Universidade de São Paulo

Instituto de Ciências Biomédicas Departamento de Microbiologia
BMM121 – Microbiologia Básica

Apostila de Aulas Práticas Profa. Elisabete José Vicente bevicent@usp.br 3091.7350 2004

MICROBIOLOGIA NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de mangas compridas e estar abotoado; Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório; O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações; Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula prática; Descarte de material: a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada; c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes Terminados os trabalhos práticos: a) b) c) d) e) f) Esterilizar alças e fios de platina; Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; Desligar lâmpadas e microscópios; Limpar microscópios e cobri-los com a capa; Tirar o avental e guardar; Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

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Módulo I Introdução à microbiologia

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Módulo I ......................................................................................................................... 4 Introdução à microbiologia ............................................................................................. 4 Prática 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7 Técnica de semeadura ............................................................................................... 7 Objetivo .................................................................................................................... 10 Material ..................................................................................................................... 10 Procedimento e Resultados...................................................................................... 10 Questionário ............................................................................................................. 11 PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM........................................................................... 12 Fixação e coloração de microrganismos................................................................... 12 Preparação de esfregaços e coloração pelo método de gram.................................. 13 A técnica ................................................................................................................... 15 Objetivo .................................................................................................................... 16 Material ..................................................................................................................... 16 Procedimento:........................................................................................................... 16 Resultados:............................................................................................................... 18 Questionário ............................................................................................................. 18 PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA..... 19 Objetivo .................................................................................................................... 19 Materiais ................................................................................................................... 19 Procedimento e resultados ....................................................................................... 19 A. Visualização de bactérias:.................................................................................... 19 B. Visualização de fungos......................................................................................... 20 PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21 Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21 Curvas de crescimento ............................................................................................. 22 Objetivo .................................................................................................................... 25 Material ..................................................................................................................... 25 Procedimento............................................................................................................ 25 Resultados................................................................................................................ 25 Questionário ............................................................................................................. 25 PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO................................................................................................................... 26 Estimativa do número de células viáveis .................................................................. 26 Problema: ................................................................................................................. 27 5

...................................... 39 PRÁTICA 10 ...............................................................................................................POSTULADO DE KOCH........................................................................................... 32 Resultados........ 35 PRÁTICA 9 .. 38 Resultados........ 29 Objetivos............ 31 Procedimento...................................................................................................................................................................................................... 35 Resultados.................. 33 Questionário ................................................... 32 Teoria .................................................... 34 PRÁTICA 8 ................................................................................................PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS.......................... 29 Anti-sépticos e desinfetantes ........................................................................................................................................................................................... 32 Objetivo .............................. 32 PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA ............................... 33 Procedimento.................Verificação de entendimento: .............................................................................. 37 Procedimento............................................................................................................................................................................................................................. 31 Material .......................................................... 40 Abordagem clássica ............................................. ............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 35 Procedimento...................... 35 Introdução......AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ................................................................................................................................................................ 40 6 ........ 33 Materiais ................................ 36 Introdução..................................................................................................................................................................... 28 PRÁTICA 6 .........................................................................CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS..................................................................................................................... 35 Questionário ........................... 37 Material ............ 35 Objetivo ....................................................................................................... 32 Questionário ......................................................................... 35 Material ..................................................................................................................................................................................................... 36 Objetivo ..............................................................................................................................................

Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho (Figura 1).PRÁTICA 1 . Figura 1. TÉCNICA DE SEMEADURA Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos presentes no ambiente.NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas. e evitar acidentes laboratoriais. esfriar previamente a alça. deve-se flambar a 7 . Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura. Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri. Flambagem da alça ou fio de platina: Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. Para retirar o material.Posição correta para a flambagem da alça 2. 1.

Para uso. Uma vez utilizada. dentro de um cilindro metálico). Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. são oferecidas embrulhadas em papel (às vezes. após flambar a alça até o rubro. 4. e introduzi-la na cultura de bactéria. Esta seqüência evite que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. torcer o papel na região central da pipeta.3). semear na placa de Petri (fig. da mão que está segurando a alça ( Figura 2). 8 . 5. Após a retirada do material com a alça.boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão). retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta). Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo. Figura 2 – Removendo o tampão de algodão 3. Na semeadura usando placas de Petri. As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar. As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas. Não pousar os tampões sobre a bancada!!! Flambar a alça após o uso. a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo solução desinfetante.

Figura 3 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias 6. Após a primeira estria. sempre invertida. ou num pedaço do ágar sem cultura). Figura 4 – Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficiência no isolamento de colônias Não esqueça!!!!!! Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa técnica é conhecida também por esgotamento. 7. As placas serão incubadas a 37˚C por 24h. lembre-se: ela está muito QUENTE!!! Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma. antes de colocar a alça em contato com a cultura. girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria. e depois guardadas a 4˚C até a próxima aula. 9 . flambar novamente a alça.

PROCEDIMENTO E RESULTADOS Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo. tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli. não esquecendo de ilustrar os resultados obtidos A) SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO B) SEMEADURA EM PLACAS CONTENDO MEIO SÓLIDO 10 . tubo de ensaio com meio completo líquido placa de Petri com meio completo sólido.OBJETIVO Fazer semeaduras em meios líquido e sólido de cultura de Eschirichia coli. e obter colônias isoladas MATERIAL alça de platina.

C) OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS QUESTIONÁRIO 1. Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferência? 2. na semeadura em placa. Qual a finalidade de se fazer várias estrias. contendo meio sólido? 11 . Por que deve-se manter sempre que possível a placa de Petri com meio sólido invertida? 3.

através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. eventualmente. os corantes conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo. Existem inúmeros métodos para coloração. o que dá a cor. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e Podem. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que. Então. Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. em geral. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta. Porém. por quatro razões principais: Permitem uma visualização melhor das células. enquanto que os ácidos tem a cor do seu íon negativo. o microrganismo deve ser fixado à lâmina. no estudo dos microrganismos. além de facilitar sua observação. portanto atrai corantes básicos. os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação.PRÁTICA 2 . Quanto aos tipos de coloração temos: 1) Coloração simples . A introdução de colorações.cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. identificar alguns grupos. veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia. azul de metileno e safranina . permite a visualização de determinadas estruturas. A célula bacteriana é negativamente carregada. Um desse íons. é chamado de radical cromóforo. já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos. antes de ser corado.nessa coloração o corante reage diferentemente com 12 . 2) Coloração diferencial .COLORAÇÃO DE GRAM FIXAÇÃO E COLORAÇÃO DE MICRORGANISMOS A morfologia individual e as reações tintoriais constituem.

e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano. é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-) (Fig. 13 . e é o caso do iodo na coloração de Gram.diferentes tipos de bactérias.são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇOS E COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. com os reagentes cristal violeta. 5). o que confere a característica de positividade ao Gram. em 1884. etanolacetona e fucsina básica. No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. iodo. A coloração de Gram e a álcool . flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas.ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. frente ao Gram. mas sim com sua estrutura física. A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular. fixado pelo calor. enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). 3) Coloração especial . Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. Essas substâncias são chamadas mordentes. Essa maneira de reagir diferentemente.

Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Figura 5 – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. que é maior que a molécula de CV que penetrou. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. quando corretamente realizada e interpretada. 14 . Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana.Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Gram positiva Membrana plasmática Complexo de membrana externa. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. que não consegue reter o complexo. e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo.

dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. Por outro lado. podendo produzir resultados falsos. portanto. Em seguida. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. o lugol. A etapa da descoloração é crítica. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Células de bactérias Gram-positivas. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. células velhas. densidade. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. Paralelamente. A retenção ou não do corante primário é. o cristal violeta. com os mesmos resultados. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. Ao microscópio. tornando-as impermeáveis ao complexo. insolúvel. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido. seguido de tratamento com um fixador. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. O corante cristal violeta pode ser substituído. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. Por outro lado. em seus citoplasmas. a amostra é tratada com um corante secundário. devem ser capazes de distinguir formas e arranjos. com um corante primário. o uso de material fresco é importante. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. decorando as células. porosidade e integridade. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. o etanol-acetona (1:1 v:v). O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%.A TÉCNICA O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). Portanto. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. a fucsina básica. 15 . o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Grampositivas e provoca a contração dos poros do peptidioglicano.

já flambada. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixá-lo.OBJETIVO Coloração de microrganismos provenientes de meios. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1) Colocar com a própria alça. 6) Secar à tempetatura ambiente. OBS. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. procurando obter um esfregaço fino. solução diferenciadora. placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido. pelo método de Gram. 2) Flambar novamente a alça 16 . uma gota de água de torneira no centro da lâmina de vidro. tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído. MATERIAL alça de platina. 5) Espalhar o material sobre a lâmina. 8) Realizar a coloração. sólido e líquido. lâmina de vidro. fucsina básica. 7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. lugol. 4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. PROCEDIMENTO: A. cristal violeta a 1%. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1) Flambar a alça corretamente 2) Esfriá-la nas paredes do tubo 3) Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça.

B. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona.3) Esfriá-la na tampa da placa de Petri. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2) Lavar rapidamente em água corrente. 6) Secar a lâmina por exposição ao ar. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. Os esfregaços não devem ser muito espessos. 5) Homogeneizar este material com a gota de água. 5) Lavar uma ou duas vezes. tomando o cuidado de não remover o esfregaço. 7) Fixar o esfregaço. 8) Lavar novamente em água corrente. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. 4) Lavar rapidamente em água corrente. Evitar estas culturas! 17 . Porém. 7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos. 4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. 6) Lavar rapidamente em água corrente. 10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão. rapidamente. com bactérias G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se fracamente. A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. Ela deve ser efetuada rapidamente. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. ou no meio sólido numa região sem colônia. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. 9) Secar a lâmina. 3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. COLORAÇÃO 1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto.

RESULTADOS: ___________________ ____________________ __________________ ___________________ QUESTIONÁRIO 1. Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram. podendo inclusive levar a erros? 18 . Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? 2.

: Pseudomonas aeruginosa 19 .MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA OBJETIVO Visualização das colônias crescidas em placas contendo meio sólido e análise por microscopia óptica e Morfologia de bactérias e de fungos . Pseudomonas aeruginosa. Visualização de bactérias: b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus c) Bacilos Gram + : Bacillus subtilis d) Bacilos Gram . Repita o procedimento para os fungos apresentados. A. PROCEDIMENTO E RESULTADOS Faça um esboço das características morfológicas e suas propriedades tintoriais de cada uma das bactérias apresentadas.PRÁTICA 3 . Bacillus subtilis. MATERIAIS Lâminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus. Microscópio ótico. Streptococcus pyogenes e dois tipos de fungos).

