Universidade de São Paulo

Instituto de Ciências Biomédicas Departamento de Microbiologia
BMM121 – Microbiologia Básica

Apostila de Aulas Práticas Profa. Elisabete José Vicente bevicent@usp.br 3091.7350 2004

MICROBIOLOGIA NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de mangas compridas e estar abotoado; Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório; O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações; Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula prática; Descarte de material: a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada; c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes Terminados os trabalhos práticos: a) b) c) d) e) f) Esterilizar alças e fios de platina; Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; Desligar lâmpadas e microscópios; Limpar microscópios e cobri-los com a capa; Tirar o avental e guardar; Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

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Módulo I Introdução à microbiologia

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Módulo I ......................................................................................................................... 4 Introdução à microbiologia ............................................................................................. 4 Prática 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7 Técnica de semeadura ............................................................................................... 7 Objetivo .................................................................................................................... 10 Material ..................................................................................................................... 10 Procedimento e Resultados...................................................................................... 10 Questionário ............................................................................................................. 11 PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM........................................................................... 12 Fixação e coloração de microrganismos................................................................... 12 Preparação de esfregaços e coloração pelo método de gram.................................. 13 A técnica ................................................................................................................... 15 Objetivo .................................................................................................................... 16 Material ..................................................................................................................... 16 Procedimento:........................................................................................................... 16 Resultados:............................................................................................................... 18 Questionário ............................................................................................................. 18 PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA..... 19 Objetivo .................................................................................................................... 19 Materiais ................................................................................................................... 19 Procedimento e resultados ....................................................................................... 19 A. Visualização de bactérias:.................................................................................... 19 B. Visualização de fungos......................................................................................... 20 PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21 Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21 Curvas de crescimento ............................................................................................. 22 Objetivo .................................................................................................................... 25 Material ..................................................................................................................... 25 Procedimento............................................................................................................ 25 Resultados................................................................................................................ 25 Questionário ............................................................................................................. 25 PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO................................................................................................................... 26 Estimativa do número de células viáveis .................................................................. 26 Problema: ................................................................................................................. 27 5

.............................................................................................................. 29 Objetivos. 32 Objetivo .......... 32 Resultados... 38 Resultados. 32 PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA ............................................................................... 40 6 . 36 Introdução................................................................................................................................. 35 PRÁTICA 9 ................................................ 37 Material ..........................................................................................CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS........................................................................................................ 32 Teoria ............................................................................................................................................................................................................ 35 Procedimento............................................................................................................................................... 35 Questionário .................. 31 Material .................................................................. 33 Questionário ................................................. 31 Procedimento..................................................................................... 37 Procedimento........................................... 40 Abordagem clássica ............. 34 PRÁTICA 8 .......Verificação de entendimento: .........................................................................................................POSTULADO DE KOCH........................................................... 36 Objetivo ..........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS............................AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE .............................. 28 PRÁTICA 6 .................................................................................................................................. 39 PRÁTICA 10 .......................... 29 Anti-sépticos e desinfetantes ...................................... 35 Resultados........................................................................................................................................................................................ 35 Material ........................................................................................................................... 35 Introdução.................................................................................................................................................................................................................................................................. .................. 35 Objetivo ..... 33 Procedimento..... 32 Questionário ....................................................................... 33 Materiais ............................................................................................................................................................................................................................

seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura. esfriar previamente a alça. Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri.NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas. deve-se flambar a 7 . TÉCNICA DE SEMEADURA Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos presentes no ambiente. 1. Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. e evitar acidentes laboratoriais. Figura 1. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho (Figura 1). Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. Para retirar o material.Posição correta para a flambagem da alça 2.PRÁTICA 1 . Flambagem da alça ou fio de platina: Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura.

As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas. As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar. da mão que está segurando a alça ( Figura 2). Após a retirada do material com a alça. semear na placa de Petri (fig. a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo solução desinfetante. Uma vez utilizada. Não pousar os tampões sobre a bancada!!! Flambar a alça após o uso. flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. 5. Para uso. e introduzi-la na cultura de bactéria. Esta seqüência evite que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. 4. Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo.boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão).3). Figura 2 – Removendo o tampão de algodão 3. retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta). dentro de um cilindro metálico). são oferecidas embrulhadas em papel (às vezes. 8 . Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. torcer o papel na região central da pipeta. Na semeadura usando placas de Petri. após flambar a alça até o rubro.

ou num pedaço do ágar sem cultura). Figura 4 – Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficiência no isolamento de colônias Não esqueça!!!!!! Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo. lembre-se: ela está muito QUENTE!!! Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma.Figura 3 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias 6. Após a primeira estria. girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria. 9 . sempre invertida. As placas serão incubadas a 37˚C por 24h. antes de colocar a alça em contato com a cultura. flambar novamente a alça. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa técnica é conhecida também por esgotamento. e depois guardadas a 4˚C até a próxima aula. 7.

não esquecendo de ilustrar os resultados obtidos A) SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO B) SEMEADURA EM PLACAS CONTENDO MEIO SÓLIDO 10 . tubo de ensaio com meio completo líquido placa de Petri com meio completo sólido. tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli.OBJETIVO Fazer semeaduras em meios líquido e sólido de cultura de Eschirichia coli. e obter colônias isoladas MATERIAL alça de platina. PROCEDIMENTO E RESULTADOS Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo.

na semeadura em placa. Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferência? 2. Qual a finalidade de se fazer várias estrias.C) OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS QUESTIONÁRIO 1. Por que deve-se manter sempre que possível a placa de Petri com meio sólido invertida? 3. contendo meio sólido? 11 .

Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta. Quanto aos tipos de coloração temos: 1) Coloração simples .PRÁTICA 2 . identificar alguns grupos. Porém. o microrganismo deve ser fixado à lâmina. Então. 2) Coloração diferencial . já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos. Existem inúmeros métodos para coloração. azul de metileno e safranina . Um desse íons. por quatro razões principais: Permitem uma visualização melhor das células. A célula bacteriana é negativamente carregada.nessa coloração o corante reage diferentemente com 12 . permite a visualização de determinadas estruturas. A introdução de colorações. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares. no estudo dos microrganismos. além de facilitar sua observação. os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação.COLORAÇÃO DE GRAM FIXAÇÃO E COLORAÇÃO DE MICRORGANISMOS A morfologia individual e as reações tintoriais constituem. eventualmente. enquanto que os ácidos tem a cor do seu íon negativo. é chamado de radical cromóforo.cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. antes de ser corado. em geral. através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. portanto atrai corantes básicos. os corantes conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo. o que dá a cor. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e Podem. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que.

3) Coloração especial . 5). e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano. mas sim com sua estrutura física.são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos. o que confere a característica de positividade ao Gram. e é o caso do iodo na coloração de Gram. frente ao Gram. iodo. No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇOS E COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram.diferentes tipos de bactérias. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo).ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. Essa maneira de reagir diferentemente. Essas substâncias são chamadas mordentes. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular. A coloração de Gram e a álcool . flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas. etanolacetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. fixado pelo calor. é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. em 1884. enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-) (Fig. com os reagentes cristal violeta. 13 .

com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Figura 5 – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. que é maior que a molécula de CV que penetrou. 14 . Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. quando corretamente realizada e interpretada. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. que não consegue reter o complexo.Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Gram positiva Membrana plasmática Complexo de membrana externa. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo.

tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Em seguida. com os mesmos resultados. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. A etapa da descoloração é crítica. o cristal violeta. O corante cristal violeta pode ser substituído. densidade. tornando-as impermeáveis ao complexo. devem ser capazes de distinguir formas e arranjos. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. o lugol. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. portanto. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Grampositivas e provoca a contração dos poros do peptidioglicano. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. a amostra é tratada com um corante secundário. Portanto. Células de bactérias Gram-positivas. insolúvel. em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos.A TÉCNICA O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. com um corante primário. Paralelamente. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. células velhas. o uso de material fresco é importante. podendo produzir resultados falsos. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. Por outro lado. A retenção ou não do corante primário é. seguido de tratamento com um fixador. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. a fucsina básica. porosidade e integridade. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido. o etanol-acetona (1:1 v:v). 15 . Por outro lado. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. Ao microscópio. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. decorando as células.

cristal violeta a 1%. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixá-lo. 8) Realizar a coloração. 2) Flambar novamente a alça 16 . solução diferenciadora. lâmina de vidro. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. pelo método de Gram. 4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido. MATERIAL alça de platina. já flambada. 7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. sólido e líquido. 6) Secar à tempetatura ambiente. tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1) Colocar com a própria alça. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1) Flambar a alça corretamente 2) Esfriá-la nas paredes do tubo 3) Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça.OBJETIVO Coloração de microrganismos provenientes de meios. OBS. PROCEDIMENTO: A. procurando obter um esfregaço fino. uma gota de água de torneira no centro da lâmina de vidro. fucsina básica. lugol. 5) Espalhar o material sobre a lâmina.

Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. 8) Lavar novamente em água corrente. 4) Lavar rapidamente em água corrente. A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. rapidamente.3) Esfriá-la na tampa da placa de Petri. Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. 7) Fixar o esfregaço. COLORAÇÃO 1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. tomando o cuidado de não remover o esfregaço. com bactérias G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se fracamente. 6) Lavar rapidamente em água corrente. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. 7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos. 5) Homogeneizar este material com a gota de água. 4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. Os esfregaços não devem ser muito espessos. B. 3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. Evitar estas culturas! 17 . pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. Porém. ou no meio sólido numa região sem colônia. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2) Lavar rapidamente em água corrente. A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. 6) Secar a lâmina por exposição ao ar. 10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão. Ela deve ser efetuada rapidamente. 9) Secar a lâmina. 5) Lavar uma ou duas vezes. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos.

podendo inclusive levar a erros? 18 . Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? 2. Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram.RESULTADOS: ___________________ ____________________ __________________ ___________________ QUESTIONÁRIO 1.

