ANA PAULA DARIF

ANGELA REBONATTO

CLAUDIA PASIN

FRANCIELI PAZINATTO CIPRIANI

NATACHA MORIANA CANEI

CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES FECAIS

PINHALZINHO – SC

2012
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA

CENTRO EDUCAÇÃO SUPERIOR DO OESTE – CEO

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

ANA PAULA DARIF

ANGELA REBONATTO

CLAUDIA PASIN

FRANCIELI PAZINATTO CIPRIANI

NATACHA MORIANA CANEI

CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES

FECAIS

Relatório apresentado à disciplina de

Microbiologia de Alimentos,
ministrada pela professora Morgana
Karin Pierozan, como condição
parcial para a aprovação no referido
curso.

PINHALZINHO – SC

2012
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INTRODUÇÃO

A classificação dos coliformes apresenta o grupo de coliformes totais que incluem as

bactérias na forma de bastonetes gram-negativos, não esporogênicos, aeróbios ou
aeróbios facultativos, capazes de fermentar a lactose com produção de gás, quando
incubados a 35-37ºC, por 48 horas.

Fazem partes desse grupo predominantemente bactérias pertencentes aos gêneros

Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella. Destes, apenas a Escherichia coli
tem como hábitat primário o trato intestinal do homem e animais homeotérmicos. Os
demais - Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella -, além de serem encontrados nas fezes,
também estão presentes em outros ambientes como na vegetação e no solo, onde
persistem por tempo superior ao de bactérias patogênicas de origem intestinal como
Samonella e Shigella.

Coliformes fecais são um sub-grupo de bactérias coliformes totais. A presença de

coliformes fecais em uma amostra de água potável, muitas vezes indica a contaminação
fecal recente. O que indica que há um risco maior de haver patógenos presentes do que
apenas as bactérias coliformes totais serem detectadas.

As bactérias pertencentes a este grupo correspondem aos coliformes totais que

apresentam a capacidade de continuar fermentando lactose com produção de gás,
quando incubadas a temperaturas de 44-45ºC. Os critérios microbiológicos que
envolvem E.coli são úteis quando é desejável determinar se houve contaminação fecal.
E. coli é a mais conhecida, sendo seu habitat o trato gastrintestinal e ela é a indicadora
de contaminação fecal, em alimentos processados.

Os grupos dos coliformes totais e fecais são os indicadores mais utilizados para
avaliar a qualidade microbiológica da água. Estes indicadores são também usados para
avaliar a qualidade de águas superficiais, águas balneário, águas para rega e águas
residuais. Os coliformes são membros da família Enterobacteriaceae.

Conforme o artigo Avaliação microbiológica das águas dos bebedouros do Campus I

da Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro, em relação à presença de coliformes
totais e fecais, no Brasil, as normas são definidas pela portaria 1469 de 29/12/2000
(2/01/2001) – Ministério da Saúde, capítulo IV Padrão de potabilidade. Estas definem
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que água para consumo humano deve ser livre de Escherichia coli ou coliformes
termotolerantes com ausência em 100 mL ou positividade de até 5% para coliformes
totais.

É de grande importância a presença de coliformes nos alimentos para a indicação de

contaminação durante o processo de fabricação ou mesmo pós-processamento. Os
micro-organismos indicadores são grupos que, quando presentes em um alimento,
podem indicar a ocorrência de contaminação fecal, sobre a provável presença de
patógenos ou sobre a deterioração potencial de um alimento, além de poder indicar
condições sanitárias inadequadas durante o processamento, produção ou
armazenamento.

A presença de coliformes totais no alimento não indica, necessariamente, conta-

minação fecal recente ou ocorrência de enteropatógenos.
A maioria dos coliformes são encontrados no meio ambiente. Essas bactérias
possuem limitada relevância higiênica. Devido ao fato de os coliformes serem
destruídos com certa facilidade pelo calor, sua contagem pode ser útil em testes de
contaminações pós-processamento.
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MATERIAIS E MÉTODOS

MATERIAS

*Bico de Bunsen;

É um dispositivos usado para efetuar aquecimento de soluções em relatórios.

*Autoclave

É um aparelho utilizado para esterilizar artigos através do calor úmido sob

pressão.

*Stomaker;

É um equipamento usado em laboratórios para fazer a homogeneização do saco

de Stomaker. O saco de Stomaker é utilizado para colocar a amostra, e fazer a sua
pesagem, antes de fazer as suas analises.

*Erlenmeyer;

É um frasco em balão, usado como recipiente em laboratório, feito de material

de vidro, plástico, é ideal para armazenar e misturar produtos e soluções, cultivo de
organismos e tecidos e também usado em titulações.

*Pipetas;

É um instrumento de medição e transferência rigorosa de volumes líquidos.

*Duran;

*Becker;

*Tubos de Ensaio;

É um recipiente usado para efetuar reações químicas de pequena escala com

pequenas quantidades de reagentes de cada vez.

*Alça de Platina;

Usada para captar elementos da colônia e coloca-los em novo meio.

