM
26 / 05 / 2018

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 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 3

1.1 BIOPROSPECÇÃO 3
1.2 ANTAGONISMO MICROBIANO 3
1.3 TESTE DE ANTIBIOGRAMA 4

2. OBJETIVOS 4

2.1 OBJETIVOS GERAIS 4

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 4

3. METODOLOGIA 5

3.1 INOCULAÇÃO MICROBIANA EM MEIO DE CULTIVO 5

3.1.1 Preparação do Meio LB 5

3.1.2 Preparo das Amostras de Diluição e Inoculação de Microorganismos 5

3.2 ISOLAMENTO DE CULTURAS PURAS 6

3.3 TESTE DE ANTAGONISMO 6

3.4 TESTE DE ANTIBIOGRAMA 7

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 7

5. CONCLUSÃO 13

REFERÊNCIAS 14

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1. INTRODUÇÃO

1.1 BIOPROSPECÇÃO
O termo bioprospecção refere-se a identificação, estudo e exploração da biodiversidade de
determinados ambientes, para posteriores aplicações tecnológicas na indústria ou em pesquisas.
Existindo vários métodos de bioprospecção de microrganismos, de tradicionais que se baseiam na
coleta, identificação e cultura em vitro, porém esse método tem uma desvantagem pois menos de
1% dos microrganismos podem ser cultivados em laboratório, por isso se faz necessário utilizar
outras métodos mais modernos de bioprospecção, como a prospecção em silício que se baseia na
descoberta de novos genes e vias metabólicas, através da análise de sequências disponíveis em
bancos de dados genéticos, sendo fundamental o uso de desenvolvimento da bioinformática.. Em
uma bioprospecção em silico, obtém-se o pool genético de microrganismos de um determinado
lugar (lagoa, solo, planta), e em laboratório se faz a extração de DNA, sequenciamento e por fim a
análise comparativa de genes existentes nos bancos de dados genéticos.
O conhecimento da biodiversidade bem como a bioprospecção de microrganismos, que é
utilizado pela biotecnologia apresentando novas soluções para as de indústria, saúde e alimentos,
atende a necessidade de se obter um desenvolvimento sustentável, não esgotando os recursos
naturais, incentivando na conservação do meio ambiente enquanto que se desenvolve as habilidades
tecnológicas, oferecendo oportunidades e crescimento econômico a longo prazo (LUZ et al, 2016).

1.2 ANTAGONISMO MICROBIANO

O antagonismo é a inibição de crescimento de uma espécie de microrganismo por outra, isso
ocorre pois há a produção de substâncias químicas ou enzimas que são tóxicas para outros
microrganismos, sendo nomeadas de antibióticos (TORTORA et al, 2016 ).
No teste de antagonismo, plaqueia-se o microrganismo alvo de estudo juntamente com
outros microrganismos testes para a verificação de existência de atividade antagônica. Esse é o
primeiro passo para a descoberta de potenciais microrganismos de interesse para a biotecnologia,
como produção de antibióticos para a indústria farmacêutica ou marcadores de seleção em
clonagem de microrganismos.

3
1.3 TESTE DE ANTIBIOGRAMA
O desenvolvimento de antibióticos tem sido um grande avanço da medicina, porém com o
aumento da resistência a antibióticos pelos microrganismos, vem aumentado a preocupação com o
surgimento das chamadas superbactérias, que são microrganismos que resistem a todas as classes de
antibióticos conhecidas (TORTORA et al, 2016 ).
Essa resistência dos microrganismos ocorre pelo de fato de algumas células, ou apenas uma
colônia dentre uma colônia de bilhões, pode ter uma mutação genética que produz alguma
substância que age degradando o antibiótico, ou é capaz de mudar algumas vias metabólicas que são
alvos. Essa mutação genética pode ser espalhada horizontalmente através do processo de
conjugação ou transdução, assim uma única célula pode em poucas horas gerar milhões de
progênies com a mesma mutação, ou ainda transferir o seu DNA plasmidial para outras células
(TORTORA et al, 2016 ).
O teste de antibiograma tem a finalidade de analisar microrganismos suscetíveis a
resistência a antibióticos. Sendo usado por profissionais de saúde, para o acompanhamento de
surgimento de linhagens persistentes. Também é muito utilizado na biotecnologia, para a
identificação de microrganismos com potenciais biotecnológicos.

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVOS GERAIS

● Realizar bioprospecção de microrganismos com potencial biotecnológico.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

● Obter amostra de solo aos redores da UFAM;
● Isolar microrganismos;
● Realização de análise e teste microbianos.

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3. METODOLOGIA

3.1 INOCULAÇÃO MICROBIANA EM MEIO DE CULTIVO

3.1.1 Preparação do Meio LB
O meio LB (Luria-Bertani) foi preparado na diluição de 1/4, dissolvido em 500mL, 2,5 g de
peptona, 1,25 gramas de extrato de levedura, 2,5 g de NaCl. Ajustado o pH para 7,0 com NaOH
0,5M ou HCl 0,5 M. Adicionado 15 g de Àgar (para meio sólido). Em seguida autoclavado por 15
minutos a 121 ºC em 1,5 atm de pressão. Distribuído o meio na temperatura próximo de 50ºC nas
placas de petri.

