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Microbiologia da fermentação alcoólica: a importância do monitoramento

microbiológico em destilarias

Article · July 2011

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Sandra Antonini
Universidade Federal de São Carlos
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Coleção UAB−UFSCar
Tecnologia Sucroalcooleira

Sandra Regina Ceccato-Antonini

Microbiologia da
fermentação alcoólica
A importância do monitoramento
microbiológico em destilarias
Microbiologia da
fermentação alcoólica
A importância do monitoramento
microbiológico em destilarias
Reitor
Targino de Araújo Filho
Vice-Reitor
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Secretária de Educação a Distância - SEaD

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Sandra Regina Ceccato-Antonini

Microbiologia da
fermentação alcoólica
A importância do monitoramento
microbiológico em destilarias

2010
© 2010, Sandra Regina Ceccato-Antonini

Concepção Pedagógica
Daniel Mill

Supervisão
Douglas Henrique Perez Pino

Equipe de Revisão Linguística

Ana Luiza Menezes Baldin
Clarissa Neves Conti
Francimeire Leme Coelho
Jorge Ialanji Filholini
Letícia Moreira Clares
Luciana Rugoni Sousa
Paula Sayuri Yanagiwara
Sara Naime Vidal Vital

Equipe de Editoração Eletrônica

Christhiano Henrique Menezes de Ávila Peres
Izis Cavalcanti
Rodrigo Rosalis da Silva

Equipe de Ilustração
Jorge Luís Alves de Oliveira
Lígia Borba Cerqueira de Oliveira
Priscila Martins de Alexandre

Capa e Projeto Gráfico

Luís Gustavo Sousa Sguissardi

Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária da UFSCar

Ceccato-Antonini, Sandra Regina.

C387m Microbiologia da fermentação alcoólica : a importância
do monitoramento microbiológico em destilarias / Sandra
Regina Ceccato-Antonini. -- São Carlos : EdUFSCar, 2010.
105 p. -- (Coleção UAB-UFSCar).

ISBN – 978-85-7600-222-2

1. Microbiologia industrial. 2. Fermentação. 3. Álcool. 4.

Levedos. 5. Bactérias. I. Título.

CDD – 660.62 (20a)

CDU – 576.8:66

Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta obra pode ser reproduzida ou transmitida por qualquer
forma e/ou quaisquer meios (eletrônicos ou mecânicos, incluindo fotocópia e gravação) ou arquivada em
qualquer sistema de banco de dados sem permissão escrita do titular do direito autoral.
........... SUMÁRIO
APRESENTAÇÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

UNIDADE 1: Importância do monitoramento microbiológico no processo

fermentativo

1.1 Primeiras palavras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.2 Problematizando o tema. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.3 Fermentação alcoólica: características gerais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.4 O monitoramento microbiológico: agentes de contaminação,

métodos de detecção e formas de controle. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.4.1 Bactérias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.4.2 Floculação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.4.3 Leveduras selvagens. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.5 Considerações finais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

UNIDADE 2: Morfologia, estrutura celular, metabolismo, nutrição e

multiplicação de bactérias e leveduras

2.1 Primeiras palavras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.2 Problematizando o tema. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.3 Características gerais das bactérias e leveduras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.3.1 Bactérias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3.2 Leveduras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
 2.4 Considerações finais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

UNIDADE 3: Técnicas e métodos microbiológicos para avaliação da

contaminação microbiana

3.1 Primeiras palavras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.2 Problematizando o tema. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.3 Técnicas para avaliação da viabilidade de leveduras

no processo fermentativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.3.1 Contagem direta ao microscópio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.3.1.1 Procedimento analítico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.3.2 Diluição seriada e plaqueamento em meios de cultura. . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.3.2.1 Procedimento analítico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.4 Técnicas para avaliação da viabilidade de bactérias

no processo fermentativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.4.1 Contagem direta ao microscópio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.4.1.1 Procedimento analítico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.4.2 Diluição seriada e plaqueamento em meios de cultura. . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.4.2.1 Procedimento analítico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.5 Coloração de Gram . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