Visualização de fungos Filamentosos Leveduras 20 .e) Cocos Gram + : Streptococcus pyogenes B.

Do ponto de vista bioquímico.. cada novo indivíduo pode catalisar a biossíntese de material celular adicional. Este tipo de crescimento populacional é denominado de crescimento exponencial ou logarítmico. o número de unidades catalíticas (células) aumenta com o tempo e. Em uma população composta por milhares de bactérias em crescimento ativo. Devido aos tempos de geração muito curtos. O aumento em tamanho de uma célula bacteriana conduz à divisão celular e conseqüente aumento do número de indivíduos na população. aumento da massa total de uma população. Uma característica importante do crescimento bacteriano é o fato de que a maioria das espécies de bactérias é capaz de crescer em taxas bastante rápidas. Quando uma bactéria se divide.CURVA DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO BACTERIANO O crescimento de qualquer organismo pode ser definido como o aumento do número de suas células ou o aumento de sua massa.g. muitas espécies bacterianas apresentam um tempo de geração médio de 20 minutos. Assim. no qual o número de indivíduos dobra a cada geração. o crescimento pode ser entendido como: aumento de tamanho de uma célula individual. a cada 20 minutos) a população dobra de tamanho. O tempo de geração refere-se ao tempo requerido para uma célula bacteriana duplicar seu DNA e dividir-se. seja em ambientes naturais (in vivo) ou em culturas de laboratório (in vitro). cada célula bacteriana é uma unidade catalítica. Nos organismos unicelulares. Sob condições ótimas de crescimento. biomassa é sintetizada em uma taxa progressiva na população em crescimento. A evolução ocorre através de mutações genéticas que produzem variações na descendência de um organismo e o ambiente determina que mutações são vantajosas no sentido de aumentar suas chances de sobrevivência e de sucesso reprodutivo (adaptação). aumento do número de células de uma população. como conseqüência. a cada 20 minutos uma nova geração de indivíduos é produzida. aumento da massa de uma célula individual. pode-se presumir que a maioria delas esteja se dividindo ao mesmo tempo e a cada nova geração (e. A maior vantagem de um tempo de reprodução tão rápido é que as bactérias podem evoluir muito rapidamente e esta e a razão do seu sucesso no mundo vivo. as bactérias podem testar 21 .PRÁTICA 4 . ou seja.

Essas quatro fases estão representadas na Figura 6. em meios de cultura e condições ambientais que variam em condições químicas e físicas. dependendo do ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador. tais como fontes de nutrientes. osmolaridade. Não há método perfeito. O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado através do aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (através de curvas de crescimento) ou da estimativa do número de células viáveis presentes na população (método de determinação do número de unidades formadoras de colônia). pH. Figura 6 – Curva de crescimento bacteriano padrão em sistema fechado 22 . Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condições nas quais seu crescimento atinge uma taxa ótima. Portanto. o crescimento bem sucedido de uma população bacteriana reflete seu grau de adaptação a um determinado ambiente e depende primariamente de sua composição: condições nutricionais. A escolha do método depende da situação particular que se apresente. Em condições experimentais. o crescimento dessa população passa por quatro fases características. presença ou ausência de oxigênio e temperatura de incubação. Estas são representações gráficas do aumento do número de indivíduos em um determinado período de tempo.bilhões de mutações em pequenos intervalos de tempo. oxigênio e luz. CURVAS DE CRESCIMENTO Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano é a obtenção de curvas de crescimento. osmolaridade. As distintas espécies bacterianas diferem no âmbito de fatores dentro dos quais podem crescer. ambos os métodos apresentam vantagens e desvantagens. como cultura pura. temperatura. Para se estudar o crescimento de uma bactéria é preciso cultivá-la. quando se inocula uma população bacteriana em um frasco contendo uma quantidade inalterável de meio de cultura (sistema fechado). pH.

A fase lag será tão mais longa quanto maiores as diferenças de composição do ambiente anterior ou se a população for constituído de bactérias esporuladas. o metabolismo celular está direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas condições ambientais encontradas pelas células. Fase estacionária: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido às condições limitantes do meio. podendo até mesmo decrescer. A duração da fase estacionária depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. o que mantém constante o número de células viáveis na população. acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço. O número de indivíduos não aumenta nesta fase. Para tal utiliza-se um espectrofotômetro onde o branco é o meio de cultura utilizado. as condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais. mede-se o aumento da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio líquido através de medidas da densidade óptica da cultura. ausente de inóculo. Fase exponencial ou logarítmica: fase na qual o número de células da população dobra a cada geração. A duração dessa fase depende das condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente. 23 . Após um determinado período de crescimento exponencial. O número de células viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população. Cada medida obtida corresponde à densidade óptica (DO) da cultura em um dado momento do crescimento. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase estacionária. Fase de declínio: fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. Alíquotas da cultura em crescimento são retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbância da cultura contra um comprimento de onda de 600 nm. As células continuam metabolizando e se dividindo. mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de morte celular. relacionando-se a DO pelo tempo. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. Desta forma pode-se construir um gráfico representativo do progresso do crescimento. A absorbância aumenta proporcionalmente ao aumento do número de células (biomassa) na população. A curva de crescimento atinge um platô.Fase lag: fase de adaptação metabólica ao novo ambiente. Para a construção de uma curva de crescimento bacteriano.