3.1.2 Preparo das Amostras de Diluição e Inoculação de Microorganismos

Foi coletado amostra de solo localizado em frente do bloco ICB-02 da Universidade Federal
do Amazonas. Em laboratório foi pesado 01 grama de solo e adicionado em um tubo de ensaio
esterilizado, adicionado 09 mL de água destilada e homogeneizada com ajuda de um vortex. Foi
−1
retirado 01 mL desse tubo que contém uma diluição de 10 e adicionado em outro tubo de ensaio
−2
com 9mL de água destilado, formando a diluição 10 , esse processo foi realizado em mais 03
−1 −5
tubos, totalizando 05 tubos, em uma diluição seriada de 10 à 10 .
Foi feito a inoculação dos microrganismo em 5 placas de petri com o meio de cultura, o
−1 −5
inóculo de cada placa foi feito a partir de uma diluição, de 10 à 10 . Às placas foram incubados
na posição invertida, para que não a água condensada não se acumulasse sobre a amostra impedindo
o crescimento dos microrganismos, à temperatura de 24 pelo período mínimo de 24 horas.
Após o período de incubação foi realizado a análise morfológica, feita a contagem de
colônias e calculada a UFC (Unidade Formadora de Colônias).

3.2 ISOLAMENTO DE CULTURAS PURAS

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 Para o isolamento de culturas foi utilizado a técnica de semeadura por esgotamento por
estrias. Foram escolhidos quatro colônias que tem características antagonistas e duas colônias
coloridas para serem isoladas. O processo foi realizado em cabine de fluxo laminar e esterilizado
por método de esterilização UV por 15 minutos. Com uma alça de platina flambada com a ajuda do
Bico de Busen, obteve a colônia escolhida, e realizou-se o plaqueamento por estrias na placa de
petri contendo o meio de cultura LB. Ao todo foram 03 placas de petri com dois isolados por placa.

Imagem 01 - Técnica de semeadura

por esgotamento por estrias.

3.3 TESTE DE ANTAGONISMO

Foi realizado o teste de antagonismo com 04 isolados do solo: Colônias S1, S2, 2.1 e 2.2,
usando 06 microrganismos testadores: E. coli, Candida albicans, Mycobacterium smegmatis,
Staphilococcus aureus e os isolados S1 e S2.
Em 04 placas de petri com meio de cultura LB fora inoculados os microrganismos com
palito de madeira esterilizado, semeado em forma de linha no centro da placa. Os microrganismos
testadores foram semeados também com palitos de madeira, em linha na direção transversal, da
borda da placa até a próximo a linha do microrganismo isolado.

6
 Imagem 02 - Teste de antagonismo.

3.4 TESTE DE ANTIBIOGRAMA

Foi realizado o teste de antibiograma, usando os antibióticos, Ampicilina ( 100µ𝑔/𝑚𝐿),
tetraciclina ( 20µ𝑔/𝑚𝐿), Cloranfenicol ( 34µ𝑔/𝑚𝐿), Canamicina ( 50µ𝑔/𝑚𝐿), Estreptomicina ( 20
µ𝑔/𝑚𝐿). Cada antibiótico utilizado foi adicionado no meio de cultura em cada uma placa de petri.
e em cada placa foram inoculados 04 colônias puras, S1, S2, 2.1 e 2.2, oriundas das placas
inoculadas com técnica de semeadura por esgotamento por estrias.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após o tempo de incubação das placas de petri inoculadas com microrganismos isolados do
solo, foram observados crescimento de colônias bacterianas em todas as placas (Imagem 03). Foram
selecionados 10 colônias de interesse que apresentaram atividades antagônicas e colorações
diferenciadas. Sendo Identificadas e feita a análise macromorfológica delas, com os resultados
conforme mostrados na tabela 01.

7
 −1 −5
Imagem 03 - Fotos das placas inoculadas com diluições seriadas de10 a 10 .
obs: Primeira foto é da placa inoculada sem diluição.

Colônia Cor Tamanho do Atividade Antagônica Características

Halo

S.1 creme grande presente -

S.2 creme - presente -

2.1 branca grande presente colônia pequena

2.2 creme - presente -

2.3 bege pequeno presente -

2.4 bege - presente colônia dispersa em grande

área

2.5 bege - presente colônia pequena

2.6 bege - presente colônia dispersa em grande

área

3.1 laranja - ausente -

3.2 amarela - ausente -

Tabela 01 - Análise Morfológica.

Para a Contagem de Unidades Formadoras de Colônias, foi selecionado a placa com

−4
diluição 10 , que continha 10 colônias. Feito o cálculo:

UFC = quantidade de colônias x fator de diluição.

