UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos

Departamento de Medicina Veterinária

Relatório de Aulas Práticas de Microbiologia Fundamental (ZMV0368)

Caio Vinicius Pratta (10431240)

Diego Prezoto (9523987)

Fabio Okagawa (10290254)

Gabriel Alegria Braz (10403655)

Sabrina Oliveira Batista (10290390)

Prof. Dra. Andrezza Fernandes

Disciplina ZMV - 0368 Microbiologia Fundamental – Diurno

Pirassununga - SP

Junho de 2018
 Sumário

1.Introdução Geral
2.Capítulo I – Bactérias
2.1.Introdução
2.2.Objetivos
2.3.Materiais e métodos
2.4.Resultados e discussão
2.5.Conclusão
3.Capítulo II – Fungos
3.1.Introdução
3.2.Objetivos
3.3.Materiais e métodos
3.4.Resultados e discussão
3.5.Conclusão
4.Capítulo III - Cadeia de transmissão de microrganismos
4.1.Introdução
4.2.Objetivos
4.3.Materiais e métodos
4.4.Resultados e discussão
4.5.Conclusão
5.Capítulo IV - Testes bioquímicos para identificação de bactérias
5.1.Introdução
5.2.Objetivos
5.3.Materiais e métodos
5.4.Resultados e discussão
5.5.Conclusão
6.Referências bibliográficas
 1. Introdução Geral

O presente relatório discorrerá sobre experiências realizadas por alunos do

curso de Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo, para estudo da
matéria de microbiologia. Dividido em 4 capítulos, sendo eles Bactérias, Fungos,
Cadeia de transmissão de microrganismos e Testes bioquímicos para identificação.

Os microrganismos, grupo que inclui bactérias, fungos, protozoários e algas

microscópicas, são seres vivos tão minúsculos que são impossíveis de enxergar a
olho nu. A maioria deles contribui de forma positiva para o bem-estar da vida na
Terra, constituindo a base da cadeia alimentar nos meios aquáticos, auxiliando na
degradação de detritos no solo, na incorporação de nitrogênio da atmosfera em
compostos orgânicos, participando da digestão de alimentos, entre outras formas.
Entretanto, uma parcela também contribui de forma negativa, causando doenças,
infecções e intoxicações desagradáveis (TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C.
L; 2005, p. 01).

Contribuindo de forma positiva ou negativa, os microrganismos estão muito

presentes na área alimentícia. Casos de doenças causadas por patógenos
veiculados por alimentos ocorrem em todos os países diariamente, sendo que a
maior responsável é a incorreta ou ausente higienização de equipamentos e
utensílios (CHEN et al, 2001).

No Brasil, há órgãos que fazem o controle sanitário dos alimentos, como o

Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal
(RIISPOA) e Ministério da Agricultura. No entanto, não é feita uma fiscalização
efetiva da produção, conservação e comercialização dos alimentos pelos serviços de
vigilância sanitária. Dessa forma, as camadas menos favorecidas da população são
as mais afetadas, principalmente pelo consumo maior de produtos de qualidade
inferior, com maior risco de contaminação (BALBANI, A. P. S.; BUTUGAN, O.; 2001).

Ao estudar o crescimento microbiano, que se refere ao número e não ao

tamanho das células, é possível saber como controlar o crescimento de
microrganismos patogênicos ou daqueles que contaminam e degradam alimentos,
assim como estimular o crescimento daqueles nos quais se tem o interesse em
estudar (TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L; 2005, p. 155).
 O crescimento de microrganismos depende de fatores físicos, como
temperatura, pH e pressão osmótica e fatores químicos, como fontes de carbono e
nitrogênio, enxofre, fósforo, oxigênio e alguns fatores orgânicos de crescimento.
Sendo assim, o meio de cultura é essencial para determinar o crescimento dos
microrganismos (TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L; 2005, p. 156 e 163).

Para que haja crescimento de uma cultura de um certo microrganismo, deve-se

levar em conta alguns critérios, como conter os nutrientes corretos, quantidade de
água necessária, pH ajustado e quantidade de oxigênio regulada, ou até ausência
de oxigênio. Além disso, o meio deverá ser estéril - não deverá conter
microrganismos vivos – e a temperatura deverá ser adequada para o crescimento
(TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L; 2005, p. 163).

Dessa forma, há uma grande variedade de meios de cultura para crescimento de

diferentes microrganismos. Um composto muito utilizado como sólido para cultivo de
cultura é o Ágar, sendo um polissacarídeo complexo obtido a partir de algas
marinhas (TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L; 2005, p. 164).

Existem meios de cultura para bactérias, fungos, protozoários e algas, sendo

diferenciados em quimicamente definidos e os complexos. O primeiro é aquele em
que a composição química é conhecida, com quantidades exatas de compostos
químicos. É utilizado quando se quer estudar uma espécie em particular. O segundo
é geralmente composto por caseína, carne, soja ou levedura, mas em quantidades
não definidas, podendo-se citar como exemplo o BHI (Brain heart infusion – meio de
infusão cérebro-coração). Além disso, os meios podem ser classificados em
redutores, seletivos, diferenciais e de enriquecimento (TORTORA, G. J.; FUNKE, B.
R.; CASE, C. L; 2005, p. 164, 167, 169; SPOLIDORIO, D. M. P.; DUQUE, C.; 2013,
p. 32, 33, 34).

