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MICROBIOLOGIA
MICROORGANISMOS
A microbiologia tem um papel essencial no monitoramento da qualidade de alimentos, gua e do ambiente. A Biocen do Brasil oferece meios de cultura destinados a deteco de microrganismos: isolamento e identificao. As enterobacteriaceas so bacilos gram negativos com muitas propriedades em comum. Habitam o intestino humano e de animais de sangue quente. Os principais gneros da famlia Enterobacteriaceae so: Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Proteus, Yersinia entre outros.

Meios de Cultura
Testes bioquimicos. Lactose Gs (glicose) H2S Urase L-TD Motilidade Indol Lisina Citrato de simmons Escherichia Shigella Salmonella Citrobacter + + D + + D + + + + + D + D D + D + Klebsiella + + + + + Enterobacter Hafnia Proteus + + D + D + + + + + D + + + D D Yersinia + D D D

As enterobactrias so bacilos gram negativos pertencentes a famlia das Enterobacteriaceae. Esto amplamente distribudos no solo, gua plantas e no intestino do homem e animais. Podem causar infeces intestinais e extra intestinais. O choque endotxico uma manifestao letal da infeco por bactrias gram negativas. As endotoxinas so lipopolisacrides farmacologicamente ativos, contidos no interior das paredes celulares das gram negativas. Esses lipopolissacarideos so estruturados por trs regies: (1) uma poro varivel externa de carboidratos que determina a especificidade antignica (ex: vrios sorotipos de Salmonella); (2) um cerne ou centro de polissacardeo que estruturalmente similar entre as espcies e (3) uma poro lipdica altamente conservada, denominada lipdio A. As bactrias entricas gram negativas possuem, comumente, um nico e grande plasmdio R que codifica para a resistncia a vrios antibiticos. Cepas dos gneros Enterobacter, Serratia, Klebsiella e Providencia, alm de vrias cepas indol positivas de Proteus e cepas cefalotina resistentes de E. coli, possue ?-lactamases induzveis que proporcionam resistncia cruzada a vrios antibiticos do grupo dos ?-lactmicos. A caracterstica morfolgica da colnia de um microrganismo em meio de agar pode ser uma forma de identificao pois as enterobactericeas produzem colnias secas ou mucides relativamente grandes de colorao cinza opaca em agar sangue. A hemlise em agar sangue varivel e no distinta. As colnias que aparecem como ondas (disperso) sugerem motilidade, provavelmente Proteus. As colnias vermelhas em agar MacConkey ou com brilho verde em agar eosina azul de metileno (BEM) indicam que o microrganismo capaz de formar cido a partir da lactose do meio. Entretanto, a diferenciao das enterobactrias se baseia na presena ou no de enzimas codificadas por genes cromossmicos. Essas enzimas participam do metabolismo bacteriano e podem reagir com substratos incorporados aos meios de cultura. Junto com um indicador, pode identificar a utilizao do substrato ou de produtos metablicos especficos estabelecendo um perfil bioqumico que identifica a espcie. possvel evitar perda de tempo e identificaes errneas realizando-se observaes preliminares. Com poucas excees, as enterobactrias tm as seguintes caractersticas: - fermentao da glicose, - oxidase negativa, - reduo de nitrato a nitrito, Por definio, fermentao um processo metablico de xido-reduo que ocorre em meio anaerbio. Nas provas bioqumicas, esse processo detectado pela observao da mudana de cor por indicadores de pH como conseqncia da formao de produtos cidos. A acidificao do meio de prova pode ocorrer atravs da degradao de carboidratos por vias diferentes que no a fermentao, ou pode haver em alguns meios componentes diferentes de carboidratos que resultem em produtos finais cidos. Embora a maioria das bactrias que metaboliza carboidratos seja anaerbia facultativa, a utilizao pode nem sempre ocorrer em condies estritamente anaerbias. Todas as enterobactrias fermentam a glicose formando cido pirvico (via de Embden-Meyerhof). As bactrias so diferenciadas pelo carboidrato que metabolizam e pelos tipos e quantidade de cidos produzidos. Na fermentao da glicose pela Escherichia coli ocorre uma fermentao cida mista o que resulta na produo de grandes quantidades de cidos actico, ltico e frmico ocasionando uma acentuada diminuio do pH no meio de prova. Isto pode ser observado no teste positivo do vermelho de metila. Por outro lado, o grupo Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia

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16/06/13 BioCen do Brasil :: http://www.biocendobrasil.com.br observado no teste positivo do vermelho de metila. Por outro lado, o grupo Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia metabolizam o cido pirvico pela via do butileno gllicol produzindo acetil metil carbinol (acena), observado na prova positiva de voges-Proskauer (VP). Observe que os principais produtos dessa via so lcoois com produo de pequena quantidade de cido gerando uma prova de vermelho de metila negativa para esse grupo de microrganismos. O gs resultante da fermentao bacteriana formado da clivagem do cido frmico. A produo de gs melhor observada em meio lquido para fermentao de carboidratos com a colocao de tubos de Durham invertidos . Bactrias que no formam cido frmico so incapazes de formar gs (a maioria das Shigella), contrariamente aos microrganismos que utilizam a via butileno glicol que produzem grandes quantidades de CO2 como o grupo Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia. A fermentao da lactose mais complexa que a da glicose. A lactose um dissacardeo composto por glicose e galactose (ligao galactosdica). Ao ser hidrolisada, ocorre a liberao da glicose e da galactose. Para metabolizar a galactose, duas enzimas devem estar presentes: (1) ?-galactosdeo permease e (2) ?-galactosdase enzima necessria para hidrolisar a ligao ?-galactosdica aps a lactose ter entrado na clula. Como a fermentao da lactose ocorre por degradao da glicose, microrganismos que no podem fermentar a glicose no podem formar cido a partir da lactose. Isto explica porque a glicose no faz parte dos meios de isolamento primrio como o agar MacConkey e BEM pois impediria a visualizao de fermentao da lactose. O ONPG (?-nitrofenil-?-D-galactopiranosdeo permanente) um composto similar lactose. O que difere a substituio da glicose pelo grupo (?-nitrofenil). A prova de ONPG consiste na deteco da enzima ?-galactosdase, sendo til para identificar fermentadores tardios de lactose. O teste de oxidase pode ser observada utilizando-se fitas de oxidase. A presena de pigmentao prpura significa que a bactria possue a enzima citrocromo axidase (oxidase +). Bactrias que no possuem a enzima so oxidase , no apresentando pigmentao nas fitas de oxidase.
Outras provas bioqumicas utilizadas para a identificao de enterobactrias so: o vermelho de metila, VogesProskauer, citrato de Simmons, teste da urease, meio de Kliger, indol e a pesquisa da triptofano desaminase. No teste de vermelho de metila observa-se se o microrganismo capaz de produzir cidos em quantidade suficiente para abaixar o pH em valores inferiores a 4,4. Isto indica que o microrganismo em questo realiza uma fermentao cida mista (cido frmico, actico, ltico e succnico) VM+. Caso no ocorra a virada do meio para o vermelho, o teste negativo e a cor do meio se mantm. No teste de Voges-Proskauer pesquisa-se bactrias fermentadoras de glicose atravs da fermentao butanodilica. VP+ o meio tem colorao vermelha, VP- meio amarelo claro. Salmonella - bacilo gram negativo pertencente a famlia Enterobacteriaceae, com ou sem presena de flagelos e intracelulares facultativas. A patogenicidade das salmonelas varia de acordo com o tipo sorolgico, idade e condies de sade do hospedeiro. A S. typhi o agente da febre tifide. As salmonelas paratficas causam infeco semelhantes a febre tifide. Os demais sorotipos de Salmonella causam uma enterocolite sem complicaes que desaparece em uma semana. As salmonelas so geralmente veiculadas por alimentos contaminados e a infeco denominada de intoxicao alimentar. Em crianas, a salmonela frequentemente invade a circulao afetando vrios rgos. A infeco por Salmonella tem incio na mucosa intestinal e quando h enterocolite sem invaso da corrente sangnea, a salmonela atravessa a camada do epitlio e se prolifera na lmina prpria da mucosa. Quando h infeco sistmica, a Salmonella cai na corrente sangnea via linftica. O diagnstico das infeces por Salmonella realizado um enriquecimento e o isolamento em agar verde brilhante, agar SS e agar MacConkey. A identificao feita por provas