8
 12 x 10000 = 120.000

Por ter sido diluído 01 grama de solo em 9 mL de água destilada, deve-se multiplicar por 10:

6
12.000 x 10 = 1,2 x10 UFC

Portanto há 1.200.000 de Unidades Formadoras de Colônias em 01 grama da amostra de

solo.

Imagem 04 - Fotos da placa

inoculadas

Após o tempo de incubação das placas de petri com os isolados de cultura pura de
microrganismos, através da técnica de semeadura por esgotamento por estrias, observou-se,
conforme Imagem 04, que algumas placas não apresentavam colônias isoladas como o esperado
(Colônia S.2, 2.1 e 2.2), isso se deve a forma na qual foi realizada a semeadura por estriamento,
pois por falta de habilidade, a ser realizado o estriamento foi o meio de cultura foi levemente
furado.

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 Imagem 05 - Fotos das placas, após o tempo de incubação, inoculadas através da técnica
de semeadura por esgotamento por estrias.
Os resultados do teste de antagonismo, demonstram que a colônia S.2 apresenta atividade
antagônica para os microrganismos testadores E. coli, Mycobacterium smegmatis e Candida
albicans. Revelando ter um grande potencial biotecnológico como produtor de antibiótico.

Imagem 06 - Fotos das placas, após o tempo de incubação, inoculadas no teste

de antagonismo.

Imagem 07 - Fotos das placas, após o tempo de incubação,

inoculadas no teste de antagonismo (reteste com ¼ de LB).

Os resultados do teste antibiograma, mostram que a colônia 2.2 é resistente ao antibiótico

Streptomicina 20 µ𝑔/𝑚𝐿, revelando ter um grande potencial biotecnológico para ser usado como
um vetor de clonagem, pois poderá ser usado em meio de cultura de seleção com antibiótico
Streptomicina.

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Imagem 08 - Fotos das placas de petri, após o tempo de incubação, inoculadas com microrganismos
no teste de biograma.

Outros resultados interessantes foi visto na colônia 4 de outro grupo (Imagem 08), que no
teste de biograma, além de terem resistido a todos os antibióticos testados, houve alteração no seu
fenótipo com mudança de coloração nas colônias, que tiverem cores diferentes conforme o
antibiótico presente no meio de cultura. Essa mudança pode ter ocorrido devido ao antibiótico ter
interferido em alguma via metabólica do microrganismos, inativando ou mudando essa via. Outra
hipótese seria a produção de enzimas que quebram as moléculas do antibiótico, formando moléculas
cromóforas.
Deve-se realizar estudos posteriores para analisar esse processo de mudança fenótipo desse
microrganismo em relação ao meio.

Imagem 09 - Fotos das placas de petri, após o tempo de incubação, inoculadas com
microrganismos da colônia 4, no teste de biograma.

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 O teste de antibiograma completo mostrado na tabela 02, revela que a maioria das colônias
de bactérias são resistentes ao antibiótico ampicilina. Também mostra que 03 microrganismos
isolados (colônia 4, colônia 4.9 e colônia 14.1), são resistentes a todos os cinco antibióticos.
Considerados superbactérias, um atual problema para a área de saúde, essas colônias isoladas são
úteis para pesquisas genéticas e vias metabólicas de resistência a antibióticos, como ferramenta para
a descoberta de novos antibióticos mais potentes.

ANTIBIOGRAMA

Colônia Ampicilina Tetraciclina Cloranfenicol Canamicina Estreptomicina

3.1 - - + + +

3.2 - - + - +

S.1 + - - - -

S.2 + - - + -

4 + + + + +

4.9 + + + + +

4.4 - - + + +

4.5 - - - - +

2.1 + - + - -

2.2 + - - - -

2.3 + - - - -

2.4 + - - - -

14 + + - - +

14.1 + + + + +
Tabela 02 - Teste de Antibiograma completo de todos os microrganismos isolados na prática do
curso de Bioensaios.

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5. CONCLUSÃO

Para a bioprospecção de microrganismos, tem-se em mãos várias técnicas relativamente

simples e baratas para a realização de isolamento e estudos preliminares, fornecendo vários
resultados que demonstram potenciais usos biotecnológicos desses microrganismos isolados. Sendo
nesse trabalho, obtido várias cepas de bactérias com alto potencial para uso em engenharia genética,
como vetores com marcadores de seleção, bem como outras cepas que são resistentes a maioria dos
antibióticos, podendo ser usados para estudos e descobertas de novos antibióticos.

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REFERÊNCIAS
CANHOS, Vanderlei Perez et al. Diretrizes e estratégias para a melhoria das coleções microbiológicas
brasileiras, tendo como meta a implantação e consolidação da Rede Brasileira de Centros de Recursos
Biológicos no horizonte de 10 anos. 2006.

LUZ, Bárbara Dutra da Silva et al. Bioprospecção de microrganismos produtores de enzimas de interesse
industrial realizada no Parque Estadual Serra do Ouro Branco, Brasil. 2016.

TORTORA, Gerard J.; CASE, Christine L.; FUNKE, Berdell R. Microbiologia-12ª Edição. Artmed Editora,
2016.

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