BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA MEDICINA: FUNDAMENTOS TERICOS E METODOLGICOS

Profa. Dra. Nancy Amaral Rebouas

So Paulo, fevereiro 2008

Referncias utilizadas para preparao dos roteiros e elaborao das discusso sobre os mtodos:

- Current Protocols in Molecular Biology F.M. Ausubel e cols - Editora: John Wiley & Sons, Inc. Atualizaes bimensais - Molecular Cloning - A Laboratory Manual Sambrook - Russel Laboratory Press 2001 Imprescindvel num laboratrio de Biologia Molecular Aqui voce pode encontrar todos os protocolos necessrios, com excelentes explicaes. 3a. Ed. - Editora: Cold Spring Harbor

- PCR Primer - A Laboratory Manual C.W.Dieffenbach G.S.Dveksler Editora: Cold Spring Harbor Laboratory Press 2a. edio - 2003

- Nucleic Acid Hybridization - A Pratical Approach B.D.Hames & S.J. Higgins Editora: IRL Press 1991

- PCR - The Polymerase Chain Reaction K.B. Mullis F.Ferr R. A. Gibbs

Revisado por James D. Watson Editora: Birkhauser 1994

- PCR Applications Protocols for Functional Genomic Michael A. Innis Davod H. Gelfand John J. Sninsky Academic Press 1999.

- PCR The Basics from Background to Bench M.J. McPherson S.G. Moller Bios Spring Verlag 2000.

- PCR 2 A Pratical Approach M.J. McPherson B.D. Hames G.R. Taylor PAS A Pratical Approach Series IRL Press 1995.

- PCR Protocols J. M. S. Bartlett D. Stirling Human Press 2. Ed.- 2003

Solues Bsicas Utilizadas no Laboratrio de Biologia Molecular:

Tris.HCl [tris(hydroxymethyl)aminomethane] - 1M Dissolva 121g de Tris Base em 800 ml de gua MiliQ Ajuste o ph desejado com HCl concentrado Adicione gua at 1L Autoclave Cerca de 70 ml de HCl so necessrios para pH de 7,4 ; e cerca de 42 ml para pH de 8,0. Nota importante: O pH dos tampes com Tris muda significativamente com a temperatura, caindo cerca de 0,028 U para elevao de cada 1oC. O pH das solues tamponadas com Tris deve ser ajustado na temperatura na qual as solues sero usadas. Como o pK do Tris 8,08, o tampo no deve ser usado a pH abaixo 7,2 nem acima de 9,0. No adicione DEPC (Diethyl Pyrocarbonate) em solues com Tris, porque o Tris inativa essa substncia. Se a soluo deve ser usada em experimentos com RNA, prepare-a com gua previamente tratada com DEPC e autoclavada.

EDTA (ethylenediamine tetra-acetic acid) - 0,5M (pH 8,0) Dissolva 186,1g de Na2EDTA.2H20 em 700 ml de gua Ajuste o pH para 8,0 com NaOH 10M (cerca de 50 ml) difcil dissolver o sal. Ele s entra em soluo quando o pH j est prximo de 8. Adicione gua MiliQ para 1 L. Autoclave

TE (tampo Tris/EDTA) 10 mM Tris.HCl - pH 7,4 - 7,5 ou 8,0 1 mM EDTA

SSC (sodium chloride/sodium citrate), 20X

NaCl 3M - 175g/L Na3citrate.2H2O 0,3M - 88g/L Ajuste o pH para 7,0 com HCl 1M

TBE(Tris/Borate/EDTA) - Tampo de Eletroforese 10X - 1L de soluo stock 108 g de Tris Base (890 mM) 55 g de cido brico (890 mM) 40 ml de EDTA 0,5M pH 8,0 (20 mM)

TAE(Tris/Acetate/EDTA) - Tampo de Eletroforese 50 X - 1L de soluo stock 242 g de Tris Base 57,1 ml de cido actico g;acial 37,2 g Na2EDTA.2H2O gua MiliQ para 1 L (TAE tem menor capacidade tamponante que TBE, porm mais adequadoquando sevai extrair DNA do gel)

NaCl - 5M

SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) - 10%

Prepare todas as solues com gua da melhor qualidade possvel Destilada - Deionizada (MiliQ).

Caso as solues sejam destinadas a uso com RNA, trate-as com DEPEC (1:1000), deixe em DEPEC at o dia seguinte e, em seguida, autoclave. Soluo com TRIS no deve ser tratada com DEPEC. Trate previamente a gua com DEPEC, autoclave, e prepare a soluo.

FUNDAMENTOS TERICOS

Extrao de DNA:
Embora o DNA em forma de dupla fita seja muito estvel e resistente a condies adversas, o DNA vulnervel mesmo a foras leves originadas durante a pipetagem ou agitao que facilmente geram tenso na molcula e quebra das ligaes fosfodister. A obteno de molculas de DNA com mais de 150 kb no fcil. No entanto, muito fcil extrair molculas de DNA fragmentadas, com 50 a 100 kb. A quantidade de DNA que se obtm usualmente a partir de 20 ml de sangue ~250 g. A extrao de DNA inclui basicamente os seguintes procedimentos: 1. Lise das clulas (citlise) 2. Purificao do DNA, separando-o de macromolculas contaminantes, tais como protenas e RNA, por digesto enzimtica e/ou processos fsico-qumicos.

O local no laboratrio e o material utilizados para extrao de DNA devem ser separados daqueles dedicados ao manuseio de DNA clonado em plasmdeos ou outro tipo de vetor. Contaminao do DNA genmico, durante o processo de extrao, com esse tipo de DNA poder causar srios problemas em experimentos futuros. Uma possvel fonte de contaminao o uso comum de centrfugas e banhos.

Extrao de DNA de sangue: Anticoagulante: 1 - citrato: (soluo ACD) 0,48% (peso/volume) - cido ctrico 1,32% - citrato de sdio 1,47% - glicose Use 3,5 ml para cada ~20 ml de sangue. 2 - EDTA - pode ser usado.

A soluo ACD ideal, se o objetivo preparar DNA genmico a partir de sangue total, pois preserva melhor molculas de DNA de elevado peso molecular. Tanto em citrato como em EDTA, o sangue pode ser estocado por vrios dias a 0oC ou indefinidamente a -70oC, antes da extrao do DNA. O sangue no deve ser coletado em heparina, pois heparina pode inibir a reao de PCR que eventualmente poder ser realizada mais tarde. No um impedimento absoluto; caso a heparina esteja diluda o suficiente na amostra, a PCR pode funcionar bem.

1 - Tranfira o sangue para um tubo de centrfuga e centrifugue a 1300 g por 15 minutos a 4 oC. 2 - Remova o sobrenadante. Transfira, com uma pipeta Pasteur ou ponteira P-1000, a camada superior de clulas, correspondente aos leuccitos, para um outro tubo. Descarte o pellet de hemcias. 3 - Centrifugue novamente a poro correspondente aos leuccitos. Remova o sobrenadante residual. Ressuspenda o pellet em 15 ml de tampo de lise. Incube a soluo a 37oC por 1 hora.

Soluo de lise: Tris-HCl, pH 8,0 - 10 mM EDTA, pH 8,0 - 10 mM SDS - 0,5% RNase-DNase free - 20 g/ml A soluo sem a RNase preparada e deixada em temperatura ambiente. RNase adicionada em uma alquota s no momento do uso.

Se for sangue congelado: 1 - Descongele o sangue em um banho maria a temperatura ambiente. Adicione igual volume de uma soluo salina tamponada com fosfato (PBS), temperatura ambiente. 2 - Transfira a mistura para um tubo para centrifuao. Centrifugue a 3.500g, po 15 minutos, a 4 oC.

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3 - Remova o sobrenadante que contm as hemcias lisadas. Ressuspenda o pellet em 15 ml de tampo de lise. Incube a soluo a 37oC por 1 hora. Na fase de lise essencial que toda a amostra entre em contato com o tampo de lise. Este deve estar sempre em quantidade suficiente e a homogeneizao deve ser tal que garanta realmente o contato de todas as clulas com o tampo de lise.