2. Capítulo I – Bactérias
2.1. Introdução

Considerados microrganismos relativamente simples, são seres unicelulares e

procariotos, ou seja, seu material genético não está envolvido por membrana
nuclear. Podem ser classificados conforme o formato, sendo os bacilos os que têm
formato de bastão, os cocos, com formato esférico ou ovalado e os espirilos, com
formato de saca-rolhas ou curvado (Figura 1). Além desses, há bactérias que podem
ter outros formatos, como quadrado ou estrela (TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.;
CASE, C. L; 2005, p. 02).

A parede celular das bactérias é composta por um complexo de carboidratos e

proteínas chamado peptideoglicana. Sua reprodução é chamada de fissão binária,
na qual a célula inicial se divide em duas novas células idênticas. Além disso, como
forma de nutrição, podem utilizar compostos orgânicos, podem sintetizar seu próprio
alimento por fotossíntese ou obtê-lo por meio de substâncias inorgânicas
(TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L; 2005, p. 02).

Como forma de diferenciar as bactérias, elas são classificadas em Gram-positivas

ou Gram-negativas. As gram-positivas contêm parede celular com muitas camadas
de peptideoglicana, formando uma estrutura espessa e rígida. Além disso, suas
paredes celulares contêm ácido teicóico, o qual tem diversos papéis, como impedir
ruptura da parede no crescimento da célula, fornecer especificidade antigênica e
podem unir e regular a entrada e saída de cátions e ânions da célula. Já as gram-
negativas contêm paredes celulares com poucas camadas de peptideoglicana, a
qual está ligada a lipoproteínas, e uma membrana externa, com periplasma
preenchendo o espaço entre as duas camadas. Essa membrana externa tem como
função fornecer uma barreira para certos antibióticos, enzimas digestivas,
detergentes, metais pesados, sais biliares e certos corantes (TORTORA, G. J.;
FUNKE, B. R.; CASE, C. L; 2005, p. 83).

O mecanismo da coloração de Gram baseia-se nas diferenças entre as paredes

celulares e como cada uma reage com os reagentes utilizados. O violeta de
genciana ou violeta de metila, corante principal utilizado, entra no citoplasma de
ambas as células. Em seguida, geralmente é aplicado o lugol, com a função de
formar cristais que não conseguem escapar pela parede celular. Então é aplicado
álcool para desidratar a peptideoglicana das células gram-positivas e tornar mais
impermeável ao cristal violeta-lugol. Nas células gram-negativas, o álcool dissolve a
membrana externa de forma a deixar buracos na camada de peptideoglicana,
espalhando o cristal violeta-lugol. Então é adicionada a safranina ou fucsina, que
torna as células gram-negativas cor-de-rosa. Sendo assim, as gram-positivas
adquirem cor roxa e as gram-negativas adquirem cor rosa. A Figura 2 representa a
diferença entre as paredes celulares de ambas as bactérias (TORTORA, G. J.;
FUNKE, B. R.; CASE, C. L; 2005, p. 85).

Figura 1. Cocos, bacilos e espirilos

Fonte: Fiapo de jaca.

Figura 2. Diferença nas paredes celulares de bactérias

Fonte: abc da medicina.

 Para obtenção das colônias de bactérias, são realizados métodos diferentes
de semeadura, os quais possuem diferentes objetivos. A técnica de semeadura por
estrias ou esgotamento de alça (Figura 3) consiste em coletar uma pequena parcela
do inóculo e espalhá-lo sobre o ágar da placa de Petri formando estrias em
movimento de zigue-zague, de forma que é possível obter colônias isoladas de
bactérias. Já a técnica de semeadura por espalhamento ou em superfície (Figura 4)
consiste em transferir um pequeno volume da solução contendo os microrganismos
para a placa com ágar já solidificado utilizando uma pipeta estéril. Depois esse
volume é espalhado por toda a superfície do ágar com auxílio de uma alça de
Drigalski. O terceiro método seria a semeadura por profundidade ou pour plate
(Figura 4), a qual consiste em colocar um pequeno volume da solução com os
microrganismos na placa de Petri sem ágar. Então é adicionado o ágar fundido e
mistura-se os dois com uma leve agitação da placa. Nesse método, é possível
enxergar o crescimento das colônias tanto na superfície quanto dentro do ágar,
podendo compará-la a semeadura de superfície (TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.;
CASE, C. L; 2005, p. 174, 175).

Figura 3: Semeadura por esgotamento

Fonte: Técnicas de semeadura de bactérias em meios de cultura.

 Figura 4: Semeadura por superfície e de profundidade

Fonte: Fandom.

2.2. Objetivos

O estudo teve como objetivo conhecer as características microbiológicas das

bactérias, praticando formas de identificação, classificação, diferenciação entre
GRAM positivas e GRAM negativas, criando diferentes formas de semeadura por
meio da utilização de uma estrutura laboratorial, a qual permite analisar
microrganismos cultivados pelo grupo durante as aulas práticas.

2.3. Materiais e métodos

Durante as pesquisas para ampliação dos conhecimentos sobre as bactérias
foram utilizados os seguintes materiais: microscópio óptico, Lâmina, placa de Petri
contendo ágar nutriente, Pipeta, Bico de Bunsen, swab, ágar PDA, ágar PCA,
solução fisiológica estéril, estufa, alça de semeadura, pipetada automática e caixa
de ponteiras, alça de Drigalski, óleo de imersão, pipeta graduada, pera de sucção,
tubo contendo caldo nutritivo, solução de violeta, solução de lugol, álcool e solução
de fucsina, papel toalha.
 Os métodos utilizados foram divididos em duas partes envolvendo o cultivo de
bactérias. No primeiro, estudou-se o preparo envolvendo técnicas de semeadura e
no segundo a leitura utilizando a coloração de Gram.

