FUNDAMENTOS DE ANÁLISES

BIOLÓGICAS
 OBJETIVOS

-Estabelecer as metodologias analíticas de investigação

dos coliformes totais, coliformes fecais, coliformes
termotolerantes e bactérias heterotróficas.

-Analisar os métodos bacteriológicos da água como:

método dos tubos múltiplos, números mais prováveis
(NMP), método da membrana filtrante e método do
substrato cromogênio.

-Interpretar os resultados obtidos nas análises

biológicas.
 MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS DE
AVALIAÇÃO DA ÁGUA
MÉTODO DOS TUBOS MÚLTIPLOS
-Enterobactérias - bacilos Gram-negativos isolados no
trato gastrointestinal de humanos e animais, solo, águas
e plantas. São oxidase negativa, não esporuladas e
reduzem nitrato a nitrito. Fermentam lactose e
produzem gás.
-Coliformes totais - indicadores de contaminação
pertencentes a família Enterobacteriaceae. Os gêneros
são: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter.
-Coliformes termotolerantes ou fecais - indicadores
de contaminação fecal. Toleram altas temperaturas (até
44,5°C).
 MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS DE
AVALIAÇÃO DA ÁGUA

MÉTODO DOS TUBOS MÚLTIPLOS

-É um método probabilístico, sendo importante para

determinar o número mais provável (NMP) de bactérias
do grupo coliformes em 100 ml de água (NMP / 100 ml).
 MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS DE
AVALIAÇÃO DA ÁGUA

MÉTODO DOS TUBOS MÚLTIPLOS

-Para a primeira fase (presuntiva) utilizamos o caldo

lactosado, que é um meio de enriquecimento. O caldo
lactosado, como seu próprio nome diz, oferece
lactose à bactéria. Como sabemos, os coliformes
pertencem às enterobactérias, microrganismos
fermentadores de lactose.
 MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS DE
AVALIAÇÃO DA ÁGUA

MÉTODO DOS TUBOS MÚLTIPLOS

- Na etapa confirmatória o meio utilizado é o caldo

lactosado verde brilhante bile de boi 2%. O objetivo
deste caldo é mimetizar as condições intestinais,
fornecendo determinada concentração de sais
biliares. Estes sais provocam certa pressão osmótica,
"matando" qualquer bactéria que não esteja habilitada
a viver no intestino - em outras palavras, somente os
coliformes totais sobrevivem.
 MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS DE
AVALIAÇÃO DA ÁGUA

MÉTODO DOS TUBOS MÚLTIPLOS

- Para a pesquisa de termotolerantes é necessário o

caldo EC, que também é um meio seletivo, somente
permitindo o crescimento das bactérias de origem
fecal que sobrevivem a 44,5°C.
 MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS DE
AVALIAÇÃO DA ÁGUA

- MÉTODO DOS TUBOS MÚLTIPLOS

(Teste confirmatório)

Neste tipo de ensaio, como o próprio nome diz, vai se

confirmar a presença de coliformes totais, que podem
ser das espécies presentes nos animais Escherichia coli
e algumas espécies Klebsiella sp., além de Citrobacter
sp.e Enterobacter sp., que são bactérias ambientais.
 MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS DE
AVALIAÇÃO DA ÁGUA

- MÉTODO DOS TUBOS MÚLTIPLOS

(Teste confirmatório)

Após preparo do caldo lactosado verde brilhante bile

de boi 2% (ou simplesmente "verde brilhante"), também
com tubos de Durham, vai-se inocular 1 ou 2 alçadas
dos tubos que foram positivo no teste presuntivo. Isto
é, se dos 15 tubos da série presuntiva 6 derem positivos,
os 6 devem ser passados para o verde brilhante para
fazer a confirmação para o grupo coliforme.
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS DE
AVALIAÇÃO DA ÁGUA

- MÉTODO DA MEMBRANA FILTRANTE

-Método para contagem de micro-organismos aeróbios

mesófilos, permitindo variação do meio de cultura, de
acordo com o objetivo da pesquisa:
-Capela de fluxo laminar
-Conjunto de porta-filtro esterilizado
-Meio de cultura requerido par ao teste
-Bomba de vácuo
-Membrana filtrante quadriculada com porosidade de 0,45
µm e diâmetro aproximado de 47 mm
 MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS DE
AVALIAÇÃO DA ÁGUA

- MÉTODO DA MEMBRANA FILTRANTE

-Filtrar, sob vácuo, através da membrana filtrante, 100 ml

(ou, 250 ml no caso de água engarrafada) da amostra de
água colhida.
-Colocar cada uma das membranas filtrantes sobre o meio
seletivo para coliformes contido em placas de Petri,
evitando a formação de bolhas de ar entre a membrana e
o meio.
-Incubar as duas placas com as membranas, uma a 37°C
e a outra a 44.5ºC, durante 24 horas.

-
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS DE
AVALIAÇÃO DA ÁGUA
- MÉTODO DA MEMBRANA FILTRANTE
-Contar as colônias amarelas formadas na superfície do
meio sólido contido em cada uma das placas incubadas a
37ºC ou a 44.5ºC .
-Estimar o nº presumível de Unidades Formadoras de
Colónias (UFC) de coliformes totais e de coliformes fecais
(termotolerantes) presentes em 100 mililitros da água
analisada (ou, em 250 ml de águas engarrafadas).
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS DE
AVALIAÇÃO DA ÁGUA
- MÉTODO DO SUBSTRATO CROMOGÊNIO
-Baseia-se na utilização de substratos análogos à lactose
(glicopiranosídeos) específicos para Escherichia coli.
-Ao serem consumidos pelas enzimas geram produtos
colridos solúveis ou insolúveis.
-Quantificação do produto – espectrofotômetro ou cor
visual ou comparação com o padrão.
-Depende do tipo de enzima a ser utilizada.
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS DE
AVALIAÇÃO DA ÁGUA
- MÉTODO DO SUBSTRATO CROMOGÊNIO
-Baseia-se na utilização de substratos análogos à lactose
(glicopiranosídeos) específicos para Escherichia coli.
-Exemplos ONPG (Orto Nitrofenil Galactopiranosídeo)
MUG (Metil-Umbeliferone Galactopiranosídeo).
-Ferramenta poderosa na identificação de E. coli (teste
confirmativo).