4 - Transfira o material lisado para outros tubos de centrifugao, de tal modo que ocupe apenas 1/3 do tubo. Adicione proteinase K (20 mg/ml) a uma concentrao final de 100 g/ml. Misture delicadamente. Pode-se usar um basto de vidro para isso. Certifique-se de que a proteinase K de boa procedncia (genomic grade livre de DNases e RNases), est dentro do tempo de validade e no foi estocada de forma de incorreta. O melhor preparar a soluo estoque de proteinase K (20 mg/ml) a partir do liofilizado quando for usar. Se for estocar, separe em alquotas e guarde a 20oC. 5 - Incube em um banho maria a 50oC por 3 horas. Misture algumas vezes durante este perodo. 6 - Resfrie a soluo at a temperatura ambiente e adicione igual volume de fenol equilibrado com Tris-HCL - 0,1 M (pH 8.0). Misture delicadamente as duas fases para isso ponha o tubo com boca para baixo em um agitador de tubos por cerca de 10 minutos (agitao leve - no vortex). Alternativamente, inverta o tubo vrias vezes, delicadamente. importante que o pH do fenol seja ~ 8,0. Se for mais cido, o DNA poder ficar na interface. A qualidade do fenol outro ponto crtico. Aps ter sido equilibrado com Tris o fenol no pode ser estocado por anos. Ele tende a ser oxidado, e neste estado levar a quebras na cadeia de DNA, alm disso, o rendimento da extrao ser muito ruim. 7 - Separe as fases por centrifugao a 5.000 g, 15 minutos, temp. ambiente. 8 - Com uma pipeta graduada larga, transfira o sobrenadante (que uma soluo viscosa) para um outro tubo. Faa isso delicadamente, sem perturbar a interface e sem submeter o DNA a choques mecnicos.

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9 - Repita a extrao com fenol por mais duas vezes.

Se for necessrio obter molculas na faixa de 150-200 kb, purifique o DNA por dilise: - Transfira a fase aquosa do procedimento anterior para um saco de dilise. Feche o saco, deixando espao para que o volume possa aumentar 1,5 a 2 vezes durante a dilise. Dialise a soluo a 4 oC em 4 L de tampo de dilise. Troque o tampo 3 vezes, a

cada 6 horas. Para dilise completa necessrio cerca de 24 horas.

Tampo de dilise: Tris-HCl (pH 8,0) - 50 mM EDTA (pH 8,0) - 10 mM

Se no for necessrio DNA com tamanhos to elevados, precipite o DNA com etanol. 10 - Adicione fase aquosa do passo anterior (extrao com fenol) 0,2 volume de acetato de amnium 10 M. Adicione 2 volumes de etanol (100%), a temperatura ambiente. Misture bem, porm delicadamente. 11 - Imediatamente se forma um precipitado de DNA. Usando uma pipeta Pasteur com ponta selada em forma de ala, remova o DNA e transfira para outro tubo. Se o DNA j estiver muito fragmentado e no for possvel pesc-lo desta maneira, centrifugue a 5.000 g, por 5 minutos, em temperatura ambiente. Despreze o sobrenadante aps a centrifugao. 12 - Lave o DNA precipitado com etanol 70%. Centrifugue novamente e remova o mximo possvel sobrenadante. Deixe o tubo aberto at que se evapore todo o etanol (alguns minutos). No deixe o pellet secar, pois ser difcil dissolv-lo. 13 - Adicione 1 ml de TE (pH 8.0) para cada 0,1 ml de clulas iniciais. Deixe agitando levemente a 4 oC, at que o pellet se dissolva completamente.

Quantifique e verifique a qualidade do DNA em gel de agarose 0,6 %.

Existem numerosos protocolos para extrao de DNA, das mais diversas fontes.

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Os kits comerciais, com utilizao de resinas, so muito convenientes e fornecem DNA de boa qualidade.

A purificao de cidos nucleicos com fenol e clorofrmio um procedimento rotineiro em laboratrios de biologia molecular. Descreveremos o procedimento a seguir.

Tcnica de extrao com fenol-clorofrmio-alcool isoamlico Fundamentos O mtodo mais comumente utilizado para desproteinizao do DNA a extrao com fenol, que desnatura as protenas de modo eficiente e, provavelmente, as solubiliza. O clorofrmio tambm um bom desnaturante de protenas com propriedades um pouco diferentes, que determinam maior estabilidade da interface entre o solvente e a fase aquosa; a interface fenol puro-gua bastante instvel. A mistura fenol-clorofrmio reduz o volume da soluo aquosa retida na fase orgnica (comparada ao fenol puro), aumentando o rendimento final. O lcool isoamlico previne a formao de espuma quando a mistura agitada em vrtex, o que torna mais fcil a separao das fases orgnica e aquosa. A protena desnaturada forma uma camada na interface das duas fases, separando-se do DNA que se mantm na fase aquosa. Em seguida o DNA precipitado por etanol absoluto, na presena de concentraes relativamente altas (100 a 500 mM) de um sal de ction monovalente. Etanol depleta a camada de hidratao dos cidos nuclicos e expe as cargas negativas dos grupos fosfato. Contra-ons, como Na+ se ligam, aos grupos carregados reduzindo a fora repulsiva entre as cadeias polinucleotdicas, at o ponto em que possa se formar um precipitado. O precipitado se formar apenas se houver ctions monovalentes em

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quantidade suficiente para neutralizar das cargas dos grupos fosfato. A precipitao com etanol absoluto necessria para concentrar o DNA e para remover resduos de fenol e clorofrmio da soluo aquosa desproteinizada. Como a maioria dos solutos inorgnicos e molculas orgnicas pequenas so solveis em etanol 70%, a lavagem do precipitado com etanol-70% ir dessalinizar o DNA de forma eficiente. Embora tanto cloreto de sdio, como acetato de sdio e acetato de amnio sejam eficazes para precipitao do DNA, mais difcil remover NaCl, devido a sua menor solubilidade em etanol. O processo, ao final, fornece uma soluo de DNA

praticamente livre de eletrlitos (sais) o que ser necessrio quando o DNA for utilizado na presena de tampes cuja composio bem definida fundamental para o sucesso do procedimento. Finalmente o DNA, precipitado pelo etanol, dissolvido em gua.

Roteiro para a extrao com fenol-clorofrmio-lcool isoamlico Todo o processo dever ser executado em tubos de polipropileno (leitosos). Os de poliestireno (transparentes) no resistem ao fenol-clorofmio.
a) Adicione soluo de DNA, resultante dos processos de extrao, um volume

igual da mistura fenol-clorofrmio-lcool isoamlico (10:10:1). Misture bem, porm gentilmente, e centrifugue por 2 a 5 min (o tempo depender do volume: volumes menores, tempos mais curtos). b) Remova com cuidado a fase aquosa, que fica por cima, e a transfira para outro tubo. Se houver precipitado branco na interface repita a extrao com fenol-clorofrmioisoamil, exatamente como no passo anterior. c) Adicione fase aquosa, separada no passo anterior, um volume 10 vezes menor de soluo de acetato sdio 3M, pH 5,2, ou volume 10 vezes menor de NaCl 5M, ou ainda igual volume de acetato de amnia 4M. O acetato de amnia favorece a precipitao de fragmentos maiores de DNA, e deve ser usado quando se quer eliminar

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da amostra de DNA pequenos oligonucleotdeos (< 30 pb) que possam estar presentes1. c) Ao volume obtido aps a adio do acetato de sdio adicione agora 2 a 2,5 volumes de etanol absoluto gelado 2. Misture e incube em gelo seco por 5 min ou a 70oC por 15 minutos ou a -20oC por 30 min (esses so os tempos mnimos, sem limite para o mximo). d) Centrifugue por 5 minutos em centrfuga com rotor de ngulo fixo, em alta velocidade de rotao (10.000 a 14.000 rpm); remova o sobrenadante. e) Adicione 1 ml de etanol 70%. Misture invertendo a tubo vrias vezes e centrifugue como no passo anterior. Se o DNA a ser precipitado for pequeno (menos de 200 pares de base) faa a lavagem do pellet com etanol 95%. f) Remova o sobrenadante e seque o pellet de DNA g) Dissolva o pellet de DNA em um volume adequado de gua (a concentrao dever ser menor do que 1 mg/ml) para uso em outras manipulaes enzimticas; dissolva em TE, pH 8,0, para estocagem por por tempo indeterminado. Desproteinizao por prolas de vidro ou por slica-gel . A desproteinizao do DNA pode ser feita tambm com a utilizao de prolas de vidro (glass beads) ou partculas de slica-gel ativadas (5l para at 5g de DNA), que ligam o DNA na presena de iodeto de sdio (NaI, 6M, 3 volumes para 1 volume de soluo de DNA). O DNA ligado s prolas de vidro ou s partculas de slica-gel

lavado com soluo contendo Tris.Cl 20 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4, trs a quatro vezes para remover protenas, e em seguida eludo com gua ou TE pH 8.0 (0,5 g/l).

Referncias para protocolos de extrao de DNA na INERNET: http://www.stratagene.com/

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No use acetato de amnia quando o DNA tiver que ser fosforilado, porque o NH4+ inibe a enzima T4PNK. 2 A precipitao do DNA pode ser tambm feita com isopropanol (2-propanol). Neste caso usa-se volume de lcool igual ao da soluo aquosa. Iso pode ser vantajoso quando o volume de soluo aquosa grande e, com a adio do etanol, o volume final excede a capacidade do frasco. O isopropanol menos voltil e, com a adio do etanol, o volume final excede a capacidade do frasco. O isopropanol menos voltil que o etanol, levando mais tempo para evaporar. Alguns sais por serem menos solveis em isopropanol se precipitaro juntamente com os cidos nucleicos. Sero necessrias lavagens adicionais em etanol a 70% para a remoo dos sais contaminantes.

