Laura Conceio 20092768 Maria da Conceio 21009154 Juceline Camar 21006814

Pesquisa de indicadores microbiolgicos da qualidade da gua

Resumo: Com a realizao deste trabalho prtico pretende-se avaliar a qualidade de amostras de guas (amostra da gua do lago da quinta das conchas e amostra de gua do mar da praia de cascais) atravs da pesquisa de indicadores microbiolgicos (indicadores de poluio fecal). Utilizando o mtodo da filtrao por membrana, verificamos se havia presena de indicadores de poluio fecal (coliformes totais, coliformes fecais, estreptococos fecais e clostridium) e quantificamos o nmero de colnias de m.o indicadores presentes na gua.

Introduo: A gua um elemento indispensvel vida e no dia-a-dia do Homem. Constitui um factor essencial do saneamento bsico e da higiene. Ao longo dos tempos a produo de resduos tem aumentado em grande escala. Consequentemente aumenta a poluio e a contaminao das guas. Relativamente noo de qualidade da gua, o conceito relativo uma vez que o que a caracteriza a funo para que esta se destina. Para consumo directo, a qualidade da gua avaliada por qualidades fsicas ( cor,turbidez, cheiro e sabor) e microbiolgicas. Os maiores riscos associados contaminao das guas so provocados pelas descargas de resduos orgnicos (fezes de animais de sangue quente incluindo o Homem) nas massas de gua, transportando consigo m.o patognicos que pem em risco a sade publica. Por isso fundamental o tratamento das guas brutas e residuais, contribuindo para a salvaguarda da qualidade da gua utilizada para consumo directo e indirecto do Homem e para proteco ambiental. Um dos maiores agentes de poluio hdrica, como j anteriormente foi referido, so os microorganismos, como tal, estes so utilizados como indicadores da qualidade da gua, servindo de referncia para a deteco de contaminaes patognicas. Um organismo indicador, para ser considerado como tal, deve obedecer a alguns critrios: permitir a anlise de todo o tipo de guas; existir sempre em nmero superior e na presena de organismos patognicos tal como ser mais resistente a desinfeces do que estes; no podem ser nocivos ao Homem; a sua concentrao deve ter uma relao directa com os nveis de poluio e as suas tcnicas de identificao devem ser de fcil e rpida execuo,

inequvocas e ter uma grande especificidade e sensibilidade para os microorganismos em questo, devem tambm ser passveis de detectar baixas concentraes do indicador. Os indicadores da qualidade da gua mais utilizados so conhecidos por indicadores clssicos e tornam possvel a deteco de contaminaes de origem fecal. So parte destes organismos os coliformes totais e fecais, os estreptococos fecais e os clostridios (m.o anaerbios, esporulados e redutores de sulfito). Os coliformes totais e fecais, da famlia Enterobacteriaceae, so microorganimos habitantes do tracto intestinal do ser humano e outros animais, representando cerca de 10% dos organismos ai presentes. Este grupo de organismos so caracterizados por serem Gram negativos, facultativamente anaerbios, oxidase-negativos, no esporularem e possurem forma de bastonete. Crescem em condies aerbias em meio de cultura selectivo contendo sais biliares. So capazes de fermentar lactose, em 48h a 37C, com produo de cido e gs. Deste grupo de microorganismos fazem parte Eschetichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae. Os enterococos fecais, geralmente reconhecidos como indicadores de contaminao fecal, so microorganismos com uma temperatura ptima de crescimento de 45C, na presena de 40% de sais biliares e em concentraes de cloreto de sdio de 6,5%, condies inibidoras do crescimento dos organismos coliformes e da maior parte das bactrias. So constitudos, por exemplo, por Enterococcus faecalis, E.faecium, E.avium, E.durans, E.gallinarum. A sua presena indicaria contaminao fecal de origem animal. Os clostridios anaerbios, esporulados, redutores de sulfito so microorganismo Gram positivos, em forma de bastonete. um habitante do tracto intestinal do Homem e de outros animais, sendo portanto, um indicador de poluio de origem fecal. um organismo resistente depurao natural e ao cloro, os seus esporos conferem-lhe uma maior resistncia, permanecendo, assim, no meio durante uma perodo de tempo considervel quando em comparao com outros microorganismos. A sua presena torna possvel concluir que a gua em estudo sofre de uma contaminao remota ou intermitente. Representa cerca de 95% dos microorganismos anaerbios, redutores de sulfito, presentes em fezes e guas residuais em menor nmero do que os coliformes e enterococos fecais.