Para a primeira parte do experimento, utilizou-se a técnica de semeadura por

esgotamento (Figura 5), a qual foi a primeira a ser estudada, utilizando-se uma placa
contendo ágar nutriente e uma alça de semeadura flambada na chama do bico de
Bunsen. Em seguida, a alça foi resfriada e mantida próxima ao fogo sem encostar
em nada para evitar a contaminação do experimento, o qual teve como passo
seguinte a transferência de uma alíquota de caldo nutritivo com Salmonella contido
em um tubo previamente homogeneizado e com a boca flambada. Após, mantendo
a placa próxima ao fogo, o conteúdo da alça foi espalhado na placa em formato de
estrias (tomando o devido cuidado de manter a tampa da placa próxima do fogo e
evitando o contato da mesma com a bancada ou outros objetos). Para finalizar, a
placa foi tampada e a alça foi devidamente flambada para voltar a bancada. Por fim,
levou-se a placa à estufa a 37º por 48 horas.

Outra forma de semeadura estudada, ainda na primeira parte, foi a

semeadura em superfície (Figura 6), a qual iniciou-se com a identificação de outra
placa contendo ágar nutriente, trabalhando sempre próximo ao fogo. Em seguida,
flambou-se a boca do tubo contendo caldo com Salmonella homogeneizado. Após,
abriu-se a caixa de ponteiras e encaixou-se uma ponteira ao pipetador automático,
pipetando uma alíquota de 0,1mL do caldo contido no tubo. Logo após, inseriu-se o
conteúdo na placa, tomando o cuidado para manter a mesma próxima a chama, ao
finalizar tampou-se a placa e descartou-se a ponteira utilizada. Seguindo, flambou-
se e resfriou-se a alça de Drigalski, mantendo próxima ao fogo, a alça foi utilizada
para espalhar o caldo na superfície do ágar (tomando o devido cuidado de manter a
tampa da placa próxima do fogo e evitando o contato da mesma com a bancada ou
outros objetos). Por fim, tampou-se a placa e flambou-se a alça de Drigalski antes de
colocá-la na bancada e então levou-se a placa a estufa a 37ºC por 48h.

A última forma de semeadura estudada é a semeadura em profundidade

(Figura 7), tal qual iniciou-se com a identificação de uma placa de Petri vazia. Em
seguida, pegou-se a pipeta graduada esterilizada e acoplou-se a uma pera de
sucção e pipetou-se 1 mL do caldo com Salmonella contido em um tubo previamente
homogeneizado e flambado. A seguir, abriu-se a placa, mantida próxima ao fogo, e
colocou-se o conteúdo na placa, a qual foi tampada. Na etapa seguinte, inseriu-se
ágar nutriente fundido à placa (tomando o devido cuidado de manter a tampa da
placa próxima do fogo e evitando o contato da mesma com a bancada ou outros
objetos) e homogeneizou-se o conteúdo da placa, movimentando-a suavemente
com o apoio da bancada com movimentos suaves em forma de um número oito.
Para encerrar, aguardou-se a solidificação do meio e levou-se a placa para ser
incubada em estufa a 37ºC por 48h, assim como as anteriores.

Para o estudo de coloração de Gram e de leitura do cultivo de bactérias,

iniciou-se com a observação das placas sem que as mesmas fossem abertas, além
da observação, anotou-se as diferenças entre o crescimento das colônias em cada
placa. A seguir, acendeu-se o bico de Bunsen e flambou-se a alça de semeadura,
após, com a alça resfriada e mantida próxima do fogo, pegou-se a placa da
semeadura de superfície e retirou-se algumas colônias com o auxílio da alça. Em
seguida colocou-se uma gota de água na lâmina e espalhou-se o conteúdo da alça
na lâmina. A seguir, a alça foi flambada antes de ser colocada de volta em cima da
bancada e passou-se a lâmina no fogo três vezes, para fixar o esfregaço. Após o
resfriamento da lâmina, iniciou-se o processo da coloração de Gram em uma pia do
laboratório, a qual foi realizada em quatro etapas: um minuto da solução de violeta
sobre a lâmina, um minuto da solução de lugol, lavagem com álcool rapidamente e
30 segundos de solução de fucsina na placa. Após cada etapa, lavou-se a lâmina
com água, secando-a suavemente após a última etapa. Ao fim dos processos de
coloração, observou-se a lâmina no microscópio, para identificar formas e arranjos.
Figura 5: Semeadura por esgotamento.

Fonte: Autoria própria.

Figura 6: Semeadura de superfície.

Fonte: Autoria própria.

 Figura 7: Semeadura de profundidade.

Fonte: Autoria própria.

2.4. Resultados e discussão

Após análise das placas nas quais foram realizados diferentes tipos de semeadura,
pôde-se observar as diferenças de utilidades entre elas. Na semeadura de
esgotamento, da qual retiramos a amostra de bactérias para observação no
microscópio, é possível formar colônias isoladas de microrganismos, de forma
que pode-se realizar contagens. Na semeadura de profundidade, é possível
enxergar o crescimento de microrganismos por toda a extensão do ágar
nutriente. Já na semeadura de superfície, há crescimento dos microrganismos
apenas na superfície do ágar,
Após a observação da lâmina no microscópio, foi possível identificar que a bactéria
Salmonella é Gram negativa, pois foi observada coloração rósea dos
microrganismos, conforme representa a Figura 8.
 Figura 8: Coloração rósea da Salmonella.