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http://www.promega.com/tbs http://www.highveld.com/protocols.html http://www.dynal.no/

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Extrao de RNA
Fundamentos
A maior dificuldade no processo de extrao de RNA evitar a ao das ribonucleases (RNases). Estas enzimas so muito estveis e no requerem cofatores para suas atividades. O primeiro passo para extrao de RNA, portanto, envolve a lise das clulas em um ambiente qumico que resulte em desnaturao de ribonucleases. Em seguida o RNA separado de outras macromolculas constituintes das clulas Alm de impedir a ao de ribonucleases provenientes das clulas das quais estamos extraindo o RNA, tem-se de evitar a introduo acidental de traos de RNAses, de outras fontes. O uso de luvas imprescindvel, pois a pele frequentemente contm bactrias e fungos que podem contaminar a preparao de RNA e serem fontes de RNAses. Evitar a contaminao com microorganismos obrigatrio quando se trabalha com RNA. Todo material de plstico utilizado tem de ser esterilizado, livre de RNases e no deve ser reutilizado. O material de vidro deve ser muito bem lavado, (tratado com DEPEC opcional), autoclavado e deixado em estufa a 180oC por pelo menos 8 horas ou 220oC por 2 horas. Caso os recipientes a serem utilizados sejam tratados com DEPEC, preencha-os com gua contendo dietil-pirocarbonato (DEPC) a 0,1%, que um potente inibidor de RNAses. Aps serem preenchidos com soluo de DEPC, esses recipientes devem ser incubados a 37C por pelo menos 2 horas, lavados vrias vezes com gua estril (gua-DEPC autoclavada) e aquecidos a 100C por 15 minutos ou autoclavados. Com estes procedimentos o DEPC removido por evaporao. Traos de DEPC

indevidamente persistentes nos frascos podem modificar resduos de purinas no RNA por carboximetilao, e, assim, inteferir na traduo do RNA in vitro. Traos de DEPC tambm podem inibir algumas enzimas. As cubas para eletroforese do RNA devem receber o seguinte tratamento: lavagem com soluo contendo detergente enxague com gua (Mili-Q) secagem com etanol (96%)

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preenchimento com soluo de gua oxigenada (H2O2) 3%. O contacto com gua oxigenada deve se estender por 10 min, em temperatura ambiente. enxague repetido bem com gua tratada com DEPC (0,1%) e autoclavada.

Os pipetadores devem ser reservados para uso exclusivo em preparaes de RNA. Se a exclusividade no for possvel, os pipetadores devem ser desmontados e tratados com um dos procedimentos acima para remoo de RNAses. As ponteiras e tubos Eppendorfs devem ser autoclavados e sem contaminao por RNAases; no devem ser reutilizados. A gua e todas as solues usadas para preparao de RNA devem ser tratadas previamente com DEPC (0,1%) e autoclavadas. Solues contendo Tris no devem ser tratadas com DEPC, porque Tris reage com DEPC, inativando-o. No entanto, as solues com Tris devem ser preparadas com gua previamente tratada com DEPC e autoclavada. A criteriosa observncia dos procedimentos que evitam a contaminao com RNAase e microorganismos garante a obteno de RNA ntegro e de boa qualidade ao final do processo de extrao.

Tcnicas para extrao de RNA

I. Extrao de RNA de clulas em cultura, leuccitos ou clulas de lavado bucal: A tcnica utiliza um detergente suave para promover a lise das clulas. O roteiro o que se segue 1. Lavar as clulas com PBS gelado (por 3 vezes) para remover meio de cultura ou outra soluo em que as clulas estiveram previamente. Para formar o pellet de clulas, centrifugue a 300g por 5 min. Partindo de clulas em cultura deve se ter um nmero de clulas em torno de 2 x 107. 2. Ressuspender as clulas em 375 l de soluo de lise gelada (composio dada abaixo). Aps agitao cuidadosa, mas vigorosa, a suspenso deve ficar transparente, indicando citlise. Composio da soluo para lise: Tris.Cl 10 mM

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NaCl 100 mM MgCl2 5 mM 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40 pH 8 (Prepare com gua-DEPC autoclavada e filtre para esterilizar) Se as clulas forem particularmente ricas em RNAses, use um inibidor de RNases, o inibidor de RNase de origem placentria (RNAsin), na concentrao de 1000 U/ml, ou o complexo vanadyl-ribonucleosideo, na concentrao de 10 mM.

3. Transferir as clulas lisadas para um tubo de microcentrfuga (1,5 ml) e centrifugue por 2 min a 4oC (14.000 rpm). 4. Transferir o sobrenadante para um outro tubo de microcentrfuga contendo 4 l de SDS 20%. Misture em um vtex. (O fluido sobrenadante o extrato citoplasmtico. levemente turvo, de cor tendendo a um branco amarelado. O pellet, que contm os ncleos e alguns debris celulares, deve ser branco e bem menor que o pellet de clulas inteiras) 5. Adicionar 2,5 l de proteinase K (20mg/ml). Incubar por 15 minutos a 37oC. 6. Adicionar 400 l de fenol-clorofrmio-lcool isoamlico (5:1:0,04). Agitar em vrtex vigorosamente. Centrifugar por 5 min ou mais a 4oC (14.000 rpm) (Se houver a formao de um precipitado muito espesso na interface, com escassa fase aquosa sobrenadante, centrifugar por mais alguns minutos; se ainda assim no for possvel separar a fase aquosa, remover a fase orgnica (de baixo) e adicionar mais 400 l de clorofrmio-lcool isoamlico (sem fenol). Agitar em vrtex e centrifugar por 2 minutos. Transferir a fase aquosa sobrenadante para outro tubo). 7. Repetir uma vez o procedimento de extrao com fenol-clorofrmio-lcool-isoamlico. 8. Fazer extrao com 400l de clorofrmio-lcool isoamlico. Transferir a fase aquosa sobrenadante para outro tubo. 9. Adicionar fase aquosa obtida (cerca de 400 l), 40 l (1/10 do volume de material) da soluo de acetato de sdio 3M, pH 5,2. Acrescentar 1 ml de etanol absoluto e misturar por inverso do frasco.

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10. Incubar em gelo por 30 minutos ou deixar no freezer, a -20oC durante a noite. 11. Recuperar o RNA centrifugando por 15 min a 4oC a 14.000 rpm. 12. Lavar o pellet com 1 ml de etanol 75% 13. Secar o pellet e ressuspend-lo em um volume de 50 a 100 l de gua-DEPC autoclavada. 14. Quantificar por espectrofotometria (A260). 15. Guardar o RNA em soluo em freezer a -70oC .

2. Extrao de RNA de clulas em cultura ou em tecidos Nesta tcnica as clulas ou tecidos so homogeneizados em meio com tiocianato de guanidina, um dos mais potentes desnaturantes de protenas. O mtodo se baseia na caracterstica do RNA de permanecer na soluo aquosa, contendo guanidine thyocianate 4M, pH 4, na presena da fase orgnica fenol/clorofrmio. Neste pH baixo, a maioria das protenas e pequenos fragmentos de DNA (5 a 10 kpb) permanecero na fase orgnica, enquanto que os fragmentos maiores de DNA e algumas protenas ficaro na interface. A fragmentao do DNA durante o processo de homogeneizao (em geral feito com Polytron) ajuda a remover o DNA da fase aquosa. Aps a homogeneizao em tiocianato de guanidina, o RNA pode tambm ser separado do DNA e das protenas por centrifugao em gradiente de cloreto de csio, explorando o fato de o RNA ser mais pesado que DNA e protenas. uma tcnica simples, com pouca manipulao da amostra, mas requer ultracentrifugao.

Tcnica Soluo de tiocianato de guanidina (GIT) 4M: GIT para 100 m de soluo: 47,26g Citrato de Sdio 1M, pH 7.0 - 2,5 ml Sarkosyl (N-laurylsarcosine) ) - 0,5% Completar para 100 ml com gua-DEPC autoclavada No momento do uso adicionar 8 l/ml de BetaMercapto Etanol (BME - Sigma)

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1. Adicionar 1 ml de GIT para cada 100g de tecido ou 107 clulas (cultura de clulas) e homogeneizar em Polytron (16.000 rpm/15 sec). 2. Adicionar 0,1 ml de acetato de sdio (2M, pH 4,0) para cada 1 ml de GIT adicionado anteriormente. Misturar muito bem. Adicionar 1 ml de fenol saturado com gua (pH 4,0) para cada 1 ml de GIT, e misturar vigorosamente. Adicionar 0,2 ml (para cada 1 ml de GIT) de clorofrmio-lcool isoamlico (24:1). Misturar muito bem em vrtex e incubar essa suspenso por 15 minutos em temperatura de 0 a 4 oC. 3. Centrifugar por 20 minutos a 4 oC, 10.000 rpm (alternativamente, 5.000 rpm por 45 minutos) . Transferir a fase aquosa sobrenadante (que deve ter o mesmo volume de GIT adicionado no incio) para um outro tubo. 4. Precipitar o RNA adicionando um volume igual de isopropanol 100%. Incubar a amostra por 20 min a -20oC. Centrifugar por 10 min a 4 oC, a 10.000 rpm. Desprezar o sobrenadante. 5. Dissolver o pellet de RNA em 0,3 ml de soluo desnaturante (GIT) e transferir para um tubo Eppendorf de 1,5 ml (se j no estiver em um Eppendorf). 6. Precipitar o RNA com igual volume (0,3 ml) de isopropanol 100% (20 min a -20oC). Centrifugar novamente por 10 min a 4 oC, 10.000 rpm. Descarte o sobrenadante e seque o pellet. 7. Dissolver o RNA em 50-100 l de H2O-DEPC autoclavada. Quantificar e armazenar a -70C.

