Enumeração de

coliformes totais e
coliformes termotolerantes
Importância da enumeração de coliformes em
alimentos

• Micro-organismos indicadores de condições

higiênico-sanitárias insatisfatórias: são grupos de
m.os que quando presentes em um alimento
fornecem informações sobre a ocorrência de
contaminação de origem fecal, sobre a provável
presença de patógenos.
 Características de um bom indicador de
contaminação fecal
• Rápida e fácil detecção
• Não deve estar presente como contaminante natural do
alimento
• deve estar presente quando o patógeno estiver
• Ausente nos alimentos livres de patógenos
• Habitat exclusivo:trato intestinal
• Ocorrer em números altos nas fezes
 Características de um bom indicador de
contaminação fecal
• E. coli como indicador:

habitat: trato intestinal de animais

 Características de um bom indicador de
contaminação fecal

Em alimentos processados, a presença de um

número considerável de coliformes indica:
Processamento térmico inadequado e/ou recontaminação
pós processamento (matéria-prima, equipamento sujo ou
manipulação sem cuidados de higiene);

Proliferação microbiana que poderia permitir a

multiplicação de mos patogênicos
 COLIFORMES TOTAIS OU GRUPO COLIFORME

Família Enterobacteriaceae
Bastonetes Gram negativos, não formadores
de esporos, fermentam a lactose com
produção de ácido e gás a 35-37°C/24-
48h
Existem os fermentadores tardios de
lactose!!!!
Gêneros:
• Escherichia (só a E. coli tem como habitat
primário o trato intestinal)
• Enterobacter
• Citrobacter
• Klebsiella
 COLIFORMES FECAIS (termotolerantes)

• → Os coliformes termotolerantes fazem parte do grupo

coliformes totais.
• Característica: continuam fermentando a lactose com
produção de ácido e gás quando incubados a 44,5 0,5°C
/24- 48h
• 90% das culturas de E. coli são positivas
• Apenas algumas cepas de Enterobacter e Klebisiella
apresentam esta característica
• E. coli (vários sorotipos)
 Escherichia coli
CLASSIFICAÇÃO

• ENTEROPATOGÊNICA CLÁSSICA (EPEC)

• ENTEROTOXIGÊNICA (ETEC)
• ENTEROINVASORA (EIEC)
ENTEROHEMORRÁGICA (EHEC)
• FACULTATIVAMENTE
ENTEROPATOGÊNICA (FEEC)
• ENTEROAGREGATIVA (EAggEC)
 Enfermidade transmitida por alimentos
EPEC
• Enteropatogênica Clássica
• Gastroenterite em crianças
• Dores abdominais, vômito e febre
• Duração 6h a 3 dias
• Capacidade de adesão a mucosa intestinal-
destruição das vilosidades intestinais
Escherichia coli Enteropatogênica - EPEC

Diarréia infantil é o nome da doença associada à E.

coli enteropatogênica (EPEC). Causa diarréia líquida
com muco, febre e desidratação. A diarréia em
crianças pode ser severa e prolongada, com elevada
percentagem de casos fatais; uma taxa de 50% de
letalidade tem sido relatada nos países em
desenvolvimento, incluídas a America do Sul, África e
Ásia (locais de condições sanitárias precárias).
 Enfermidade transmitida por alimentos
EIEC
• Enteroinvasora
• Disenteria, cólicas abdominais, febre, mal
estar, com eliminação de sangue e muco pelas
fezes
• PI: 8-24h
 Enfermidade transmitida por alimentos
ETEC
• Enterotoxigênicas
• Capazes de produzir enterotoxinas
• Diarréia aquosa, febre baixa, dores
abdominais, náuseas
• Forma mais severa: semelhante a cólera: fezes
tipo água de arroz –desidratação
• PI: 8-44h
 Enfermidade transmitida por alimentos
EHEC

• Enterohemorrágica
• Gado reservatório natural
• Sintomas:

• E. coli: O157:H7 –”doença do

hamburguer”
• Produção de citotoxinas
• Colite hemorrágica: dores
abdominais severas e diarréia
aguda, seguida de diarréia
sanguinolenta, sem febre
• PI: 3-9 dias
• Pode evoluir para síndrome
urêmica hemolítica (grave)
 TESTES DA COLIMETRIA
Coliformes pelo
NMP Número mais provável
Dividido em:

• PRESUNTIVO
• CONFIRMATIVO
• COMPLETO
 Teste presuntivo
• Este teste é realizado tanto para coliforme total como para
coliforme fecal. Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com tubos
de Durham invertidos - três séries de três tubos - Incubação
:35-37◦C por 24-48 h.
• Células estressadas por tratamentos térmicos, pelo
congelamento ou por outro motivo pode ser recuperadas
nesta fase.
• Princípio: oferece como fonte de carbono apenas a lactose, a
qual é fermentada pelos coliformes com produção de ácidos e
gás, que é evidenciado nos tubos de Durham. O meio ainda
contém lauril sulfato que inibe a flora acompanhante
• Leitura: Os coliformes utilizam a lactose produzindo ácido e
gás, sendo este detectado no teste presuntivo através da
retenção de gás no tubo de Durham.
Teste Presuntivo LST – Lauril sulfato triptose
 Teste confirmativo para Coliforme Total
• Os tubos positivos no teste presuntivo são semeados
em Caldo Verde Brilhante Bile Lactose (VBBL) com
tubos de Durham em seu interior - Incubação:35-37◦C
por 24-48 h.
• O VBBL contém inibidores (bile e verde brilhante) do
crescimento da microflora acompanhante,
especialmente bactérias Gram positivas, e a lactose ,
como única fonte de carboidrato.
• Leitura: os tubos com produção de gás indica que
houve desenvolvimento de bactérias Gram negativas
que fermentam a lactose, característicos do grupo
coliformes
• Cálculo do Número Mais Provável (NMP) para
Coliformes Totais.
Teste confirmativo para Coliforme Total
Caldo VBB
 Teste confirmativo para Coliforme Fecal
(coliformes termotolerantes)