Fonte: Autoria própria.

2.5. Conclusão
Após obtenção e análise dos resultados, foi possível concluir as diferenças entre os
objetivos para cada tipo de semeadura. Além disso, pôde-se concluir que a bactéria
Salmonella presente no tubo é Gram negativa, por conta da coloração rosada vista
em microscópio ótico.

3. Capítulo II - Fungos
3.1. Introdução
Seres eucariotos, com parede celular constituída de glicanas, mananas e/ou quitina.
Produzem uma grande variedade de esporos reprodutivos sexuais e assexuais, com
metabolismo heterotrófico e anaeróbio ou anaeróbio facultativo. Esses seres podem
ser benéficos, com importância na decomposição de vegetais, reciclo de elementos
vitais, alimentação humana, produção de alimentos, como pão e drogas, como
penicilina; mas também podem ser maléficos, já que são responsáveis por doenças
que podem afetar não só os seres humanos, mas também os vegetais (TORTORA,
G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L; 2005, p. 334, 335).
 Como exemplo de fungos unicelulares, há as leveduras, as quais são capazes
de crescimento anaeróbio facultativo. Na ausência de oxigênio, fermentam hidratos
de carbono e produzem etanol e gás carbônio; na presença de oxigênio, respiram
aerobicamente metabolizando hidratos de carbono e formando gás carbônico e
água. Essa forma de metabolismo é muito visada para a fabricação de cerveja,
vinhos e pães. Uma célula de levedura pode produzir mais de 24 células filhas por
brotamento (TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L; 2005, p. 336).

Os bolores ou fungos filamentosos têm esse nome por consistir de filamentos

longos (hifas) de celular conectadas. Essas hifas podem ser septadas ou cenocíticas
(Figura 9). A porção dela que obtém nutrientes é chamada de p vegetativa e a
porção responsável pela reprodução é a hifa reprodutiva. Quando essas hifas
crescem formando uma massa, são chamadas de micélio, podendo ser visível a olho
nu (TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L; 2005, p. 335, 336).

Figura 9: Hifas septadas ou cenocíticas

Fonte: O melhor da biologia.

3.2. Objetivos
O estudo dos fungos tem como objetivo conhecer e estudar o reino fungi,
classificando microrganismos como leveduras e bolores. Nos estudos em laboratório,
foram estudados o crescimento bem como a diferenciação dos bolores e das leveduras,
utilizando as semeaduras preparadas pelos integrantes do grupo durantes as aulas
práticas no laboratório de microbiologia.
 3.3. Materiais e métodos
No estudo dos fungos foram utilizados os seguintes materiais: bico de Bunsen,
alça de semeadura, placa de Petri, lâmina, microscópio ótico, pinça, ágar PDA,
papel de filtro, corante azul de algodão, esmalte, placas contendo fungos.
O estudo dos fungos foi dividido em duas partes. A primeira baseada na
microscopia de levedura e no preparo do micro cultivo de bolores, enquanto na
segunda, após o período de incubação, a leitura microscópica do micro cultivo de
bolores.
A primeira parte iniciou com a observação microscópica de leveduras.
Primeiramente usou-se o bico de Bunsen para flambar a alça de semeadura e,
depois de esperar esfriá-la, usou a mesma para retirar uma amostra das colônias
contida em uma placa de Petri (Figura 10). A seguir, pingou-se uma gota de água na
lâmina e o conteúdo contido na alça foi espalhado na mesma lâmina. Por fim a
lâmina foi observada no microscópio.
Figura 10: Colônias de levedura

Fonte: Autoria própria

Para o micro cultivo de bolores, também foi necessário trabalhar com o bico de
Bunsen aceso, assim, utilizou-se uma pinça para transferir um quadrado de ágar
PDA para o centro da lâmina contida na placa de vidro. Em seguida, utilizando uma
alça de semeadura com a ponta em "L" flambada utilizando o mesmo método feito
anteriormente, pegou-se um pequeno pedaço da colônia de bolor (figura 10), a qual
foi transferida para um dos lados quadrados de PDA, o processo foi repetido até
completar os quatro lados do quadrado. No passo seguinte, colocou-se uma das
lamínulas, contidas na placa de vidro, sobre o quadrado de PDA. Por último,
colocou-se um pouco de água esterilizada no papel de filtro contido no fundo da
placa de vidro e identificado na tampa, a figura 8 mostra montagem final. Assim a
placa foi incubada a temperatura ambiente.
Figuras 10 e 11: Colônias de bolor e montagem final, respectivamente.

