CURSO: PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO

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BIOMEDICINA LABORATÓ RIO DE ANÁ LISES AMBIENTAIS- LAM
Pontifícia Universidade Católica de Goiás

PROCEDIMENTO: Aná lise de Coliformes Fecais Totais, Termotolerâ ntes e Escherichia coli pela Técnica de Tubos Mú ltiplos

INTRODUÇÃO

Coliformes: A presença de coliformes na á gua indica poluiçã o e sua ausência é indicativo de uma á gua bacteriologicamente
potável, visto que sã o mais resistentes nesse ambiente que as bactérias patogênicas de origem intestinal (CETESB, 1984). O
grupo coliforme inclui todos os bacilos Gram-negativos, aeró bios ou anaeró bios facultativos, nã o formadores de esporos,
oxidase-negativos, capazes de crescer na presen;a de sais biliares ou outros compostos ativos de superfície com
propriedades similares de inibiçã o de crescimento e que fermentam a lactose com produçã o de aldeído, á cido e gá s à 35 °C
em 24 - 48 horas. Quanto à s técnicas de detcçã o, considera-se do grupo Coliforme aqueles organismos que na técnica dos
Tubos Mú ltiplos (ensaios presuntivo e confirmativo) 2 fermentam a lactose, com produçã o de gá s, à 35 °C; no caso da
Técnica da Membrana Filtrante, aqueles que produzem colô nias escuras, com brilho metá lico à 35 °C, em meios de cultura
do tipo Endo, no prazo má ximo de 24 horas.

Coliformes totais: A maior parte das bactérias do grupo coliforme pertencem aos gêneros Escherichia, Klebsiela,
Enterobacter e Citrobacter. Podem ocorrer no meio ambiente, fezes humanas, em á guas com alta concentraçã o de matéria
orgâ nica, solo ou vegetaçã o em decomposiçã o. Uma vez que o grupo dos coliformes totais é composto de gêneros que nã o
sã o exclusivamente de origem fecal, a sua aplicaçã o como indicador específico de contaminaçã o fecal fica limitada.

Coliformes termotolerantes( ou fecais): microorganismos capazes de fermentar a lactose a 44-45°C sendo representados
principalmente pela Escherichia coli (fecal). Somente Escherichia coli dentre estes microorganismos é de origem
exclusivamente fecal, estando presente em densidades elevadas nas fezes humanas, mamíferos e pá ssaros, sendo raramente
encontrada na á gua ou no solo que nã o tenham recebido contaminaçã o fecal. Dentre todas do grupo Coliforme a E. coli é a
ú nica bactéria que possui a enzima β-D glucoronidase- presente em 95% das linhagens de E. coli- requerida para a hidró lise
do MUG.

OBJETIVOS

Identificar/isolar, dentro das bacterias do grupo de bactérias Coliformes, as bacterias mais comumente encontradas no
trato intetsinal de seres de sangue quente, a fim de investigar a poluiçã o de cursos de á gua, eficiência de desinfecçã o de
sistemas de tratamento de á gua, de efluentes industriais e domésticos, balneabilidade de praias, rios e monitoramento
sistemá tico para classificaçã o da qualidade da á gua de rios.

PRINCÍPIO DO MÉTODO

Por meio de um sistema de cultura em mú ltiplos tubos, com tubo invertido de Durhan, e diluiçã o em série, obter uma
quantificaçã o de bactérias pertencentes ao grupo de Coliformes Fecais, por meio da observaçã o de turvaçã o, fermentaçã o da
lactose e formaçã o de CO2, sedimentaçã o ao fundo, cor amarelada ou luminescência azulada.

FRASCO PARA COLETA

De vidro neutro ou plá stico autoclavável ató xico, com capacidade mínima de 125 mL, boca larga e tampa à prova de
vazamento.
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MATERIAIS
27. Lâ mpada ultravioleta
1. Balança 28. Estantes de plá sticos.
2. Banho-Maria
3. Destilador de á gua ou aparelho para desionizaçã o
4. Autoclave
5. Estufa
6. Bomba de Vá cuo
7. Frasco Kitassato
8. Frascos
9. Porta-Filtro de Vidro
10. Incubadora Bacterioló gica
11. Refrigerador
12. Potenciô metro
13. Balõ es
14. Frasco para coleta de amostra
15. Provetas
16. Tubos de ensaio
17. Tubos de Durhan
18. Frasco para á gua de diluiçã o
19. Pipetas
20. Placas de Petri
21. Alças de inoculaçã o
22. Bandejas de plá stico ou aço inoxidável
23. Bicos de Bü nsen ou incinerador
24. Estantes de aço inoxidável galvanizado
25. Membranas filtrantes
26. Pinças

MÉTODO

Para todos os microrganismos pesquisados aplicou-se a técnica convencional dos tubos mú ltiplos a qual subdivide-se no
ensaio presuntivo, confirmativo e completo expressando-se os resultados em nú mero mais provável de colô nias por 100 mL
(NMP).