o experimento não é cansativo. Vantagens e desvantagens do método de medidas da densidade óptica Vantagens simplicidade da metodologia. acima disto as leituras perdem a confiabilidade. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura interferem na obtenção de resultados .Só são confiáveis medidas de DO até 2. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas. reduzindo a introdução de erros experimentais por parte do operador. Quadro 1. Acima disto as leituras perdem a confiabilidade. a introdução de erros experimentais pelo operador é menor.0. reduzida quantidade de material utilizado.0 deve-se fazer uma diluição 10-1 dessa amostra e registrar sua DO. células inviáveis. células bacterianas agrupadas após a divisão celular não prejudicam os resultados.0. Desvantagens e limitações não é possível a estimativa do número de células/ml da população. medidas prontamente obtidas: o resultado do experimento é conhecido ao seu final. Para a plotagem dos dados no gráfico deve-se multiplicar a DO obtida por 10. 24 . só se obtêm leituras acuradas da DO até o valor de 2. possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em gráfico). Se a leitura de uma amostra for maior que 2. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais.

Tubos de ensaio. coli MATERIAL Cultura bacteriana pura. Pipetas. os demais pontos serão medidos pelos monitores e repassados para os grupos.OBJETIVO Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de através de medidas de densidade óptica. Espectofotômetro. E. e suas unidades!!!) B) Identificar cada uma das fases de crescimento no gráfico. 25 . QUESTIONÁRIO 1. Quais os problemas observados na construção dos gráficos (em que etapa do crescimento)? Você diria que todos os pontos são confiáveis? Justifique sua resposta. Solução salina. RESULTADOS A) Construir um gráfico a partir dos pontos obtidos.(Não se esqueça de identificar os eixos. PROCEDIMENTO Durante a aulas serão obtidos apenas alguns pontos experimentais.

o resultado da contagem das colônias multiplicado pela quantidade de diluições decimais é a estimativa do número de bactérias presentes em um ml da cultura original. no espalhamento. muitos indivíduos viáveis podem não se replicar. seguido da semeadura de uma alíquota de cada diluição em placas de Petri contendo meio bacteriológico sólido. Como cada colônia supostamente originou-se da multiplicação um único indivíduo.PRÁTICA 5 . aquelas capazes de formarem colônias. A célula individual que originou uma colônia é denominada de "Unidade Formadora de Colônia" ou UFC. prejudicando o cálculo se as células da bactéria estudada mantém-se agrupadas após a divisão celular (cada colônia em meio sólido seria formada por mais de uma célula) se as diluições não forem homogeneizadas adequadamente se um número muito pequeno ou muito grande de colônias for usado na contagem se o operador não fizer o espalhamento rapidamente e de forma possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em um gráfico) pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais 26 .DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO ESTIMATIVA DO NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS A estimativa do número de células viáveis comumente é feita através de diluições seriadas de uma cultura bacteriana. Vantagens e desvantagens do método da contagem de células viáveis Vantagens permite uma estimativa do número de células viáveis/ml da população Desvantagens e limitações detecta somente as células viáveis e que se repliquem. células bacterianas individuais ocuparão posições separadas na superfície do meio de maneira que cada uma dê origem a uma colônia bacteriana isolada. em solução salina. Esse procedimento é repetido em diferentes intervalos de tempo e com os resultados pode-se construir um gráfico representando o progresso do crescimento Quadro 2. Esta técnica baseia-se na hipótese de que. As colônias crescendo no meio de cultura podem ser visualizadas e contadas pelo experimentador. ou seja.

Neste caso você poderá: 0. o que prejudica a estimativa a grande quantidade de material utilizado a acuracidade dos resultados está diretamente relacionada à quantidade de material (principalmente placas de Petri) a limitação de material impõe um aumento do erro experimental o resultado do experimento é só conhecido após o crescimento das colônias isoladas nas placas de Petri A) BACTERIANA A determinanção da concentração de bactérias é feita geralmente pela técnica de determinação do Número de UFC (unidades formadoras de colônias).1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. a cada diluição um erro experimental é introduzido pela instrumentação e pelo experimentador este método detecta apenas um número muito reduzido de células. VOCE PRECISA RECUPERAR SUA BACTÉRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE. Qual é a concentração de E. coli número de (UFC/ml da cultura original)? (X)_________ 27 . PROBLEMA: 1. Você tem um estoque de uma super bactéria Escherichia coli (lac+). fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura não interferem na obtenção de resultados adequada.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e 0.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e contaminação e _________lac_________lac_________lac_________lac- 3. Mas digamos que você precisa ou deseja conhecer o nível de que a bactéria contaminante seja lac-. Você fez um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada.células inviáveis.1ml (diluição 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. QUE FAZER? 2.

contaminante (UFC/ml da cultura original)? ( Y) _________ Qual é porcentagem da contaminação? _( Y) / (X)_____________________ B) DE LEVEDURAS Pela técnica de contagem em câmara de ¨Neubauer¨ VERIFICAÇÃO DE ENTENDIMENTO: Várias técnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prática. Você saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos? 28 . Qual é a concentração da bactéria lac.4.

