Universidade de São Paulo

Instituto de Ciências Biomédicas Departamento de Microbiologia
BMM121 – Microbiologia Básica

Apostila de Aulas Práticas Profa. Elisabete José Vicente bevicent@usp.br 3091.7350 2004

MICROBIOLOGIA NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de mangas compridas e estar abotoado; Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório; O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações; Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula prática; Descarte de material: a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada; c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes Terminados os trabalhos práticos: a) b) c) d) e) f) Esterilizar alças e fios de platina; Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; Desligar lâmpadas e microscópios; Limpar microscópios e cobri-los com a capa; Tirar o avental e guardar; Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

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Módulo I Introdução à microbiologia

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Módulo I ......................................................................................................................... 4 Introdução à microbiologia ............................................................................................. 4 Prática 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7 Técnica de semeadura ............................................................................................... 7 Objetivo .................................................................................................................... 10 Material ..................................................................................................................... 10 Procedimento e Resultados...................................................................................... 10 Questionário ............................................................................................................. 11 PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM........................................................................... 12 Fixação e coloração de microrganismos................................................................... 12 Preparação de esfregaços e coloração pelo método de gram.................................. 13 A técnica ................................................................................................................... 15 Objetivo .................................................................................................................... 16 Material ..................................................................................................................... 16 Procedimento:........................................................................................................... 16 Resultados:............................................................................................................... 18 Questionário ............................................................................................................. 18 PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA..... 19 Objetivo .................................................................................................................... 19 Materiais ................................................................................................................... 19 Procedimento e resultados ....................................................................................... 19 A. Visualização de bactérias:.................................................................................... 19 B. Visualização de fungos......................................................................................... 20 PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21 Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21 Curvas de crescimento ............................................................................................. 22 Objetivo .................................................................................................................... 25 Material ..................................................................................................................... 25 Procedimento............................................................................................................ 25 Resultados................................................................................................................ 25 Questionário ............................................................................................................. 25 PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO................................................................................................................... 26 Estimativa do número de células viáveis .................................................................. 26 Problema: ................................................................................................................. 27 5

....................... 28 PRÁTICA 6 ........................................................................................................................................... 35 Questionário ............ 32 Questionário ............................... 37 Material .................................................................................................................................................................PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS......................................................................................POSTULADO DE KOCH............... 38 Resultados............................................................................................... 35 Material ................................................................................................. 31 Material ............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 32 Teoria ........................................................................................................... 32 PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA .......................................................................................................................................................... 35 Resultados........................................................................................................................................................................ 32 Objetivo ............................................................................................................................................................................................... 33 Questionário ...........................................AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ........................................................................................................................CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS................. 35 PRÁTICA 9 ............................... 29 Anti-sépticos e desinfetantes .............................................................................................................................. 32 Resultados............................................................................................................................ 37 Procedimento........................................................Verificação de entendimento: ..................................................................................................................................................................... 34 PRÁTICA 8 .......... 36 Objetivo .............................................. 31 Procedimento..................................... 40 Abordagem clássica ............................................................................................... 33 Materiais ........................ 35 Procedimento....................................................................................................... 36 Introdução................. 35 Objetivo .. 40 6 ................................................... 35 Introdução............................................................................................................. 29 Objetivos... 39 PRÁTICA 10 .................................................................... ............... 33 Procedimento........................................

A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho (Figura 1). Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio. Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri. Para retirar o material. deve-se flambar a 7 . e evitar acidentes laboratoriais. TÉCNICA DE SEMEADURA Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos presentes no ambiente.PRÁTICA 1 . esfriar previamente a alça. 1. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura.Posição correta para a flambagem da alça 2. Flambagem da alça ou fio de platina: Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. Figura 1.NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas.

Não pousar os tampões sobre a bancada!!! Flambar a alça após o uso. As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas.3). após flambar a alça até o rubro. 4.boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão). Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo. e introduzi-la na cultura de bactéria. dentro de um cilindro metálico). Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. Esta seqüência evite que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. Figura 2 – Removendo o tampão de algodão 3. Após a retirada do material com a alça. 5. a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo solução desinfetante. flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. Uma vez utilizada. Na semeadura usando placas de Petri. 8 . retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta). torcer o papel na região central da pipeta. são oferecidas embrulhadas em papel (às vezes. Para uso. As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar. semear na placa de Petri (fig. da mão que está segurando a alça ( Figura 2).

girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria. lembre-se: ela está muito QUENTE!!! Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma. e depois guardadas a 4˚C até a próxima aula. 7. antes de colocar a alça em contato com a cultura. ou num pedaço do ágar sem cultura). Após a primeira estria. 9 . Figura 4 – Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficiência no isolamento de colônias Não esqueça!!!!!! Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo.Figura 3 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias 6. sempre invertida. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa técnica é conhecida também por esgotamento. flambar novamente a alça. As placas serão incubadas a 37˚C por 24h.

tubo de ensaio com meio completo líquido placa de Petri com meio completo sólido. e obter colônias isoladas MATERIAL alça de platina.OBJETIVO Fazer semeaduras em meios líquido e sólido de cultura de Eschirichia coli. tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli. PROCEDIMENTO E RESULTADOS Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo. não esquecendo de ilustrar os resultados obtidos A) SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO B) SEMEADURA EM PLACAS CONTENDO MEIO SÓLIDO 10 .

C) OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS QUESTIONÁRIO 1. Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferência? 2. na semeadura em placa. Qual a finalidade de se fazer várias estrias. contendo meio sólido? 11 . Por que deve-se manter sempre que possível a placa de Petri com meio sólido invertida? 3.

eventualmente. em geral. 2) Coloração diferencial . Então. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares.PRÁTICA 2 . enquanto que os ácidos tem a cor do seu íon negativo. veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e Podem. portanto atrai corantes básicos.COLORAÇÃO DE GRAM FIXAÇÃO E COLORAÇÃO DE MICRORGANISMOS A morfologia individual e as reações tintoriais constituem. A célula bacteriana é negativamente carregada. por quatro razões principais: Permitem uma visualização melhor das células. azul de metileno e safranina . além de facilitar sua observação. os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação.nessa coloração o corante reage diferentemente com 12 .cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta. é chamado de radical cromóforo. Existem inúmeros métodos para coloração. A introdução de colorações. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que. Um desse íons. Porém. através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. permite a visualização de determinadas estruturas. Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. o que dá a cor. já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos. antes de ser corado. no estudo dos microrganismos. os corantes conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo. o microrganismo deve ser fixado à lâmina. identificar alguns grupos. Quanto aos tipos de coloração temos: 1) Coloração simples .

Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. mas sim com sua estrutura física. com os reagentes cristal violeta. A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular. etanolacetona e fucsina básica. em 1884. Essas substâncias são chamadas mordentes.ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. 5). fixado pelo calor. 3) Coloração especial . A coloração de Gram e a álcool . Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇOS E COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-) (Fig. frente ao Gram.diferentes tipos de bactérias. flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas. é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias.são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos. iodo. e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano. No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Essa maneira de reagir diferentemente. o que confere a característica de positividade ao Gram. enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). 13 . e é o caso do iodo na coloração de Gram.

a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Figura 5 – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. 14 . que não consegue reter o complexo. quando corretamente realizada e interpretada. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. que é maior que a molécula de CV que penetrou.Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Gram positiva Membrana plasmática Complexo de membrana externa. e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo.

Paralelamente. densidade. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. a fucsina básica. Ao microscópio. seguido de tratamento com um fixador. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. o cristal violeta. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Grampositivas e provoca a contração dos poros do peptidioglicano.A TÉCNICA O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. O corante cristal violeta pode ser substituído. em seus citoplasmas. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. Por outro lado. 15 . dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. o lugol. Células de bactérias Gram-positivas. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. tornando-as impermeáveis ao complexo. O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). podendo produzir resultados falsos. portanto. insolúvel. devem ser capazes de distinguir formas e arranjos. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. com um corante primário. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. o uso de material fresco é importante. Por outro lado. células velhas. porosidade e integridade. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. a amostra é tratada com um corante secundário. A etapa da descoloração é crítica. Portanto. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. A retenção ou não do corante primário é. com os mesmos resultados. decorando as células. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. o etanol-acetona (1:1 v:v). Em seguida. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos.

PROCEDIMENTO: A. já flambada. 4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. cristal violeta a 1%. placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido. tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído. 6) Secar à tempetatura ambiente. fucsina básica. MATERIAL alça de platina. 5) Espalhar o material sobre a lâmina. 8) Realizar a coloração. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1) Colocar com a própria alça. sólido e líquido. pelo método de Gram.OBJETIVO Coloração de microrganismos provenientes de meios. lugol. solução diferenciadora. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. uma gota de água de torneira no centro da lâmina de vidro. 7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. lâmina de vidro. 2) Flambar novamente a alça 16 . procurando obter um esfregaço fino. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1) Flambar a alça corretamente 2) Esfriá-la nas paredes do tubo 3) Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixá-lo. OBS.

8) Lavar novamente em água corrente. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. 4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. Ela deve ser efetuada rapidamente. rapidamente.3) Esfriá-la na tampa da placa de Petri. A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. 10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão. Os esfregaços não devem ser muito espessos. 4) Lavar rapidamente em água corrente. A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. 7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. B. tomando o cuidado de não remover o esfregaço. 5) Homogeneizar este material com a gota de água. 6) Lavar rapidamente em água corrente. 5) Lavar uma ou duas vezes. 3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. Porém. ou no meio sólido numa região sem colônia. 7) Fixar o esfregaço. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. COLORAÇÃO 1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2) Lavar rapidamente em água corrente. 9) Secar a lâmina. 6) Secar a lâmina por exposição ao ar. Evitar estas culturas! 17 . com bactérias G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se fracamente.

RESULTADOS: ___________________ ____________________ __________________ ___________________ QUESTIONÁRIO 1. podendo inclusive levar a erros? 18 . Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram. Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? 2.