1. Ensaio Presuntivo: Consiste na inoculaçã o de volumes de 10 ml; 1,0ml e 0.1 mL de á gua a ser analisada numa série de
10 tubos. Os tubos que recebem inó culos de 10 mL têm meio de cultura contendo 10 ml de meio com concentraçã o
dupla, a fim de compensar a diluiçã o. Os volumes de 1 e 0,1 mL da amostra sã o inoculados em meio de concentraçã o
simples, em casos que amostra d’á gua a ser analisada tenha sofre grande contaminaçã o. O ensaio visa ao
enriquecimento da amostra e um resultado positivo, dentro de 24-48h, é apenas sugestivo de á gua contaminada, já que
o grupo de Coliformes envolvem bactérias que nã o podem ser de exclusividade fecal, difernetemente das E. coli que
ocorrem predominantemente no trato intetsinal de animais de sangue quente, além da possibilidade de contaminaçã o
do meio por outros microorganismos.

2. Ensaio Confirmativo: Todos os tubos positivos no ensaio presuntivo devem ser submetidos ao ensaio confirmativo, o
qual consiste na inoculaçã o dos ensaios presuntivos positivos em meio de cultura seletivo para a bactéria ou grupo de
3. bactérias pesquisadas, reduzindo-se a possibilidade de ocorrência de resultados falso-positivos. Um resultado positivo
confirma a presença de bactérias indicadoras de contaminaçã o.

4. Ensaios Complementares: Este ensaio é caracterizado pela realizaçã o de provas adicionais, nã o sendo obrigató rio.
Consiste na utilizaçã o de provas bioquímicas adicionais para identificaçã o da espécie ou quando se suspeita da
interferência de microrganismos nos ensaios anteriores.
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PROCEDIMENTO

1. ESQUEMA

1. 10 tubos de ensaio com 10 ml cada de caldo LTS

2. Pipetar 10 ml de amostra da á gua (Frasco de Coleta).
OBS: Ao final a soluçã o terá 20ml (10 ml de LTS e 10 ml de amostra).
3. Apó s incubaçã o de 24 a 48h , observar em qual houve formaçã o de gá s.
OBS: Caso a á gua seja muito contaminada, devera ser incluída, antes do preparo dos meio de cultura, 3 diluiçõ es
seriadas com 5 tubos para cada uma (15 ao total), da seguinte forma:
1. Diluir 10 ml, retirado diretamente do Frasco de Coleta, em 90 ml de á gua peptonada e identificar com o ponto de
coleta, nú mero e diluiçã o 1:10;
2. Desta diluiçã o 1:10, adicionar 10 ml em 5 tubos, contendo 10ml de caldo lactosado (Caldo Lauril Triptose-LTS).
Diluiçã o dos tubos 10¯¹;
3. Em outros 5 tubos contendo 10ml de LTS, prosseguir dando continuidade numérica e com a mesma identificaçã o
dos tubos anteriores, adicione 1ml da diluiçã o 1:10. Diluiçã o final 10¯²;
4. Nos ú ltimos 5 tubos, prossiga com a mesma identificaçã o numérica e de diluiçã o e acrescente 0,01ml da diluiçã o
1:10. Diluiçã o final 10¯³;
5. Incubar de 24 a 48h entre 35-36 graus.
6. Separar os meios em que houve turbidez, formaçã o de gá s, pelo tubo de Durhan, e sedimentaçã o;
OBS: A partir de agora começa as etapas de confirmaçã o/seleçã o com os Caldos Lactosado (LTS), BVB, EC e EC-MUG,
listados abaixo na etapa 3. ANÁLISE DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS;
OBS: Pode se fazer o cultivo direto das amostras positvas em uma placa de petri com meio EC-MUG para diferenciaçã o
Qualitatida de E.coli e pode utilizar também o ONPG, para detecçã o de outros tipos de coliformes fecais totais,
comentado no pró ximo tó pico Método Enzimá tico. Caso seja requerido uma metodologia Quantitativa, deve-se pegar os
tubos positivos (incluindo os de diluiçã o) e seguir com as etapas listadas na etapa 3. ANÁLISE DE COLIFORMES POR
TUBOS MÚLTIPLOS.
1. Semear por esgotamento de alça em meio de cultura EC-MUG em uma placa de petri as amostras positivas
submetidas (15 tubos) ou nã o (5 tubos com 10ml de amostra e 10ml de Caldo LTS) à s diluiçõ es seriadas;
2. Observar a coloraçã o amarelada indicativa de positividade para coliformes fecais totais mediada pela ONPG
e/ou/concomitantemente a luminescência azul das colô nias em que houve crescimento bacteriano com auxílio de
uma lâ mpada/lanterna ultravioleta, mediada pela MUG contida diretamente em meio EC ou caldo.
OBS: Ao invés de utilizar as amostras dos tubos positivos, os Métodos Enzimá ticos podem ser utilizados diretamente no
Frasco da Coleta (com 100ml de amostra). A partir daí a positividade e negatividade sã o realizado da mesma forma,
porém diretamente nos frascos de coleta. Utilizados dessa forma, caracterizam-se como Método Qualitativo também.

