Microbiologia de

Alimentos
Daniela Cristina de Macedo Vieira
 Quantificação de
Enterobacteriacea

E. coli, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Hafnia,

Klebsiella, Morganella, Pantoea, Pectobacterium, Proteus,

Salmonella, Serratia, Shigella eYersinia….

Atualmente, 44 gêneros e 176 espécies

Contagem de Enterobacteriaceae –
IN 60/2019

1 - Contagem padrão em placa

Método de plaqueamento APHA 9.62:2015 para a contagem de

Enterobacteriaceae em alimentos.

Agar Vermelho Violeta Bile Glicose (VRBG) – meio seletivo

diferencial contendo cristal violeta e sais biliares que inibem

bactérias Gram positivas.
9 mL de solução salina 25 mL

1 mL
1 mL 225 mL
SPT (10-1)

(10-3) (10-2)

0,1 mL

VRBG
(enterobactérias)
} Contagem de enterrobacteriacea
(UFC/g))
NUMERO MAIS PROVÁVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES
TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS (GERAL)

25 mL 1 mL 1 mL 1 mL

225 mL (10-2)
(10-3) (10-4)
SPT (10-1)

{
CLST (coliformes)
 {
CLST (coliformes)
1 alçada tubos onde houve crescimento
1 alçada
e produção de gás

Caldo EC Caldo VB (bile verde brilhante) 2%

Caldo confirmativo para coliformes 35oC
termotolerantes Contagem coliformes totais
45,5oC em banho maria NMP/g
Contagem coliformes termotolerantes
NMP/g confirmação de E. coli
confirmação de E. coli

estrias de esgotamento

série bioquímica
colônias típicas

PCA
35o/24 h
1. Etapas do Ensaio
1.1 Prova presuntiva
• Baseia-se na inoculação da amostra em Caldo Lauril Sulfato Triptose (CLST - pré-
enriquecimento), em que a presença de coliformes é evidenciada pela formação de gás
nos tubos de Durhan, produzido pela fermentação da lactose contida no meio.
• A seletividade do CLST se deve ao lauril sulfato de sódio, um agente surfactante
aniônico, que atua na membrana citoplasmática de micro-organismos Gram positivos,
inibindo o crescimento.
1.2 Prova confirmativa para coliformes totais - 35°C
A confirmação de coliformes totais é feita em Caldo lactosado verde brilhante bile
lactose 2% (CLVB ou VB) e posterior incubação a 36 ± 1ºC. A presença de gás nos
tubos de Durhan evidencia a fermentação da lactose presente no meio.
O caldo verde brilhante bile lactose 2% apresenta, em sua composição, bile
bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsáveis
pela inibição dos micro-organismos Gram positivos.
1.3 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes - 45°C
A confirmação de coliformes termotolerantes é feita em caldo EC, com incubação em
temperatura seletiva de 45 ± 0,2ºC, a partir dos tubos positivos obtidos na prova
presuntiva. A presença de gás nos tubos de Durhan evidencia a fermentação da lactose
presente no meio.
O caldo EC apresenta em sua composição uma mistura de fosfatos que lhe confere
um poder tamponante, impedindo a sua acidificação. A seletividade do meio se deve à
presença de sais biliares, responsáveis pela inibição dos micro-organismos Gram
positivos, bem como à temperatura de incubação, 45°C.
Pesquisa de Salmonella sp

inibir as outras bactérias e

favorecer a Salmonella
Ágar Rajhans
No SS, as colônias suspeitas de Salmonella são incolores, transparentes com ou sem o
centro negro.
Enriquecimento seletivo – Caldos para Inibir a microbiota acompanhante e elevar
preferencialmente, o número de células de Salmonella sp.
Caldo Rappaport Vasiliadis , Caldo Tetrationato, Caldo Selenito cistina, Gram Negativo
Diferentes tipos de inibidores tem sido propostos para enriquecimento seletivo de
salmonelas, sendo a bile, o tetrationato, o selenito e corantes, como o verde brilhante e o
verde malaquita, os mais usados. Esses inibidores são incorporados aos meios, isolados
ou em combinação.
Particularmente para produtos gordurosos, como leite de coco, maionese, manteiga,
creme de leite, chocolate, utilizar Tween-80, Triton X ou Tergitol 7
 Caldo selenito cistina – não autoclavar!

Princípio: Têm propriedades que inibem coliformes e outras espécies da flora

intestinal como estreptococos.
Esse meio vem sendo recomendado para o enriquecimento de Salmonella spp. em
espécimes fecais, especialmente para o isolamento de S. Typhi e S. Paratyphi B,
sendo também útil para a detecção de outros sorovares de Salmonella spp.,

mesmo quando os micro-organismos estão

presentes em pequeno número. A adição de
cistina melhora a qualidade do meio de

cultura
 Caldo tetrationato – não autoclavar!