bioqumicas e por sorologia. Shigella - o gnero Shigella constitudo de 4 es[cies: S. dysenteriae, S. flexneri, S.boydii, S. sonnei. Os sorotipos de Shigella so caracterizados somente pelos antgenos O ou somticos uma vez que essa bactria desprovida de antgenos capsulares (K) e flagelares (H). A doena causada pela Shigella denominada de shigelose ou disenteria bacilar. Ocorre uma invaso e destruio da camada epitelial da mucosa com intensa reao inflamatria acarretando leuccitos, muco e sangue nas fezes. Na infeco por Shigella dysenteriae tipo I (bacilo de shiga) pode aparecer a sndrome hemoltica urmica gerada pela presena de altos nveis de verotoxina I (VT I). A infeco pode ser adquirida pela ingesto de gua e/ou alimentos contaminados, alm do contato pessoal. O diagnstico feito pelo isolamento da Shigella, a partir de fezes, em meio MacConkey e SS. A identificao feita por testes bioqumicos e sorolgicos. Yersinia - o gnero Yersinia compreende a Y. pestis, Y.enterocolitica, Ypseudotuberculosis, Y.frederiksenii, Y.kristensenii e Y. intermedia sendo que as 3 ltimas no so associadas a doenas humanas. Y. pestis o agente etiolgico da peste e tem os roedores como reservatrios e as pulgas como veculos. O homem pode adquirir a doena aps ser picado pela pulga ou por manipulao de animais contaminados. A peste se caracteriza de 3 formas clnicas: bubnica, pulmonar e septicmica. A bubnica caracteriza-se pela inflamao dos linfonodos principalmente os axilares e inguinais. A fase pulmonar pode ocorrer como uma complicao da bubnica ou ser adquirida por contato com pacientes com infeco pulmonar. A septicmica rara mas pode ocorrer no pico da epidemia. O fator de virulncia de Y. pestis so os antgenos superficiais que a tornam resistentes fagocitose. Essa bactria produz, tambm, uma exotoxina. Y. enterocolitica uma espcie bastante heterogenia. So encontradas no ambiente e em animais normais ou acometidos pela doena e causam diferentes tipos de sintomatologia, sendo a principal a infeco intestinal manifestada por diarria e dores abdominais. Infeces sistmicas podem ocorrer e geram doenas debilitantes como cirrose heptica, eritrema nodoso, artrite, conjuntivite e osteomielites. A infeco intestinal adquirida pela ingesto de alimentos contaminados. O isolamento realizado em agar MacConkey e SS com posterior identificao bioqumica e sorolgica da bactria. E. coli bacilo gram negativo pertencente as enterobactrias. O gnero Escherichia compreende as espcies E. coli, E. hermanii, E. fergusonii, E.vulneris e E. blattae. Seis so as categorias de E. coli enteropatognicas: E. coli enteropatognica clssica (EPEC), E. coli enterotoxignica (ETEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enterohemorrgica (EHEC) E. coli enteroaderente (EAEC) e E. coli enteroagregativa (EAggEC). As EPECs so os agentes mais freqentes de diarria infantil. Os sorotipos mais comuns so O111:H-, )111:H2 e O119:H6. A capacidade da bactria em aderir mucosa intestinal mediada por plasmdio. A adeso pode ser difusa, quando ocorre em toda a superfcie da clula, ou localizada quando a adeso se d em certos locais da clula. Aps se aderirem a clula, inicia-se a produo de citotoxinas semelhantes a toxina de Shiga (Shigalike). O reservatrio o homem e o isolamento de EPEC das fezes realizado em gar MacConkey. A identificao ocorre por provas bioqumicas e pelo emprego de soros polivalentes que so empregados para a identificao presuntiva e os soros monovalentes que so usados para a confirmao. As EIECs so imveis pois no dispem de flagelos, no descarboxilam a lisina e apresentam um plasmdio que transporta determinantes genticos responsveis pela penetrao nas clulas epiteliais. As EIECs proliferam no

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16/06/13 BioCen do Brasil :: http://www.biocendobrasil.com.br transporta determinantes genticos responsveis pela penetrao nas clulas epiteliais. As EIECs proliferam no interior das clulas causando uma infeco e necrose da mucosa do leo e clon. As infeces intestinais causadas por EIEC so comuns em crianas com mais de 2 anos e so adquiridas por ingesto de alimentos e gua contaminados ou por contato pessoal. A deteco realizada por cultivo de fezes em agar MacConkey e agar SS e por provas bioqumicas e sorolgicas.