Anos mais tarde Pasteur explicou sobre a fermentação bacteriana e a existência de agentes infectantes como responsáveis por processos patológicos.AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES HISTÓRIA O uso de anti-sépticos e desinfetantes evolui desde o Antigo Egito. Uma substância anti–séptica não mata o microrganismo. Tais como: O microorganismo. 29 . até matar o tecido normal do hospedeiro. mel. interferindo assim com o crescimento normal do tecido de granulação na cicatrização de feridas. USOS TERAPÊUTICOS DE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES Vários fatores podem influenciar na eficácia e/ou eficiência dos procedimentos ou agentes microbianos. consequentemente. bálsamo. evitando a infecção. mura. CONCEITOS GERAIS Um desinfetante é uma substância usada para destruir bactérias ou outros microrganismos infectantes. número de microrganismos. em relação aos processos de embalsamento. concentração da droga e temperatura. vinagres. O tempo de contato entre o microorganismo e o antimicrobiano. Os anti-sépticos são valiosos no tratamento de infecções locais causadas por microrganismos refratários a quimioterapia sistêmica. As substâncias anti-sépticas são aplicadas ao tecidos para suprimir ou impedir a infecção bacteriana.PRÁTICA 6 . mas inibe sua velocidade de crescimento. seu número e sua suscetibilidade. O aumento da concentração de um agente anti-séptico pode irritar e talvez. inicialmente desenvolvidos com o intuito da preservação do corpo à ressurreição. Coube a Lister. Bem como as células bacterianas. além do fato de os vinhos e vinagres continuarem a serem utilizados durante a Idade Média ao recobrimento de feridas e. compressas cirúrgicas. vinhos. A concentração de anti-séptico em geral é baixa para evitar a lesão e irritação tecidual indesejáveis. instrumental cirúrgico e anti-sepsia das feridas. Os egípcios e outros povos utilizaram várias misturas. tais como óleos voláteis. A presença ou não de resistência bacteriana ao agente antimicrobiano. a divulgação dos métodos de esterilização de bandagens. A presença ou não de uma limpeza mecânica prévia. A diferença entre um anti-séptico e um desinfetante pode ser uma questão de tempo de reação. Os desinfetantes possuem atividade bactericida ou germicida e costumam ser aplicados em superfícies inanimadas. em 1865. A descoberta do cloro na Idade Média foi amplamente utilizada como substância desodorante e anti-séptica. O agente microbiano e sua respectiva concentração. sendo utilizado em 1847-49 em um hospital vienense quanto à demonstração prática da ação benéfica da anti-sepsia. A prévia remoção ou não de detritos e impurezas da superfície ou tecidos através do uso de sabões ou detergentes. resinas oleosas.

de apresentarem baixo custo e praticamente serem atóxicos. Iodo. na presença de matéria orgânica o mais ativo é o Iodo. pela borracha e materiais porosos. A presença de água é fundamental para a atividade dos álcoois (50-70%) e são mais eficazes na ausência de sujeiras e matéria orgânica. desidratantes. HALOGÊNIOS Possuem efeitos antibacterianos potentes devido à alta afinidade pelo protoplasma. Desvantagens: São neutralizados por surfactantes aniônicos (sabões). São antibacterianos contra microrganismos Gram negativos e ácido-resistentes. Gram positivas. METAIS PESADOS 30 . são inodoros. O mecanismo de ação está relacionado à concentração do íon hidroxila. a concentração eficiente e a eficácia antibacteriana. Já. As atividades em soluções livres de matéria orgânica são. não possuírem ação residual e não devem ser utilizados para limpezas de ferimentos abertos. Não-iônicos. Um pH maior do que 9 inibirá a maioria das bactérias. baixa toxicidade. ÁLCOOIS Os álcoois alifáticos comuns são bons solventes. As desvantagens são: baixa atividade fungicida e virucida. anti-sépticos e desinfetantes. em ordem decrescente: 1º. de terem ação rápida. São utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes. fungicida ou esporocida. SURFACTANTES É um composto químico que diminui a tensão superficial de uma solução aquosa. os detergentes catiônicos não possuem ação virucida. Vantagens: Não são em geral irritantes para a pele e tecidos.ÁLCALIS Os álcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigüidade. Gram negativas. não agem na presença de matéria orgânica e podem causar irritação quando em contato prolongado com a pele. Cloro. Com base na posição hidrofóbica da molécula. 2º. podem ser usados em soluções com água e álcool. 3º. Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem ótimos solventes em relação a outros agentes germicidas. mucosas e trato respiratório. diminuindo assim. Bromo. Apesar de possuírem efeitos limitados sobre os vírus. baixa penetrabilidade. Os surfactantes são adsorvidos em um grau significativo pelo algodão. Catiônicos : Os compostos de amônio quaternário são os principais. São potentes bactericidas contra micobactérias. eles são eficientes contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. fungos patogênicos. mas em geral. há três tipos: Aniônicos : Os sabões são os mais importantes. muitos vírus e não em esporos.