Visualização de bactérias: b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus c) Bacilos Gram + : Bacillus subtilis d) Bacilos Gram . Bacillus subtilis. MATERIAIS Lâminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus.PRÁTICA 3 . PROCEDIMENTO E RESULTADOS Faça um esboço das características morfológicas e suas propriedades tintoriais de cada uma das bactérias apresentadas. Streptococcus pyogenes e dois tipos de fungos). Pseudomonas aeruginosa. Microscópio ótico. A.: Pseudomonas aeruginosa 19 .MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA OBJETIVO Visualização das colônias crescidas em placas contendo meio sólido e análise por microscopia óptica e Morfologia de bactérias e de fungos . Repita o procedimento para os fungos apresentados.

e) Cocos Gram + : Streptococcus pyogenes B. Visualização de fungos Filamentosos Leveduras 20 .

pode-se presumir que a maioria delas esteja se dividindo ao mesmo tempo e a cada nova geração (e. o número de unidades catalíticas (células) aumenta com o tempo e. Quando uma bactéria se divide.. aumento da massa de uma célula individual. a cada 20 minutos uma nova geração de indivíduos é produzida. a cada 20 minutos) a população dobra de tamanho. no qual o número de indivíduos dobra a cada geração. aumento da massa total de uma população. Este tipo de crescimento populacional é denominado de crescimento exponencial ou logarítmico. ou seja. como conseqüência. Uma característica importante do crescimento bacteriano é o fato de que a maioria das espécies de bactérias é capaz de crescer em taxas bastante rápidas. biomassa é sintetizada em uma taxa progressiva na população em crescimento. Em uma população composta por milhares de bactérias em crescimento ativo. A maior vantagem de um tempo de reprodução tão rápido é que as bactérias podem evoluir muito rapidamente e esta e a razão do seu sucesso no mundo vivo.g. Devido aos tempos de geração muito curtos. seja em ambientes naturais (in vivo) ou em culturas de laboratório (in vitro). Sob condições ótimas de crescimento. muitas espécies bacterianas apresentam um tempo de geração médio de 20 minutos. Nos organismos unicelulares. o crescimento pode ser entendido como: aumento de tamanho de uma célula individual. O aumento em tamanho de uma célula bacteriana conduz à divisão celular e conseqüente aumento do número de indivíduos na população. Do ponto de vista bioquímico. A evolução ocorre através de mutações genéticas que produzem variações na descendência de um organismo e o ambiente determina que mutações são vantajosas no sentido de aumentar suas chances de sobrevivência e de sucesso reprodutivo (adaptação). O tempo de geração refere-se ao tempo requerido para uma célula bacteriana duplicar seu DNA e dividir-se. as bactérias podem testar 21 .CURVA DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO BACTERIANO O crescimento de qualquer organismo pode ser definido como o aumento do número de suas células ou o aumento de sua massa. Assim. aumento do número de células de uma população. cada célula bacteriana é uma unidade catalítica. cada novo indivíduo pode catalisar a biossíntese de material celular adicional.PRÁTICA 4 .

ambos os métodos apresentam vantagens e desvantagens. em meios de cultura e condições ambientais que variam em condições químicas e físicas. A escolha do método depende da situação particular que se apresente. pH. Figura 6 – Curva de crescimento bacteriano padrão em sistema fechado 22 . o crescimento bem sucedido de uma população bacteriana reflete seu grau de adaptação a um determinado ambiente e depende primariamente de sua composição: condições nutricionais. O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado através do aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (através de curvas de crescimento) ou da estimativa do número de células viáveis presentes na população (método de determinação do número de unidades formadoras de colônia). Portanto. dependendo do ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador. Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condições nas quais seu crescimento atinge uma taxa ótima. oxigênio e luz. Essas quatro fases estão representadas na Figura 6. como cultura pura. Para se estudar o crescimento de uma bactéria é preciso cultivá-la.bilhões de mutações em pequenos intervalos de tempo. As distintas espécies bacterianas diferem no âmbito de fatores dentro dos quais podem crescer. osmolaridade. osmolaridade. Estas são representações gráficas do aumento do número de indivíduos em um determinado período de tempo. Em condições experimentais. temperatura. tais como fontes de nutrientes. presença ou ausência de oxigênio e temperatura de incubação. pH. o crescimento dessa população passa por quatro fases características. CURVAS DE CRESCIMENTO Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano é a obtenção de curvas de crescimento. quando se inocula uma população bacteriana em um frasco contendo uma quantidade inalterável de meio de cultura (sistema fechado). Não há método perfeito.

A duração dessa fase depende das condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente. mede-se o aumento da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio líquido através de medidas da densidade óptica da cultura. A curva de crescimento atinge um platô. Para a construção de uma curva de crescimento bacteriano. mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de morte celular.Fase lag: fase de adaptação metabólica ao novo ambiente. podendo até mesmo decrescer. Fase estacionária: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido às condições limitantes do meio. acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço. o que mantém constante o número de células viáveis na população. relacionando-se a DO pelo tempo. A absorbância aumenta proporcionalmente ao aumento do número de células (biomassa) na população. Fase exponencial ou logarítmica: fase na qual o número de células da população dobra a cada geração. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase estacionária. As células continuam metabolizando e se dividindo. O número de células viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população. Cada medida obtida corresponde à densidade óptica (DO) da cultura em um dado momento do crescimento. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. Fase de declínio: fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. A fase lag será tão mais longa quanto maiores as diferenças de composição do ambiente anterior ou se a população for constituído de bactérias esporuladas. Alíquotas da cultura em crescimento são retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbância da cultura contra um comprimento de onda de 600 nm. 23 . O número de indivíduos não aumenta nesta fase. as condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais. Após um determinado período de crescimento exponencial. Para tal utiliza-se um espectrofotômetro onde o branco é o meio de cultura utilizado. o metabolismo celular está direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas condições ambientais encontradas pelas células. A duração da fase estacionária depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. ausente de inóculo. Desta forma pode-se construir um gráfico representativo do progresso do crescimento.