• Tubos positivos no teste presuntivo - Caldo

Escherichia coli (EC) contendo tubos de
Durham em seu interior - Incubação: 44,5 ±
0,5°C por 24-48 h.
• O teste baseia-se na utilização de um meio de
cultura seletivo – os tubos com produção de
gás = positivos para o teste confirmativo
• Cálculo do Número Mais Provável (NMP) para
Coliformes a 45°C.
 Teste confirmativo para Coliforme
Termotolerantes - caldo EC – Escherichia coli
25g de alimento em 25 mL H2O pte
9 mL H2O pte 9 mL H2O pte

1 mL 1 mL

1 mL 10 -3 1 mL
1 mL 10 -2
10 -1
Teste Presuntivo
LST com tubos de
Durham
Incubação 35°C/24 h

Teste Confirmativo Teste Confirmativo

Caldo Verde Caldo EC
brilhante Bile (VB) NMP de Coliformes
NMP de Coliformes termotolerantes /25 g ou 25 mL
Totais /25 g ou 25 mL Incubação 45°C/ 24-48 h
Incubação 35°C/48 h
Cada Tubo positivo. Todas as subculturas do
caldo EC são repicadas para ágar EMB – estrias
por esgotamento - EMB 35°C/ 18-24 h
De cada placa correspondente a cada tubo , repicar 2
a 3 colônias para ágar nutriente inclinado e incubar por
Colônias verdes com brilho metálico esverdeado
18 a 24 h 35°C Efetuar em cada cultura em ágar ou com centro metálico
nutriente as seguintes provas bioquímicas: Indol;
Vermelho de Metila VM; Voges-Proskauer- VP; Citrato
Este grupo de Prova é denominado de IMVIC
 NMP
• Exemplo de Resultado:
10-1 10-2 10-3
3 2 3
NMP/g = Número da tabela x FDI
100

290 x 102 = 290 = 2,9 x 102 NMP/g

100
 Teste completo
Coliformes Totais
• Os tubos positivos no teste confirmativo (VBBL) foram semeados para
o meio EMB (Eosina Metileno Blue) - possui sais biliares que inibem o
crescimento de bactérias Gram (+), favorecendo o crescimento das
Gram (-).
• A placa foi dividida de acordo com o número de diluições positivas no
VBBL
• Semeadura por estriamento do inoculo no meio de cultura.
• incubação foi a 35-37◦C por 24h
• Leitura: As UFC são pretas com ou sem brilho verde metálico (suspeita
de E. coli), os outros CT (Enterobacter, Citrobacter e Klebisiella)
apresentam UFC mucóides e com tendência a se confluírem.
 Ágar EMB
Klebisiella Enterobacter
 Teste completo
Coliformes fecais
• Os tubos positivos no
teste confirmativo (EC)
são semeados para o
meio EMB
• incubação :35-37°C por
24 h.
• Leitura: As UFC são
pretas com brilho verde
metálico (suspeita de E.
coli).
 Enumeração de E. coli
• Após o teste completo segue-se para o :
• IMVIC
• As UFC típicas para coliformes fecais, são transferidas
com agulha flambada para o meio ágar nutriente
inclinado, sendo incubado em estufa 35-37◦C por 24 h,
para posterior realização da bioquímica (IMVIC): prova
do indol, Prova do vermelho de metila (VM), prova do
Vorges Proskauer (VP), prova do citrato
 PROVAS BIOQUÏMICAS - IMVIC:
Prova de Indol
O teste do Indol detecta a acção da
enzima triptofanase ajudando na
diferenciação de
Enterobacteriaceae e outros grupos
de micro-organismos.
O teste do Indol determina a
capacidade que o organismo tem
em produzir indol através da
degradação do aminoácido L-
Triptofano em Indol, Ácido Pirúvico
e Amónia.
Voges- Proskauer Há bactérias que utilizam a
fermentação butilenoglicólica,
fermentam a glicose produzindo
acetil-metil- carbinol (acetoína),
butilenoglicol e pequenas
quantidades de ácidos.Quando é
adicionado KOH e na presença de
O2 atmosférico a acetoína é
convertida em diacetila a adição
de alfa-naftol nesta reação
cataliza a produção de um anel
vermelho. Este tipo de
fermentação da glicose é
característico do E.aerogenes.
Teste que avalia se as
bactérias que fermentam a
Vermelho de Metila glicose pela via ácida mista,
com isso há a produção de
vários ácidos (ácido
fórmico, lático, acético) que
faz com que o pH do meio
fique abaixo de 4,4 que é o
limite de viragem do
indicador de pH.
O indicador de pH é o
vermelho de metila que em
pH abaixo de 4,4 é
vermelho e acima de 6 é
amarelo. Serve para
diferenciar organismos
entéricos, em particular E.
coli de E. aerogenes
Prova de citrato Este teste determina se a
bactéria é capaz de usar o
citrato de sódio como única
fonte de carbono para o seu
metabolismo e crescimento.
Deve ser utilizado o meio
Citrato de Simmons,
composto por citrato de
sódio, fosfato de amônia e
por azul de bromo fenol.
Com o uso de citrato há a
produção de hidróxido de
amônia que eleva o pH
fazendo que a reação se
torne azul.