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2004
MICROBIOLOGIA
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Módulo I
Introdução à microbiologia
4
Módulo I ......................................................................................................................... 4
Introdução à microbiologia ............................................................................................. 4
Prática 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7
Técnica de semeadura ............................................................................................... 7
Objetivo .................................................................................................................... 10
Material ..................................................................................................................... 10
Procedimento e Resultados...................................................................................... 10
Questionário ............................................................................................................. 11
PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM........................................................................... 12
Fixação e coloração de microrganismos................................................................... 12
Preparação de esfregaços e coloração pelo método de gram.................................. 13
A técnica ................................................................................................................... 15
Objetivo .................................................................................................................... 16
Material ..................................................................................................................... 16
Procedimento:........................................................................................................... 16
Resultados:............................................................................................................... 18
Questionário ............................................................................................................. 18
PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA..... 19
Objetivo .................................................................................................................... 19
Materiais ................................................................................................................... 19
Procedimento e resultados ....................................................................................... 19
A. Visualização de bactérias:.................................................................................... 19
B. Visualização de fungos......................................................................................... 20
PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21
Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21
Curvas de crescimento ............................................................................................. 22
Objetivo .................................................................................................................... 25
Material ..................................................................................................................... 25
Procedimento............................................................................................................ 25
Resultados................................................................................................................ 25
Questionário ............................................................................................................. 25
PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA
SUSPENSÃO................................................................................................................... 26
Estimativa do número de células viáveis .................................................................. 26
Problema: ................................................................................................................. 27
5
Verificação de entendimento: ................................................................................... 28
PRÁTICA 6 - AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ..................... 29
Anti-sépticos e desinfetantes .................................................................................... 29
Objetivos................................................................................................................... 31
Material ..................................................................................................................... 31
Procedimento............................................................................................................ 32
Resultados................................................................................................................ 32
Questionário ............................................................................................................. 32
PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA ...................................................................................... 32
Teoria ....................................................................................................................... 32
Objetivo .................................................................................................................... 33
Materiais ................................................................................................................... 33
Procedimento............................................................................................................ 33
Questionário ............................................................................................................. 34
PRÁTICA 8 - PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS. ............... 35
Introdução................................................................................................................. 35
Objetivo .................................................................................................................... 35
Material ..................................................................................................................... 35
Procedimento............................................................................................................ 35
Resultados................................................................................................................ 35
Questionário ............................................................................................................. 35
PRÁTICA 9 - CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS............................................................... 36
Introdução................................................................................................................. 36
Objetivo .................................................................................................................... 37
Material ..................................................................................................................... 37
Procedimento............................................................................................................ 38
Resultados................................................................................................................ 39
PRÁTICA 10 - POSTULADO DE KOCH.......................................................................... 40
Abordagem clássica ................................................................................................. 40
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PRÁTICA 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA
TÉCNICA DE SEMEADURA
Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo
mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos
presentes no ambiente, e evitar acidentes laboratoriais.
1. Flambagem da alça ou fio de platina:
Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de
qualquer operação de semeadura. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte
inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. A posição correta para
a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de
trabalho (Figura 1). Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen.
Para retirar o material, seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura, esfriar
previamente a alça. Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na
tampa da placa de petri;
2. Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a
7
boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de
algodão). Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo, da mão que está
segurando a alça ( Figura 2). Após a retirada do material com a alça, flambar
novamente a boca do tubo e colocar a tampa. Não pousar os tampões sobre a
bancada!!! Flambar a alça após o uso;
4. As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar
contaminação com germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser
incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo.
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Figura 3 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias
6. Após a primeira estria, flambar novamente a alça, girar a placa cerca de 30˚ e
puxar nova estria. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa
técnica é conhecida também por esgotamento.
7. As placas serão incubadas a 37˚C por 24h, e depois guardadas a 4˚C até a
próxima aula.
1Não esqueça!!!!!!
Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo, ou
num pedaço do ágar sem cultura), antes de colocar a alça em contato com a cultura,
lembre-se: ela está muito QUENTE!!!
Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma, sempre invertida.