bico de Bunsen. MATERIAL 4 Placas com Ágar-sangue : Meio base para ágar sangue ou TSB enriquecido com 5% sangue desfibrinado de carneiro. Liberam Oxigênio que se combina com a matéria orgânica se tornando inativos. Quando é distribuído sobre ferida com exsudato. mertiolate. lâminas. 4 zaragatoas (“Swab”) estéreis. ou + 3 zaragatoas estéreis. A solução de Peróxido de Hidrogênio libera Oxigênio livre rapidamente ao entrar em contato com mucosas e superfícies sem pêlos que fornecem a enzima catalase. O Permanganato de Potássio libera Oxigênio em contato com a matéria orgânica. sabão. Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaeróbicos.Derivados do mercúrio Parecem ser primariamente bacteriostáticos e apenas levemente bactericidas. As soluções possuem uma grande ação antibacteriana. antibacterianos pela ação do íon de prata livre e produz desnaturação de proteínas. a sua efervescência vai remover o pus e restos celulares e confere atividade germicida limitada. A sua ação antibacteriana está relacionada à inibição reversível da atividade enzimática essencial da bactéria e à capacidade de se combinar com íons de compostos metálicos orgânicos e inorgânicos. Alça de Platina . anti-sépticos comerciais (anti-sépticos em geral disponíveis 1 para cada grupo. O uso para anti-sepsia de superfícies e objetos inanimados parece imprudente já que há agentes com um modo de ação mais eficiente. adstringentes. Compostos de Prata Produzem efeitos cáusticos. mas não destroem esporos bacterianos. álcool iodado. OBJETIVOS Verificar a ação de anti-sépticos no crescimento bacteriano. Microscópio óptico. 31 . Os preparados de Prata coloidal não são corrosivos nem irritantes e são usados sobre tecidos sensíveis. AGENTES OXIDANTES São compostos germicidas de ação breve sobre algumas bactérias aeróbicas Gram+ e Gram-. É valioso para limpar e desodorizar o tecido infectado. Possuem pouca atividade esporicida e são inativados por restos orgânicos. 3 cotonetes embrulhados em papel alumínio autoclavados. bateria de Gram. A prata metálica precipita as proteínas e produz efeito irritante. podendo haver repetições).

5. 2. Umedecer um cotonete estéril em solução fisiológica e esfregar vigorosamente sobre as costas de uma das mãos. Tomar cuidado para não atingir a região não desinfectada. Observar os resultados e anotar. Espalhar o conteúdo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo ágar-sangue.Nesta lista deve conter o principal composto ativo. Marcar na placa o anti-séptico utilizado e o número do grupo que realizou o experimento. e o uso . 7. em estufa a 37°C. 2. Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio Ágar sangue. Descreva duas situações: uma em que você usaria um anti-séptico e uma em que usaria um desinfetante. (Não se esqueça de ilustrar o que você observou!) QUESTIONÁRIO 1. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a 32 . 4. 6. Faça uma lista com pelo menos seis anti-sépticos e seis desinfetantes. 3. numa área de mesmo diâmetro da primeira.PROCEDIMENTO 1. PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA TEORIA Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos. 2. Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar nas costas da outra mão. Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de diâmetro. Esperar 4 minutos para que haja ação do anti-séptico e passar na área desinfectada um terceiro cotonete umedecido com solução fisiológica. Analisar a Morfologia MACROSCÓPICA das colônias e MICROSPICA das bactérias após coloração de Gram. o nome comercial. RESULTADOS Na quinta-feira: 1. Incubar a placa por 24h.

ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). 33 . coli a alguns antibióticos. e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes. formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. com meio Mueller-Hinton sólido. 2. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível. devendo-se realizar a coloração de Gram. retirar o excesso de líquido comprimindo a ponta do “swab” nas paredes do tubo.Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo. OBJETIVO Analisar pelo método de difusão a ressitência de E. no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. Introduzir nas culturas um “swab” estéril.Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível. PROCEDIMENTO 1. MATERIAIS “Swab” estéril. alguns fatores são essenciais: − Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton. que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas. Para a garantia desta técnica. intermediário ou resistente. 1. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0. régua. pinças.atividade de novos agentes. placas de Petri. − Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias. cultura líquida fresca de Eschirichia coli.5 na escala padrão de turbidez (Escala de MacFarland). discos de papel com antibióticos.

3. Espalhar bem. 4. coli testada? Por que? 5. 4. Faça um esquema da parede de uma bactéria Gram-positiva e de uma bactéria Gram-negativa? 34 . Incubar em estufa a 37ºC . Medir os halos formados (em mm). de modo a obter um “tapete” de bactérias em toda a superfície do meio sólido. Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar pinças). 5. registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela abaixo: Bactéria Oxacilina OX (1µg/mL) Carbemicilina CB (100µg/mL) Discos com antibióticos Kanamicina K (30µg/mL) Rifampicina RIF (30µg/mL) Sulfonamida SUL (300µg/mL) Estreptomicina EST (10µg/mL) Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padrões R< 10 S> 13 R< 13 S> 17 R< 12 S> 15 R< 16 S> 20 R< 12 S> 17 R< 11 S> 15 Relate os resultados obtidos e interprete comentando.2. 3. 6. O que é antibiograma e para que serve? Quais são os antibióticos beta-lactâmicos? Qual o seu modo de ação? Qual a diferença entre agente bactericida e bacteriostático? Dos antibióticos testados na experiência acima qual seria o mais indicado para o tratamento da infecção causada pela linhagem E. Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa placa de Petri (meio Mueller-Hinton). 2. Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos). por 16 a 24 horas. QUESTIONÁRIO 1.