: Pseudomonas aeruginosa 19 . Visualização de bactérias: b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus c) Bacilos Gram + : Bacillus subtilis d) Bacilos Gram . Streptococcus pyogenes e dois tipos de fungos).PRÁTICA 3 . A. MATERIAIS Lâminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus. Bacillus subtilis. Pseudomonas aeruginosa. Microscópio ótico. Repita o procedimento para os fungos apresentados. PROCEDIMENTO E RESULTADOS Faça um esboço das características morfológicas e suas propriedades tintoriais de cada uma das bactérias apresentadas.MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA OBJETIVO Visualização das colônias crescidas em placas contendo meio sólido e análise por microscopia óptica e Morfologia de bactérias e de fungos .

e) Cocos Gram + : Streptococcus pyogenes B. Visualização de fungos Filamentosos Leveduras 20 .

pode-se presumir que a maioria delas esteja se dividindo ao mesmo tempo e a cada nova geração (e. muitas espécies bacterianas apresentam um tempo de geração médio de 20 minutos. as bactérias podem testar 21 . Este tipo de crescimento populacional é denominado de crescimento exponencial ou logarítmico. a cada 20 minutos uma nova geração de indivíduos é produzida. Nos organismos unicelulares. cada célula bacteriana é uma unidade catalítica. ou seja. seja em ambientes naturais (in vivo) ou em culturas de laboratório (in vitro). no qual o número de indivíduos dobra a cada geração. aumento da massa total de uma população.PRÁTICA 4 . O tempo de geração refere-se ao tempo requerido para uma célula bacteriana duplicar seu DNA e dividir-se. o número de unidades catalíticas (células) aumenta com o tempo e. Devido aos tempos de geração muito curtos. O aumento em tamanho de uma célula bacteriana conduz à divisão celular e conseqüente aumento do número de indivíduos na população. a cada 20 minutos) a população dobra de tamanho. como conseqüência.CURVA DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO BACTERIANO O crescimento de qualquer organismo pode ser definido como o aumento do número de suas células ou o aumento de sua massa. biomassa é sintetizada em uma taxa progressiva na população em crescimento. A evolução ocorre através de mutações genéticas que produzem variações na descendência de um organismo e o ambiente determina que mutações são vantajosas no sentido de aumentar suas chances de sobrevivência e de sucesso reprodutivo (adaptação). Em uma população composta por milhares de bactérias em crescimento ativo. Assim. aumento da massa de uma célula individual.g. o crescimento pode ser entendido como: aumento de tamanho de uma célula individual. Do ponto de vista bioquímico. Uma característica importante do crescimento bacteriano é o fato de que a maioria das espécies de bactérias é capaz de crescer em taxas bastante rápidas. Sob condições ótimas de crescimento. aumento do número de células de uma população. A maior vantagem de um tempo de reprodução tão rápido é que as bactérias podem evoluir muito rapidamente e esta e a razão do seu sucesso no mundo vivo. cada novo indivíduo pode catalisar a biossíntese de material celular adicional. Quando uma bactéria se divide..

Portanto. pH. dependendo do ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador. pH. Para se estudar o crescimento de uma bactéria é preciso cultivá-la. Estas são representações gráficas do aumento do número de indivíduos em um determinado período de tempo. tais como fontes de nutrientes. As distintas espécies bacterianas diferem no âmbito de fatores dentro dos quais podem crescer. osmolaridade. Essas quatro fases estão representadas na Figura 6. Figura 6 – Curva de crescimento bacteriano padrão em sistema fechado 22 . o crescimento dessa população passa por quatro fases características. presença ou ausência de oxigênio e temperatura de incubação.bilhões de mutações em pequenos intervalos de tempo. Em condições experimentais. Não há método perfeito. osmolaridade. CURVAS DE CRESCIMENTO Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano é a obtenção de curvas de crescimento. como cultura pura. o crescimento bem sucedido de uma população bacteriana reflete seu grau de adaptação a um determinado ambiente e depende primariamente de sua composição: condições nutricionais. ambos os métodos apresentam vantagens e desvantagens. quando se inocula uma população bacteriana em um frasco contendo uma quantidade inalterável de meio de cultura (sistema fechado). temperatura. A escolha do método depende da situação particular que se apresente. O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado através do aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (através de curvas de crescimento) ou da estimativa do número de células viáveis presentes na população (método de determinação do número de unidades formadoras de colônia). em meios de cultura e condições ambientais que variam em condições químicas e físicas. Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condições nas quais seu crescimento atinge uma taxa ótima. oxigênio e luz.

Fase exponencial ou logarítmica: fase na qual o número de células da população dobra a cada geração. Fase estacionária: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido às condições limitantes do meio. As células continuam metabolizando e se dividindo.Fase lag: fase de adaptação metabólica ao novo ambiente. A fase lag será tão mais longa quanto maiores as diferenças de composição do ambiente anterior ou se a população for constituído de bactérias esporuladas. 23 . O número de indivíduos não aumenta nesta fase. mede-se o aumento da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio líquido através de medidas da densidade óptica da cultura. o que mantém constante o número de células viáveis na população. A duração dessa fase depende das condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente. mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de morte celular. A curva de crescimento atinge um platô. Alíquotas da cultura em crescimento são retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbância da cultura contra um comprimento de onda de 600 nm. A absorbância aumenta proporcionalmente ao aumento do número de células (biomassa) na população. ausente de inóculo. Para tal utiliza-se um espectrofotômetro onde o branco é o meio de cultura utilizado. o metabolismo celular está direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas condições ambientais encontradas pelas células. relacionando-se a DO pelo tempo. Desta forma pode-se construir um gráfico representativo do progresso do crescimento. podendo até mesmo decrescer. Após um determinado período de crescimento exponencial. O número de células viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população. Cada medida obtida corresponde à densidade óptica (DO) da cultura em um dado momento do crescimento. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. A duração da fase estacionária depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. Fase de declínio: fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase estacionária. as condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais. Para a construção de uma curva de crescimento bacteriano.