o experimento não é cansativo. células bacterianas agrupadas após a divisão celular não prejudicam os resultados. Desvantagens e limitações não é possível a estimativa do número de células/ml da população. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas. reduzida quantidade de material utilizado. a introdução de erros experimentais pelo operador é menor. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais. células inviáveis. reduzindo a introdução de erros experimentais por parte do operador. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura interferem na obtenção de resultados . 24 . Se a leitura de uma amostra for maior que 2. Para a plotagem dos dados no gráfico deve-se multiplicar a DO obtida por 10.0. Vantagens e desvantagens do método de medidas da densidade óptica Vantagens simplicidade da metodologia. acima disto as leituras perdem a confiabilidade. só se obtêm leituras acuradas da DO até o valor de 2. medidas prontamente obtidas: o resultado do experimento é conhecido ao seu final.0.0 deve-se fazer uma diluição 10-1 dessa amostra e registrar sua DO. Quadro 1.Só são confiáveis medidas de DO até 2. possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em gráfico). Acima disto as leituras perdem a confiabilidade.

Tubos de ensaio. os demais pontos serão medidos pelos monitores e repassados para os grupos. e suas unidades!!!) B) Identificar cada uma das fases de crescimento no gráfico. Pipetas.(Não se esqueça de identificar os eixos. Solução salina. 25 . E. Quais os problemas observados na construção dos gráficos (em que etapa do crescimento)? Você diria que todos os pontos são confiáveis? Justifique sua resposta.OBJETIVO Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de através de medidas de densidade óptica. Espectofotômetro. RESULTADOS A) Construir um gráfico a partir dos pontos obtidos. QUESTIONÁRIO 1. coli MATERIAL Cultura bacteriana pura. PROCEDIMENTO Durante a aulas serão obtidos apenas alguns pontos experimentais.

Como cada colônia supostamente originou-se da multiplicação um único indivíduo. A célula individual que originou uma colônia é denominada de "Unidade Formadora de Colônia" ou UFC.DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO ESTIMATIVA DO NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS A estimativa do número de células viáveis comumente é feita através de diluições seriadas de uma cultura bacteriana. Esse procedimento é repetido em diferentes intervalos de tempo e com os resultados pode-se construir um gráfico representando o progresso do crescimento Quadro 2. muitos indivíduos viáveis podem não se replicar. ou seja. aquelas capazes de formarem colônias. seguido da semeadura de uma alíquota de cada diluição em placas de Petri contendo meio bacteriológico sólido. o resultado da contagem das colônias multiplicado pela quantidade de diluições decimais é a estimativa do número de bactérias presentes em um ml da cultura original.PRÁTICA 5 . células bacterianas individuais ocuparão posições separadas na superfície do meio de maneira que cada uma dê origem a uma colônia bacteriana isolada. Vantagens e desvantagens do método da contagem de células viáveis Vantagens permite uma estimativa do número de células viáveis/ml da população Desvantagens e limitações detecta somente as células viáveis e que se repliquem. em solução salina. no espalhamento. As colônias crescendo no meio de cultura podem ser visualizadas e contadas pelo experimentador. Esta técnica baseia-se na hipótese de que. prejudicando o cálculo se as células da bactéria estudada mantém-se agrupadas após a divisão celular (cada colônia em meio sólido seria formada por mais de uma célula) se as diluições não forem homogeneizadas adequadamente se um número muito pequeno ou muito grande de colônias for usado na contagem se o operador não fizer o espalhamento rapidamente e de forma possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em um gráfico) pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais 26 .

1ml (diluição 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. o que prejudica a estimativa a grande quantidade de material utilizado a acuracidade dos resultados está diretamente relacionada à quantidade de material (principalmente placas de Petri) a limitação de material impõe um aumento do erro experimental o resultado do experimento é só conhecido após o crescimento das colônias isoladas nas placas de Petri A) BACTERIANA A determinanção da concentração de bactérias é feita geralmente pela técnica de determinação do Número de UFC (unidades formadoras de colônias). VOCE PRECISA RECUPERAR SUA BACTÉRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE. Mas digamos que você precisa ou deseja conhecer o nível de que a bactéria contaminante seja lac-. Você fez um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. QUE FAZER? 2. Você tem um estoque de uma super bactéria Escherichia coli (lac+). Neste caso você poderá: 0.células inviáveis. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura não interferem na obtenção de resultados adequada.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. coli número de (UFC/ml da cultura original)? (X)_________ 27 . PROBLEMA: 1.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e contaminação e _________lac_________lac_________lac_________lac- 3. a cada diluição um erro experimental é introduzido pela instrumentação e pelo experimentador este método detecta apenas um número muito reduzido de células. Qual é a concentração de E.

4. Você saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos? 28 .contaminante (UFC/ml da cultura original)? ( Y) _________ Qual é porcentagem da contaminação? _( Y) / (X)_____________________ B) DE LEVEDURAS Pela técnica de contagem em câmara de ¨Neubauer¨ VERIFICAÇÃO DE ENTENDIMENTO: Várias técnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prática. Qual é a concentração da bactéria lac.