Fonte: Autoria própria Fonte: Autoria própria

Para a segunda parte do experimento de coloração e microscopia, com o bico
de Bunsen aceso, abriu-se a placa de vidro, colocou-se uma ou duas gotas de
corante azul de algodão na lâmina limpa, retirou-se a lamínula do micro cultivo, com
cuidado, e colocou-se sobre a gota de corante vedando-se com esmalte. A seguir
retirou-se da placa de vidro, colocando uma ou duas gotas de corante azul do micro
cultivo, colocou-se uma lâmina limpa sobre a gota e vedou-se com esmalte. Por fim,
observou-se as duas lâminas ao microscópio com aumento máximo de 400 vezes.
Desenhou-se a estrutura observada e, por comparação, tentou-se identificar qual era
o bolor.
 Figura 12: Crescimento do fungo após incubação

Fonte: Autoria própria

3.4. Resultados e discussão
Observou-se na microscopia de colônias de leveduras estruturas ovaladas, de
coloração azulada devido ao corante utilizado, e comparando com a figura 10, em
que mostra um fungo do gênero Saccharomyces em alto grau de aumento, pode-se
afirmar que as leveduras pertencem a esse gênero.
Figura 13: Saccharomyces sp.

Fonte: Classificação e reprodução dos fungos.

Contudo, na observação das duas lâminas feitas a partir do microcultivo de bolor,
não foi possível comparar o tipo de conídio formado com os já conhecidos (figura
15). O tempo de incubação, que foi de uma semana, talvez fora insuficiente para
haver o crescimento dos conídios (Figura 14), portanto não se teve certeza de qual
gênero pertencia o fungo incubado.
Figura 14: Diferenciação das estruturas conforme o gênero do fungo.

Fonte: Classificação e reprodução dos fungos.

Figura 15: Microscopia do micro cultivo de bolor

Fonte: Autoria própria.

Apesar da dificuldade na classificação do fungo estudado, este já estava identificado
anteriormente e fora escrito na tampa da placa, conforme a Figura 11. Portanto o
bolor pertencia ao gênero Alternaria.
3.5. Conclusão
Foi possível visualizar e identificar as leveduras, que pertencem ao gênero
Saccharomyces, fungos unicelulares de estrutura ovaladas. Porém, não foi possível
fazer a comparação das estruturas já conhecidas na literatura com as do
microcultivo de bolor.
4. Capítulo III - Cadeia de transmissão de microrganismos
4.1. Introdução
Para que ocorra a cadeia de transmissão de microrganismos, são necessários
três elementos básicos: o hospedeiro, o microrganismo e o meio ambiente, sendo
que, em muitos casos podem haver vetores (transmissão indireta), como os insetos
que os transportam. Os seres microscópios infectantes podem ser bactérias, fungos,
vírus, parasitas ou príons que procuram um reservatório de recursos de que possam
utilizar para o crescimento (multiplicação), que pode ser por meio dos nutrientes,
como o ferro no organismo humano ou por lesão direta, retirando diretamente das
células, produzindo subprodutos tóxicos. (TRABULSI, L.R.; 2008, p.215-234).

A infecção de um hospedeiro ocorrerá caso o microrganismo consiga aderir e

danificar um tecido penetrando suas defesas. Tais portas de entrada podem ser
membranas mucosas, pele e via parenteral. As ações do agente invasor podem
levar à produção de toxinas, sendo classificadas tanto por endotoxinas como
exotoxinas. (RIBEIRO, M. C.; SOARES, M. M. S. R.; 1993, p. 5).

As endotoxinas partem da membrana externa da parede celular de bactérias

Gram negativas. São menos específicas e potentes. Já as exotoxinas são
produzidas no interior da célula, sendo mais comum em bactérias Gram positivas,
têm fácil difusão pelo corpo e são altamente específicas. (RIBEIRO, M. C.; SOARES,
M. M. S. R.; 1993, p. 5-8).

Segundo Potter e Parry (2013), as infecções transmitidas seguem um padrão

progressivo. A severidade de uma doença em um paciente depende da
patogenicidade dos microrganismos, virulência, dose do organismo e suscetibilidade
do hospedeiro.
 4.2. Objetivos
Ao estudar a cadeia de transmissão de microrganismos, o objetivo foi avaliar
formas de propagação das formas de vida microscópicas entendendo como elas se
comportam em situações como as do cotidiano, utilizando os conhecimentos
previamente adquiridos sobre bactérias e fungos.

4.3. Materiais e métodos

Para a realização do experimento, foram utilizados uma solução contendo leveduras,
8 swabs e 2 placas de Petri contendo ágar Sabouraud divididas em quadrantes,
numerados de 1 a 8. Além disso, reuniu-se 8 alunos, também enumerados de 1 a 8.
Estes alunos higienizaram bem as mãos com água e sabão, secaram-nas com papel
toalha e posteriormente utilizaram álcool 70% para esterilizá-las com mais eficácia.
Após essa etapa, permaneceram com as palmas das mãos uma em cima da outra
para evitar contaminação de algum possível microrganismo presente no ar.
Acendeu-se o bico de Bunsen e derramou-se a solução contendo leveduras na mão
direita do aluno número 1. Passou-se o swab em sua mão recém contaminada e
transferiu-se, em forma de estria, no quadrante 1 da placa. O aluno 1, com a mão
contaminada, apertou a mão do aluno 2 e assim passou-se um novo swab na mão
do aluno 2 e espalhou-se no quadrante 2. O aluno 2 apertou a mão do aluno 3. Esse
procedimento foi repetido até transferir o conteúdo da mão do aluno 8 para o seu
respectivo quadrante. Por fim, as placas foram incubadas à temperatura ambiente.
Todos os procedimentos, de abrir e fechar a placa de Petri, passar o swab nas mãos
e transferência para os respectivos quadrantes, foram feitos próximas ao bico de
Bunsen aceso para evitar contaminação externa.