24 . acima disto as leituras perdem a confiabilidade. reduzida quantidade de material utilizado. só se obtêm leituras acuradas da DO até o valor de 2. Quadro 1. células bacterianas agrupadas após a divisão celular não prejudicam os resultados. o experimento não é cansativo.0. a introdução de erros experimentais pelo operador é menor.0 deve-se fazer uma diluição 10-1 dessa amostra e registrar sua DO. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura interferem na obtenção de resultados . células inviáveis.Só são confiáveis medidas de DO até 2. medidas prontamente obtidas: o resultado do experimento é conhecido ao seu final. Desvantagens e limitações não é possível a estimativa do número de células/ml da população. Acima disto as leituras perdem a confiabilidade. Para a plotagem dos dados no gráfico deve-se multiplicar a DO obtida por 10. Se a leitura de uma amostra for maior que 2. reduzindo a introdução de erros experimentais por parte do operador. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas. possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em gráfico). Vantagens e desvantagens do método de medidas da densidade óptica Vantagens simplicidade da metodologia. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais.0.

coli MATERIAL Cultura bacteriana pura. os demais pontos serão medidos pelos monitores e repassados para os grupos. QUESTIONÁRIO 1. RESULTADOS A) Construir um gráfico a partir dos pontos obtidos.(Não se esqueça de identificar os eixos. PROCEDIMENTO Durante a aulas serão obtidos apenas alguns pontos experimentais. E. Solução salina. Pipetas. Tubos de ensaio. Quais os problemas observados na construção dos gráficos (em que etapa do crescimento)? Você diria que todos os pontos são confiáveis? Justifique sua resposta. 25 .OBJETIVO Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de através de medidas de densidade óptica. Espectofotômetro. e suas unidades!!!) B) Identificar cada uma das fases de crescimento no gráfico.

células bacterianas individuais ocuparão posições separadas na superfície do meio de maneira que cada uma dê origem a uma colônia bacteriana isolada. o resultado da contagem das colônias multiplicado pela quantidade de diluições decimais é a estimativa do número de bactérias presentes em um ml da cultura original. aquelas capazes de formarem colônias. em solução salina. Esse procedimento é repetido em diferentes intervalos de tempo e com os resultados pode-se construir um gráfico representando o progresso do crescimento Quadro 2. seguido da semeadura de uma alíquota de cada diluição em placas de Petri contendo meio bacteriológico sólido. no espalhamento.DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO ESTIMATIVA DO NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS A estimativa do número de células viáveis comumente é feita através de diluições seriadas de uma cultura bacteriana. muitos indivíduos viáveis podem não se replicar. As colônias crescendo no meio de cultura podem ser visualizadas e contadas pelo experimentador. prejudicando o cálculo se as células da bactéria estudada mantém-se agrupadas após a divisão celular (cada colônia em meio sólido seria formada por mais de uma célula) se as diluições não forem homogeneizadas adequadamente se um número muito pequeno ou muito grande de colônias for usado na contagem se o operador não fizer o espalhamento rapidamente e de forma possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em um gráfico) pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais 26 . Como cada colônia supostamente originou-se da multiplicação um único indivíduo. Vantagens e desvantagens do método da contagem de células viáveis Vantagens permite uma estimativa do número de células viáveis/ml da população Desvantagens e limitações detecta somente as células viáveis e que se repliquem. A célula individual que originou uma colônia é denominada de "Unidade Formadora de Colônia" ou UFC. Esta técnica baseia-se na hipótese de que.PRÁTICA 5 . ou seja.

coli número de (UFC/ml da cultura original)? (X)_________ 27 . Mas digamos que você precisa ou deseja conhecer o nível de que a bactéria contaminante seja lac-. Você fez um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada. PROBLEMA: 1.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. a cada diluição um erro experimental é introduzido pela instrumentação e pelo experimentador este método detecta apenas um número muito reduzido de células. VOCE PRECISA RECUPERAR SUA BACTÉRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE.células inviáveis.1ml (diluição 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura não interferem na obtenção de resultados adequada. Qual é a concentração de E. QUE FAZER? 2. Você tem um estoque de uma super bactéria Escherichia coli (lac+).1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e contaminação e _________lac_________lac_________lac_________lac- 3.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. Neste caso você poderá: 0. o que prejudica a estimativa a grande quantidade de material utilizado a acuracidade dos resultados está diretamente relacionada à quantidade de material (principalmente placas de Petri) a limitação de material impõe um aumento do erro experimental o resultado do experimento é só conhecido após o crescimento das colônias isoladas nas placas de Petri A) BACTERIANA A determinanção da concentração de bactérias é feita geralmente pela técnica de determinação do Número de UFC (unidades formadoras de colônias).

Qual é a concentração da bactéria lac.4.contaminante (UFC/ml da cultura original)? ( Y) _________ Qual é porcentagem da contaminação? _( Y) / (X)_____________________ B) DE LEVEDURAS Pela técnica de contagem em câmara de ¨Neubauer¨ VERIFICAÇÃO DE ENTENDIMENTO: Várias técnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prática. Você saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos? 28 .