As ETECs so os biosorotipos de E. coli que produzem enterotoxinas termolbeis e termoestveis. As toxinas termolbeis so conhecidas por LT I e LT II e as toxinas termoestveis por STa e STb. As EIECs isoladas de seres humanos raramente produzem enterotoxinas LT II e nunca a enterotoxina STb. A enterotoxina LT I uma protena imunognica com peso molecular de 100.000 daltons cuja molcula possui 5 subunidades perifricas (subunidade B) e uma central (subunidade A). As subunidades B fixam a toxina superfcie da clula epitelial e a subunidade A altera o metabolismo celular, pois bloqueia a absoro de sdio estimulando a excreo de potssio e carbonato pelas clulas das criptas. Isto determinar um aumento do volume de lquido na luz intestinal e consequentemente a diarria. A enterotoxina LT I semelhante a enterotoxina produzida pelo Vibrio cholera. A STa contariamente a LT I uma molcula pequena (17-18aminocidos) e no imunognica pesando aproximadamente 5.000 daltons. A STa uma potente toxina que tambm altera o metabolismo hidrossalino da mucosa intestinal. Alm das enterotoxinas, ETEC apresentam fmbrias usadas para fix-las mucosa do intestino delgado. Essas fmbrias so imunognicas e so conhecidas como fatores de colonizao. So pelo menos 3 fatores de colonizao imunologicamente distintos de origem humana. Depois que a bactria atravessa a barreira gstrica, ela se fixa na mucosa intestinal por meio do fator de colonizao (as fimbras).uma vez fixada, comea a se proliferar e produzir as enterotoxinas que determinaro a diarria aquosa. As enterotoxinas LT I e STa assim como os fatores de colonizao, so codificados por genes localizados em plasmdios designados de ent. As ETECs acorrem em crianas e em adultos e conhecida como a diarria do viajante. Seu reservatrio o prprio homem e a infeco se transmite pela ingesto de gua e alimentos contaminados. A infeco por ETEC superficial, no havendo penetrao do epitlio intestinal. Desta forma, os pacientes no apresentam leuccitos, sangue ou muco nas fezes. O isolamento de ETEC se faz em agar MacConkey e na pesquisa de enterotoxinas LT I e STa. A enterotoxina LT I pode ser demonstrada em cultura de clulas e por testes de aglutinao de hamcias sensibilizadas pela toxina. A pesquisa de STa geralmente feita por inoculao em camundongos recm nascidos. A EHEC determina uma diarria sanguinolenta que denominada de collite hemorrgica. Est associada a ingesto de alimentos contaminados e conhecida como a doena do hambrguer. As EHEC produzem duas citotoxinas semelhantes a toxina de Shiga (Shigalike toxin) SLT I e SLT II ou verotoxinas (VT) I e II . Essas toxinas so codificadas por bacterifagos lisognicos e so as responsveis pela hemorragia intestinal e pela sndrome hemoltica urmica que pode acompanhar a colite hemorrgica. As EHEC aderem mucosa intestinal por fmbrias codificadas por plasmdios. A identificao se d pela dosagem de toxinas em cultura de clulas Vero ou por sondas genticas que detectam os genes que as codificam. O sorotipo que representa esse biogrupo a E. coli O157:H7. Listeria monocytogenes O gnero Listeria compreende a L. monocytogenes que patognica para o homem, e outras espcies no patognicas geralmente encontradas no solo, vegetais, animais e no homem. A L. monocytogenes causa beta hemlise. A listereriose pode ser confundida com outras doenas, pois sua sintomatologia pode se assemelhar a um resfriado comum, a uma inflamao de garganta, uma septicemia severa ou a doenas do sistema nervoso central. Infeces inaparentes podem ser transmitidas durante a gestao via placenta, o que resulta em aborto. A infeco pode tambm ser transmitida durante o parto em decorrncia de aspirao do lquido aminitico. A listeriose uma causa freqente de abortos