Universidade de São Paulo – USP

Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” – Esalq

Departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição - LAN

LAN 0451 - AÇÚCAR E BEBIDAS

Análises microbiológicas: viabilidade e brotamento de

leveduras

Prof. Antonio Sampaio Baptista

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 1.INTRODUÇÃO

 Métodos para determinação da viabilidade de leveduras

- Plaqueamento em meio de cultivo;
- Observação microscópica;
 Os métodos de contagem direta no microscópio são rápidos
e simples, exigem um mínimo de equipamento, permitindo que
seja observada, simultaneamente, a morfologia celular;

Este aspecto é extremamente importante porque a

tolerância da levedura ao seu produto de fermentação, o
etanol, é bastante significante em relação à eficiência de
produção de álcool em fermentações em escala industrial.

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 1.INTRODUÇÃO

 No controle da viabilidade celular nos processos de

produção de levedura (fermento prensado) e fermentação
alcoólica (álcool), a coloração das células de levedura com
azul de metileno ou eritrosina são os mais empregados.

Princípio do método de coloração com azul de metileno

 A técnica de coloração com azul de metileno consiste em

se misturar partes iguais da suspensão de levedura
(amostra), adequadamente diluída, e da solução corante
(azul de metileno). As células com alta atividade fisiológica
(vivas) não se colorem, enquanto as células inativas (mortas)
se apresentam coloridas de azul (Figura 1).
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 1.INTRODUÇÃO

Figura 1. Determinação da viabilidade celular de leveduras com

azul de metileno. As células coradas de azul são células
mortas enquanto as incolores são células viáveis (A foto
foi cedida por C.D. Tosta). 5
 2. Procedimento analítico

a) Pontos de amostragem

- Dornas no final de fermentação (dorna morta)

- Pé-de-cuba

b) Método de amostragem

As amostras devem ser coletadas usando frascos

limpos, os quais podem ser mergulhados diretamente
com as mãos nos pontos de coleta ou,
preferencialmente, utilizando um coletor tipo caneca
limpo. Deve-se evitar a análise após 1 h da coleta do
material.
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 2. Procedimento analítico
Levedura

Diluição
em série

1 mL 1 mL

Diluição
1:103 Lâmina

0,1 mL
9 mL 9 mL 9 mL
H2O H2O H2O
célula célula
viva morta Observação

Pierce, 1970.
40 a 60 células por
campo de observação
Figura 1 – Esquema ilustrativo da análise de viabilidade celular7 em
leveduras.
 2. Procedimento analítico

2.2 Interpretação dos resultados

1 célula viva 1 célula viva 2 células vivas

1 broto

1 célula morta 1 célula viva 1 célula morto 2 células mortas

1 broto morto 1 broto morto

% de viabilidade = (número de células não coradas /número total de células) X

100

% de brotamento =(número de brotos não corados/número total de células) x 100

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% de células mortas = 100 - % de viabilidade
 2. Procedimento analítico

2.3 Contagem em câmara de Neubauer

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Figura 2 – Ilustrações representando uma câmara de Neubauer
 2. Procedimento analítico

2.3.1 Contagem em câmara de Neubauer

Figura 3 – Ilustração representando as regiões de contagem em 10

uma câmara de Neubauer
2. Procedimento analítico

2.3.1 Contagem em câmara de Neubauer

Áreas de contagem dos quadrantes A

Áreas de contagem dos quadrantes C

Figura 4 – Ilustração identificando as regiões de contagem em

uma câmara de Neubauer 11
 2. Procedimento analítico

2.3.2 Cálculos dos resultados obtidos em câmara de Neubauer

No quadrante A - contar o número de células de leveduras

observados nos 4 quadrantes A e dividir o
valor por 4.

Número de células de leveduras mL-1 = N x 104 x D

Onde: N = médio de células de leveduras contados nos campos A

D = fator de diluição

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 2. Procedimento analítico

2.3.2 Cálculos dos resultados obtidos em câmara de Neubauer

No quadrante B  - contar o número de células de leveduras

observados em 3 sub-quadrantes (b) de B,
dois do canto e um central e dividir por 3.

Número de células de leveduras mL-1 = N x 2,0 x D x 105

Onde: N = médio de células de leveduras contados em b
D = fator de diluição

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 2. Procedimento analítico

2.3.2 Cálculos dos resultados obtidos em câmara de Neubauer

No quadrante C  - contar o número de células de leveduras

observados em 5 sub-quadrantes (c) de C, os
4 do canto e o sub-quadratne central e
dividir por 5.

Número de células de leveduras mL-1 = N x 2,5 x 105 x D

Onde: N = médio de células de leveduras contados em c

D = fator de diluição

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 2. Procedimento analítico

2.3.3 Exemplo
Contagem no quadrante b:

Número de células de leveduras mL-1 = N x 2,0 x D x 105

Onde: N = médio de células de leveduras contados em c
D = 10 15
 2. Procedimento analítico

2.3.3 Exemplo
Contagem no quadrante c:

Número de células de leveduras mL-1 = N x 2,5 x D x 105

Onde: N = médio de células de leveduras contados em c
D = 100 16
 3. Considerações finais

 A determinação da viabilidade das células de leveduras por

análise microscópica é uma técnica simples e rápida;

 A observação ao microscópico de células de leveduras

submetidas à coloração com azul de metileno permite
determinar a viabilidade dessas células em uma população;

Com o uso de uma câmara de Neubauer é possível determinar

a viabilidade das células de leveduras, bem como estimar o
número de células por mL.

 A análise da viabilidade das leveduras em um processo de

fermentação permite verificar se a população de leveduras do
processo fermentativo está normal ou em condições não
desejáveis. 17
 Referências

1 - COPERSUCAR. Centro de Tecnologia. Divisão Industrial -

Fermentação. 434p., 1987.
2 - ROSE, A.H. & HARRISON, J.S. The yeasts. 2 nd ed. Academic
Press, London, 1987, vol. 2 nd. 309 p.
3 - SECATO-ANTONINI, S.R. Métodos de análises e
monitoramento microbiológico em laboratório de destilaria. São
Carlos:UFScar, 2004. 34p.
4 - OLIVEIRA, A.J.; GALLO, C.R.; ALCARDE, V.E.; GODOY, A.;
AMORIM, H.V.; Métodos para o controle microbiológico na
produção de álcool e açúcar.
Piracicaba:FERMENTEC/FEALQ/ESALQ-USP, 1996. 89p.
5 - PELCZAR, M.; REID, R,; CHAN,E.C.S. Microbiologia. São Paulo,
McGraw-Hill do Brasil, 1996.
6 - PIERCE, J.S. Analysis committee measurement of yeast viability.
Journal of the Institute of Brewing, v.76, n.5, p.442-443, 1970.
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