Anos mais tarde Pasteur explicou sobre a fermentação bacteriana e a existência de agentes infectantes como responsáveis por processos patológicos. Os desinfetantes possuem atividade bactericida ou germicida e costumam ser aplicados em superfícies inanimadas. a divulgação dos métodos de esterilização de bandagens. A presença ou não de uma limpeza mecânica prévia. O aumento da concentração de um agente anti-séptico pode irritar e talvez. Os anti-sépticos são valiosos no tratamento de infecções locais causadas por microrganismos refratários a quimioterapia sistêmica. Bem como as células bacterianas.PRÁTICA 6 . tais como óleos voláteis. A descoberta do cloro na Idade Média foi amplamente utilizada como substância desodorante e anti-séptica. Os egípcios e outros povos utilizaram várias misturas. A prévia remoção ou não de detritos e impurezas da superfície ou tecidos através do uso de sabões ou detergentes. inicialmente desenvolvidos com o intuito da preservação do corpo à ressurreição. em relação aos processos de embalsamento. além do fato de os vinhos e vinagres continuarem a serem utilizados durante a Idade Média ao recobrimento de feridas e. A presença ou não de resistência bacteriana ao agente antimicrobiano. em 1865. compressas cirúrgicas. até matar o tecido normal do hospedeiro. vinagres. 29 . Uma substância anti–séptica não mata o microrganismo. A diferença entre um anti-séptico e um desinfetante pode ser uma questão de tempo de reação. Coube a Lister. resinas oleosas. mas inibe sua velocidade de crescimento. consequentemente. USOS TERAPÊUTICOS DE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES Vários fatores podem influenciar na eficácia e/ou eficiência dos procedimentos ou agentes microbianos. concentração da droga e temperatura. mura. instrumental cirúrgico e anti-sepsia das feridas. A concentração de anti-séptico em geral é baixa para evitar a lesão e irritação tecidual indesejáveis. evitando a infecção. bálsamo.AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES HISTÓRIA O uso de anti-sépticos e desinfetantes evolui desde o Antigo Egito. O tempo de contato entre o microorganismo e o antimicrobiano. seu número e sua suscetibilidade. vinhos. sendo utilizado em 1847-49 em um hospital vienense quanto à demonstração prática da ação benéfica da anti-sepsia. CONCEITOS GERAIS Um desinfetante é uma substância usada para destruir bactérias ou outros microrganismos infectantes. número de microrganismos. Tais como: O microorganismo. mel. interferindo assim com o crescimento normal do tecido de granulação na cicatrização de feridas. As substâncias anti-sépticas são aplicadas ao tecidos para suprimir ou impedir a infecção bacteriana. O agente microbiano e sua respectiva concentração.

HALOGÊNIOS Possuem efeitos antibacterianos potentes devido à alta afinidade pelo protoplasma. desidratantes. SURFACTANTES É um composto químico que diminui a tensão superficial de uma solução aquosa. não possuírem ação residual e não devem ser utilizados para limpezas de ferimentos abertos. baixa penetrabilidade. A presença de água é fundamental para a atividade dos álcoois (50-70%) e são mais eficazes na ausência de sujeiras e matéria orgânica. Vantagens: Não são em geral irritantes para a pele e tecidos. de terem ação rápida. Não-iônicos. podem ser usados em soluções com água e álcool. Com base na posição hidrofóbica da molécula. de apresentarem baixo custo e praticamente serem atóxicos. Gram positivas. fungos patogênicos. Apesar de possuírem efeitos limitados sobre os vírus. O mecanismo de ação está relacionado à concentração do íon hidroxila. mas em geral. São antibacterianos contra microrganismos Gram negativos e ácido-resistentes. a concentração eficiente e a eficácia antibacteriana. Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem ótimos solventes em relação a outros agentes germicidas. mucosas e trato respiratório. Um pH maior do que 9 inibirá a maioria das bactérias. há três tipos: Aniônicos : Os sabões são os mais importantes. METAIS PESADOS 30 . na presença de matéria orgânica o mais ativo é o Iodo. Desvantagens: São neutralizados por surfactantes aniônicos (sabões). Catiônicos : Os compostos de amônio quaternário são os principais. eles são eficientes contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. As desvantagens são: baixa atividade fungicida e virucida. São utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes. Bromo. São potentes bactericidas contra micobactérias. Já. muitos vírus e não em esporos. ÁLCOOIS Os álcoois alifáticos comuns são bons solventes. em ordem decrescente: 1º. 2º. anti-sépticos e desinfetantes. As atividades em soluções livres de matéria orgânica são. baixa toxicidade. fungicida ou esporocida. Gram negativas. Cloro. pela borracha e materiais porosos. Iodo. não agem na presença de matéria orgânica e podem causar irritação quando em contato prolongado com a pele. são inodoros.ÁLCALIS Os álcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigüidade. os detergentes catiônicos não possuem ação virucida. diminuindo assim. Os surfactantes são adsorvidos em um grau significativo pelo algodão. 3º.