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OBJETIVO
Fazer semeaduras em meios líquido e sólido de cultura de Eschirichia coli, e obter
colônias isoladas
MATERIAL
¾ alça de platina;
¾ tubo de ensaio com meio completo líquido
¾ placa de Petri com meio completo sólido;
¾ tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli.
PROCEDIMENTO E RESULTADOS
Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo, não esquecendo de
ilustrar os resultados obtidos
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C) OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS
QUESTIONÁRIO
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PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM
1) Coloração simples - cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das
células mais visíveis.
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diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool - ácido resistente são
exemplos de colorações diferenciais.
3) Coloração especial - são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas
dos microrganismos como esporos, flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas.
No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por
aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Essas substâncias são
chamadas mordentes, e é o caso do iodo na coloração de Gram. Uma outra função do
mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a
coloração.
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Parede celular constituída de uma camada
grossa de peptídeoglicano
Gram positiva
Membrana plasmática
Membrana plasmática
Gram negativa
Figura 5 – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas
Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo
penetram facilmente, e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CV-
Iodo, que é maior que a molécula de CV que penetrou. Por causa do seu tamanho o
complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células
permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta.
Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é
lavado através da camada fina de peptideoglicano, que não consegue reter o complexo.
Estas células são então contracoradas pelo segundo corante, a Safranina ou Fucsina e
aparecem vermelhas.
Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana, mas não deve
nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. É importante ressaltar que a
coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil, quando corretamente
realizada e interpretada.
14
A TÉCNICA
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OBJETIVO
Coloração de microrganismos provenientes de meios, sólido e líquido, pelo método
de Gram.
MATERIAL
¾ alça de platina;
¾ lâmina de vidro;
¾ placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido;
¾ tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído;
¾ cristal violeta a 1%;
¾ lugol;
¾ solução diferenciadora;
¾ fucsina básica;
PROCEDIMENTO:
A. PREPARO DO ESFREGAÇO
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3) Esfriá-la na tampa da placa de Petri, ou no meio sólido numa região sem colônia.
4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano.
5) Homogeneizar este material com a gota de água, cuidando para obter uma suspensão
pouco densa e sem grumos.
6) Secar a lâmina por exposição ao ar.
7) Fixar o esfregaço.
B. COLORAÇÃO
1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. ATENÇÃO PARA NÃO
COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!!
2) Lavar rapidamente em água corrente;
3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto;
4) Lavar rapidamente em água corrente;
5) Lavar uma ou duas vezes, rapidamente, com a solução diferenciadora: álcool ou acetona;
6) Lavar rapidamente em água corrente;
7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos;
8) Lavar novamente em água corrente;
9) Secar a lâmina, tomando o cuidado de não remover o esfregaço;
10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão.
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RESULTADOS:
___________________ ____________________
__________________ ___________________
QUESTIONÁRIO
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PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA
MICROBIANA
OBJETIVO
Visualização das colônias crescidas em placas contendo meio sólido e análise por
microscopia óptica e Morfologia de bactérias e de fungos .
MATERIAIS
¾ Lâminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes e
dois tipos de fungos);
¾ Microscópio ótico;
PROCEDIMENTO E RESULTADOS
Faça um esboço das características morfológicas e suas propriedades tintoriais de
cada uma das bactérias apresentadas. Repita o procedimento para os fungos
apresentados.
A. Visualização de bactérias:
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e) Cocos Gram + : Streptococcus pyogenes
B. Visualização de fungos
Filamentosos
Leveduras
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PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO
CRESCIMENTO BACTERIANO
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bilhões de mutações em pequenos intervalos de tempo.
Portanto, o crescimento bem sucedido de uma população bacteriana reflete seu
grau de adaptação a um determinado ambiente e depende primariamente de sua
composição: condições nutricionais, temperatura, pH, osmolaridade, oxigênio e luz. As
distintas espécies bacterianas diferem no âmbito de fatores dentro dos quais podem
crescer. Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condições nas quais seu crescimento
atinge uma taxa ótima.
Para se estudar o crescimento de uma bactéria é preciso cultivá-la, como cultura
pura, em meios de cultura e condições ambientais que variam em condições químicas e
físicas, tais como fontes de nutrientes, osmolaridade, pH, presença ou ausência de
oxigênio e temperatura de incubação.