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*Meio de Cultura Escherichia Coli;

É recomendado para contagem de coliformes fecais. Cuidado especial deve ser

dado ao inóculo de amostras maiores que 1ml. Por exemplo, inóculo de 10ml deve ser
realizado em 10ml do meio com sua formulação dobrada.

*Meio de Cultura Verde Brilhante;

O caldo Bile Verde Brilhante 2% é um meio seletivo para coliformes totais

recomendado para confirmação de testes confirmativos para organismos coliformes em
analises bacteriologicas de agua, aguas residuos, alimentos, leites e laticnios.

O verde brilhante e a bile inibem o desenvolvimento de outros organismos não

coliformes, assim como: Clostridium perfringens.

*Água Peptonada;

Na preparação de diluições padronizadas de micro-organismos, transferência de

entre meios, manutenção por tempos curtos exige-se a utilização de um diluente inerte,
com pH e pressão osmótica estáveis, livre de carboidratos que favorecem o crescimento
bacteriano, o que leva ao acumulo de ácidos e outros excretas tóxicos. A água
peptonada 0,1% preparada com a solução tamponada de Sorensen.

*LST;

Caldo Lauril Triptose, é recomendado pela APHA para detecção presuntiva de

coliformes na água, efluentes e esgoto pelo teste MPN e para detecção de coliformes em
alimentos.
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MÉTODOS

ANÁLISE DE COLIFORMES FECAIS E COLIFORMES TOTAIS EM ALIMENTOS

Primeiramente pesou-se 25mL de iogurte de morango, com auxilio de um pipeta

de 10ml; misturou-se na amostra 225ml de água peptonada 0,1% ( já preparada dentro
de um Erlenmeyer ).

Homogeneizou-se o recipiente por aproximadamente 1 minuto, a partir da

solução da amostra juntamente com a água peptonada, fez-se as diluições.

Imagem 01. Diluição seriada

Da amostra (1:10) retirou-se 1ml através da pipeta, sendo adicionada ao tubo de

ensaio, que continha 9ml de água peptonada, fazendo a diluição 2 (1:100).

Do tubo de ensaio com (1:100), foi retirado novamente 1ml, fazendo a diluição 3
(1:1000), em outro tubo de ensaio, também contendo 9ml de água peptonada.

Se pega as três diluições (1:10), (1:100) e (1:1000) e inoculamos distribuindo

1ml de cada uma das 3 diluições, para cada 3 tubos de ensaio, sendo que, em cada 1
desses 3 tubos de ensaio, continha 10ml de LST em concentração simples.
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Após feitas as inoculações, incubamos em estufa a 35°C, por 24 a 48 horas,

sendo neste caso, 24 horas, o restante da amostra, é descartado com devido. Se durante
esse período de inoculação, as amostras derem negativo para a incidência de micro-
organismos, deve-se fazer a reincubação das mesmas.

Passada às 24 horas observou-se que todas as inoculações; exeto um dos tubos

de ensaio de diluição 10-²; deram positivas, ou seja, nos outros tubos de ensaio
restantes, no total 8, houve a formação de gás, detectados através de bolhas, que são
percebidas devido o auxilio do tubo de Durham, presentes nos tubos.

Imagem 02 – Resultados obsevados com auxilio do tubo de Durham. Observa-se a

formação de gás.

As inoculações das amostras que deram positivas foram transferidas através de

alçadas, para meios de cultura de Verde Brilhante (V.B) (contagem de coliformes
totais), e após para Escherichia coli (E.C) (contagem de coliformes fecais).
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Imagem 03 – Diluições das amostras no meio LST

Havia 1 tubo de ensaio de Escherichia coli, e 1 tubo de ensaio de Verde

Brilhante para cada tubo de LST que deram positivas, como 8 das 9 inoculações deram
positivas, usou-se 8 tubos de ensaio com V.B e 8 tubos com E.C.

Abriu-se o tubo com a inoculação do alimento (10-¹), pegou-se uma alçada,

através da alça descartável, posteriormente inoculada no meio de cultura V.B e da
mesma forma, uma alçada para o meio de cultura E.C; assim feitas também com as
demais diluições 10-¹. O mesmo procedimento foi seguido para as diluições de 10-² e
10-³.

Imagem 04 – Teste confirmativo

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Feita a inoculação, tanto para V.B quanto para E.C, incubou-se na estufa o V.B a
35°C, de 24/48 horas, e em banho Maria o E.C a 44, 5°C por 24/48 horas, após as 24/48
horas, foram feitas as contagens dos micro-organismos, através das tabelas
representadas nos resultados e discussões.

ANÁLISE DE COLIFORMES FECAIS E COLIFORMES TOTAIS EM ÁGUA

Tem-se uma amostra de água, essa amostra deve ser homogeneizada. Nossa
amostra foi coletada diretamente da fonte, em uma propriedade rural, em um poço
caxambu.

Fez-se as diluições de 10ml da amostra (10-0), para 5 tubos de ensaio (10-¹, 10-²,
10-³, 10-4, 10-5), contendo 9ml de LST em concentração dupla em cada tubo de ensaio.