anti-sépticos comerciais (anti-sépticos em geral disponíveis 1 para cada grupo. O uso para anti-sepsia de superfícies e objetos inanimados parece imprudente já que há agentes com um modo de ação mais eficiente. sabão. a sua efervescência vai remover o pus e restos celulares e confere atividade germicida limitada. 3 cotonetes embrulhados em papel alumínio autoclavados. A solução de Peróxido de Hidrogênio libera Oxigênio livre rapidamente ao entrar em contato com mucosas e superfícies sem pêlos que fornecem a enzima catalase. É valioso para limpar e desodorizar o tecido infectado. MATERIAL 4 Placas com Ágar-sangue : Meio base para ágar sangue ou TSB enriquecido com 5% sangue desfibrinado de carneiro. adstringentes. Microscópio óptico. ou + 3 zaragatoas estéreis. O Permanganato de Potássio libera Oxigênio em contato com a matéria orgânica. AGENTES OXIDANTES São compostos germicidas de ação breve sobre algumas bactérias aeróbicas Gram+ e Gram-. Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaeróbicos. A sua ação antibacteriana está relacionada à inibição reversível da atividade enzimática essencial da bactéria e à capacidade de se combinar com íons de compostos metálicos orgânicos e inorgânicos. Possuem pouca atividade esporicida e são inativados por restos orgânicos. Liberam Oxigênio que se combina com a matéria orgânica se tornando inativos. antibacterianos pela ação do íon de prata livre e produz desnaturação de proteínas. Alça de Platina . bico de Bunsen. mertiolate. OBJETIVOS Verificar a ação de anti-sépticos no crescimento bacteriano. As soluções possuem uma grande ação antibacteriana. 4 zaragatoas (“Swab”) estéreis. mas não destroem esporos bacterianos. Os preparados de Prata coloidal não são corrosivos nem irritantes e são usados sobre tecidos sensíveis. podendo haver repetições).Derivados do mercúrio Parecem ser primariamente bacteriostáticos e apenas levemente bactericidas. 31 . bateria de Gram. Compostos de Prata Produzem efeitos cáusticos. A prata metálica precipita as proteínas e produz efeito irritante. álcool iodado. lâminas. Quando é distribuído sobre ferida com exsudato.

Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de diâmetro. 7. 2. Incubar a placa por 24h. RESULTADOS Na quinta-feira: 1. (Não se esqueça de ilustrar o que você observou!) QUESTIONÁRIO 1. Espalhar o conteúdo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo ágar-sangue. 4. Umedecer um cotonete estéril em solução fisiológica e esfregar vigorosamente sobre as costas de uma das mãos. Faça uma lista com pelo menos seis anti-sépticos e seis desinfetantes. o nome comercial. 2. Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar nas costas da outra mão. Marcar na placa o anti-séptico utilizado e o número do grupo que realizou o experimento. em estufa a 37°C.PROCEDIMENTO 1. Observar os resultados e anotar. 6. numa área de mesmo diâmetro da primeira. Esperar 4 minutos para que haja ação do anti-séptico e passar na área desinfectada um terceiro cotonete umedecido com solução fisiológica. 5. Analisar a Morfologia MACROSCÓPICA das colônias e MICROSPICA das bactérias após coloração de Gram. 3. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a 32 . 2. Tomar cuidado para não atingir a região não desinfectada. e o uso . Descreva duas situações: uma em que você usaria um anti-séptico e uma em que usaria um desinfetante.Nesta lista deve conter o principal composto ativo. Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio Ágar sangue. PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA TEORIA Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos.

Para a garantia desta técnica. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível. cultura líquida fresca de Eschirichia coli. pinças. 33 .Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo. PROCEDIMENTO 1. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC. retirar o excesso de líquido comprimindo a ponta do “swab” nas paredes do tubo. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível. − Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias. com meio Mueller-Hinton sólido. placas de Petri. coli a alguns antibióticos. 2. no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. alguns fatores são essenciais: − Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton. devendo-se realizar a coloração de Gram.Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). régua. que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas. discos de papel com antibióticos. OBJETIVO Analisar pelo método de difusão a ressitência de E. Introduzir nas culturas um “swab” estéril. MATERIAIS “Swab” estéril. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0. e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes.atividade de novos agentes.5 na escala padrão de turbidez (Escala de MacFarland). formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. intermediário ou resistente. 1.

por 16 a 24 horas. QUESTIONÁRIO 1. coli testada? Por que? 5. O que é antibiograma e para que serve? Quais são os antibióticos beta-lactâmicos? Qual o seu modo de ação? Qual a diferença entre agente bactericida e bacteriostático? Dos antibióticos testados na experiência acima qual seria o mais indicado para o tratamento da infecção causada pela linhagem E. Espalhar bem. 3. registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela abaixo: Bactéria Oxacilina OX (1µg/mL) Carbemicilina CB (100µg/mL) Discos com antibióticos Kanamicina K (30µg/mL) Rifampicina RIF (30µg/mL) Sulfonamida SUL (300µg/mL) Estreptomicina EST (10µg/mL) Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padrões R< 10 S> 13 R< 13 S> 17 R< 12 S> 15 R< 16 S> 20 R< 12 S> 17 R< 11 S> 15 Relate os resultados obtidos e interprete comentando. de modo a obter um “tapete” de bactérias em toda a superfície do meio sólido. 5. Medir os halos formados (em mm).2. Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar pinças). Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos). 6. Incubar em estufa a 37ºC . Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa placa de Petri (meio Mueller-Hinton). 4. 4. 2. 3. Faça um esquema da parede de uma bactéria Gram-positiva e de uma bactéria Gram-negativa? 34 .