2. PREPARO DE MEIO DE CULTIVO- utilizando o Caldo Lactosado como exemplo:

A. Calcular a quantidade de meio de cultura para fazer 50 ml de Caldo Lactosado-, utilizando regra de três;
B. Destacar e identificar um papel, com lados de comprimento iguais, com o nome do Caldo LTS e a quantidade do
meio em gramas a ser utilizado, seguindo o ró tulo do fornecedor;
C. Dobrar suavemente o papel, de uma ponta a outra (ambos os lados);
D. Separar uma proveta com o volume 50 ml
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E. Dobrar suavemente o papel, de uma ponta a outra (ambos os lados);

F. Separar uma proveta com o volume 50 ml;
G. Separar um balã o volumétrico de fundo chato (evitar vidraria com o“pescoço” longo) com o dobro de capacidade
para o Volume Final: Caldo LTS e Á gua Desionizada, ou seja os 50 ml;
H. Utilizando o papel como suporte, pesar a quantidade precisa de Caldo LTS em uma balança de precisã o
(descontando o peso do papel), (a balança precisa estar em um ambiente protegido de ventilaçã o, ensolaçã o ou
calor excessivo);
I. Verta uma pequena quantia da á gua desionizada para o balã o volumétrico;
J. Para facilitar, forme um “funil” com as pontas do papel e despeje o Caldo LTS dentro do balã o;
K. Aos poucos, despeje o restante da á gua, ainda utilizando o papel como “funil”, sempre girando o balã o a fim de
desempregnar/limpar a superfície interna do balã o volumétrico e o papel (nã o descarte o papel);
L. Misturar delicadamente o balã o, evitando empregnaçã o do líquido, até a dissoluçã o do meio;
M. Apó s, preparar um rolo, de algodã o hidrofó bico, (evitar deixar partes doltas) suficientemente espesso para tampar
a boca do balã o;
N. Cobrir a boca do balã o volumétrico, sem deixar abas abertas, com o papel identificado e fita crepe (pouca fita para
facilitar a remoçã o);
O. Levar ao autoclave, observando as instruçã o do fornecedor para temperatura, tempo, pressã o, arrefecimento e
introduçã o de reagentes adicionais necessá ria para a esterilizaçã o/funacionalidade do meio.

3. ANÁLISE DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS- testagem quantitativa

A. Teste para Coliformes

i. Já relatado na etapa 1. ESQUEMA.

B. Teste de Confirmação para Coliformes Fecais Totais

i. Os tubos contendo TLS com positividade devem ser repicados em outros tubos contendo Caldo BVB, mantendo as
identificaçõ es do tubo anterior. Antes do repique deve ser feito uma homogenizaçã o do tubo com caldo LTS positivo
por inversã o;
ii. Incubar por 24h em 36-37 grau;
iii. Apó s, observar quais tubos tiveram formaçã o de gá s, turvaçã o e sedimentaçã o no fundo. Os que tiveram formaçã o
de gá s sã o separados para repique e os negativos incubados por mais 24h para confirmaçã o de negatividade.
iv. OBS: Os dois Testes a seguir devem ser feito paralelamente, caso seja necessá rio a diferenciaçã o para Escherichia
coli na amostra.
v. OBS: Preparar Caldos EC-MUG para diferenciaçã o de E.coli e Caldo EC para a Determinaçã o de Coliformes Fecais
Termotolerantes.