O aumento da concentração de um agente anti-séptico pode irritar e talvez. vinhos. seu número e sua suscetibilidade. A presença ou não de resistência bacteriana ao agente antimicrobiano. concentração da droga e temperatura. além do fato de os vinhos e vinagres continuarem a serem utilizados durante a Idade Média ao recobrimento de feridas e. a divulgação dos métodos de esterilização de bandagens. mel. mura. interferindo assim com o crescimento normal do tecido de granulação na cicatrização de feridas. Bem como as células bacterianas. bálsamo. 29 . A diferença entre um anti-séptico e um desinfetante pode ser uma questão de tempo de reação. A prévia remoção ou não de detritos e impurezas da superfície ou tecidos através do uso de sabões ou detergentes. A concentração de anti-séptico em geral é baixa para evitar a lesão e irritação tecidual indesejáveis. As substâncias anti-sépticas são aplicadas ao tecidos para suprimir ou impedir a infecção bacteriana. resinas oleosas. O agente microbiano e sua respectiva concentração.PRÁTICA 6 . até matar o tecido normal do hospedeiro. sendo utilizado em 1847-49 em um hospital vienense quanto à demonstração prática da ação benéfica da anti-sepsia. em 1865. Uma substância anti–séptica não mata o microrganismo. tais como óleos voláteis. A descoberta do cloro na Idade Média foi amplamente utilizada como substância desodorante e anti-séptica. A presença ou não de uma limpeza mecânica prévia. número de microrganismos. Os egípcios e outros povos utilizaram várias misturas. Coube a Lister. inicialmente desenvolvidos com o intuito da preservação do corpo à ressurreição. Tais como: O microorganismo. em relação aos processos de embalsamento.AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES HISTÓRIA O uso de anti-sépticos e desinfetantes evolui desde o Antigo Egito. CONCEITOS GERAIS Um desinfetante é uma substância usada para destruir bactérias ou outros microrganismos infectantes. mas inibe sua velocidade de crescimento. USOS TERAPÊUTICOS DE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES Vários fatores podem influenciar na eficácia e/ou eficiência dos procedimentos ou agentes microbianos. Anos mais tarde Pasteur explicou sobre a fermentação bacteriana e a existência de agentes infectantes como responsáveis por processos patológicos. instrumental cirúrgico e anti-sepsia das feridas. consequentemente. O tempo de contato entre o microorganismo e o antimicrobiano. Os anti-sépticos são valiosos no tratamento de infecções locais causadas por microrganismos refratários a quimioterapia sistêmica. compressas cirúrgicas. vinagres. Os desinfetantes possuem atividade bactericida ou germicida e costumam ser aplicados em superfícies inanimadas. evitando a infecção.

pela borracha e materiais porosos. A presença de água é fundamental para a atividade dos álcoois (50-70%) e são mais eficazes na ausência de sujeiras e matéria orgânica. Gram negativas. 2º. mucosas e trato respiratório. METAIS PESADOS 30 . As atividades em soluções livres de matéria orgânica são.ÁLCALIS Os álcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigüidade. a concentração eficiente e a eficácia antibacteriana. HALOGÊNIOS Possuem efeitos antibacterianos potentes devido à alta afinidade pelo protoplasma. Iodo. Já. de terem ação rápida. SURFACTANTES É um composto químico que diminui a tensão superficial de uma solução aquosa. não possuírem ação residual e não devem ser utilizados para limpezas de ferimentos abertos. diminuindo assim. Desvantagens: São neutralizados por surfactantes aniônicos (sabões). baixa toxicidade. podem ser usados em soluções com água e álcool. Apesar de possuírem efeitos limitados sobre os vírus. São utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes. Um pH maior do que 9 inibirá a maioria das bactérias. fungos patogênicos. As desvantagens são: baixa atividade fungicida e virucida. São antibacterianos contra microrganismos Gram negativos e ácido-resistentes. em ordem decrescente: 1º. O mecanismo de ação está relacionado à concentração do íon hidroxila. 3º. mas em geral. baixa penetrabilidade. São potentes bactericidas contra micobactérias. Bromo. na presença de matéria orgânica o mais ativo é o Iodo. fungicida ou esporocida. desidratantes. Gram positivas. os detergentes catiônicos não possuem ação virucida. de apresentarem baixo custo e praticamente serem atóxicos. Catiônicos : Os compostos de amônio quaternário são os principais. Com base na posição hidrofóbica da molécula. são inodoros. muitos vírus e não em esporos. eles são eficientes contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. ÁLCOOIS Os álcoois alifáticos comuns são bons solventes. Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem ótimos solventes em relação a outros agentes germicidas. Os surfactantes são adsorvidos em um grau significativo pelo algodão. Não-iônicos. Vantagens: Não são em geral irritantes para a pele e tecidos. anti-sépticos e desinfetantes. há três tipos: Aniônicos : Os sabões são os mais importantes. não agem na presença de matéria orgânica e podem causar irritação quando em contato prolongado com a pele. Cloro.

Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaeróbicos. antibacterianos pela ação do íon de prata livre e produz desnaturação de proteínas. O uso para anti-sepsia de superfícies e objetos inanimados parece imprudente já que há agentes com um modo de ação mais eficiente. Liberam Oxigênio que se combina com a matéria orgânica se tornando inativos. 4 zaragatoas (“Swab”) estéreis. A solução de Peróxido de Hidrogênio libera Oxigênio livre rapidamente ao entrar em contato com mucosas e superfícies sem pêlos que fornecem a enzima catalase. Compostos de Prata Produzem efeitos cáusticos. O Permanganato de Potássio libera Oxigênio em contato com a matéria orgânica. adstringentes. OBJETIVOS Verificar a ação de anti-sépticos no crescimento bacteriano. bateria de Gram. Os preparados de Prata coloidal não são corrosivos nem irritantes e são usados sobre tecidos sensíveis. Alça de Platina . ou + 3 zaragatoas estéreis. podendo haver repetições). mertiolate. A sua ação antibacteriana está relacionada à inibição reversível da atividade enzimática essencial da bactéria e à capacidade de se combinar com íons de compostos metálicos orgânicos e inorgânicos. 31 . lâminas. É valioso para limpar e desodorizar o tecido infectado. mas não destroem esporos bacterianos. Microscópio óptico. Possuem pouca atividade esporicida e são inativados por restos orgânicos. MATERIAL 4 Placas com Ágar-sangue : Meio base para ágar sangue ou TSB enriquecido com 5% sangue desfibrinado de carneiro. A prata metálica precipita as proteínas e produz efeito irritante. AGENTES OXIDANTES São compostos germicidas de ação breve sobre algumas bactérias aeróbicas Gram+ e Gram-.Derivados do mercúrio Parecem ser primariamente bacteriostáticos e apenas levemente bactericidas. As soluções possuem uma grande ação antibacteriana. a sua efervescência vai remover o pus e restos celulares e confere atividade germicida limitada. bico de Bunsen. sabão. Quando é distribuído sobre ferida com exsudato. anti-sépticos comerciais (anti-sépticos em geral disponíveis 1 para cada grupo. 3 cotonetes embrulhados em papel alumínio autoclavados. álcool iodado.

Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de diâmetro. Incubar a placa por 24h. numa área de mesmo diâmetro da primeira. Marcar na placa o anti-séptico utilizado e o número do grupo que realizou o experimento. 6. 2. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a 32 .PROCEDIMENTO 1. o nome comercial. Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar nas costas da outra mão. Espalhar o conteúdo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo ágar-sangue. Faça uma lista com pelo menos seis anti-sépticos e seis desinfetantes. 4.Nesta lista deve conter o principal composto ativo. RESULTADOS Na quinta-feira: 1. Umedecer um cotonete estéril em solução fisiológica e esfregar vigorosamente sobre as costas de uma das mãos. Descreva duas situações: uma em que você usaria um anti-séptico e uma em que usaria um desinfetante. 2. Observar os resultados e anotar. 7. PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA TEORIA Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos. 2. Tomar cuidado para não atingir a região não desinfectada. e o uso . 3. Esperar 4 minutos para que haja ação do anti-séptico e passar na área desinfectada um terceiro cotonete umedecido com solução fisiológica. (Não se esqueça de ilustrar o que você observou!) QUESTIONÁRIO 1. Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio Ágar sangue. em estufa a 37°C. 5. Analisar a Morfologia MACROSCÓPICA das colônias e MICROSPICA das bactérias após coloração de Gram.

cultura líquida fresca de Eschirichia coli. 33 . Introduzir nas culturas um “swab” estéril. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0.atividade de novos agentes. formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas. alguns fatores são essenciais: − Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton. OBJETIVO Analisar pelo método de difusão a ressitência de E. régua. − Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC.5 na escala padrão de turbidez (Escala de MacFarland). com meio Mueller-Hinton sólido. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível. intermediário ou resistente.Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo. PROCEDIMENTO 1. 2. e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes.Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. discos de papel com antibióticos. no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. retirar o excesso de líquido comprimindo a ponta do “swab” nas paredes do tubo. placas de Petri. devendo-se realizar a coloração de Gram. pinças. Para a garantia desta técnica. 1. coli a alguns antibióticos. MATERIAIS “Swab” estéril. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível.

Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa placa de Petri (meio Mueller-Hinton). QUESTIONÁRIO 1. 3. 4. por 16 a 24 horas. 6. 2.2. Faça um esquema da parede de uma bactéria Gram-positiva e de uma bactéria Gram-negativa? 34 . Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos). Medir os halos formados (em mm). Espalhar bem. registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela abaixo: Bactéria Oxacilina OX (1µg/mL) Carbemicilina CB (100µg/mL) Discos com antibióticos Kanamicina K (30µg/mL) Rifampicina RIF (30µg/mL) Sulfonamida SUL (300µg/mL) Estreptomicina EST (10µg/mL) Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padrões R< 10 S> 13 R< 13 S> 17 R< 12 S> 15 R< 16 S> 20 R< 12 S> 17 R< 11 S> 15 Relate os resultados obtidos e interprete comentando. 3. 4. Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar pinças). O que é antibiograma e para que serve? Quais são os antibióticos beta-lactâmicos? Qual o seu modo de ação? Qual a diferença entre agente bactericida e bacteriostático? Dos antibióticos testados na experiência acima qual seria o mais indicado para o tratamento da infecção causada pela linhagem E. coli testada? Por que? 5. de modo a obter um “tapete” de bactérias em toda a superfície do meio sólido. Incubar em estufa a 37ºC . 5.