Para verificar a pureza do RNA determinar a razo de absorbncia 260/280 (260 nm para cidos nucleicos e 280nm para protenas), que deve ser 1,8-1,9. Ao secar o pellet no permitir que esse seque completamente, o que dificultar muito a dissoluo do RNA. Se secar exageradamente, as protenas ainda presentes como contaminantes se dissolvero com maior facilidade que o RNA, o que resultar em baixas razes 260/280. A gua utilizada para diluir o RNA para espectrofotometria deve ter pH 7,5. pH cido afeta o espectro de absoro UV do RNA e diminui significativamente a razo 260/280. Ajuste o pH da gua para valores levemente alcalinos adicionando Na2HPO4 para uma concentrao final de 1 mM.

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3. Extrao de RNA de sangue: 1.100 l de sangue anticoagulado com 1 mL de tampo de lise de hemceas. Tampo de lise de hemceas: - Sacarose 1,6 M - Triron X-100 5% - MgCl2 25 mM - Tris.HCl 60 mM - pH 7,5

2. Deixe em temperatura ambiente agitando de vez em quando at que as clulas vermelhas tenham sido lisadas. 3. Centrifugue por 30s a 13.000g para separar leuccitos no pellet. Remova e descarte o sobrenadante. 4. Adicione 200 L de tampo de extrao e ressuspenda o pellet aspirando e ejetando de uma seringa com agulha fina, vrias vezes. Tampo de extrao: - Guanidinium tiocianato 5,25 M - Tris.HCl 50 mM, pH 6,4 - EDTA 20 mM - Triton X-100 1% - -mercaptoethanol 0,1 M 5. Adicione 20 L de acetato de sdio (2 M, pH 4,0) e misture por inverso. 6. Adicine 220 L de phenol e misture por inverso. 7. Adicione 60 L de chloroform/isoamyl alcohol (24:1) e vortex vigorasamente. 8. Ponha no gelo por 15min. 9. Centrifugue a 12.000g por 5 min e transfira a o sobrenadante para um novo tubo. 10. Adicione 200 L de isopropanol gelado, misture e ponha no freezer a -20oCpor 30 min. 11. Centrifugue a 12.000g por 15 min e descarte o sobrenadante. 12. Ressuspenda o pellet em 200 L de tampo de extrao.

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13. Repita os passos de 3 a 9. 14. Lave o pellet com 400 L de etanol-70% gelado. 15. Centrifugue a 12.000g por 5 min e descarte o sobrenadante. 16. Remova o etanol completamente (com micropipeta e secando o restante com leno de papel para laboratrio). 17.Ressuspenda em 100 mL de H2O (deixe a 50oC por 15 min para dissolver o pellet). Como pode ser observado, os diferentes protocolos tm muito em comum. Certamente, voc poder fazer adaptaes no protocolo dependendo dos resultados que obtiver.

Eletroforese em gel de agarose:

Sob influncia de uma diferena de potencial eltrico tomos, molculas e partculas com carga, em soluo aquosa, migram na direo do eletrdio com carga oposta. Como as molculas tm cargas e massas variveis, a migrao em um meio de viscosidade definida se dar em diferentes velocidades, com separao das vrias fraes de uma mistura. A mobilidade eletrofortica, que a velocidade de migrao por unidade de campo eltrico, um parmetro caracterstico da molcula em um determinado meio de eletroforese. Este parmetro depende da densidade de cargas da molcula e do seu

tamanho. Depende, portanto, do pK do grupo ionizvel e do pH do tampo que disssolve a amostra. Como a viscosidade do gel determina o atrito, limitando a velocidade de propagao, a mobilidade eletrofortica ser dependente da temperatura. O que normalmente analisamos a mobilidade eletrofortica relativa da molcula, comparandose as distncias de migrao com as de uma substncia padro, aplicada na mesma corrida eletrofortica. Estas substncias constituiro marcadores que tornam a avaliao da separao eletrofortica relativamente independente de variaes na diferena de potencial eltrico e do tempo de eletroforese.

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As amostras para eletroforese no podero conter partculas grandes ou gotculas de leo em suspenso, pois estas interferem com a separao por bloquear os poros da matriz de eletroforese. Pode-se centrifugar as solues antes de coloc-las no gel. Separar substncias que tm ou cargas positivas ou cargas negativas, como os cidos nucleicos, que s tm cargas negativas, no constitui, em geral, problema. As molculas como as protenas cuja carga resultante dependente do pH do meio tero as migraes eletroforticas fortemente influenciadas pelo pH do tampo. A fora inica (concentrao total de ons) do tampo utilizado deve ser to baixa quanto possvel (o mnimo que garanta um pH constante), reduzindo-se, desta forma, as correntes inicas que fluem pelo gel e a dissipao trmica excessiva (lembrar que os ons que constituem o tampo tambm migram eletroforeticamente, contribuindo para a corrente total). Quem j se confundiu com os tampes, colocando na cuba de eletroforese 2 X SSC (SSC - tampo usado para Nothern e Southern blot), sabe o quanto aquece o gel e do tampo. A voltagem deve ser 1 a 5 Volts/cm (distncia entre os dois eletrodos). Para se avaliar o progresso da separao e reconhecer o fim da corrida, corantes com alta mobilidade eletrofortica so adicionados juntamente com a amostra. A matriz do gel de eletroforese deve ter poros de tamanhos regulares e ajustveis, deve ser quimicamente inerte. A eletro-osmose, que o arraste do solvente pela migrao eletrofortica do soluto, quando os poros so pequenos, no deve ocorrer, pois alteraria a mobilidade dos ons. Os gis de agarose, um polissardeo extrado de algas marinhas, so adequados para separar molculas com dimetro igual ou superior a 10 nm. Com a remoo da agaropectina, se obtm tipos de agarose com diferentes graus de pureza e de eletrosmose. As diferentes agaroses se caracterizam pelo seu ponto de fuso (melting point), que pode variar entre 35oC e 95oC e pelo grau de eletrosmose (mr), que depende do nmero de grupos polares que persistem aps a purificao. O tamanho dos poros depende da concentrao de agarose. A concentrao em geral dada como peso de agarose por volume de gua. Em geral, gis a 1% tm poros em torno de 150 nm e gis a 0,16% tm poros em torno de 500 nm. A agarose dissolvida em gua fervendo e forma um gel quando esfria. Durante esse processo h

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formao de duplas hlices que se juntam lateralmente, de modo a formar filamentos finos. Durante a geleificao h formao de polmeros. Eletroforese em gel de agarose o mtodo de escolha para separao, purificao e identificao DNA e RNA. So utilizados, para isso, gis horizontais, submarinos: o gel fica diretamente mergulhado no tampo. O nvel do tampo deve ser 3 a 5 mm acima do gel. Excesso de tampo resulta em aquecimento. O gel de agarose tem menor resoluo que o de acrilamida (que veremos posteriormente), mas tem uma faixa de separao maior (entre 200 pb e cerca de 50 kpb).

Colorao de cidos nuclicos no gel de agarose:

O DNA ou o RNA podem ser facilmente visualizados pela colorao com brometo de etdeo (EthB) em baixas concentraes. O brometo de etdeo um corante flourescente, excitado por luz ultravioleta, que se intercala entre as fitas da dupla hlice de DNA ou de segmentos antiparalelos complementares dentro de uma mesma molcula de RNA (que fita simples). Quando desejamos diferenciar a migrao eletrofortica de fragmentos de DNA parecidos, melhor fazer a colorao do gel aps amigrao, porque o EthB intercalado na fitas de DNA modificam levemente a migrao. O DNA ou o RNA podem ser revelados colocando-se o gel no transiluminador com luz ultravioleta (254 nm). De 1 a 10 ng de DNA ou RNA so necessrios para um sinal que se possa perceber a vista desarmada. Justamente por se intercalar entre fitas da dupla hlice, o brometo de etdeo um agente mutagnico e deve ser sempre manuseado com luvas, evitando-se qualquer tipo de contaminao do pesquisador. O lixo contendo brometo de etdeo tambm necessita tratamento especial, que comentaremos posteriormente. Uma alternativa ao brometo de etdeo o corante SYBR Green I (para DNA) e SYBR Green II (para RNA) - da Molecular Probes, que pode ser utilizado tanto em gel de agarose como de poliacrilamida. Este corante pode detectar at 20 pg de DNA-dupla fita e at 100 pg de RNA ou de DNA-fita simples. A excitao mxima obtida a 497nm; em 254 nm a sensibilidade cerca de 3 a 5 vezes menor. A emisso tem o pico em 520 nm. O que torna o SYBR green superior ao brometo de etdeo a sensibilidade de 50 a 100 vezes maior, podendo detectar 1-2 ng de oligonucleotdeos em gel de

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poliacrilamida 5% (UV/450 nm). O SYBR Green tem excepcional afinidade por DNA e apresenta um grande aumento de fluorescncia aps a ligao. muito menos mutagnico que o brometo de etdeo, mas como ainda so poucos os dados referentes a sua mutagenicidade.