Parte experimental Preparao das solues: A amostra de gua utilizada para a nossa actividade prtica foi recolhida do lago da quinta das conchas. Fizemos 3 diluies da amostra: 1/10 = 10-1 ; 1/100=10-2 ; 1/1000=10-3

10ml de gua da amostra+90ml de gua estril.

10ml de gua do tubo 10 +90ml de gua estril.

-2

10ml de gua do tubo de

10-1 +90ml de gua

estril.

Procedimento

Realizao dos mtodos de confirmao: Estreptococos fecais: Resultado positivo: Placas pretas Coliformes totais Resultado positivo: Formao de gs nos tubos e passaram de verdes para amarelos Coliformes fecais Resultado positivo: Formao de gs nos tubos

Fundamento do mtodo Para avaliao da qualidade da gua, procura-se a presena de m.o indicadores de contaminao fecal presentes nas amostras de gua. So eles: Coliformes totais e fecais Estreptococos fecais (Enterococos) Anaerbios sulfitos redutores (Clostridium)

Estes m.o esto presentes nas fezes dos seres vivos e no so patognicos, mas a sua presena nas guas indica uma grande probabilidade de existir contaminao por agentes patognicos, causadores de doenas. A utilizao destes indicadores deve-se facilidade de os qualificar em laboratrio e atravs de tcnicas simples e mais econmicas. Alm da deteco da presena de indicadores, fundamental determinar o nmero desses m.o presentes na gua. As amostras devem estar diludas de modo a que o nmero de colnias fique compreendido entre 10 e 100. Estes critrios de grau de exigncia de qualidade da gua esto estabelecidos, em Portugal, em decreto lei publicados no Dirio da repblica. Existem vrios mtodos de anlise bacteriolgica de guas, sendo eles:

Mtodo das membranas filtrantes: Utilizado para guas de consumo ou pouco contaminadas: consoante o grau de contaminao, usa-se diferentes volumes ( guas mais contaminadas usa-se um menor volume gua, at mnimos de 10ml).

Filtrao sobre vcuo, de um volume adequado da gua a analisar atravs de uma membrana filtrante, com uma porosidade entre 0,20micras( para Clostridia) e 0,45micras(para Enterococos e Coliformes), onde ficam assim retidas estas mesmas bactrias. Tal pode ser feita atravs de uma bomba de vcuo ou com um funil de Buchner, por suco.

Colocao da membrana sobre uma placa de Petri, num meio de cultura apropriado para a seleco de um grupo especfico de microrganismo indicador. Realizao da incubao da placa a uma temperatura adequada a cada microrganismo a analisar: 37C para Enterococos, Coliformes totais e Clostridia; e 44C para coliformes fecais. Durante 48 horas.

Observao e contagem das colnias formadas em cada meio ( considera-se que cada colnia originada por um nico m.o) Realizao da confirmao do tipo de microrganismos indicadores atravs da repicagem dos mesmos ( seleccionar as membranas que apresentam contagens entre 20-60 colonias) para meios selectivos adequados a cada um, durante 48 horas temperaturas indicadas: 44C para Enterococos e Coliformes fecais e 37C para Coliformes totais. Para os Clostridia, ser pela colorao apresentada.

O resultado final devera estar expresso em U.F.C/100ml de amostra.

Fermentao por tubos mltiplos para Coliformes totais e fecais (principalmente):

Inoculao de diferentes volumes de amostra em tubos com meio selectivo, adequado a cada microrganismo indicador. Incubao dos mesmos tubos a 37C para Coliformes totais e a 44C para Coliformes fecais, durante 48 horas. Observao e contagem dos microrganismos de acordo com o numero de tubos que apresentam crescimento com reaco caracterstica. Realiza-se a confirmao da existncia dos microrganismos e o resultado final expresso em N.M.P/100ml de amostra pela tabela de MacCrady