O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado através do
aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (através de curvas de
crescimento) ou da estimativa do número de células viáveis presentes na população
(método de determinação do número de unidades formadoras de colônia). Não há
método perfeito; ambos os métodos apresentam vantagens e desvantagens. A escolha
do método depende da situação particular que se apresente.
CURVAS DE CRESCIMENTO
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Fase lag: fase de adaptação metabólica ao novo ambiente; o metabolismo celular está
direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas
condições ambientais encontradas pelas células. O número de indivíduos não aumenta
nesta fase, podendo até mesmo decrescer. A duração dessa fase depende das
condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente. A fase lag
será tão mais longa quanto maiores as diferenças de composição do ambiente anterior
ou se a população for constituído de bactérias esporuladas.
Fase exponencial ou logarítmica: fase na qual o número de células da população
dobra a cada geração. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente
em um sistema fechado. Após um determinado período de crescimento exponencial, as
condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais,
acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço. A taxa de crescimento da
população diminui e segue-se a fase estacionária.
Fase estacionária: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido
às condições limitantes do meio. As células continuam metabolizando e se dividindo, mas
parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de
morte celular, o que mantém constante o número de células viáveis na população. A
curva de crescimento atinge um platô. A duração da fase estacionária depende do
balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando
inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais
tornarem-se progressivamente desfavoráveis.
Fase de declínio: fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de
morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. O número de células viáveis entra em
declínio progressivo até a completa extinção da população.
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Só são confiáveis medidas de DO até 2.0. Acima disto as leituras perdem a
confiabilidade. Se a leitura de uma amostra for maior que 2.0 deve-se fazer uma diluição
10-1 dessa amostra e registrar sua DO. Para a plotagem dos dados no gráfico deve-se
multiplicar a DO obtida por 10.
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OBJETIVO
Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de E. coli
através de medidas de densidade óptica.
MATERIAL
¾ Cultura bacteriana pura;
¾ Espectofotômetro;
¾ Solução salina;
¾ Pipetas;
¾ Tubos de ensaio;
PROCEDIMENTO
Durante a aulas serão obtidos apenas alguns pontos experimentais, os demais
pontos serão medidos pelos monitores e repassados para os grupos.
RESULTADOS
A) Construir um gráfico a partir dos pontos obtidos.(Não se esqueça
de identificar os eixos, e suas unidades!!!)
B) Identificar cada uma das fases de crescimento no gráfico.
QUESTIONÁRIO
1. Quais os problemas observados na construção dos gráficos (em que etapa do
crescimento)? Você diria que todos os pontos são confiáveis? Justifique sua resposta.
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PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA
SUSPENSÃO
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adequada.
¾ células inviáveis, fragmentos de ¾ a cada diluição um erro experimental
células mortas e material difundido no meio é introduzido pela instrumentação e pelo
de cultura não interferem na obtenção de experimentador
resultados ¾ este método detecta apenas um
número muito reduzido de células, o que
prejudica a estimativa
¾ a grande quantidade de material
utilizado
A) BACTERIANA
A determinanção da concentração de bactérias é feita geralmente pela técnica de
determinação do Número de UFC (unidades formadoras de colônias).
PROBLEMA:
1. Você tem um estoque de uma super bactéria Escherichia coli (lac+). Você fez
um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada. VOCE
PRECISA RECUPERAR SUA BACTÉRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE,
QUE FAZER?
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4. Qual é a concentração da bactéria lac- contaminante (UFC/ml da cultura
original)? ( Y) _________
Qual é porcentagem da contaminação? _( Y) / (X)_____________________
B) DE LEVEDURAS
Pela técnica de contagem em câmara de ¨Neubauer¨
VERIFICAÇÃO DE ENTENDIMENTO:
Várias técnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prática. Você
saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos?