Tcnica para eletroforese de DNA

Tampes: Podem ser usados o TBE (Tris/base-Borato-EDTA) ou TAE (Tri/AcetatoEDTA). Utilizamos na rotina de nosso laboratrio o TBE que tem maior capacidade

tamponante. Ao preparar as solues de tampo use gua destilada e deionizada, proveniente de um sistema de purificao tipo Nono-Pure ou MiliQ. Soluo estoque de TBE concentrada em 10 vezes (por litro): 108g de Tris base/l (890 mM) 55g de cido brico/l (890 mM) 40 ml de EDTA 0,5 M - pH 8,0 (20 mM) Concentrao de trabalho: diluir 10. diluies de 20 vezes, sem problemas. tende a produzir precipitao dos sais. estoque 5 vezes concentrado. Para gel de agarose pode-se usar

A concentrao elevada da soluo estoque Pode-se, para evit-la, preparar solues

Soluo estoque de TAE concentrada 50 vezes (para 1 l): 242g de Tris base 57,1 ml de cido ctico glacial (Tris.acetato 2M) 37,2g de Na2EDTA.2H20 (100 mM) H2O para 1 l Concentrao de trabalho: diluir 50 vezes (40 mM Tris.acetato; 2 mM Na2EDTA.2H2O; pH ~8,5) TAE tem menor poder tamponante, e a capcidade de tamponamento pode se esgotar se o tempo de eletroforese for muito longo.

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Preparao do gel de agarose a 1 % 1. Adicione 100 ml de TBE ou TAE a 1g de DNA Typing Grade Agarose. 2. Misture e aquea no forno de micro-ondas por tempo de 1 min a 1 min e 30 seg. 3. Misture, agitando levemente o frasco, e verifique se no h fragmentos ntegros de agarose. Se houver aquea por mais alguns segundos. 4. Coloque a agarose fundida num cilindro graduado de 100 ml e complete o volume com gua (alguma gua ter evaporado) 5. Retorne a agarose para o frasco anterior e adicione 5 l de soluo de Brometo de Etdeo (10mg/ml). Se for corar com SYBER Green, no execute este passo. 6. Coloque a agarose na bandeja de eletroforese previamente vedada e com o pente que formar as pocinhas onde sero colocadas as amostras de DNA. 7 . Deixe esfriar. Prepare 1 l de TBE ou TAE para cobrir o gel de agarose na cuba de eletroforese.

Preparo da amostra de DNA: 1. Separe o volume da amostra de DNA a ser colocado no gel de eletroforese (de acordo com a quantificao feita previamente) 2. Acrescente gua (MilliQ-autoclavada) at o volume final desejado (por ex.: 18 l) 3. Acrescente o loading buffer concentrado 10 vezes, de modo a dilu-lo para concentrao de trabalho (no exemplo: 2 ul). Loading Buffer: Para que a amostra de DNA permanea nas poas do gel de agarose (visveis quando se retira o pente que serve de molde), necessrio que se acrescente a ela algo que a torne mais densa que o tampo de corrida (ex: Ficoll 400, glicerol ou sacarose). Alm disso, acrescentamos um ou dois corantes de elevada mobilidade eletrofortica, que nos fornecer informao sobre o andamento da eletroforese, indicando o momento de interromp-la. Se sua banda migra junto com o corante dificultando sua visualizao, dilua o "loading buffer" em glicerol-30, 1:5.

Protocolos

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1- 5ml de loading buffer concentrado 10 vezes: 1 ml de EDTA 0,5 M - pH 8,0 (100 mM EDTA) 2,5 ml de glicerol (50%) 0,025g de azul de bromofenol (0,5%)

ou 2- loading buffer com TAE - concentrado 2 vezes: 2X TAE buffer pH 8,3 20 Mm EDTA 5% Ficoll 400 0,1% azul de bromofenol

Coloque a amostra no gel, sempre ao lado de um marcador de peso molecular que deve ser preparado do mesmo modo que sua amostra. Desligue a eletroforese quando o azul de bromofenol tiver percorrido cerca de 2/3 do gel ou mais. Se tiver colocado brometo de etdeo no gel, visualise o DNA no transiluminador UV e fotografe (Polaroid, filme 667 branco e preto). Utilize uma rgua transparente a UV durante a fotografia, para marcar a posio dos marcadores de peso molecular aps transferncia do DNA para a membrana, no passo posterior (Southern blot). Se utilizar SYBR Green, dilua-o a 1:10.000 em TE (10 mM Tris.HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), em TBE ou emTAE, pH entre 7,5 e 8,0 (preferencialmente 8,0). Cubra o gel com o corante diludo por 10-40 min, dependendo da espessura do gel. Remova o gel do corante, visualise o DNA no transiluminador UV (254 nm) e fotografe, ou faa o scanning do gel no STORM (Molecular Dynamic), se dispuser desse equipamento.

Quando se pretende fazer uma anlise posterior dos fragmentos de DNA, separados por eletroforese, necessrio transfer-los para uma membrana (nylon) para posterior hibridizao com sonda especfica (ver protocolo de Southern blot mais adiante).

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Tcnica para eletroforese de RNA:

Fundamentos Para a eletroforese de RNA o tampo usualmente utilizado o MOPS (3-(Nmorpholino)-propanesulfonic acid), pH 7,0 (o RNA facilmente hidrolizado em meio alcalino). Como o objetivo mais freqente transferir o RNA para uma membrana (northern-blot), para posterior anlise com sondas especficas, a eletroforese efeita em condies desnaturantes, porque embora a molcula de RNA tenha uma nica fita, dupla hlice de segmentos antiparalelos complementares so freqentes e sua persistncia ir dificultar a ligao do RNA membrana, assim como a hibridizao da sonda com a molcula de RNA que est sendo analisada. O agente desnaturante mais freqentemente utilizado o formaldedo (embora existam outras opes, como o glioxal).

Tcnica Soluo estoque de MOPS (10X): 0,4M MOPS, pH 7,0 0,1M acetato de sdio 0,1M EDTA Preparao da soluo A 400 ml de H20-DEPC (autoclavada) adicione 20,9g de MOPS 8,3 ml de acetato de sdio 3M - pH 5,2 (soluo tratada com DEPC e autoclavada) Ajuste o pH para 7,0 com pellets de NaOH Eleve o volume final para 500ml Esterilize por filtrao ou autoclave (se autoclavar, a soluo ficar amarelada, o que normal). Armazene a soluo protegida da luz (envolva o frasco em papel alumnio)

Gel de agarose:

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1. 1,0 a 1,5 g de agarose 2. 10 ml de 10X MOPS 3. 87 ml de H2O-DEPC autoclavada 4. Dissolva a agarose, aquecendo em forno de micro-ondas 5. Deixe esfriar em banho-maria a 50oC 6. Adicione 5,1 ml de formaldedo a 37% (em capela para produtos qumicos txicos) 7. Homogeinize muito bem evitando formar bolhas 8. Coloque na bandeija de eletroforese, j com o pente, e deixe esfriar. (A cuba de eletroforese, a bandeja o pente devem ser previamente tratados para eliminar quaquer contaminao com RNase, como previamente descrito).

Loading buffer para RNA (1 ml) 1. 0,75 ml de formamida pura (deionizada) 2. 0,15 ml de 10X MOPS 3. 0,24 ml de formaldedo 37% 4. 0,1 ml de H2O-DEPC autoclavada 5. 0,1 ml de glicerol (autoclavado)

Preparo da amostra para eletroforese: 1. Separe as alquotas de RNA a serem submetidas a eletroforese, de acordo com a quantificao feita previamente. 2. Se o volume por superior a 5 l, reduza-o a 5l no dessecador a vcuo. Se for inferior a 5 l, complete com gua para 5 l. 3. Adicione 25 l de loading buffer 4. Aquea a 65C por 15 min (para desnaturar) e ponha em seguida no gelo. 5. Se for corar com brometo de etdeo, acrescente amostra 1 l de soluo de brometo de etdeo (1mg/ml) em H2O-DEPC autoclavada. Se for corar com SYBR Green, coloque a amostra nas poas do gel, previamente coberto com tampo MOPS 1X (diludo em H2O-DEPC autoclavada), sem a adio do brometo de etdeo.