Alho e cebola. 2. OBJETIVO Estudar a presença de compostos antimicrobianos em vegetais. em graal. 35 . 5. 3. Incubar a 25°C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibição. coli.PRÁTICA 8 . RESULTADOS Descreva as observações feitas ao final da incubação. Culturas: Staphylococcus sp e E. Cotonetes. Mergulhar o cotonete na suspensão do microrganismo. separadamente. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e colocá-los sobre a superfície do meio semeado. Graal e pistilo.PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS. PROCEDIMENTO 1. Um importante exemplo deste processo é o alho. Discos de papel de filtro. QUESTIONÁRIO Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . Espalhar sobre a superfície do meio com o próprio cotonete embebido na cultura. MATERIAL Placas de ágar Sabouraud. Macerar o alho e a cebola. Pode ser algum já relatado na literatura ou algum de conhecimento popular. INTRODUÇÃO Muitos vegetais contêm compostos que são inibidores de crescimento de microrganismos e exercem papel importante na resistência destes vegetais a patógenos. A presença de substâncias antimicrobianas pode ser verificada através de extratos ou partes homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos. 4.

Por outro lado. refere-se aos genes mob. descoberta por Lederberg e Tatum (1946) é o processo “sexual"de transferência de genes de uma bactéria doadora para outra receptora. A transferência do DNA é iniciada pela ação de um gene mob que tem a atividade em romper (nicking) em uma única fita da molécula do DNA. na formação dos poros na membrana. Como a interação mob-oriT é específica. somente uma fita. Esta célula doadora é diferenciada durante a conjugação pela presença de um apêndice na sua superfície chamado de pili F. Experimentos genéticos demonstraram que todas as três classes de funcões de 36 . somente um dos conjuntos das funções encontradas nos plasmídios auto-transmissíveis para concluir a transferência. para que o plasmídio possa ser transferido. chamado de oriT e catalisa o desenrolamento da dupla hélice.CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS INTRODUÇÃO A conjugação bacteriana. os produtos dos genes mob preparam o DNA para serem transferidos. Para que uma linhagem bacteriana seja doadora. Contudo. coli K12 e o elemento extra-cromossômico responsável foi chamado de fator F (de fertilidade) ou plasmídio F. bem como. O processo de conjugação foi descoberto em E. os genes tra. os plasmídios mobilizáveis codificam. pode ser transferida para a célula aceptora e a outra fita permanece na célula doadora. o plasmídio mobilizável deve conter um ori T. Ambas servem como molde para sintetizar a fita complementar. ela deve conter um plasmídio conjugativo (elemento extra-cromossômico). Há dois tipos de plasmídios conjugativos: os plasmídios auto-transmissíveis e os mobilizáveis. Como resultado. Um exemplo de plasmídio mobilizável é o plasmído natural ColE1 ou colicinogênico que codifica as atividades dos genes mob e seu oriT. o sítio de oriT deve ser compatível com as funcões mob presentes nas células doadoras. O outro grupo.PRÁTICA 9 . especifica proteínas envolvidas não só na interação superficial (contacto) entre as células doadora e aceptora. os quais especificam proteínas envolvidas na mobilização do DNA. Os autotransmissíveis carregam um conjunto de genes. Concluindo. cujos produtos promovem a transferência deste plasmídio para uma célula aceptora. em um sítio específico. ainda que os produtos dos genes tra promovem o contacto das células doadora-aceptora e promovem um contexto físico (formação dos poros) para esta transferência. Os genes tra podem ser divididos em dois grandes grupos: um grupo.

Os plasmídios conjugativos após serem transferidos e replicados podem permanecerem livres (autônomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano (chamados de estado integrado). Raramente. Estes plasmídios ColE1 codificam proteínas chamadas de colicinas que matam algumas linhagens sensíveis de E. a linhagem bacteriana é chamada de F+ e no segundo Hfr ( a integração do fator F parece ser mediada por pequenas sequências chamadas de elementos IS). normalmente no cromossomo bacteriano. coli. No primeiro caso. para a Escherichia coli K12 . o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. transferem em alta frequência para esta última uma réplica ou cópia do plasmídio F. OBJETIVO Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmídio que carrega o gene que confere resistência a tetraciclina. outros plasmídios conjugativos foram sendo descobertos como é o caso dos fatores ou plasmídios R ou RTF (fator de transferência de resistência). Hospeda um plasmídio que carrega o marcador que confere resistência a tetraciclina (Tcr ). mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugação entre bactérias e bactérias e leveduras. 37 .conjugação. O fenótipo de resistência ao ácido Nalidíxico deve-se a uma mutação cromossomal. Raramente. Linhagens a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac. b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ . mas podem ser mobilizados por outros plasmídios conjugativos. transfere. As células F+ após contato com as células F-. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. Nalr). MATERIAL Tubos de ensaio . a linhagem Hfr cujo fator F está integrado ao cromossomo bacteriano. o fator F media a transferência do cromossoma da célula Hfr para a célula F-. sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. Por outro lado. tornando-a F+. Neste estado.. Tetr ). tra. O fator F também é raramente transferido. Estes plasmídios possuem marcadores para a resistência às drogas antibacterianas e não integram-se. Alguns plasmídios não promovem conjugação. Após a descoberta do fator F. Placas com meio sólido.