4. coli. MATERIAL Placas de ágar Sabouraud. Espalhar sobre a superfície do meio com o próprio cotonete embebido na cultura. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e colocá-los sobre a superfície do meio semeado. Incubar a 25°C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibição. Um importante exemplo deste processo é o alho. em graal.PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS. Pode ser algum já relatado na literatura ou algum de conhecimento popular.PRÁTICA 8 . 2. Alho e cebola. 3. Macerar o alho e a cebola. Cotonetes. RESULTADOS Descreva as observações feitas ao final da incubação. 35 . Mergulhar o cotonete na suspensão do microrganismo. PROCEDIMENTO 1. OBJETIVO Estudar a presença de compostos antimicrobianos em vegetais. A presença de substâncias antimicrobianas pode ser verificada através de extratos ou partes homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos. INTRODUÇÃO Muitos vegetais contêm compostos que são inibidores de crescimento de microrganismos e exercem papel importante na resistência destes vegetais a patógenos. 5. separadamente. Culturas: Staphylococcus sp e E. Graal e pistilo. Discos de papel de filtro. QUESTIONÁRIO Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural .

descoberta por Lederberg e Tatum (1946) é o processo “sexual"de transferência de genes de uma bactéria doadora para outra receptora. somente um dos conjuntos das funções encontradas nos plasmídios auto-transmissíveis para concluir a transferência. Como a interação mob-oriT é específica. em um sítio específico. O outro grupo. Ambas servem como molde para sintetizar a fita complementar. chamado de oriT e catalisa o desenrolamento da dupla hélice. Por outro lado. pode ser transferida para a célula aceptora e a outra fita permanece na célula doadora. coli K12 e o elemento extra-cromossômico responsável foi chamado de fator F (de fertilidade) ou plasmídio F. bem como. Esta célula doadora é diferenciada durante a conjugação pela presença de um apêndice na sua superfície chamado de pili F. Experimentos genéticos demonstraram que todas as três classes de funcões de 36 . o sítio de oriT deve ser compatível com as funcões mob presentes nas células doadoras. somente uma fita. na formação dos poros na membrana. Os autotransmissíveis carregam um conjunto de genes. cujos produtos promovem a transferência deste plasmídio para uma célula aceptora.PRÁTICA 9 . ela deve conter um plasmídio conjugativo (elemento extra-cromossômico). os plasmídios mobilizáveis codificam. para que o plasmídio possa ser transferido. refere-se aos genes mob. Contudo. especifica proteínas envolvidas não só na interação superficial (contacto) entre as células doadora e aceptora. Para que uma linhagem bacteriana seja doadora. Como resultado. O processo de conjugação foi descoberto em E. o plasmídio mobilizável deve conter um ori T. os produtos dos genes mob preparam o DNA para serem transferidos. A transferência do DNA é iniciada pela ação de um gene mob que tem a atividade em romper (nicking) em uma única fita da molécula do DNA. os genes tra. Há dois tipos de plasmídios conjugativos: os plasmídios auto-transmissíveis e os mobilizáveis. Um exemplo de plasmídio mobilizável é o plasmído natural ColE1 ou colicinogênico que codifica as atividades dos genes mob e seu oriT. Os genes tra podem ser divididos em dois grandes grupos: um grupo. os quais especificam proteínas envolvidas na mobilização do DNA.CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS INTRODUÇÃO A conjugação bacteriana. ainda que os produtos dos genes tra promovem o contacto das células doadora-aceptora e promovem um contexto físico (formação dos poros) para esta transferência. Concluindo.

O fenótipo de resistência ao ácido Nalidíxico deve-se a uma mutação cromossomal. Raramente. O fator F também é raramente transferido. Por outro lado. Linhagens a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac. b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ . tornando-a F+. para a Escherichia coli K12 . OBJETIVO Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmídio que carrega o gene que confere resistência a tetraciclina. Estes plasmídios ColE1 codificam proteínas chamadas de colicinas que matam algumas linhagens sensíveis de E. a linhagem Hfr cujo fator F está integrado ao cromossomo bacteriano. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. As células F+ após contato com as células F-. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. transferem em alta frequência para esta última uma réplica ou cópia do plasmídio F. a linhagem bacteriana é chamada de F+ e no segundo Hfr ( a integração do fator F parece ser mediada por pequenas sequências chamadas de elementos IS). Hospeda um plasmídio que carrega o marcador que confere resistência a tetraciclina (Tcr ). o fator F media a transferência do cromossoma da célula Hfr para a célula F-. sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugação entre bactérias e bactérias e leveduras. coli.. Após a descoberta do fator F.conjugação. Placas com meio sólido. MATERIAL Tubos de ensaio . outros plasmídios conjugativos foram sendo descobertos como é o caso dos fatores ou plasmídios R ou RTF (fator de transferência de resistência). transfere. No primeiro caso. normalmente no cromossomo bacteriano. Neste estado. Raramente. Nalr). Alguns plasmídios não promovem conjugação. 37 . Estes plasmídios possuem marcadores para a resistência às drogas antibacterianas e não integram-se. Os plasmídios conjugativos após serem transferidos e replicados podem permanecerem livres (autônomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano (chamados de estado integrado). tra. mas podem ser mobilizados por outros plasmídios conjugativos. Tetr ).