e mortalidade de recm nascidos. No adulto, a principal doena a meningite, e no idoso a mortalidade bastante alta (70%). So bacilos gram positivos flagelado, resistente a temperaturas de refrigerao. Pseudomonas - bacilo gram negativo que so diferenciados entre eles por testes bioqumicos, de sensibilidade a antibiticos, formao de pigmentao, nmero e localizao dos flagelos. As espcies comumente isoladas correspondem a P. aeruginosa, P. malthophila e P.cepacia. P. aeruginosa tem a capacidade de produzir um pigmento esverdeado denominado piocianina. um germe oportunista que infecta processos cirrgicos e queimaduras podendo resultar em bacteremias severas, ceratites em cirurgias oculares e pneumonias. O cultivo realizado a partir de material infectado e identificado por srie bioqumicas e pela presena de pigmentos. Staphylococcus O gnero compreende vrias espcies, sendo duas delas as mais importantes: S. aureus, S. epidermides. So cocos gram positivos, com diviso em vrios planos tendendo a formar cachos de uvas. A diferenciao entre as espcies se d pelo testes de coagulase (S. aureus coagulase + e S. epidermides coagulase ). Streptococcus Os estreptococos so denominados de vrias maneiras. A designao mais comum tem por base a hemlise em gar sangue. Se a hemlise total disse que o estreptococos beta-hemoltico, se for parcial que ele alfa hemoltico e, no havendo hemlise disse que ele gama hemoltico ou no hemoltico. Os estreptococos alfa hemolticos que costumam conferir colorao esverdeada s hemcias por transformao da hemoglobina em uma substncia semelhante a bilerrubina so conhecidos por S. viridans. So cocos gram positivos que se dividem em um s plano e se agrupam em cadeias de tamanho varivel. Fazem parte desse grupo o S. pyogenes, S. agalactiae, S. faecalis, S. bovis, S. pneuminiae. Neisseria O gnero Neisseria compreende vrias espcies que podem ser diferenciadas por meio de provas bioqumicas. A N. gonorrhoeae ou gonococo e a N. meningitidis ou meningococo causam gonorria e meningite, respectivamente. Essas so resistentes vancomicina e a polimixina. As neisserias so cocos gram negativos que se agrupam em pares geralmente. Os bordos dos pares so achatados ou levemente cncavos semelhantes ao gro de feijo. Haemophylus O gnero Haemophylus um bastonete gram negativo cultivvel em meios que contenham sangue. As espcies mais patognicas para o homem so H. influenzae, H. parainfluenzae, H. haemolyticus e H. aphrophilus que so encontrados nas vias areas superiores. H. ducreyi o agente do cancro mole, uma doena venrea. So cocobacilos bem pequenos, gram negativo. Brucella O gnero Brucella constitudo por cocobacilos ou bacilos gram negativos. So 3 as espcies de importncia para o homem: B. abortus, B. melitensis e B. suis. A doena a brucelose que bastante invasiva,

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16/06/13 BioCen do Brasil :: http://www.biocendobrasil.com.br importncia para o homem: B. abortus, B. melitensis e B. suis. A doena a brucelose que bastante invasiva, podendo penetrar no organismos atravs da mucosa digestiva e ocular. A brucela um parasita intracelular do sistema retculo-endotelial. A brucelose uma zoonose, pois o homem a adquire atravs do contato com animais doentes.
Bibliografia Consultada Jaw etz,E, Melnick,J.L., Adelberg,E.A., Brooks,G.F., Butel,J.S., Ornston,L.N. Microbiologia Mdica. 18. Ed . 1989. Koneman,E.W., Allen, S.D., Janda,W.M., Schreckenberger,P.C., Winn,W.C.Jr. Diagnstico Microbiolgico. Texto e Atlas colorido. 5. Ed. 2001. Silva,N, Junqueira,V.C.A., Silveira,N.F.A. Manual de mtodos de anlise microbiolgica de alimentos. 1997. Trabulsi, L.R. Microbiologia. 2. Ed.1991
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