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6. No obrigatrio o uso de marcador de peso molecular para RNA, porque como se trata de RNA total, os RNAs ribossmicos, muito abundantes, servem para indicar o tamanho das molculas em cada posio (rRNA 28S ~ 5kb; rRNA 18S ~ 2kb). 7. Corra a eletroforese at o corante percorrer 2/3 a 3/4 da extenso do gel. 8. Visulize no transiluminador UV e fotografe (utilize uma rgua transparente a UV durante a fotografia, para definir a posio das molculas de RNA), ou 9. Core com SYBER Green II, do mesmo modo descrito para DNA. visualize no transiluminador ou faa o scanning no STORM.

Se desejar, transfira o RNA para membrana de nylon (northern-blot). O gel til para se verificar a integridade do RNA (avaliada pelo aspecto do RNA ribossomal) que, na rea de diagnstico, quase sempre ser usado para transcrio reversa e PCR (RT-PCR).

Transferncia para membrana (Southern-blot):

Southern-blotting a transferncia de fragmentos de DNA do gel de eletroforese para uma membrana que serve de suporte. A transferncia e o tratamento subseqente (secagem e exposio a luz ultravioleta) resultam em imobilizao de fragmentos de DNA na membrana, de forma semi-permanente. Aps a imobilizao, o DNA pode ser submetido a anlise por hibridizao, que permite a identificao de bandas contendo molculas de DNA similares molcula de cido nucleico utilizada como sonda. Os tipos de membrana mais comumente utilizadas so as de nitrocelulose e as membranas de nylon, com ou sem cargas positivas. As membranas de nylon so mais freqentemente empregadas porque so mais resistentes, permitindo o uso sucessivo de vrias sondas. A membrana de nitrocelulose, no entanto, em algumas situaes pode fornecer menos background (ligao inespecfica da sonda).

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O mtodo bsico de transferncia a transferncia por capilaridade, usando um tampo com elevada concentrao de sal, o que permite a ligao do DNA membrana. Na presena de elevada concentrao de sal o DNA fica preso membrana durante a transferncia, mas no de forma permanente. A imobilizao permanente (ou semipermanente) obtida pela exposio a luz UV (membrana de nylon, com a qual o DNA estabelece ligaes covalentes) ou secagem prolongada (2 horas) em forno vcuo a 80oC (membrana de nitrocelulose, com a qual o DNA estabelece interao hidrofbica relativamente fraca, no covalente). O protocolo de transferncia dividido em trs etapas: 1. O gel de agarose tratado com solues que promovem a despurinao (necessria apenas quando se pretende transferir eficientemente molculas maiores que 5 kpb; esse procedimento remove purinas introduzindo nicks nas fitas de DNA), desnaturao (separao das fitas da dupla hlice, fundamental para que o DNA se ligue membrana e sonda) e neutralizao (quando o pH do gel cai a valores menores que 9, o que fundamental para que o DNA se ligue membrana). 2. A segunda etapa a transferncia propriamente dita. 3. Finalmente, o DNA imobilizado na membrana.

Despurinao: tratamento com HCl - 0,25M. Deixe o gel mergulhado nessa soluo, sob agitao leve e contnua, por 30 minutos, temperatura ambiente (TA).

Desnaturao: tratamento com soluo de NaCl 1,5M/NaOH 0,5M Deixe o gel mergulhado nessa soluo, sob agitao leve e contnua, por 20 minutos (TA)

Neutralizao: tratamento com soluo de NaCl 1,5M/Tris.Cl 0,5M, pH 7,0. descarte a soluo denaturante e enxague o gel com gua MiliQ. Em seguida deixe o gel mergulhado na soluo de neutralizao por 20 minutos. Troque a soluo e lave por mais 20 minutos.

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A transferncia propriamente dita feita promovendo o fluxo de um tampo (20X SSC ou 10X SSC) atravs do gel, em direo membrana, de modo que o fluxo dessa soluo arraste as molculas de DNA que ficam depositadas na membrana, j que no a podem atravessr (poros de 0,45 um). Esse fluxo induzido aplicando-se uma camada espessa de papel absorvente sobre a membrana que est em contado com o gel (ver esquema da montagem), ou por aplicao de presso negativa que fora a passagem do tampo atravs do gel e da membrana. 20X SSC: NaCl - 3 M Na3-citrato - 0,3 M Ajuste o pH PARA 7,0 com 1 N HCl Autoclave e estoque em temperatura ambiente.

A transferncia por capilaridade demora de 15 a 16 horas e a transferncia por presso negativa, bem menos demorada, demanda 1 hora. Concluda a transferncia, a membrana removida aps a marcao das posies correspondentes s poas do gel de agarose (assim se poder medir a distncia de migrao e comparar com a fotografia do gel, que foi feita com este ao lado de uma rgua), e lavada em soluo 2X SSC por 5 min, para remover o excesso de sal e vestgios de agarose. Em seguida a membrana colocada entre dois pedaos de papel de filtro (3MM-Watmann) e submetida a secagem em forno, a 80oC, por 20 minutos, para fixao por UV, ou por 2 horas, se no se usar UV. Terminado esse passo, a membrana est pronta para hibridizao com uma sonda especfica, e pode ser guardada por tempo indeterminado, em ambiente bem sco. Fixao por UV: Expe-se a membrana a 70.000 microjoules/cm2 de radiao UV, 254 nm, por 2 a 3 minutos (UV crosslinker - Amersham).

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Estratgias de Hibridizao:
Definies importantes: DNA com cpia nica: so as seqncias de DNA que ocorrem uma s vez no genoma haplide (na verdade, nessa definio podem estar includas seqncias com um nmero muito pequeno de cpias). Seqncias repetidas de DNA: seqncias que ocorrem vrias vezes. Complexidade: descreve o total de seqncias diferentes em uma amostra de cidos nuclicos; isto , seqncias que no pareiam entre si nas condies experimentais utlizadas. Quando se trata de RNA, complexidade tem o mesmo significado, independente da abundncia de cada transcrito. Desnaturao: separao de seqncias complementares de cidos nuclicos. Reassociao ou renaturao: o restabelecimento de pontes de H+ entre duas seqncias complementares, previamente separadas. Estringncia: se refere s condies fsicas em que a desnaturao ou a renaturao ocorre. Os fatores fsicos que interferem com a estringncia sero discutidos adiante. Zippering: descreve o fenmeno que ocorre logo aps o incio da reassociao. H formao de um ncleo de reassociao seguida de rapidssimo pareamento do restante da seqncia. Hibridizao: utilizado atualmente para descrever o pareamento de bases (formao de duplexes) entre seqncias especficas, a partir de qualquer combinao de fragmentos de cidos nuclicos (DNA ou RNA), usualmente in vitro. Melting Temperature (Tm): a temperatura na qual as fitas de cidos nuclicos que se pareiam entre si esto desnaturadas em 50%. um parmetro til para avaliao da estabilidade da dupla-fita (seja DNA-DNA, DNA-RNA ou RNA-RNA).

Fatores que afetam a velocidade de reassociao 1. Temperatura: a velocidade mxima alcanada a cerca de 25oC abaixo do Tm. 2. Concentrao do sal: em concentrao NaCl abaixo de 0,1 M, um aumento de 2 vezes na concentrao aumenta a velocidade de reassociao entre 5 e 10 vezes. A velocidade

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continua a subir at concentrao de sal de cerca de 1,2 M, que corresponde a cerca de 7 vezes a concentrao numa situao padro. Ctions divalentes, que esto frequentemente presentes como impurezas nas solues, tm um efeito muito mais intenso que os ctions monovalentes, tornando necessrio o uso de EDTA como quelante em situaes em que se deseja uma estringncia elevada. 3. Pareamentos imperfeitos (mismatch): para cada 10% de pareamentos imperfeitos a velocidade de reassociao reduzida de um fator de aprox. 2 vezes, quando a reao ocorre em temperaturas 25oC abaixo do Tm. 4 .Comprimento do fragmento: 4.1. Reassociao de DNA-DNA: a velocidade de zippering muito rpida quando comparada velocidade de formao do pareamento inicial (nucleao). Se os fragmentos complementares so do mesmo tamanho, a velocidade de reassociao se eleva com a raiz quadrada do comprimento (nmero de bases), relao vlida para fragmentos entre 100 e 100.000 pb. Isso aparentemente se relaciona com o maior nmero de possibilidades de nucleao, contrabalanado pela maior restrio espacial oferecida pelos fragmentos maiores. Quando os dois fragmentos so de tamanhos diferentes, o efeito do comprimento sobre a velocidae de reassociao depende de qual fragmento est presente em excesso. Se fragmento em excesso o curto, a velocidade de reassociao aumenta com o tamanho do fragmento escasso. Se ocorre o contrrio, h uma inesperada reduo na velocidade de reassociao. 4.2. Reassociao de RNA-DNA: na reao com excesso de DNA, a velocidade de reassociao cerca de 4 a 5 vezes menor do que a da interao DNA-DNA. 5. Viscosidade: quando se considera o efeito da viscosidade, deve-se distinguir entre viscosidade microscpica e macroscpica. Viscosidade microscpica se refere ao micro ambiente em torno do DNA e comumente alterada pela adio de sacarose, glicerol ou perclorato de sdio. A macroviscosidade depende da presena de polmeros (entre eles o prprio DNA). Aa viscosidade, medida em viscosmetro, inclui ambas, a micro e a macroviscosidade. Na presena de sacarose, glicerol, etilenoglicol e perclorato de sdio, a velocidade de reassociao do DNA inversamente proporcional viscosidade. O aumento da macroviscosidade (presena de ficoll ou dextran sulfato), por outro lado, aumenta a velocidade de reassociao, porque provoca um aumento efetivo na