Para cada microrganismo indicador, so utilizados diferentes tipos de incorporao: Enterococos - distribui-se por placas de Petri o meio de cultura SlanetzBartley (oxoid), filtra-se a amostra previamente diluda utilizando a membrana de filtrao, que de seguida colocada na placa e incubada. A confirmao realizada pela repicagem das colnias formadas para placas de azidaEsculina com Karamicina. Coliforme fecal e totais - embebe-se almofadas de papel com meio de Lauryl Sulphate e coloca-se em placas; filtra-se a amostra e incuba-se. A confirmao feita pela repicagem de 5 colnias em mais ou menos 5 tubos de meio liquido de verde brilhante 2% (coliformes totais) e meio liquido de EC (coliformes fecais). Clostridia - destribui-se por tubos de ensaio o meio de Agar com Sulfito de Ferro, liquefaz-se 2 tubos em banho quente na altura da inoculao; filtra-se a amostra anteriormente aquecida a 80C durante por 10 min para obrigar a esporular, e colocase a membrana na placa de forma invertida; coloca-se o meio por cima da amostra pois trata-se de um microrganismo anaerbio. De modo a confirmar a presena destes indicadores, o meio apresenta uma colorao preta.

Resultados

Coliformes totais lago gua bruta P%C T= P= P% C T= P= P- 22 % C T= P= P% C T= P= P% C T= P= P% C T= P= P% C T= P= praia P%C T= P=

Coliformes fecais lago P%C T= P= P- 11 % C T= P= P% C T= P= P% C T= P= P% C T= P= P% C T= P= P% C T= P= praia P%C T= P=

Enterococos lago P- 115 %C T= P= P- 18 % C T= P= P% C T= P= P% C T= P= P% C T= P= P% C T= P= praia P%C T= P= P- 74 % C T= P=

clostridium lago P%C T= P= P- 3 % C T= P= P% C T= P= P% C T= P= P% C T= P= P% C T= P= P% C T= P= praia P%C T= P=

P % C

resultados presuntivos ( contagem de colnias nas placas) percentagem de colnias nas placas de acordo com os resultados obtidos resultados confirmativos ( obtidos atravs das mtodos de confirmao )

T : nmero de tubos ou placas que se testaram P: nmero de resultados positivos

 Clculo do UFC/100ml do nmero de colnias: Enterococos lago

gua bruta: x= 575 UFC/ 100ml

Diluio 10-1 : x= 90 - Aplicando o facto de diluio: 90 x 10 = 900 UFC/100ml - fazendo a mdia dos dois valores obtidos:

Enterococos praia x = 370

- Aplicando o facto de diluio: 370 x 10 = 3700 UFC/ 100ml

Coliformes totais x = 110

- Aplicando o facto de diluio: 110 x 10-2 = 11000 UFC/ 100ml

Coliformes fecais x = 55

- Aplicando o facto de diluio: 55 x 10 = 550 UFC/ 100ml

Clostridium x = 15

- Aplicando o facto de diluio: 15 x 10 = 150 UFC/ 100ml

Tabela com os resultados finais em UFC/100ml: Coliformes totais ---------------11000 UFC/100ml Coliformes fecais -------------550 UFC/100ml Enterococos 3700 UFC/100ml 738 UFC/100ml Clostridium -------------150 UFC/100ml

Praia Lago

Discusso A partir da anlise das diferentes quantidades dos indicadores de qualidade da gua podemos tirar vrias concluses. A existncia de um nmero relativamente superior de Enterococos relao aos Coliformes indica que a poluio hdrica de origem fecal mista na sua maioria animal (para ser contaminao de origem animal, os valores UFC/100ml de enterococos tinham que ser 4 vezes superiores relativamente aos valores de coliformes). Embora os Clostridium no estejam em maior quantidade estes esto presentes num nmero significativo. A presena de Clostridium indicativo da realizao de descargas intermitentes na gua do lago da quinta das conchas. Estas bactrias so capazes de realizar esporulao em condies adversas, um importante mecanismo de sobrevivncia em caso de concentrao baixa de nutrientes, oxignio em elevadas concentraes, temperatura e pH desfavorveis, entre outros. A sua presena permite-nos retirar concluses em relao ao estado do meio em que se encontram. Assim, podemos concluir que as condies do meio em que se encontram no so favorveis, obrigando a que estas bactrias reproduzam-se por esporulao.

Como encontrmos um nmero considervel de indicadores de contaminao na gua em estudo, pudemos afirmar que existe uma grande probabilidade desta possuir organismos patognicos.