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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE RONDÔNIA
CAMPUS GUAJARÁ-MIRIM.

Teste seletivo para detecção presuntiva de coliformes totais,

coliformes fecais e Escherichia coli pelo método Número
mais provável (NMP) e a Identificação da presença do
Staphylococus Aureus

Docente: Cícera Alexsandra Costa dos Santos

Discente: Eliana Castro
Izis da Cruz
Mª Aparecida
Samara Nunes
Waldir de Jesus
Wellinton Douglas

GUAJARÁ- MIRIM/ RO
Novembro de 2019
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1. INTRODUÇÃO

A técnica de diluição do número mais provável ( NMP) é empregada para estimar o

número de microrganismos de uma amostra a partir de respostas onde os resultados são
reportados como positivos ou negativos em única diluição ou para diluições múltiplas; Suas
principais aplicações são a contagem de coliformes totais, coliformes fecais e E.Coli em água e
alimentos.
Os coliformes totais compõem os grupos de bactérias gram-negativas que podem ser
aeróbicas ou anaeróbicas (isto dependerá do ambiente e da bactéria), não originam esporos e
fermentam a lactose, produzindo ácido e gás à 35/37°C. Os coliformes fecais são também
conhecidos como “termotolerantes” por suportarem uma temperatura superior à 40°C, convivem
em simbiose com humanos, bois, gatos, porcos e outros animais de sangue quente,são excretados
em grande quantidade nas fezes e normalmente não causam doenças (quando estão no trato
digestivo). Neste grupo está presente a bactéria gram-negativa Escherichia coli, e ao se ingerir
alimentos por ela contaminados, os resultados desagradáveis (como uma gastrenterite, por
exemplo) podem ser brandos ou desastrosos, dependendo do grau de contaminação.
A Staphylococcus aureus é uma espécie das muitas do gênero dos estafilococos, um tipo
de bactéria integrante da flora residente no corpo humano. Normalmente ela permanece no corpo
sem causar doenças, ela está presente nas fossas nasais de 20 a 30% das pessoas.

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1 OBJETIVOS

É aplicar a técnica do número mais provável (NMP) na detecção de coliformes totais e fecais
(E.Coli) e a detecção de Staphylococus aureus em uma amostra de bolo de coco é uma amostra
de pudim.