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concentrao de cido nucleico em soluo. 6. Composio de bases: praticamente no tem efeito sobre a velocidade da reassociao. 7. Agentes desnaturantes: em soluo aquosa, a velocidade ideal de reassociao de cidos nuclicos ocorre em temperaturas entre 60oC e 75oC. No entanto, extensos perodos de incubao nessas temperaturas podem levar a considervel quebra das molculas de cidos nucleicos, por agitao trmica. Para reduzir a temperatura, mantendo a estringncia, pode-se introduzir agentes desnaturantes, como a formamida, que desestabilizam a dupla hlice, o que reduz a velocidade de reassociao. Adio de 1% de formamida reduz o Tm em 0,72 oC e a velocidade de reassociao em cerca de 1,1%. A reduo na velocidade de reassociao se deve a aumento da microviscosidade. A comparao da taxa de degradao de DNA observada em soluo aquosa, em temperatura elevada, com a observada com formamida a baixa temperatura, mostra que a reduo na degradao compensa, em muito, a reduo na velocidade de renaturao. Para hbridos RNA-DNA a relao entre concentrao de formamida e reduo no Tm no linear. Na presena de formamida 50%, a estabilidade do hbrido RNA-DNA maior que a da dupla hlice de DNA. Essa uma vantagem que pode ser explorada em tcnicas de microscopia, nas quais se pretende a pareamento in situ com RNA mas no com DNA.

Fatores que interferem com a estabilidade da dupla hlice 1. Pareamentos imperfeitos (mismatch): 1% de mismatch reduz a estabilidade trmica em cerca de 1oC (avaliado pelo Tm). 2. Comprimento do fragmento: Quanto maior o fragmento, maior a estabilidade da dupla hlice. 3. Concentrao de sal: na faixa de concentrao de 0,01-0,1M, o Tm muda cerca de 16C para cada 10 vezes de variao na concentrao de sal. O efeito menor em concentraes mais elevadas (1M). Os ction divalentes tm um efeito muito mais intenso que os monovalentes sobre o Tm. 4. Composio das bases: como o pareamento GC mais estvel (3 pontes de H) que o pareamento AT (2 pontes de H), o Tm de uma dupla-hlice est realcionado com contedo de GC de acordo com a equao emprica:

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Tm = 0,41 (%GC) + 69,3 O efeito da composio das bases, no entanto, pode ser eliminado na presena de alguns solventes caotrpicos (por exemplo, o: cloreto de tetrametilamnio 2,4 M). 5. Criterion: essa palavra descreve o limite mnimo de fidelidade do pareamento de bases e comprimento da duplex, estabelecido pelas condies de incubao. Na presena de tetrametilamnio, situao em que variaes no Tm, decorrentes da composio das bases, so eliminadas, o criterion pode ser definido com preciso de 1oC. A temperatura de incubao (Ti) para a hibridizao ideal de uma sonda pode ser calculada pela equao emprica: Ti = Tm - 15C Tm = 16,6 log[M] + 0,41[Pgc] + 81,5 - Pm - B/L - 0,65[Pf] Onde: M - concentrao molar de Na+, at um mximo de 0,5M (1 X SSC contm 0,165M de Na+) Pgc - a porcentagem de bases G e C na sonda Pm - a porcentagem de mismatched bases Pf - a porcentagem de formamida B - 675 para sondas de at 100 bases L - o comprimento da sonda em nmero de bases Obviamente, essa frmula serve como uma orientao incial, no substituindo o teste empirico, no laboratrio.

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Marcao de cidos nucleicos a serem utilizados como sondas: Marcao com istopo radioativo: Escolha do istopo:
32P

meia-vida: 14,3 dias tipo de decaimento: beta energia: alta

33P:

meia vida: tipo de deacimento: beta energia: mdia

35S:

meia vida - ~75 dias tipo de decaimento: beta energia: baixa

125I:

meia-vida - 60 dias tipo de decaimento: gama energia: mdia

3H:

meia-vida: 12,35 anos tipo de decaimento: beta energia: baixa

Mtodos de marcao: 1- Nick-translation: Esse processo utiliza DNAase I para gerar quebras (nicks) em cada fita da dupla fita de DNA. As aes de exonuclease 5-> 3 e de polimerase 5->3da DNA polimerase I de E. coli so usadas para remover trechos de DNA a partir das quebras e substitu-los por segmentos de DNA-fita nica, marcados pela incorporao de desoxirribonucleotdeos
125I, 3H

com

tomos

radioativos.

Pode-se

utilizar

qualquer

desoxirribonucleotdeo marcado com

32P, 35S

na posio alfa. Nucleotdoes marcados

ou biotina tambm podem ser incorporados.

2- Random oligonucleotide-primed labelling 3- Marcao com T4 DNA polimerase:

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A T4 DNA polimerase possui atividade de exonuclease 3->5 e atividade de polimerase 5->3. Na ausncia de fosfato de desoxirribonucleosdeos exgenos verificase apenas a atividade de exonuclease que, em condies normais (temperatura e tampo adequados), remove cerca de 25 nucletdeos/min. Quando os nucleotdeos so adicionados, a atividade de polimerase predomina, e a extremidade previamente removida preenchida, agora com um ou mais desoxirribonucleotdeos marcados.

4- Marcao da extremidade com T4 polinucleotdeo quinase (T4 PNK): A polinucleotdeo quinase usada para transferir o fosfato gama do ATP para o grupo 5OH livre na extremidade da molcula de DNA ou RNA. Essa enzima tem tambm uma atividade fosfatsica. Duas reaes so, portanto, possveis: a)forward reaction em que a enzima cataliza a fosforilao, aps remoo do fosfato do terminal 5 com fosfatase alcalina, e b) exchange reaction em que a enzima cataliza a troca de um fosfato 5 previamente existente pelo fosfato gama do ATP. A reao de troca tem que ser realizada na presena de excesso de ATP e ADP, para que se consiga uma fosforilao adequada. Ambas as reaes so mais eficientes quando o DNA tem extremidade 5 protusa. A extremidade 5 recuada fosforilada com muito menor eficincia. Extremidades rombas (blunt) so marcadas com eficincia intermediria. O RNA mais eficientemente marcado pela T4 PNK aps clivagem da base com NaOH.

5- Marcao da extremidade com desoxinucleotidil transferase terminal (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase - TDT) Essa enzima adiciona desoxinucleotdeos na extremidade 3 dos fragmentos de DNA. Tanto DNA-fita dupla como DNA-fita nica so substratos, na presena de cobalto como co-fator. At mesmo a extremidade 3 recuada substrato. Para evitar a formao de caudas de homopolmeros com comprimento varivel pode-se usar um anlogo do nucleotdeo que tenha o oxignio do grupo 3OH removido (alfa32Pcordycepin trifosfato).

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6- Marcao da extremidade com o fragmento grande da DNA polimerase I de E. coli (Klenow fragment) O fragmento Klenow da DNA polimerase I de E. coli, que tem atividade de polimerase 5-> 3, pode ser usada para preencher extremidades 3 recuadas, que ocorram naturalmente, ou que foram geradas por enzimas de restrio, tornando a extremidade romba. Para isso se usa um ou mais dos desoxirribonucleotdeos marcados a serem incorpoarados.

7- Uso de exonuclease III para criar extremidades 5 protusas (ou 3 recuadas): uma alternativa utilizao de T4 DNA polimerase.

