Técnica de Análise de Coliformes Totais e Fecais

BIOLOGIA
Os coliformes totais e fecais são os microrganismos mais abundantes como contaminantes
ambientais e possuem várias técnicas de identificação e meios de cultura seletivos e diferenciais.
A técnica mais utilizada para análise de água para a identificação de coliformes é a quantitativa
dos tubos múltiplos.
Ela é também utilizada para microrganismos termotolerantes. Para a coleta da água é utilizado
um frasco estéril com cerca de 100ml e transferidos 10 ml da amostra para uma série de três
tubos com 10 ml de caldo lauril duplo ou caldo lactosado duplo (concentração dupla de
nutrientes) com tubo de Duran invertido (tubo de vidro pequeno, colocado de boca para baixo
dentro dos tubos com caldo para reter os gases formados durante o crescimento microbiano e
indicar positividade no teste).
Após o término da primeira bateria de testes é realizada a segunda bateria, que consiste em
transferir 1 ml da amostra de água para três tubos com 9ml de caldo lauril simples ou caldo
lactosado simples, com tubo de Duran.
Por último é realizada a terceira bateria de testes, quando é transferido 0,1ml para três tubos com
9 ml de caldo lauril simples ou caldo lactosado simples, com tubo de Duran invertido. Incubar as
três séries de tubos em estufa a 35ºC por 48 horas. Resultados: (Positivos) Tubos turvos, com
formação de bolhas de gás nos tubos de duran invertidos, indicando a presença de possíveis
organismos coliformes e (Negativos) não há a formação de gás nos tubos de Duran.
Após a confirmação de coliformes (testes positivos) é necessário identificar se é um coliforme
total (microrganismos presentes nas fezes em pequenas quantidades) ou coliformes fecais
(microrganismos presentes nas fezes em grandes quantidades, como a E. coli).
A amostra com tubos positivos deve ser transferida com uma alça de inoculação, um tubo com
10 ml de caldo verde brilhante com tubo de Duran invertido e incubada por 24 horas a 35ºC.
Resultados: (Positivo): Presença de gás no tubo de Duran é indicativo de Coliformes Totais e
(Negativo): ausência de gás nos tubos de Duran.
No próximo passo, os tubos positivos de caldo verde brilhante são transferidos para um tubo com
9 ml de Caldo EC com tubo de Duran invertido por meio de uma alça de inoculação e incubado
em estufa a 44ºC por 24 horas. Resultados: (Positivo): Presença de gás no tubo EC é indicativo
de coliformes fecais (E. coli) e termotolerantes e (Negativos): Ausência de gás.
Os tubos positivos de caldo EC são inoculados em um meio de cultura seletivo para a
identificação das colônias de coliformes e identificação de cepas. Geralmente os meios mais
utilizados são o Ágar MacConkey e Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB).
No Ágar MacConkey as colônias de E. coli são de coloração rosa a vermelho e no meio EMB as
colônias são de coloração escura a verde brilhante. Por último é recomendado pesquisar as
características bioquímicas da bactéria, inoculando uma colônia do meio em um tubo com meio
de Rugai e Araújo e alterada a constituição do meio, conforme a utilização do nutriente no tubo.
https://www.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/biologia/tecnica-de-analise-de-coliformes-
totais-e-fecais/15561

Análises de coliformes por

tubos múltiplos
GALERIA
Publicado em 3 de setembro de 2013

A técnica de tubos múltiplos é a mais tradicional para a análise

de coliformes (totais ou termotolerantes) e E.coli. Esta metodologia permite a quantificação por
“número mais provável” (NMP) de microorganismos e é dividida em duas fases sucessivas, uma
presuntiva e outra confirmativa. E esta ultima somente é realizada se houver crescimento positivo na
etapa presuntiva.
O procedimento da fase presuntiva consiste em fazer a homogeneização e transferência de alíquotas
e/ou diluições da amostra para tubos de ensaios contendo, no fundo, um tubo invertido para coleta de
gás (tubo de Durhan), e o meio de cultura apropriado (caldo lauril triptose). Todos os tubos são
incubados a 35°C durante 24 a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento
(positivo) de coliformes totais, resultado identificado pela ocorrência de reação ácida (coloração
amarelada) ou produção de gás (retida no tudo de Durhan).
Diluições de tubos de ensaio contendo tubo de Durhan invertido

Na fase confirmativa, efetua-se o repique (transferência de alíquotas com alça de platina) dos tubos
presuntivos positivos para tubos preparados da mesma forma que no anterior, porém contendo caldo
verde brilhante. Todos os tubos são incubados a 35°C durante 24 a 48 horas e posterior identificação
dos que tiverem crescimento (positivo) de coliformes totais, identificado pela ocorrência de produção
de gás nos tubos de Durhan.
A fase complementar serve para identificação dos coliformes termotolerantes, na qual faz-se o
repique dos tubos presuntivos para outros tubos, desta vez contendo meio EC (recomenda-se que seja
feito simultaneamente ao teste confirmativo), que deverão ser incubados a 44,5ºC durante 24 horas.
Todo este procedimento totaliza no mínimo 72 horas para obtenção de resultado positivo para
coliformes termotolerantes.
De acordo com o número de tubos positivos em cada uma das diluições e das fases utilizadas,
determina-se o número mais provável (NMP), tendo como base tabelas estatísticas.