2.2 MATERIAL UTILIZADOS

Por que a realização da prática nos permite o estudo, identificação e análise do meio cultura.
1) Reagentes
a. Ágar Sal Manitol
b. Peptona
c. Caldo Lauril
d. Água destilada
e. Corante cristal violeta
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f. Corante Fucsina
g. Álcool 70%
h. Óleo de imersão
2) Equipamentos de Vidrarias
a. Balança Analítica
b. Autoclave
c. Placas de Petri
d. Erlenmeyer 125ml e 500ml
e. Algodão
f. Bastão de vidro
g. Provetas de 500ml
h. Fita controle de autoclave
i. Espátulas
j. Lâminas
k. Becker 50ml e 100ml
l. Tubos de ensaio
m. Pipetas volumétricas c/Pêra
n. Vela
o. Alça de Drigalski
p. Papel toalha
q. Ponteira
r. Pincel
s. Frasco com tampa de rosca
t. Estante de suporte
u. Faca de Serra.
v. Bandeja de alumínio.
w. Colher de alumínio.
x. Tesoura.
y. Fita de medição de Ph.
z. Microscópio.
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PROCEDIMENTO
Passo 1- Foi pesado 1 g de Casean Peptona em um Becker de 50ml, depois pesamos 13.32g de
Sal Manitol em um Erlenmeyer de 250ml e por último 4.31g de Caldo Lauril. Foi realizada a
diluição de 1g de peptona no pote de vidro contendo 225 ml de água destilada, após a diluição
foi retirado 9ml de água pepitonada para dois tubos de ensaio. Foi reservado 10 tubos de ensaio
contendo 8ml de caldo Lauril, foi realizado a desinfecção da área com álcool 70 para eliminar
microrganismos externo.
Passo 2 - Isolamos as 06 (seis) placas de Petri, 01 (um) Pote de Vidro de 400ml contendo água
pepitonada, tubos de ensaio, bandeja de alumínio, faca e a colher com papel madeira e
acrescentamos um pedaço da fita de controle de autoclave e identificamos, após a identificação
os matérias foram autoclavados por 15 minutos a 121º C
Passo 3 – Foi utilizada a bandeja para pesar 25g do bolo e transferido para o pote de vidro que
continha 225 ml de água pepitonada (diluição 10-1) e diluindo totalmente o bolo.
Passo 4 – Diluições seriadas da amostra: Para a preparação da segunda diluição (10-2), foi
transferido 1,0 ml da diluição (10-1) para 9ml de diluente. As diluições subsequentes, são
obtidas de maneira similar, transferindo-se 1ml da diluição anterior para 9ml do diluente.
Passo 5 –Foi medido o Ph do caldo Lauril antes da inoculação na água pepitonada usando tiras
de medir o Ph que deu resultado -7.Na diluição ( 10-1) foi passado 1ml para a diluição (10-2) e
desta foi passado 1 ml para diluição (10-3), toda transferência de produto foi realizado próximo
de uma vela para evitar contaminação com meio externo.
Passo 6 – após a transferência do produto para os tubos de ensaio que continha 8 ml de caldo
Lauril foi levada para estufa bacteriológica em uma temperatura de 35º C por um período de 24
a 48h para verificação de presença de coliformes totais (caso Positivo haverá presença de gases
no tubo de ensaio)
Passo 7 – após a retirada dos tubos de ensaio após 48h de incubação verificou-se na diluição 10-
1 a presença de sedimentação no fundo do tubo com formação de película e liquido turvo, na
diluição 10-2 foi verificado tubo com liquido com coloração mais transparente do que a solução
10-1 e com presença de sedimentação e sem a presença de película, foi verificado na diluição
10-3 liquido translucido e sem presença de sedimentação. Obtendo resultado negativo para
presença de coliformes totais, após a verificação foi realizado novamente a medição do Ph das
diluições 10-1,10-2,10-3 com seguintes resultados diluição 10-1 apresentou o nível de Ph 6, a
diluição 10-2 e 10-3 apresentou Ph 7.
Passo 8 – procedimento para detecção de Staphylococus aureus foi realizada preparação do meio
de cultura nas placas de petri de foi reservado em um Erlenmeyer 120 ml de água destilada e foi
acrescido 13.32g de Sal manitol a mistura foi autoclavada a 121º C por 15 minutos após a
autoclavagem a mistura foi distribuída de forma uniforme em 6 placas de petris.
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Passo 9 - Foi utilizada a bandeja para pesar 25g de Pudim transferido para o pote de vidro que
continha 225 ml de água pepitonada (diluição 10-1) para homogeneização e total diluição do
Pudim.
Passo 10 Diluições seriadas da amostra: Para a preparação da segunda diluição (10-2), foi
transferido 1,0 ml da diluição (10-1) para 9ml de diluente. As diluições subsequentes, são
obtidas de maneira similar, transferindo-se 1ml da diluição anterior para 9ml do diluente.
Passo 11 - após realização da separação dos diluentes foi realizado a retirada da solução 10-1
com auxílio da pipeta volumétrica 1 ml transferido para a diluição 10-2 que continha 9 ml de
água pepitonada e da diluição 10-2 foi transferido 1 ml para diluição 10-3 que continha 9 ml de
água pepitonada.
Passo 12 – foi transferido da diluição 10-1, com auxílio da pipeta volumétrica 0,1ml para duas
placas de petris, e das diluição 10-2 e 10-3 repetiu-se o processo da diluição 10-1, cada diluição
previamente preparadas e secadas com auxílio da alça Drigalski até todo o excesso de liquido
seja absolvido, em seguida as placas fora incubadas invertidas a 35º C por 48h e em seguida foi
obtido o resultado do crescimento de colônias.
Passo 13 - Foi usado 06 lâminas para fazer o teste da catalase utilizando 01 gota de Peróxido de
hidrogênio a 3% é com o auxílio de uma ponteira foi retirada uma parte da colônia e observou-se
a presença de borbulhamento imediato (teste positivo) ou não (teste negativo).
Passo14 – Realização da Técnica da Coloração de Gram – selecionar a lâmina que deu positivo
para catalase cobrindo com cristal violeta e deixar agir por 1minuto e verter o corante, remover o
excesso da solução de cristal violeta da lâmina, lavando-a levemente em água corrente, utilizar a
solução de rugou e deixar agir por 1minuto e retirar em seguida lavando com um filete de água,
decorar o esfregaço usando uma solução de álcool acetona, rapidamente (10 a15
segundos).Lavar com água corrente imediatamente, cobrir o esfregaço com fucsina deixando por
30segundos e retirar lavando com água corrente e secar com papel absorvente a parte inferior da
lâmina, após realização da coloração de Gram foi observado a lâmina no microscópio utilizando
uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço corado utilizando a objetiva de 100x obtendo o
resultado negativo para presença de Staphylococus aureus e constatando a presença de Bacilos
Gram positivos.

Passo 15 - Realização da coagulasse – foi colhido uma amostra de sangue da Aluna Neyliane,
desta amostra foi obtido 250 ml de plasma, colocar 0,5 ml de plasma no tubo de ensaio e com
auxílio da ponteira retirou -se uma amostra da colônia e transferida diretamente para o plasma,
incubar por 4h a 32º C em estufa obtendo resultado negativo para coagulasse.
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RESULTADOS E DISCUSSÃO

No laboratório foi feito o teste presuntivo de coliformes totais, coliformes fecais e Escherichia
coli pelo método Número mais provável (NMP), também foi feita a Detecção de Staphylococus
aureus utilizando a Técnica de Coloração de Gram, Teste da Catalase e Teste de Coagulasse e
alcançamos os seguintes resultados:
Método Número mais provável (NMP) – Resultado Negativo
Coloração de Gram – Ausência de Cocos Gram Positivo mais com presença de Bacilos Gram
Positivo.
• Teste da Catalase – De 06 lâminas testadas apenas 02 borbulharam obtendo-se resultado
Positivo
• Teste de Coagulasse – Resultado Negativo
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2.3 CONCLUSÃO

Foi concluído nessas aulas práticas que através de alguns testes específicos e possível detectar a
presença de microrganismos como os Coliformes Totais, Coliformes Fecais e Escherichia Coli,
assim como se pode detectar Staphylococus aureus, através da utilização de uma pequena
amostra de algum alimento que foi manipulado ou armazenado inadequadamente. também
Nessa mesma aula podemos aprender a preparar álcool 70% e todos os procedimentos
adequados para a manipulação e aplicação de teste de qualidades em alimentos.

3.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Método Número mais provável (NMP).
Disponível em: https://pt.scribd.com/document/268844974/Metodo-do-Numero-Mais-
Provavel.Acesso em 23/11/2019.
Staphylococus aureus
Disponível em: https://www.instein.br/noticias/noticia/o-que-staphylococcus-aureus.Acesso
em 23/11/2019.
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Em Anexos
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