4.4. Resultados e discussão

Após o período de incubação, foi possível observar o crescimento de colônias
de levedura, que apresentam um aspecto cremoso de coloração esbranquiçada, até
o sétimo quadrante, com um grande número de colônias no primeiro quadrante e
que se diminui ao decorrer dos consecutivos cumprimentos de mão. Como
desenvolveram-se colônias reduzidas nos quadrantes 5 e 7, estes foram destacados
com um círculo de cor amarela. Ocorreu também a contaminação por um fungo no
quadrante 1, 3 e 5 em destaque com círculos vermelhos marcados nas figuras 16 e
17. No quadrante 6 não ocorreu o desenvolvimento de colônia (Figura 17).
 Visto que houve crescimento de colônia no quadrante 7, mas não no 6, pode-
se deduzir que ocorreu uma transferência errônea ou ineficiente do swab da mão do
aluno 6 para o seu respectivo quadrante.
Embora o experimento tenha apresentado contaminação por fungos, onde foi
observado que não se desenvolveu colônias de leveduras onde os fungos cresciam
(Figura 16), essa contaminação foi apenas pontual e não influenciou no objetivo do
experimento, uma vez que as colônias se propagaram nos quadrantes
subsequentes.

Figura 16: Quadrantes 1 ao 4.

Fonte: Autoria própria.

 Figura 17: Quadrantes 5 ao 8.

Fonte: Autoria própria.

4.5. Conclusão
Pôde-se concluir que há um grande risco de transmissão de microrganismos,
patógenos ou não, de um simples aperto de mão. Assim, deve-se ter bons hábitos
de higiene, principalmente ao manusear os utensílios usados em um laboratório de
microbiologia.
Além disso, como pode-se observar, houve um crescimento de fungo nos
quadrantes 1, 3 e 5, o que mostra o quão suscetível está à contaminação de
microrganismos um meio de procriação, os alimentos ou, no caso do experimento, o
ágar Sabourad, apesar de todos os cuidados de higienização e utilizando o bico de
Bunsen como um meio de impedir a contaminação da placa de agentes presentes
no ar.

5. Capítulo IV - Testes bioquímicos para identificação de bactérias

5.1. Introdução
Diferentes bactérias podem apresentar morfologia e metabolismo idênticos,
apresentando dificuldades para identificação, sendo necessária a utilização de
técnicas e também da observação de um conjunto complexo de características: A
morfologia celular, que descreve a forma da bactéria juntamente com sua estrutura
específica, mobilidade, comportamento tintorial e arranjos; as características
 culturais mostram o crescimento das colônias em diferentes meios (placa, inclinado,
gelatina, líquido); diferentes genéticas e sequência de genes específicos.
Patogenicidade, divergência em habitat, condições ambientais, hospedeiros,
resistência e proveniência; especificidade fisiológica como suas exigências nutritivas
para fontes de carbono e nitrogênio, observando os fatores de crescimento.
(PELCZAR, J. M. J.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, N. R.1993, p. 75-76).

Com isso, utiliza-se a análise microbiológica que pode ser dividida em cinco
fases. O preparo de uma amostra (homogeneização), semeadura em que se dilui a
amostra, incubação, leitura de resultados para identificação e contagem de colônias
e confirmação de resultados. Há diversos mecanismos para tais identificações, como
por exemplo: produção de catalase que se aplica a microrganismos que contém a
enzima denominada catalase. Como prova disso, é a quebra de uma molécula de
peróxido de hidrogênio formando água e oxigênio; a prova da oxidase é comprovada
caso haja um sistema enzimático relacionado com os citocromos da cadeia
respiratória que denotarão uma cor púrpura à amostra; utilização do citrato para
verificar se as enzimas possuem o mecanismo para o transporte do citrato indicada
pela coloração azul; a degradação da ureia, chamada teste da urease que é
comprovada com a coloração rosa; produção de indol a partir de triptofano (cor
rósea dentro de cinco minutos); produção de gás sulfídrico a partir de tiossulfato,
resultando um precipitado preto; reações em TSI inclinado que pode relatar se é
ácido, alcalino, se há produção de ácido sulfídrico ou gases, respectivamente pelas
cores amarelo, vermelho, preto e se há rachaduras ou bolhas; prova se o plasma é
coagulado; fermentação de açucares utilizando indicadores como o vermelho de
metila; e as reações em tiras de diagnóstico, sendo altamente completas e
específicas quanto a comprovação dos demais testes. (OLIVINDO, C.S.; 2007, p.
12-22).
5.2. Objetivos

O estudo teve por objetivo colocar em prática conhecimentos bioquímicos tais

quais propiciaram a identificação de uma bactéria previamente desconhecida. O estudo
também colocou em uso os conhecimentos adquiridos pelo grupo durante o curso de
microbiologia, os quais permitiram a realização de diversos testes necessários para a
identificação de bactérias.
 5.3. Materiais e métodos

Preparo: Inicialmente, após acender o bico de Bunsen, identificaram-se com os

tubos enumerados de 1 a 5, que forneciam as 5 provas bioquímicas para a
realização do procedimento e mais a placa contendo ágar MacConkey. Após
isso, flambou-se a agulha de semeadura e aguardou-se seu esfriamento,
mantendo-a próxima ao fogo, sem encostar em nada. Adiante, abriu-se a placa
com a bactéria, próxima ao fogo, e encostou-se a ponta da agulha de
semeadura na superfície de uma colônia.
Para o tubo 1 MEIO DE EPM (água verde inclinada) :Depois de flambar a boca do
tubo, semeou-se por uma picada central, até o fundo e, ao retornar-se a agulha,
semeou-se por estrias a superfície inclinada do meio.