Sistemas especiais de clonagem para marcao de cidos nucleicos com alta atividade especfica: 1- Sonda universal com plasmdeo M13: O DNA a ser utilizado como sonda deve ser clonado nas sries pares dos vetores M13 (por ex.: M13mp8), pelas tcnicas usuais de clonagem em plasmdeo.. Um oligonucleotdeo de 13 mer (5 GAAATTGTTATCC 3), complementar a um segmento do plasmdeo, localizado na regio 5 que flanqueia o stio de mltiplos pontos de clonagem deste (multiple cloning site), usado como primer universal para sntese da fita marcada complementar (fita (-)) seqencia da fita (+) do plasmdeo, feita pelo fragmento Klenow da DNA polimerase I de E. coli. A sntese da fita minus (-) no completa, de tal modo que a insero especfica no stio de clonagem permanece como fita nica, e, portanto, disponvel para a hibridizao com a seqncia complementar que se deseja localizar. 2 - Sistema utilizando T3 e T7 RNA polimerase ou SP6 RNA polimerase O fragmento de DNA a ser utilizado como sonda inserido no vetor plasmdeo SP6, derivado do pBR322, no qual foi inserido o gene da RNA polimerase SP6 (fago de Samonella) e seu promotor. Algumas bases adiante do promotor est o mltiplo stio de clonagem, onde inserido o DNA de interesse.

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Outra possibilidade, mais verstil que a anterior devido existncias de dois promotores, a insero do segmento de interesse no plasmdeo Blue Script, cujo mltiplo stio de clonagem flanqueado pelos promotores das RNA polimerases T3 e T7. Uma vez inserido o fragmento de DNA que servir como sonda, o plasmdeo linearizado, utilizando uma enzima de restrio que corte imediatamente aps, ou bem na extremidade da seqncia especfica clonada, e em seguida porcede-se sntese do RNA complementar, marcado com [alfa 32P]rNTP. Esse sistema porque fornece uma grande quantidade de transcrito marcado (at 10 g para cada 1g de template), com elevada atividade especfica. O inconveniente a instabilidade do RNA. A sonda deve ser tratada com todos cuidados dispensados ao manuseio de molculas de RNA. No se presta tambm a hibridizao in situ, devido facilidade de degradao.

Marcao no radioativa de cidos nucleicos: Essas sondas eliminam os cuidados relacionados ao uso de radioistopos e tm a vantagem adicional de serem estveis, podendo ser estocadas por perodos de 6 meses a 2 anos. Embora vrios tipos de marcadores no radioativos tenham sido descritos na literatura, a biotina (GIBCO-BRL e outros) e digoxigenina (Boehringer Mannhein) so os mais comumente utilizados e esto disponveis comercialmente. Ambos podem ser facilmente incorporados em sondas de DNA e ser detectados com os sistemas de deteco que comentaremos em seguida. Os desoxinucleotdeos marcados com biotina podem ser detectados por complexos contendo avidina ou streptavidina, molculas que apresentam alta afinidade por biotina. A avidina uma glicoprotena (68.000 Da) derivada da clara do ovo, e a streptavidina uma protena (60.000 Da) do Streptomyces avidinii. A avidina ou a streptavidina podem estar ligadas a uma enzima, como a fosfatase alcalina, podendo esta ser detectada pela adio de um substrato que resulte em um produto colorido, insolvel. O sistema de deteco pode envolver, alternativamente, a utilizao de um anticorpo

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anti-biotina, anti-avidina, anti-streptavidina, ou ainda anti-digoxigenina, seguida de um anticorpo secundrio conjugado a um fluorocromo ou a uma enzima. Quando se usa anticorpo anti-biotina, o bloqueio da membrana no pode ser feito com leite desnatado, porque este contm biotina e causar intenso background. DNA a ser marcado pode ser um fragmento isolado, ou, como nas sondas para hibridizao in situ, um clone no fago, cosmdeo ou plasmdeo intacto.

Sondas Biotiniladas: A incorporao de nucleotdeos biotinilados (bio-11-UTP ou bio-16-UTP no lugar de dTTP e bio-14-dATP no lugar de dATP) feita atravs das tcnicas previamente discutidas para marcao de cidos nucleicos com istopos radioativos. Os mtodos comumente empregados so nick-translation ou sntese com oligonucleotdeos aleatrios biotinilados na extremidade 5(random primed labelling). A Biotina uma vitamina hidrossolvel, que pode ser covalentemente ligada posio C5 do anel pirimidnico por meio de um linker alilamina: bio-11-dUTP, ou bio-16-dUTP, no lugar de dTTP e bio-14-dATP no lugar de dATP (os nmeros referemse ao nmero de grupos CH2 presente no linker). O linker propicia uma distncia razovel entre a biotina e a base marcada, o que diminui a restrio espacial decorrente da presena da biotina. A tcnica deNick Translationresulta em incorporao, em condies normais, de cerca de 50 nucleotdeos biotinilados por cada 1000 pb. Para Random Primed Labelling com oligonucleotdeos no biotinilados normalmente se usam hexmeros. Com oligonucleotdeos biotinilados so usados octmeros, pois a adio de mais dois nucleotdeos necessria para a estabilizao do annealing, devido instabilidade decorrente da restrio espacial dada pela biotina na posio 5terminal. Nesse ltimo mtodo, comum adicionar-se reao de sntese pelo menos um desoxinucleotdeo biotinilado (bio-16-dUTP, por ex.), para aumentar a eficincia da marcao. O DNA que serve de template ( com 200 pb ou mais) tem que estar linearizado e removido do vetor onde foi clonado, para maior eficincia. Podem ser marcados de 25ng a 2 g de DNA, mas a eficncia da marcao maior com 25 a 50ng de DNA.

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Digoxigenina-11-dUTP tambm pode ser incorporada ao DNA tanto por Nick Translation como por random oligonucleotide primed synthesis. Os protocolos so basicamente os mesmos utilizados para marcao com biotina. Essas sondas podem ser manuseadas normalmente, evitando-se apenas extrao com fenol e desnaturao alcalina (a desnaturao deve ser feita pela incubao em temperatura elevada, seguida de transferncia imediata da sonda para o gelo). Deteco por mtodo colorimtrico: A biotina detectada atravs de incubao com avidina ou streptavidina, ou ainda com um anticorpo anti-biotina, quimicamente acoplados a uma enzima que cataliza uma reao cujos produtos podem ser quantificados por colorimetria (fosfatase, luciferase, peroxidase). Um exemplo de sistema de deteco a streptoavidina conjugada a fosfatase alcalina, que se liga fortemente biotina e visualizada quando se adiciona um substrato da fosfatase alcalina que produz um precipitado colorido (NBT/BICP - nitroblue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate). O limite mnimo de deteco com esse mtodo colorimtrico cerca de 2 pg de DNA.

Deteco por quimiluminescncia: O advento de tcnicas de quimiluminescncia e de fluorescncia tem tornado essas sondas quase to sensveis quanto as marcadas com istopos radioativos (mtodos de deteco com quimiluminescncia so cerca de 5000 vezes mais sensveis que os colorimtricos). A fosfatase alcalina reage com um substrato quimiluminescente que resulta na deteco altamente sensvel do DNA alvo. O substrato fluorescente o DIOXETANE. Este clivado pela fosfatase alcalina o que resulta na emisso localizada de luz que pode ser detectada por um filme de raio-X. Os sistemas comerciais so vrios, mas o princpio o mesmo em todos eles. O fragmento de DNA marcado com biotina, aps hibridizao com a sequncia alvo imobilizada em membrana de nylon, ligado a fosfatase alcalina biotinilada e, em seguida exposto, ao substrato de deteco.

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Outra possibilidade a utilizao de sondas de cidos nucleicos marcadas com a prpria fosfatase alcalina (ACES - GIBCO/BRL). Nesse caso, aps a hibridizao da sonda, passa-se diretamente ao sistema de deteco (LUMI-PHOS PLUS - GIBCO/BRL). A deteco com quimiluminescncia deve ser feita em membrana de nylon. Membranas de nitrocelulose no so indicadas, porque estas promovem o esmaecimento do sinal luminoso (quenching).

Sondas marcadas com substncias fluorescentes - deteco por fuorescncia e quimifluorescncia:

Para sntese se sondas fluorescentes, se utiliza um desoxinucleotdeo marcado com fluorescena (ex.: fluorescena-11-dUTP - Fl-dUTP). O sistema de marcao pode ser Nick Translation ou Radom Primed Labelling. O sistema comercialmente disponvel at o momento por Random Primed Labelling (Vistra Florescence AMERSHAM). So utilizados monmeros aleatrios como primers para a reao de sntese da fita marcada pela Klenow DNA-polimerase. A sonda sintetizada (com rendimento de cerca de 7ng/l por 25ng de DNA-template) pode ser estocada a -20oC por 6 meses ou mais. Aps a hibridizao, a deteco pode ser feita imediatamente, sem amplificao do sinal, em FluorImager (ex.: STORM - Molecular Dynamics). Se for necessrio, a membrana pode ser tratada com reagentes que amplificam o sinal. O sistema de amplificao consiste de um anticorpo anti-fluorescena conjugado a fosfatase alcalina. Aps a ligao do anticorpo, adiciona-se o substrato da fosfatase alcalina (AttoPhos reagent - Amersham - fosfato orgnico aromtico, cuja estrutura confidencial), podendo a membrana ser submetida a scanning em FluorImager. Embora o sinal mais intenso seja observado 24 horas aps a adio do substrato, aps 1 a deteco j possvel.