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PRÁTICA 6 - AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE
ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES
HISTÓRIA
O uso de anti-sépticos e desinfetantes evolui desde o Antigo Egito, em relação aos
processos de embalsamento, inicialmente desenvolvidos com o intuito da preservação do
corpo à ressurreição. Os egípcios e outros povos utilizaram várias misturas, tais como
óleos voláteis, resinas oleosas, vinhos, vinagres, mel, mura, bálsamo, além do fato de os
vinhos e vinagres continuarem a serem utilizados durante a Idade Média ao recobrimento
de feridas e, consequentemente, evitando a infecção.
A descoberta do cloro na Idade Média foi amplamente utilizada como substância
desodorante e anti-séptica, sendo utilizado em 1847-49 em um hospital vienense quanto
à demonstração prática da ação benéfica da anti-sepsia.
Anos mais tarde Pasteur explicou sobre a fermentação bacteriana e a existência de
agentes infectantes como responsáveis por processos patológicos. Coube a Lister, em
1865, a divulgação dos métodos de esterilização de bandagens, compressas cirúrgicas,
instrumental cirúrgico e anti-sepsia das feridas.
CONCEITOS GERAIS
Um desinfetante é uma substância usada para destruir bactérias ou outros
microrganismos infectantes. Os desinfetantes possuem atividade bactericida ou
germicida e costumam ser aplicados em superfícies inanimadas.
Uma substância anti–séptica não mata o microrganismo, mas inibe sua
velocidade de crescimento. Os anti-sépticos são valiosos no tratamento de infecções
locais causadas por microrganismos refratários a quimioterapia sistêmica. As
substâncias anti-sépticas são aplicadas ao tecidos para suprimir ou impedir a infecção
bacteriana. A concentração de anti-séptico em geral é baixa para evitar a lesão e
irritação tecidual indesejáveis. O aumento da concentração de um agente anti-séptico
pode irritar e talvez, até matar o tecido normal do hospedeiro. Bem como as células
bacterianas, interferindo assim com o crescimento normal do tecido de granulação na
cicatrização de feridas.
A diferença entre um anti-séptico e um desinfetante pode ser uma questão de
tempo de reação, número de microrganismos, concentração da droga e temperatura.
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ÁLCALIS
Os álcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigüidade. O mecanismo
de ação está relacionado à concentração do íon hidroxila. Um pH maior do que 9 inibirá a
maioria das bactérias.
ÁLCOOIS
Os álcoois alifáticos comuns são bons solventes, anti-sépticos e desinfetantes.
São utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes.
São potentes bactericidas contra micobactérias, Gram positivas, Gram negativas,
fungos patogênicos, muitos vírus e não em esporos. A presença de água é fundamental
para a atividade dos álcoois (50-70%) e são mais eficazes na ausência de sujeiras e
matéria orgânica.
Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem ótimos solventes em
relação a outros agentes germicidas, de terem ação rápida, de apresentarem baixo custo
e praticamente serem atóxicos.
As desvantagens são: baixa atividade fungicida e virucida, baixa penetrabilidade,
desidratantes, não possuírem ação residual e não devem ser utilizados para limpezas de
ferimentos abertos.
SURFACTANTES
É um composto químico que diminui a tensão superficial de uma solução aquosa.
Os surfactantes são adsorvidos em um grau significativo pelo algodão, pela borracha e
materiais porosos, diminuindo assim, a concentração eficiente e a eficácia antibacteriana.
Com base na posição hidrofóbica da molécula, há três tipos:
¾ Aniônicos : Os sabões são os mais importantes. São antibacterianos contra
microrganismos Gram negativos e ácido-resistentes;
¾ Catiônicos : Os compostos de amônio quaternário são os principais. Apesar
de possuírem efeitos limitados sobre os vírus, eles são eficientes contra
bactérias Gram positivas e Gram negativas, mas em geral, os detergentes
catiônicos não possuem ação virucida, fungicida ou esporocida, Vantagens:
Não são em geral irritantes para a pele e tecidos, baixa toxicidade, são
inodoros, podem ser usados em soluções com água e álcool.
Desvantagens: São neutralizados por surfactantes aniônicos (sabões), não
agem na presença de matéria orgânica e podem causar irritação quando
em contato prolongado com a pele, mucosas e trato respiratório.
¾ Não-iônicos.