Para o tubo 2 CALDO LISINA (caldo purpura): Logo após flambar-se a boca do
tubo, semeou-se o mesmo, por uma picada central, até o fundo.

Para o tubo 3 meio MIO – Motilidade, Indol e Ornitina, semi-sólido: Após flambar
a boca do tubo, semeou-se ele, por uma picada central, até o fundo e ao voltar a
agulha manteve-se a mesma trajetória, isso faz com que a prova de motilidade não
se prejudique.

Para o tubo 4 AGAR CITRATO DE SIMMONS (ágar verde inclinado): Após

flambar-se a boca do tubo, semeou-se o tubo na superfície.

Para o tubo 5 CALDO RHAMNOSE (caldo verde claro): Logo depois de flambar a
boca do tubo, semeou-se o mesmo, na superfície, e cobriu-se vaselina estéril, para
garantir ambiente anaeróbio.

Semeadura na placa com ágar MacConkey: Primeiramente, flambou-se a alça de

semeadura e aguardou-se o esfriamento dela, mantendo-a próxima ao fogo, sem
encostar em nada. Em seguida, abriu-se a placa com a bactéria, próximo ao fogo, e
encostou-se a alça na colônia. Depois de fechar a placa, abriu-se a outra placa com
ágar MacConkey, nas proximidades do fogo, e semeou-se por estrias.
Leitura: Apenas pela observação das alterações ocorridas dentro da placa e dos
tubos, realizou-se os testes bioquímicos a partir de reações químicas e metabólicas,
as quais forneceram resultados que permitiram detectar o microrganismo presente
nos tubos e na placa, podendo ser positivo ou negativo.

Para o tubo 1 MEIO DE EPM (água verde inclinada): Para a realização da leitura
do tubo 1, utilizou-se a desaminação do L-triptofano (TRI), fermentação da glicose
(GLI) e produção de gás sulfídrico (H 2S).Na análise da desaminação de L-triptofano
(TRI), considerou-se o resultado como positivo se a mistura contida no tubo
apresentasse uma coloração verde garrafa e negativo, caso o meio mantivesse sua
coloração inicial intacta (verde azulado) .Na fermentação da glicose (GLI), utilizaram-
se os seguintes parâmetros: positivo se ocorresse o desenvolvimento de uma cor
amarela no fundo do tubo e negativo caso o fundo do tubo mantivesse a cor original
do meio, já na produção de gás sulfídrico (H 2S), o microrganismo como positivo se
houvesse o desenvolvimento de uma coloração negra de intensidade variada no
interior do tubo e como negativo se não ocorresse nenhuma mudança no meio.

Para o tubo 2 CALDO LISINA (caldo purpura): Na leitura do tubo 2, utilizou-se a

descarboxilação de lisina (LIS), considerando-se o microrganismo como positivo se
o meio desenvolvesse uma coloração entre amarelo e púrpura e como negativo caso
o meio gerasse uma cor amarela.

Para o tubo 3 meio MIO – Motilidade, Indol e Ornitina, semi-sólido: A análise do

tubo 3 consistiu em descarboxilação da ornitina (ORN), motilidade (MOT) e indol
(IND). Na descarboxilação da ornitina (ORN), a classificação do microrganismo foi
realizada da seguinte forma: positivo caso ocorresse o desenvolvimento de uma
coloração entre amarelo e púrpura no meio e negativo se houvesse o aparecimento
de uma coloração amarela.

Quanto à motilidade (MOT), classificou-se a bactéria como positiva se houvesse

o crescimento difuso com turvação total ou parcial do meio e como negativa se o
crescimento fosse restrito à linha de picada. Já na análise do teste com Indol (IND),
primeiramente, adicionaram-se gotas do reativo de Kovac’s sobre a superfície. Após
certo período, classificou-se o microrganismo como positivo se houvesse o
surgimento de um anel vermelho na superfície do meio e como negativo se o anel
fosse amarelo.

Para o tubo 4 - ÁGAR CITRATO DE SIMMONS (ágar verde inclinado): A leitura

do tubo 4 consistiu no uso de citrato (CIT), em que classificou-se o microrganismo
como positivo se ocorresse o crescimento no meio ou desenvolvimento de coloração
azul e como negativo se não houvesse sinais de crescimento e mudança de
coloração.

Para o tubo 5 - CALDO RHAMNOSE (caldo verde claro): Para a leitura do tubo 5,
utilizou-se Rhamnose (RHA) e classificou-se a bactéria da seguinte maneira: positiva
se houvesse o desenvolvimento de uma coloração amarela com turvação do meio e
negativa se o meio mantivesse sua coloração original com crescimento (turvação).

Semeadura na placa com ágar MacConkey: A classificação da bactéria foi

mediada da seguinte maneira: positiva se ocorresse a fermentação da lactose com
surgimento de colônias róseas e como negativa se não houvesse fermentação e
surgisse colônias incolores.

5.4. Resultados e discussão

A Figura 7 representa a coloração dos tubos de 1 a 5 antes de serem realizadas as

semeaduras e os testes bioquímicos. Já a figura 8 representa os resultados
obtidos, com observação de mudanças nos tubos.
Figura 7: Antes dos testes (Tubos 1 ao 5).

Fonte: Autoria própria.

Figura 8: Depois dos testes (Tubos 1 ao 5).