typhimurium MG031 (doadora) e 1.0ml de TSB ou LB as seguintes culturas: 1.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Tc 3. Incubar à temperatura de 37°C por uma noite. 38 . typhimurium MG031 0.1 Célula doadora: S.2 Célula receptora: E.Antibióticos a) Ácido Nalidíxico (Nal) usar a concentração de 10µg/ml b) Tetraciclina (Tc) usar a concentração de 50 µg/ml PROCEDIMENTO 1° Dia 1.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey -Tc 0.1ml (diluição 10-4 ) em meio MacConkey -Nal 0.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Tc 0. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitação à temperatura de 37°C.1ml (sem diluição) em meio YT-Nal-Tc 0. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1. Fazer os pré-inóculos das linhagens doadoras e receptoras em 4.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Nal 0.0ml de meio TSB.0 ml da linhagem E.1ml (sem diluição) em meio MacConkey-Nal 0.1ml (sem diluição) em meio MacConkey -Nal-Tc 0.1ml (diluição 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc 4.3 Mistura de conjugação (Transconjugantes): 0. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio sólido: 3.0 ml da linhagem S.1ml (diluição 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc 0. coli K12 0.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Nal 3. Incubar em estufa à temperatura de 37°C por 16-24 horas (durante uma noite). 2°Dia 1. 3. coli K12 (receptora) 2.

RESULTADOS 3°Dia Analisar os resultados e determinar a freqüência de conjugação. 39 . A freqüência é determinada dividindo o número de células transconjugantes pelo número total de células receptoras.

dos mecanismos que regem a infectividade bacteriana. A cultura pura quando inoculada em voluntário humano susceptível ou animal experimental deve produzir os sintomas da doença. A bactéria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doença. 1. ABORDAGEM CLÁSSICA Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relação casual entre um microrganismo em particular e uma doença.POSTULADO DE KOCH Como provar que um microrganismo é responsável por uma doença? A resposta clássica é um conjunto de quatro postulados formulados por Robert Koch e posteriormente revisados com o desenvolvimento da Microbiologia. Na realidade. Há algumas 40 . a bactéria ou seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doença. Estes se constituíram nas primeiras abordagens que forneceram bases científicas para o estudo das doenças infecciosas. 2. 2. A bactéria deve ser isolada de lesões de uma pessoa infectada e mantida em culturas puras. Estes postulados apresentam. uma série de limitações devido ao precário conhecimento. tratamento com corticosteróides. O segundo postulado enfatiza a obtenção de culturas puras do patógeno.PRÁTICA 10 . 4. a susceptibilidade do hospedeiro é tão ou mais importante que as características de virulência da bactéria: Indivíduos cujo sistema imunológico esteja seriamente comprometido por quimioterapia anti-câncer. contudo. A mesma bactéria pode ou não satisfazer os postulados de Koch dependendo da sub-população usada como ponto de referência. A mesma bactéria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivíduos intencionalmente infectados. infecção por HIV ou diabetes e que podem ser infectados por bactérias incapazes de causar infecção em pessoas sadias. 3. ao tempo de Koch. 1. Epidemiologia e da Genética Molecular. Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactérias causadoras de epidemias como a cólera e a tuberculose. Os postulados de Koch implicam que a virulência é uma característica exclusiva das bactérias e independente do hospedeiro.

respectivamente. o cultivo de uma bactéria em meio de laboratório pode causar a "perda" do fator de virulência: não expressão dos genes nas condições ambientais do meio. Em muitos casos não é possível a utilização de voluntários humanos e a única alternativa é a utilização de um modelo animal. 41 . 4. A combinação das tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR) com as de seqüenciamento de ácidos nucléicos possibilita a detecção e identificação de bactérias não-cultiváveis e revela o agente causativo de muitas doenças. se houver um disponível. os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espécies de bactérias e há doenças cujas lesões são causados por uma mistura de diferentes linhagens (infecções polimicrobianas). disponível: Há consideráveis evidências para implicar as bactérias Treponema pallidum e Mycobacterium leprae como causadoras da sífilis e hanseníase. uma resposta imunológica dos indivíduos infectados contra os antígenos de superfície das bactérias observadas nas lesões provocadas pela doença. diferentes linhagens de uma espécie bacteriana não somente variam consideravelmente em virulência como podem causar doenças distintas. ainda. 3. Antibióticos que causam o desaparecimento de sintomas também causam a eliminação da bactéria do tecido infectado.doenças cujo agente causativo não pode ser cultivado em meios de laboratório ou cujo meio adequando não é. Alguns patógenos humanos não causam doenças em animais ou provocam sintomas diferentes daqueles observados em humanos. Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espécie bacteriana são igualmente virulentos e que somente uma única espécie causa uma determinada doença. os casos nos quais uma única espécie de bactéria é a única responsável por uma doença parece mais uma exceção do que uma regra. O terceiro postulado requer que a bactéria seja reinoculada em um voluntário humano ou em um animal experimental e que a reinoculação cause os sintomas da doença. Há também.

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