HALOGÊNIOS
Possuem efeitos antibacterianos potentes devido à alta afinidade pelo
protoplasma. As atividades em soluções livres de matéria orgânica são, em ordem
decrescente: 1º. Cloro, 2º. Bromo, 3º. Iodo. Já, na presença de matéria orgânica o mais
ativo é o Iodo.
METAIS PESADOS
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Derivados do mercúrio
Parecem ser primariamente bacteriostáticos e apenas levemente bactericidas. A
sua ação antibacteriana está relacionada à inibição reversível da atividade enzimática
essencial da bactéria e à capacidade de se combinar com íons de compostos metálicos
orgânicos e inorgânicos. Possuem pouca atividade esporicida e são inativados por restos
orgânicos. O uso para anti-sepsia de superfícies e objetos inanimados parece
imprudente já que há agentes com um modo de ação mais eficiente.
Compostos de Prata
Produzem efeitos cáusticos, adstringentes, antibacterianos pela ação do íon de
prata livre e produz desnaturação de proteínas. Os preparados de Prata coloidal não são
corrosivos nem irritantes e são usados sobre tecidos sensíveis. A prata metálica precipita
as proteínas e produz efeito irritante.
AGENTES OXIDANTES
São compostos germicidas de ação breve sobre algumas bactérias aeróbicas
Gram+ e Gram-. Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaeróbicos,
mas não destroem esporos bacterianos. Liberam Oxigênio que se combina com a
matéria orgânica se tornando inativos.
A solução de Peróxido de Hidrogênio libera Oxigênio livre rapidamente ao entrar
em contato com mucosas e superfícies sem pêlos que fornecem a enzima catalase.
Quando é distribuído sobre ferida com exsudato, a sua efervescência vai remover o pus
e restos celulares e confere atividade germicida limitada. É valioso para limpar e
desodorizar o tecido infectado.
O Permanganato de Potássio libera Oxigênio em contato com a matéria orgânica.
As soluções possuem uma grande ação antibacteriana.
OBJETIVOS
Verificar a ação de anti-sépticos no crescimento bacteriano.
MATERIAL
¾ 4 Placas com Ágar-sangue : Meio base para ágar sangue ou TSB enriquecido
com 5% sangue desfibrinado de carneiro;
¾ 4 zaragatoas (“Swab”) estéreis;
¾ 3 cotonetes embrulhados em papel alumínio autoclavados, ou + 3 zaragatoas
estéreis;
¾ sabão, álcool iodado, mertiolate, anti-sépticos comerciais (anti-sépticos em geral
disponíveis 1 para cada grupo, podendo haver repetições);
¾ Alça de Platina , bico de Bunsen;
¾ Microscópio óptico, bateria de Gram, lâminas;
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PROCEDIMENTO
1. Umedecer um cotonete estéril em solução fisiológica e esfregar vigorosamente
sobre as costas de uma das mãos. Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de
diâmetro;
RESULTADOS
Na quinta-feira:
1. Observar os resultados e anotar.
2. Analisar a Morfologia MACROSCÓPICA das colônias e MICROSPICA das bactérias
após coloração de Gram. (Não se esqueça de ilustrar o que você observou!)
QUESTIONÁRIO
1. Descreva duas situações: uma em que você usaria um anti-séptico e uma em que
usaria um desinfetante.
2. Faça uma lista com pelo menos seis anti-sépticos e seis desinfetantes.Nesta lista
deve conter o principal composto ativo, o nome comercial, e o uso .
PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA
TEORIA
Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade
de bactérias aos antimicrobianos. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a
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atividade de novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias
resistentes. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como
sensível, intermediário ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC (minimun
inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration).
1- Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de
diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou
líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. Após incubação determina-se MIC
e/ou MBC.
2- Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste
qualitativo, no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na
superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. A droga se difunde no
ágar e produz inibição do agente sensível, formando um halo de inibição que deve ser
medido e comparado com tabelas padronizadas. Para a garantia desta técnica, alguns
fatores são essenciais:
− Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton, que se caracteriza
por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas;
− Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias,
devendo-se realizar a coloração de Gram. A densidade do inóculo deve
corresponder a turbidez 0,5 na escala padrão de turbidez (Escala de Mac-
Farland).