Após feitas as diluições incubou-se em estufa por 35°C, em torno de 24/48

horas. Passou-se o tempo de incubação e verificou-se que todos os 5 tubos de ensaio
com a amostra, apresentaram turvação e presença de gás, isso devido a presença do tubo
de Durham.

As inoculações das amostras que deram positivas foram transferidas através de

alçadas, para meios de cultura de Verde Brilhante (V.B) (contagem de coliformes
totais), e após para Escherichia coli (E.C) (contagem de coliformes fecais).

Havia 1 tubo de ensaio de Escherichia coli, e 1 tubo de ensaio de Verde

Brilhante para cada tubo de LST em concentração dupla que deram positivas, como as 5
inoculações deram positivas, usou-se 5 tubos de ensaio com V.B e 5 tubos com E.C.

Abriu-se o tubo com a inoculação do alimento (10-¹), pegou-se uma alçada,

através da alça descartável, posteriormente inoculada no meio de cultura V.B e da
mesma forma, uma alçada para o meio de cultura E.C; assim feitas também com as
demais diluições 10-¹. O mesmo procedimento foi seguido para as diluições de 10-² ,
10-³, 10-4 e 10-5.

Feita a inoculação, tanto para V.B quanto para E.C, incubou-se na estufa o V.B a
35°C, de 24/48 horas, e em banho Maria o E.C a 44, 5°C por 24/48 horas, após as 24/48
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horas, foram feitas as contagens dos micro-organismos, através das tabelas

representadas nos resultados e discussões.
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RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados referentes á contagem de coliformes fecais e totais no alimento, no

caso, no iogurte Daninha, deram negativos, ou seja, não houve crescimento de nenhuma
das duas formas de contagem, concluindo-se que o iogurte não possui coliformes fecais,
nem totais.

Na contagem feita para a amostra de água, houve a presença de coliformes

totais, para todos os tubos de ensaio, feitos através do meio de cultura Verde Brilhante,
e também houve presença de coliformes fecais, para todos os tubos de ensaio, feitos
através do meio de cultura Escherichia coli.

De acordo com a tabela de Números Mais Provável (NMP) e intervalo de

confiança a nível de 95% de probabilidade, para diversas combinações de tubos
positivos e negativos na inoculação de 5 porções de 10ml da amostra por tubo:

Numero de tubos NMP/100ml Mínimo Máximo

positivos
5 >16 8,0 infinito

Portanto, em 5 tubos de ensaio positivos o NMP ( Número Mais Provável) de

contaminação por coliformes fecais e coliformes totais na água em inoculação de 10ml
de amostra por tubo com intervalo de confiança a nível de 95% de probabilidade é
maior que 16,0; onde o mínimo é de 8,0 e o máximo é de infinito, ou seja, incontável.

Portanto, a amostra de água é imprópria para consumo, pois apresenta números

significativos de contaminação, tanto por coliformes fecais, quanto por coliformes
totais.
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CONCLUSÃO

Após as analises feitas, conclui-se que na amostra de iogurte não teve presença
de coliformes totais e nem de coliformes fecais, os resultados foram esperados, pois
esse produto é submetido a procedimentos rigorosos de controle de qualidade e de
processos de pasteurização em altas temperaturas.

Já na amostra de água, houve presença de coliformes totais como de coliformes

fecais. Considerando que a amostra não era tratada, e sim, foi coletada diretamente da
fonte isso pode ter influenciado na proliferação de determinados micro-organismos.
Conclui-se que essa água esta fora dos padrões especificados pelas normas, pois o
numero mais provável de contaminação por micro organismo para este experimento,
superou os estabelecidos, desobedecendo aos critérios especificados pelo regulamento.
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Cristina. Análise microbiológica de águas minerais e de água potável de
abastecimento, Marília, SP. Rev. Saúde Pública. 2002, vol.36, n.6, pp. 749-751.
ISSN 0034-8910.

GEUS, Juliana Aline Mascarenhas de. ANÁLISE DE COLIFORMES TOTAIS

E FECAIS: Um Comparativo entre técnicas oficiais VRBA e Petrifilm EC aplicados
em uma indústria de carnes. UTFPR

OLIVEIRA, Ana Carolina Santana de. Avaliação microbiológica das águas dos
bebedouros do Campus I da Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro, em
relação à presença de coliformes totais e fecais. Revista da Sociedade Brasileira de
Medicina Tropical 37(3):285-286, mai-jun, 2004.

M.P.SILVA. Avaliação do padrão coliformes a 45ºc e comparação da eficiência

das técnicas dos tubos múltiplos e Petrifilm e E.coli na detecção de coliformes totais
e Escherichia coli em Alimentos. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, SP. abr.-jun.
2006

TORTORA, Gerard J; FUNKE, Berbell T; CASE, Chistine L. Microbiologia.

6ed. Porto Alegra: Artmed, 200. 827p.

Acessado em <www.ebah.com.br>, acesso em 09 de maio de 2012.