3.5.1 Procedimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

3.6 Teste de sensibilidade de bactérias a antimicrobianos . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.6.1 Procedimento analítico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

3.6.1.1 Preparo do inóculo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
3.6.1.2 Realização do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

3.7 Composição dos meios de cultura e soluções . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

3.8 Considerações finais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

Unidade 4: Caracterização de leveduras por técnicas tradicionais e
moleculares

4.1 Primeiras palavras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

4.2 Problematizando o tema. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

4.3 Técnicas utilizadas na identificação de leveduras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

4.3.1 Técnicas clássicas ou tradicionais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

4.3.2 Técnicas de biologia molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.3.2.1 Cariotipagem por meio da eletroforese em campo pulsado. . . . . . 73
4.3.2.2 Reação de polimerização em cadeia (PCR). . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4.3.2.3 DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso (RAPD). . . . . . . . . . . . . . 79
4.3.2.4 Polimorfismo de tamanho do fragmento de restrição
do DNA mitocondrial (RFLP/mtDNA). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.3.2.5 Microssatélites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

4.4 Comparação entre as técnicas de tipagem genética . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

4.5 Considerações finais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

Unidade 5: Leveduras selecionadas

5.1 Primeiras palavras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

5.2 Problematizando o tema. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

5.2.1 Fatores que afetam as leveduras fermentativas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

5.2.2 Estudo comparativo das linhagens de leveduras
utilizadas na fermentação alcoólica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
5.2.3 Estratégias para seleção de linhagens de leveduras . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

5.3 Considerações finais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

REFERÊNCIAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
 Apresentação

O setor sucroalcooleiro é uma das indústrias mais representativas do pro-

cesso de desenvolvimento brasileiro. Desde o Brasil Colônia, em que a cultura da
cana-de-açúcar foi uma das primeiras atividades econômicas, sendo até os dias
atuais, o nosso país é líder de produção e o mais competitivo na fabricação de
açúcar e álcool.

Os produtores sucroalcooleiros enfrentam constante concorrência e não de-

vem medir esforços na procura por elevada competitividade do produto nacional.
Além disso, a redução nos custos aumenta a eficiência da cadeia produtiva.

No processamento industrial da cana-de-açúcar para produção de álcool

combustível, a fermentação contínua com reciclo celular, da forma como é pratica-
da no Brasil, expõe o processo a uma série de situações que facilitam a contami-
nação por microrganismos indesejáveis. A própria levedura do processo fica tam-
bém exposta a situações estressantes, características do processo, que acabam
por afetar a viabilidade celular e consequentemente o rendimento fermentativo.

Assim é de fundamental importância que a unidade industrial monitore a

fermentação, analítica e microbiologicamente, para que a tomada de decisões
possa ser feita de forma racional e efetiva. Medições bem feitas permitem avaliar
os resultados das medidas adotadas, o retorno dos investimentos e, quando ne-
cessário, o ajuste das condições do processo.

Este livro foi então organizado com o objetivo de abordar os principais

aspectos relativos à microbiologia do processo fermentativo, apresentando as
características das bactérias e leveduras, sua importância no processo, as téc-
nicas e os métodos microbiológicos utilizados no monitoramento e a caracteri-
zação de linhagens baseada em testes morfológicos/fisiológicos e moleculares.
A importância do uso de leveduras selecionadas é também discutida na unidade
final deste livro.

Como a aplicação das técnicas de monitoramento microbiológico exige co-

nhecimentos teóricos e um treinamento prático, procurou-se ainda apresentar em
detalhes os procedimentos e protocolos utilizados para a avaliação da contami-
nação microbiana nas dornas de fermentação, porém, não houve pretensão de
esgotar o assunto.

A bibliografia ao final do livro deve servir de ponto de partida para os técnicos

buscarem temas pertinentes, pois os desafios ainda são grandes e o conheci-
mento pode ser mais aprofundado. O setor sucroalcooleiro ainda é altamente
carente de mão de obra especializada, e nesse sentido, este livro pretende dar
a sua contribuição.

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