OBJETIVO
Analisar pelo método de difusão a ressitência de E. coli a alguns antibióticos.
MATERIAIS
¾ “Swab” estéril;
¾ cultura líquida fresca de Eschirichia coli;
¾ placas de Petri, com meio Mueller-Hinton sólido;
¾ discos de papel com antibióticos;
¾ pinças;
¾ régua.
PROCEDIMENTO
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2. Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa
placa de Petri (meio Mueller-Hinton). Espalhar bem, de modo a obter um “tapete”
de bactérias em toda a superfície do meio sólido;
6. Medir os halos formados (em mm), registrar os dados obtidos e relacionar com a
tabela abaixo:
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PRÁTICA 8 - PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS.
INTRODUÇÃO
Muitos vegetais contêm compostos que são inibidores de crescimento de
microrganismos e exercem papel importante na resistência destes vegetais a patógenos.
Um importante exemplo deste processo é o alho.
A presença de substâncias antimicrobianas pode ser verificada através de extratos
ou partes homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos.
OBJETIVO
Estudar a presença de compostos antimicrobianos em vegetais.
MATERIAL
¾ Placas de ágar Sabouraud;
¾ Alho e cebola;
¾ Cotonetes;
¾ Graal e pistilo;
¾ Discos de papel de filtro;
¾ Culturas: Staphylococcus sp e E. coli.
PROCEDIMENTO
1. Mergulhar o cotonete na suspensão do microrganismo;
2. Espalhar sobre a superfície do meio com o próprio cotonete embebido na
cultura;
3. Macerar o alho e a cebola, separadamente, em graal,
4. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e colocá-los sobre a
superfície do meio semeado;
5. Incubar a 25°C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibição.
RESULTADOS
Descreva as observações feitas ao final da incubação.
QUESTIONÁRIO
Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . Pode ser algum já relatado na
literatura ou algum de conhecimento popular.
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PRÁTICA 9 - CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS
INTRODUÇÃO
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conjugação, tra, mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugação entre
bactérias e bactérias e leveduras. Estes plasmídios ColE1 codificam proteínas chamadas
de colicinas que matam algumas linhagens sensíveis de E. coli.
Os plasmídios conjugativos após serem transferidos e replicados podem
permanecerem livres (autônomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano
(chamados de estado integrado). No primeiro caso, a linhagem bacteriana é chamada de
F+ e no segundo Hfr ( a integração do fator F parece ser mediada por pequenas
sequências chamadas de elementos IS). Neste estado, o fator F media a transferência
do cromossoma da célula Hfr para a célula F-. Raramente, o cromossomo inteiro da
célula Hfr é transferido.
As células F+ após contato com as células F-, transferem em alta frequência
para esta última uma réplica ou cópia do plasmídio F, tornando-a F+. Por outro lado, a
linhagem Hfr cujo fator F está integrado ao cromossomo bacteriano, transfere,
sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. Raramente, o
cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. O fator F também é raramente
transferido.
Após a descoberta do fator F, outros plasmídios conjugativos foram sendo
descobertos como é o caso dos fatores ou plasmídios R ou RTF (fator de transferência
de resistência). Estes plasmídios possuem marcadores para a resistência às drogas
antibacterianas e não integram-se, normalmente no cromossomo bacteriano. Alguns
plasmídios não promovem conjugação, mas podem ser mobilizados por outros
plasmídios conjugativos.
OBJETIVO
Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmídio que carrega o gene que confere
resistência a tetraciclina, para a Escherichia coli K12 .
MATERIAL
¾ Tubos de ensaio ;
¾ Placas com meio sólido;
¾
Linhagens
a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac- , Tetr ). Hospeda um
plasmídio que carrega o marcador que confere resistência a tetraciclina (Tcr ).
b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ , Nalr). O fenótipo de resistência
ao ácido Nalidíxico deve-se a uma mutação cromossomal.
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Antibióticos
a) Ácido Nalidíxico (Nal) usar a concentração de 10µg/ml
b) Tetraciclina (Tc) usar a concentração de 50 µg/ml
PROCEDIMENTO
1° Dia
1. Fazer os pré-inóculos das linhagens doadoras e receptoras em 4,0ml de meio
TSB. Incubar à temperatura de 37°C por uma noite.