typhimurium MG031 0.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Tc 3. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio sólido: 3.Antibióticos a) Ácido Nalidíxico (Nal) usar a concentração de 10µg/ml b) Tetraciclina (Tc) usar a concentração de 50 µg/ml PROCEDIMENTO 1° Dia 1.1ml (diluição 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc 4. coli K12 0.0ml de meio TSB. 3. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitação à temperatura de 37°C. Incubar em estufa à temperatura de 37°C por 16-24 horas (durante uma noite).1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey -Tc 0.1ml (sem diluição) em meio MacConkey -Nal-Tc 0. coli K12 (receptora) 2.1ml (diluição 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc 0. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1. 2°Dia 1.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Nal 3.1ml (diluição 10-4 ) em meio MacConkey -Nal 0. 38 .3 Mistura de conjugação (Transconjugantes): 0.2 Célula receptora: E.0ml de TSB ou LB as seguintes culturas: 1.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Tc 0.1 Célula doadora: S. Fazer os pré-inóculos das linhagens doadoras e receptoras em 4.0 ml da linhagem E. typhimurium MG031 (doadora) e 1.1ml (sem diluição) em meio MacConkey-Nal 0.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Nal 0. Incubar à temperatura de 37°C por uma noite.1ml (sem diluição) em meio YT-Nal-Tc 0.0 ml da linhagem S.

A freqüência é determinada dividindo o número de células transconjugantes pelo número total de células receptoras.RESULTADOS 3°Dia Analisar os resultados e determinar a freqüência de conjugação. 39 .

contudo. Estes postulados apresentam. 3. Na realidade. 2. A mesma bactéria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivíduos intencionalmente infectados. ao tempo de Koch. Epidemiologia e da Genética Molecular. 4. infecção por HIV ou diabetes e que podem ser infectados por bactérias incapazes de causar infecção em pessoas sadias. a susceptibilidade do hospedeiro é tão ou mais importante que as características de virulência da bactéria: Indivíduos cujo sistema imunológico esteja seriamente comprometido por quimioterapia anti-câncer. 2. dos mecanismos que regem a infectividade bacteriana. a bactéria ou seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doença. A mesma bactéria pode ou não satisfazer os postulados de Koch dependendo da sub-população usada como ponto de referência. 1. A cultura pura quando inoculada em voluntário humano susceptível ou animal experimental deve produzir os sintomas da doença. tratamento com corticosteróides. A bactéria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doença. 1. ABORDAGEM CLÁSSICA Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relação casual entre um microrganismo em particular e uma doença. Estes se constituíram nas primeiras abordagens que forneceram bases científicas para o estudo das doenças infecciosas. Há algumas 40 .PRÁTICA 10 . Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactérias causadoras de epidemias como a cólera e a tuberculose. A bactéria deve ser isolada de lesões de uma pessoa infectada e mantida em culturas puras. uma série de limitações devido ao precário conhecimento.POSTULADO DE KOCH Como provar que um microrganismo é responsável por uma doença? A resposta clássica é um conjunto de quatro postulados formulados por Robert Koch e posteriormente revisados com o desenvolvimento da Microbiologia. Os postulados de Koch implicam que a virulência é uma característica exclusiva das bactérias e independente do hospedeiro. O segundo postulado enfatiza a obtenção de culturas puras do patógeno.

A combinação das tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR) com as de seqüenciamento de ácidos nucléicos possibilita a detecção e identificação de bactérias não-cultiváveis e revela o agente causativo de muitas doenças. o cultivo de uma bactéria em meio de laboratório pode causar a "perda" do fator de virulência: não expressão dos genes nas condições ambientais do meio. Em muitos casos não é possível a utilização de voluntários humanos e a única alternativa é a utilização de um modelo animal. respectivamente. Alguns patógenos humanos não causam doenças em animais ou provocam sintomas diferentes daqueles observados em humanos. os casos nos quais uma única espécie de bactéria é a única responsável por uma doença parece mais uma exceção do que uma regra. 4. 41 . O terceiro postulado requer que a bactéria seja reinoculada em um voluntário humano ou em um animal experimental e que a reinoculação cause os sintomas da doença. Há também. ainda. Antibióticos que causam o desaparecimento de sintomas também causam a eliminação da bactéria do tecido infectado. diferentes linhagens de uma espécie bacteriana não somente variam consideravelmente em virulência como podem causar doenças distintas. se houver um disponível. os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espécies de bactérias e há doenças cujas lesões são causados por uma mistura de diferentes linhagens (infecções polimicrobianas). Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espécie bacteriana são igualmente virulentos e que somente uma única espécie causa uma determinada doença. 3. disponível: Há consideráveis evidências para implicar as bactérias Treponema pallidum e Mycobacterium leprae como causadoras da sífilis e hanseníase. uma resposta imunológica dos indivíduos infectados contra os antígenos de superfície das bactérias observadas nas lesões provocadas pela doença.doenças cujo agente causativo não pode ser cultivado em meios de laboratório ou cujo meio adequando não é.