Princípio: Os sais de bile contidos no meio de tetrationato inibem micro-organismos

Gram positivos e a adição da solução de iodo inibe a flora intestinal normal de
espécies fecais.
• A seletividade do caldo tetrationato depende de sua capacidade de restringir a
multiplicacao de coliformes.
• Sorovares de Salmonella (exceto S. Choleraesuis, S. Typhisuis, S. Gallinarum e S.
Pullorum) possuem a enzima tetrationato-redutase e, consequentemente, são capazes
de multiplicar-se no meio.
•Porem, o desenvolvimento excessivo de Proteus spp., que tambem produz essa enzima,
pode interferir na detecção de Salmonella spp. Nesse caso, o caldo tetrationato verde
brilhante, segundo Muller-Kauffmann, contendo verde brilhante e bile, inibe a
multiplicação de especies de Proteus.
 Caldo Rappaport Vassiliadis
Princípio:
• O Caldo Cloreto de Magnésio Verde Malaquita (Caldo Rappaport) vem demonstrando
eficácia na detecção de Salmonella spp. A associação do cloreto de magnésio com um
corante bacteriostático (verde malaquita) constituiu-se no meio de enriquecimento para a
maioria dos sorovares de Salmonella spp., com exceção de S. Typhi.
• Posteriormente, uma modificação desse meio, resultante da diminuição da concentração
de verde malaquita, com temperatura de 43°C para incubação, o qual foi denominado
meio de Rappaport Vassiliadis, vem evidenciando maior eficiência quando da utilização de
pequenas quantidades de inoculo, bem como por ter maior capacidade de inibição dos
microrganismos competitivos.
 ÁGAR Salmonella-Shigella(SS) – não
autoclavar
Princípio - Ágar SS possui os seguintes componentes (sais de bile, verde brilhante e
citrato de sódio) que inibem micro-organismos Gram positivos. A incorporação de
lactose ao meio permite diferenciar se o micro-organismo é lactose positiva (bactérias
que fermentam a lactose produzem ácido que na presença do indicador vermelho
neutro, resultando na formação de colônias de cor rosa), e bactérias que não
fermentam a lactose formam colônias transparentes. Tiossulfato de sódio e o citrato
férrico permitem a detecção de H2S evidenciado por formação de colônias de cor
negra no centro.
AGAR Salmonella Diferencial Modificado (Meio de Rajhans) – não autoclavar.

Finalidade: O Agar Salmonella Diferencial Modificado é recomendado para

identificação e diferenciação de espécies de Salmonella pertencentes à
Enterobacteriaceae, especialmente espécies de Proteus.
O Agar Rambach vem sendo utilizado para identificar Salmonella spp. em gêneros
alimentícios e amostras clinicas, permitindo a diferenciação com Proteus e outras
bactérias entéricas.
• As Salmonella spp. são identificadas pela formação de ácido, a partir do
propilenoglicol. Esse ácido na presença do Indicador B.C. proporciona coloração
vermelho carmim às colônias do micro-organismo.
• A presença de fragmentos de b-galactosidase, enzima típica dos coliformes, é
evidenciada pelo desenvolvimento de colônias azul-esverdeadas ou violeta-
azuladas.
• Outras enterobactérias ou bactérias Gram negativas, como Proteus, Pseudomonas,
Shigella. S. Typhi e S. Paratyphi A apresentam colônias incolores.
 TSI / LIA
Princípios:
• No TSI, a Salmonella produz H2S e gás;
• A base do meio fica negra –
(fermentação da dextrose – amarelo
com gás e produção do H2S – enegrece)
e a rampa fica vermelha (não fermentação
da lactose e sacarose)
 LIA

No LIA, a maioria das Salmonella intensifica o violeta e produz H2S

(fundo e rampa púrpura com ou sem produção de H2S).
QUANTIFICAÇÃO DE ESTAFILOCOCOS
COAGULASE POSITIVA
•Agar Baird Parker
As colônias de S. aureus são negras, lustrosas, convexas, com 1 a 5 mm de
diâmetro, rodeadas por halo claro de 2 a 5 mm de largura. A formação de
colônias negras circundadas por halo é devida a transformação do telurito a
telúrico, e a lipólise e proteólise da gema, respectivamente.
Colônias típicas são identificadas - provas bioquímicas:
coagulase, catalase
1- Repicar as colônias típicas para o caldo BHI e incubar a 35ºC / 24h.
2- Prova da Coagulase: 0,3ml da cultura em caldo BHI serão juntados a 0,5 ml
de plasma de coelho e incubados em Banho-Maria a 37ºC / 1-4 horas (esta
prova verifica a capacidade de certos micro-organismos produzirem a
coagulase, ou seja, coagular o plasma).
3- Prova da Catalase: a partir da cultura em caldo BHI, coloca-se uma
gotícula deste inoculo numa lâmina e gotejar água oxigenada.
Observar o desprendimento de bolha (catalase positiva).