2°Dia
1. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1,0ml de TSB ou LB as seguintes
culturas:
¾ 1,0 ml da linhagem S. typhimurium MG031 (doadora) e
¾ 1,0 ml da linhagem E. coli K12 (receptora)
4. Incubar em estufa à temperatura de 37°C por 16-24 horas (durante uma noite).
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RESULTADOS
3°Dia
Analisar os resultados e determinar a freqüência de conjugação. A freqüência é
determinada dividindo o número de células transconjugantes pelo número total de células
receptoras.
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PRÁTICA 10 - POSTULADO DE KOCH
ABORDAGEM CLÁSSICA
Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava
deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relação casual entre um
microrganismo em particular e uma doença.
1. A bactéria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doença; a bactéria ou
seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doença;
2. A bactéria deve ser isolada de lesões de uma pessoa infectada e mantida em
culturas puras;
3. A cultura pura quando inoculada em voluntário humano susceptível ou animal
experimental deve produzir os sintomas da doença;
4. A mesma bactéria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivíduos
intencionalmente infectados.
Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactérias
causadoras de epidemias como a cólera e a tuberculose. Estes se constituíram nas
primeiras abordagens que forneceram bases científicas para o estudo das doenças
infecciosas.
Estes postulados apresentam, contudo, uma série de limitações devido ao precário
conhecimento, ao tempo de Koch, dos mecanismos que regem a infectividade
bacteriana.
1. Os postulados de Koch implicam que a virulência é uma característica exclusiva das
bactérias e independente do hospedeiro. Na realidade, a susceptibilidade do hospedeiro
é tão ou mais importante que as características de virulência da bactéria:
¾ Indivíduos cujo sistema imunológico esteja seriamente comprometido por
quimioterapia anti-câncer, tratamento com corticosteróides, infecção por HIV ou
diabetes e que podem ser infectados por bactérias incapazes de causar infecção
em pessoas sadias;
¾ A mesma bactéria pode ou não satisfazer os postulados de Koch dependendo da
sub-população usada como ponto de referência.
2. O segundo postulado enfatiza a obtenção de culturas puras do patógeno. Há algumas
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doenças cujo agente causativo não pode ser cultivado em meios de laboratório ou cujo
meio adequando não é, ainda, disponível:
¾ Há consideráveis evidências para implicar as bactérias Treponema pallidum e
Mycobacterium leprae como causadoras da sífilis e hanseníase, respectivamente.
Antibióticos que causam o desaparecimento de sintomas também causam a
eliminação da bactéria do tecido infectado. Há também, uma resposta imunológica
dos indivíduos infectados contra os antígenos de superfície das bactérias
observadas nas lesões provocadas pela doença;
¾ A combinação das tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR) com as
de seqüenciamento de ácidos nucléicos possibilita a detecção e identificação de
bactérias não-cultiváveis e revela o agente causativo de muitas doenças.
3. Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espécie
bacteriana são igualmente virulentos e que somente uma única espécie causa uma
determinada doença.
¾ diferentes linhagens de uma espécie bacteriana não somente variam
consideravelmente em virulência como podem causar doenças distintas;
¾ os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espécies de bactérias e
há doenças cujas lesões são causados por uma mistura de diferentes linhagens
(infecções polimicrobianas);
¾ os casos nos quais uma única espécie de bactéria é a única responsável por uma
doença parece mais uma exceção do que uma regra;
¾ o cultivo de uma bactéria em meio de laboratório pode causar a "perda" do fator
de virulência: não expressão dos genes nas condições ambientais do meio.
4. O terceiro postulado requer que a bactéria seja reinoculada em um voluntário humano
ou em um animal experimental e que a reinoculação cause os sintomas da doença.
¾ Em muitos casos não é possível a utilização de voluntários humanos e a única
alternativa é a utilização de um modelo animal, se houver um disponível;
¾ Alguns patógenos humanos não causam doenças em animais ou provocam
sintomas diferentes daqueles observados em humanos.
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