C. Teste de Determinação de Coliformes Fecais Termotolerantes

i. Identificar novos tubos contendo Caldo EC e repicar os tubos positivos com Caldo BVB, mantendo sempre as
identificaçõ es;
i. Fazer a homogenizaçã o por inversã o antes do repique dos tubos com positividade;
ii. Incubar por 24h em a 44,5-45,5 grau;
iii. Apó s observar quais tubos tiveram, formaçã o de gá s. Os que tiveram formaçã o sã o tubos positivos para presença de
Coliformes Fecais Termotolerâ ntes.
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D. Teste de Confirmação de E. coli

i. Identifciar novos tubos contendo Caldo EC e repicar os tubos positivos com Caldo EC-MUG, mantendo sempre as
identificaçõ es;
ii. Fazer a homogenizaçã o por inversã o antes do repique dos tubos com positividade
iii. Incubar por 24h em a 35-36 graus;
iv. Apó s incubaçã o, levar os tubos a uma sala escura e submetê-los à exposiçã o de luz ultravioleta. A presença de
luminosidade azul-flourescente revela positividade para Escherichia coli.

Observações adicionais

 A quantidade de tubos e diluiçã o utilizada para preparo da primeira etapa do teste presentivo [A)-i] dependerá da
“presuntividade” da qualidade de á gua amostral, respondendo a seguinte pergunta: A á gua retirada como Amostra tem
sugetividade de contaminaçã o, há indícios de grande interferência antropoló gica?. Se houver muita cntaminaçã o, é
necessá rio três ou mais séries de diluiçã o: 1:1 (10 tubos), 1:10 (10 tubos), 1:100 (10 tubos) etc;
 As diluiçõ es devem sempre ser feitas utilizando água peptonada;
 O Caldo utilizado em [A)-i], pode ser utilizado em dobro (ou seja, o dobro de meio de cultura para 10ml de amostra),
caso a amostra seja “presumida” como pouco contaminada.

MÉTODO ENZIMÁTICO- Qualitativo

I. ONPG- Orto-nitrofenil-beta-D-galactopiranosídeo

Quando degradado pela beta-galactosidade resulta num produto de coloraçã o amarelada. Detecta a atividade da enzima
beta-galactosidase no metabolismo fermentativo da lactose. Enzima esta comum a todos os Coliformes.

II. MUG- 4-metilumbeliferil-beta-D-glicuranídeo

Quando degradado pela enzima beta-glicuronidase, resulta em 4-metilumbeliferona, que é flourescente sob luz UV. É o
método enzimá tico diferencial para Escherichia coli.

CÁLCULO/ FÓRMULA

O Nú mero Mais Provável (NMP) de coliformes é expresso como a densidade média de bactérias contidas em 100 mililitros
de amostra, ou NMP de coliformes fecais/100 ml (NMP CF/100 ml).

Como alternativa à utilizaçã o da fó rmula, pode—se observar os resultados de positividade dos tubos e comparar com as
tabelas de NMP e os procedimentos completos para aná lise de coliformes, disponíveis em:
http://paginapessoal.utfpr.edu.br/arcoelho/microbiologia-de-alimentos/roteiros-de-aulas-praticas/roteiros-de-aulas-
praticas/TabeladeHoskins.PDF ou Resoluçã o do CONAMA N° 20 - 18/06/1986. As quais contêm combinaçõ es de
possibilidade de positividade para 3 tubos de diluiçã o 1:1. Ou seja, diluiçõ es de amostras com grande contaminaçã o deve-se
pegar os resultados (positividade entre os tubos) e lançar na fó rmula: NMP / mL = P / √NT.
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INTERPRETAÇÃO

Expressão dos resultados em número mais provável de bactérias por 100mL (NMP): A combinaçã o de resultados
positivos e negativos no ensaio confirmativo permite a obtençã o de uma estimativa da densidade original das bactérias
(NMP) através da aplicaçã o de cá lculos de probabilidade, predeterminados na tabela de Hoskins. Os resultados sã o, entã o,
expressos em nú mero mais provável de bactérias por 100mL.

REFERÊNCIAS

1- CETESB. NORMA TÉ CNICA L5.202: Coliformes totais, coliformes termotolerâ ntes e Escherichia coli- Determinaçã o
pela Técnica de tubos mú ltiplos. 5 ediçã o. Rio de Janeiro, 2018. 29 pá ginas. Disponível em:
https://cetesb.sp.gov.br/wp-content/uploads/2018/01/Para-enviar-ao-PCSM_-NTC-L5.202_5%C2%AAed-_dez.-
2018.pdf. Acessos em: 21 de set. 2023
2- https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4115599/mod_resource/content/0/Microbiologia
%20%C3%A1gua.pdf.
3- https://abre.ai/gOHX .