Fonte: Autoria própria.

 Teste dos tubos de 1 ao 5.

Tubo 1- MEIO DE EPM (água verde inclinada)

Não foi possível testar no tubo 1 a desaminação do L-Triptofano (TRI) e fermentação

da glicose (GLI). Para o (H2S) foi evidenciado que não houve o desenvolvimento de
cor negra de intensidade variável no tubo, o que confere uma resposta negativa
para a produção de gás sulfídrico (H2S), com isso identificamos a presença de
E.coli.

Tubo 2 - CALDO LISINA (caldo purpura)

Para o tubo 2 obteve-se resultado positivo para a descarboxilação da lisina para

ambas as bactérias, observando-se uma coloração púrpura, onde qualquer cor
diferente do amarelo é positiva.

Tubo 3: meio MIO – Motilidade, Indol e Ornitina, semi-sólido.

O teste para a descarboxilação da ornitina foi positivo para ambas as bactérias,

uma vez que houve o desenvolvimento de coloração púrpura. Na prova de
motilidade, foi possível observar a turvação do meio, o que indica um resultado
positivo também para ambas. Por fim, para o Indol, ao adicionar-se o reativo de
Kovac’s, formou-se um anel de cor vermelha correspondente ao reativo na
superfície do meio, resultado positivo que indica a presença de E.coli.

Tubo 4: AGAR CITRATO DE SIMMONS (ágar verde inclinado).

Para este tubo, que atua como prova da utilização do citrato como fonte única de
carbono, obteve-se resultado negativa indicando a presença de E.coli.
Tubo 5: CALDO RHAMNOSE (caldo verde claro)

Para o Tubo 5, obteve-se coloração amarela com a turvação do meio, o que

confere resultado positivo para ambos os microrganismos testados.

Semeadura na placa com ágar MacConkey

Na semeadura na placa com ágar MacConkey (Figura 9), para identificar os

microrganismos, o meio possui o indicador de pH vermelho neutro, que é incolor em
meios alcalinos e rosa em meios ácidos. O resultado obtido em laboratório foi
positivo, no qual observou-se a formação de coloração rósea (Figura 10), indicando
a presença de E.coli. Essas bactérias, quando fermentam a lactose, liberam ácido
que abaixam o pH do meio deixando as colônias rosadas. Quando não ocorre
fermentação, ficam incolores.

Figura 9: Coloração na placa de ágar MacConkey antes do teste

Fonte: Autoria própria

 Figura 10: Coloração rósea na placa de ágar MacConkey depois do teste.

Fonte: Autoria própria.

5.5. Conclusão
Após a utilização de testes bioquímicos que possibilitam a verificação da presença
de enzimas bacterianas relacionadas ao metabolismo de vários substratos, foi
possível analisar os resultados e afirmar que a bactéria presente nos tubos era E.
coli.

6. Referências bibliográficas

ALENCAR, R. B. Classificação e reprodução dos fungos. Universidade do

Estado do Amazonas: Ciências biológicas. Manaus: 2015.

ANTIBACTERIANOS – CLASSSES DE REMÉDIOS E MECANISMOS DE AÇÃO.

Abc da medicina. Disponível em:
<http://www.abcdamedicina.com.br/antibacterianos-classes-de-remedios-e-
mecanismos-de-acao.html>. Acesso em: 23 jun. 2018.

BALBANI, A. P. S.; BUTUGAN, O. Contaminação biológica dos alimentos.

Pediatria, 2001, p. 320-328.
CHEN, Y.; JACKSON, K. M.; CHEA, F. P.; SCHAFFNER, D. W. Quantification and
variability analysis of bacterial cross-contamination rates in common food
service tasks. J Food Prot., v. 64, n. 1, p. 72-80, 2001.

FORMA DAS BACTÉRIAS. Fiapo de Jaca. Disponível em:

<http://www.fiapodejaca.com.br/formas-das-bacterias/>. Acesso em: 23 jun. 2018

FURTADO, A. P. Técnicas de semeadura de bactérias em meios de cultura.

Universidade Federal do Pará: Instituto de Ciências Biológicas.

MELLO, A. Tipos de hifas. O melhor da biologia. Disponível em:

<http://melhordabio.blogspot.com/2016/12/tipos-de-hifa.html>. Acesso em: 23 jun.
2018.

OLIVINDO, C.S.; Detecção de microrganismos no leite de cabra. Universidade

Federal do Ceará. Fortaleza: 2007, p. 12-22.

PELCZAR Jr, M. J.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, N. R. Microbiology: concepts and

applications. Nova Iorque: McGrawHill, 1993, p. 75-76

POTTER, P.; PERRY, A. G.; Fundamentos da enfermagem. 8 ed. Rio de Janeiro:

2013, p. 50-64.

POUR PLATE SPREAD. Disponível em: <http://pt-

br.aia1317.wikia.com/wiki/Arquivo:Pour_plate_spread.jpg>. Acesso em: 23 jun. 2018.

RIBEIRO, M. C.; SOARES, M. M. S. R.; Microbiologia prática: roteiro e manual.

Atheneu; 1993, p. 5-8.

SPOLIDORIO, D. M. P.; DUQUE, C. Microbiologia e Imunologia Geral e

Odontológica. Vol. 2. São Paulo: Artes Médicas, 2013, p. 32-34.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L.; Microbiologia. 8 ed. Porto Alegre:
Artmed, 2005. p. 01- xx..