Um importante exemplo deste processo é o alho. Discos de papel de filtro. QUESTIONÁRIO Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . 3.PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS. RESULTADOS Descreva as observações feitas ao final da incubação. Culturas: Staphylococcus sp e E. 35 . OBJETIVO Estudar a presença de compostos antimicrobianos em vegetais. Incubar a 25°C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibição. Macerar o alho e a cebola. Espalhar sobre a superfície do meio com o próprio cotonete embebido na cultura. 4. 5. MATERIAL Placas de ágar Sabouraud. em graal. Graal e pistilo. INTRODUÇÃO Muitos vegetais contêm compostos que são inibidores de crescimento de microrganismos e exercem papel importante na resistência destes vegetais a patógenos. Pode ser algum já relatado na literatura ou algum de conhecimento popular. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e colocá-los sobre a superfície do meio semeado.PRÁTICA 8 . coli. Mergulhar o cotonete na suspensão do microrganismo. PROCEDIMENTO 1. A presença de substâncias antimicrobianas pode ser verificada através de extratos ou partes homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos. Cotonetes. 2. separadamente. Alho e cebola.

CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS INTRODUÇÃO A conjugação bacteriana. pode ser transferida para a célula aceptora e a outra fita permanece na célula doadora. O outro grupo. os genes tra. Ambas servem como molde para sintetizar a fita complementar. ela deve conter um plasmídio conjugativo (elemento extra-cromossômico). Há dois tipos de plasmídios conjugativos: os plasmídios auto-transmissíveis e os mobilizáveis. somente uma fita. na formação dos poros na membrana. os produtos dos genes mob preparam o DNA para serem transferidos.PRÁTICA 9 . Para que uma linhagem bacteriana seja doadora. Experimentos genéticos demonstraram que todas as três classes de funcões de 36 . o sítio de oriT deve ser compatível com as funcões mob presentes nas células doadoras. Por outro lado. cujos produtos promovem a transferência deste plasmídio para uma célula aceptora. Um exemplo de plasmídio mobilizável é o plasmído natural ColE1 ou colicinogênico que codifica as atividades dos genes mob e seu oriT. A transferência do DNA é iniciada pela ação de um gene mob que tem a atividade em romper (nicking) em uma única fita da molécula do DNA. Como a interação mob-oriT é específica. os plasmídios mobilizáveis codificam. em um sítio específico. Como resultado. chamado de oriT e catalisa o desenrolamento da dupla hélice. Esta célula doadora é diferenciada durante a conjugação pela presença de um apêndice na sua superfície chamado de pili F. descoberta por Lederberg e Tatum (1946) é o processo “sexual"de transferência de genes de uma bactéria doadora para outra receptora. Contudo. O processo de conjugação foi descoberto em E. Concluindo. para que o plasmídio possa ser transferido. somente um dos conjuntos das funções encontradas nos plasmídios auto-transmissíveis para concluir a transferência. refere-se aos genes mob. os quais especificam proteínas envolvidas na mobilização do DNA. ainda que os produtos dos genes tra promovem o contacto das células doadora-aceptora e promovem um contexto físico (formação dos poros) para esta transferência. o plasmídio mobilizável deve conter um ori T. especifica proteínas envolvidas não só na interação superficial (contacto) entre as células doadora e aceptora. Os genes tra podem ser divididos em dois grandes grupos: um grupo. coli K12 e o elemento extra-cromossômico responsável foi chamado de fator F (de fertilidade) ou plasmídio F. bem como. Os autotransmissíveis carregam um conjunto de genes.

para a Escherichia coli K12 . transfere. coli. Após a descoberta do fator F. o fator F media a transferência do cromossoma da célula Hfr para a célula F-. Hospeda um plasmídio que carrega o marcador que confere resistência a tetraciclina (Tcr ). a linhagem bacteriana é chamada de F+ e no segundo Hfr ( a integração do fator F parece ser mediada por pequenas sequências chamadas de elementos IS). Estes plasmídios possuem marcadores para a resistência às drogas antibacterianas e não integram-se. Neste estado. b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ . mas podem ser mobilizados por outros plasmídios conjugativos.conjugação. mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugação entre bactérias e bactérias e leveduras.. transferem em alta frequência para esta última uma réplica ou cópia do plasmídio F. Estes plasmídios ColE1 codificam proteínas chamadas de colicinas que matam algumas linhagens sensíveis de E. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. No primeiro caso. Os plasmídios conjugativos após serem transferidos e replicados podem permanecerem livres (autônomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano (chamados de estado integrado). OBJETIVO Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmídio que carrega o gene que confere resistência a tetraciclina. MATERIAL Tubos de ensaio . 37 . Nalr). O fator F também é raramente transferido. a linhagem Hfr cujo fator F está integrado ao cromossomo bacteriano. tornando-a F+. Raramente. Tetr ). Linhagens a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac. Raramente. Alguns plasmídios não promovem conjugação. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. outros plasmídios conjugativos foram sendo descobertos como é o caso dos fatores ou plasmídios R ou RTF (fator de transferência de resistência). sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. tra. Por outro lado. normalmente no cromossomo bacteriano. Placas com meio sólido. As células F+ após contato com as células F-. O fenótipo de resistência ao ácido Nalidíxico deve-se a uma mutação cromossomal.

1ml (diluição 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc 0.0 ml da linhagem S. Incubar em estufa à temperatura de 37°C por 16-24 horas (durante uma noite).1 Célula doadora: S. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitação à temperatura de 37°C. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1.1ml (sem diluição) em meio MacConkey-Nal 0. 2°Dia 1. coli K12 0.1ml (sem diluição) em meio YT-Nal-Tc 0.0ml de meio TSB. typhimurium MG031 0. typhimurium MG031 (doadora) e 1. Fazer os pré-inóculos das linhagens doadoras e receptoras em 4.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Nal 0. 3.0ml de TSB ou LB as seguintes culturas: 1.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Tc 3.0 ml da linhagem E.1ml (diluição 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc 4.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey -Tc 0.Antibióticos a) Ácido Nalidíxico (Nal) usar a concentração de 10µg/ml b) Tetraciclina (Tc) usar a concentração de 50 µg/ml PROCEDIMENTO 1° Dia 1. Incubar à temperatura de 37°C por uma noite.3 Mistura de conjugação (Transconjugantes): 0.1ml (diluição 10-4 ) em meio MacConkey -Nal 0. coli K12 (receptora) 2.2 Célula receptora: E.1ml (sem diluição) em meio MacConkey -Nal-Tc 0. 38 .1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Nal 3.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Tc 0. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio sólido: 3.

RESULTADOS 3°Dia Analisar os resultados e determinar a freqüência de conjugação. 39 . A freqüência é determinada dividindo o número de células transconjugantes pelo número total de células receptoras.

ao tempo de Koch. A bactéria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doença. O segundo postulado enfatiza a obtenção de culturas puras do patógeno. A mesma bactéria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivíduos intencionalmente infectados. 2. 3. tratamento com corticosteróides. Epidemiologia e da Genética Molecular. Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactérias causadoras de epidemias como a cólera e a tuberculose.PRÁTICA 10 . 1. Estes se constituíram nas primeiras abordagens que forneceram bases científicas para o estudo das doenças infecciosas. 1. uma série de limitações devido ao precário conhecimento. Estes postulados apresentam. Há algumas 40 . contudo. a bactéria ou seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doença. A mesma bactéria pode ou não satisfazer os postulados de Koch dependendo da sub-população usada como ponto de referência. ABORDAGEM CLÁSSICA Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relação casual entre um microrganismo em particular e uma doença. A cultura pura quando inoculada em voluntário humano susceptível ou animal experimental deve produzir os sintomas da doença. a susceptibilidade do hospedeiro é tão ou mais importante que as características de virulência da bactéria: Indivíduos cujo sistema imunológico esteja seriamente comprometido por quimioterapia anti-câncer. infecção por HIV ou diabetes e que podem ser infectados por bactérias incapazes de causar infecção em pessoas sadias. dos mecanismos que regem a infectividade bacteriana.POSTULADO DE KOCH Como provar que um microrganismo é responsável por uma doença? A resposta clássica é um conjunto de quatro postulados formulados por Robert Koch e posteriormente revisados com o desenvolvimento da Microbiologia. 2. Na realidade. A bactéria deve ser isolada de lesões de uma pessoa infectada e mantida em culturas puras. Os postulados de Koch implicam que a virulência é uma característica exclusiva das bactérias e independente do hospedeiro. 4.

diferentes linhagens de uma espécie bacteriana não somente variam consideravelmente em virulência como podem causar doenças distintas. se houver um disponível. O terceiro postulado requer que a bactéria seja reinoculada em um voluntário humano ou em um animal experimental e que a reinoculação cause os sintomas da doença. respectivamente. os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espécies de bactérias e há doenças cujas lesões são causados por uma mistura de diferentes linhagens (infecções polimicrobianas). Em muitos casos não é possível a utilização de voluntários humanos e a única alternativa é a utilização de um modelo animal. A combinação das tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR) com as de seqüenciamento de ácidos nucléicos possibilita a detecção e identificação de bactérias não-cultiváveis e revela o agente causativo de muitas doenças. Antibióticos que causam o desaparecimento de sintomas também causam a eliminação da bactéria do tecido infectado. 3.doenças cujo agente causativo não pode ser cultivado em meios de laboratório ou cujo meio adequando não é. o cultivo de uma bactéria em meio de laboratório pode causar a "perda" do fator de virulência: não expressão dos genes nas condições ambientais do meio. Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espécie bacteriana são igualmente virulentos e que somente uma única espécie causa uma determinada doença. uma resposta imunológica dos indivíduos infectados contra os antígenos de superfície das bactérias observadas nas lesões provocadas pela doença. os casos nos quais uma única espécie de bactéria é a única responsável por uma doença parece mais uma exceção do que uma regra. ainda. Há também. 4. disponível: Há consideráveis evidências para implicar as bactérias Treponema pallidum e Mycobacterium leprae como causadoras da sífilis e hanseníase. 41 . Alguns patógenos humanos não causam doenças em animais ou provocam sintomas diferentes daqueles observados em humanos.

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