Apostila de microbiologia (aulas práticas)

Universidade de São Paulo

Instituto de Ciências Biomédicas Departamento de Microbiologia
BMM121 – Microbiologia Básica

Apostila de Aulas Práticas Profa. Elisabete José Vicente bevicent@usp.br 3091.7350 2004

MICROBIOLOGIA NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de mangas compridas e estar abotoado; Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório; O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações; Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula prática; Descarte de material: a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada; c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes Terminados os trabalhos práticos: a) b) c) d) e) f) Esterilizar alças e fios de platina; Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; Desligar lâmpadas e microscópios; Limpar microscópios e cobri-los com a capa; Tirar o avental e guardar; Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

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Módulo I Introdução à microbiologia

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Módulo I ......................................................................................................................... 4 Introdução à microbiologia ............................................................................................. 4 Prática 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7 Técnica de semeadura ............................................................................................... 7 Objetivo .................................................................................................................... 10 Material ..................................................................................................................... 10 Procedimento e Resultados...................................................................................... 10 Questionário ............................................................................................................. 11 PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM........................................................................... 12 Fixação e coloração de microrganismos................................................................... 12 Preparação de esfregaços e coloração pelo método de gram.................................. 13 A técnica ................................................................................................................... 15 Objetivo .................................................................................................................... 16 Material ..................................................................................................................... 16 Procedimento:........................................................................................................... 16 Resultados:............................................................................................................... 18 Questionário ............................................................................................................. 18 PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA..... 19 Objetivo .................................................................................................................... 19 Materiais ................................................................................................................... 19 Procedimento e resultados ....................................................................................... 19 A. Visualização de bactérias:.................................................................................... 19 B. Visualização de fungos......................................................................................... 20 PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21 Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21 Curvas de crescimento ............................................................................................. 22 Objetivo .................................................................................................................... 25 Material ..................................................................................................................... 25 Procedimento............................................................................................................ 25 Resultados................................................................................................................ 25 Questionário ............................................................................................................. 25 PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO................................................................................................................... 26 Estimativa do número de células viáveis .................................................................. 26 Problema: ................................................................................................................. 27 5

.................................................................................................................................. 39 PRÁTICA 10 ..................................................................................................POSTULADO DE KOCH..................... 37 Procedimento............................................PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS....................................................................................................................................... 35 Introdução..................................................................................................... 33 Materiais ..... 32 Teoria .............................................................................................................................................................................................................................................................. 28 PRÁTICA 6 .................................... 31 Procedimento... 32 Objetivo ................................................. 36 Objetivo ................................................... 35 PRÁTICA 9 .......................................................................................................... 40 6 ............. 37 Material ................ 29 Anti-sépticos e desinfetantes .......................................................................................................................................................................................................................................... ....... 35 Procedimento.................................................................................................................... 36 Introdução............................................................................................................................................. 35 Questionário ......................................... 38 Resultados................................................................................................................................................................ 29 Objetivos................................................................................................... 34 PRÁTICA 8 .. 35 Objetivo ....................... 31 Material ........................................................................................ 33 Questionário ........................................Verificação de entendimento: ....................... 32 PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA ..................... 35 Resultados............................CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS........................................................................................................................................................................................... 40 Abordagem clássica ............................................... 32 Questionário ............................................................................... 35 Material ...............AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ........................................................................................................................................................................................................ 33 Procedimento................................................................................. 32 Resultados............................................................................................................................................................................................................

A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho (Figura 1). esfriar previamente a alça. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. deve-se flambar a 7 . e evitar acidentes laboratoriais. Para retirar o material.Posição correta para a flambagem da alça 2. Flambagem da alça ou fio de platina: Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. TÉCNICA DE SEMEADURA Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos presentes no ambiente. Figura 1.PRÁTICA 1 . 1.NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas. Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri. Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio. seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura.

5. Figura 2 – Removendo o tampão de algodão 3. Para uso. Após a retirada do material com a alça. após flambar a alça até o rubro. da mão que está segurando a alça ( Figura 2). Na semeadura usando placas de Petri. Esta seqüência evite que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo solução desinfetante. Uma vez utilizada. são oferecidas embrulhadas em papel (às vezes. semear na placa de Petri (fig.boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão). dentro de um cilindro metálico). As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar.3). Não pousar os tampões sobre a bancada!!! Flambar a alça após o uso. retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta). 4. 8 . Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo. torcer o papel na região central da pipeta. e introduzi-la na cultura de bactéria. As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas.

7. lembre-se: ela está muito QUENTE!!! Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma. Figura 4 – Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficiência no isolamento de colônias Não esqueça!!!!!! Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo. Após a primeira estria. sempre invertida. 9 . girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria. antes de colocar a alça em contato com a cultura. As placas serão incubadas a 37˚C por 24h. ou num pedaço do ágar sem cultura). flambar novamente a alça. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa técnica é conhecida também por esgotamento.Figura 3 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias 6. e depois guardadas a 4˚C até a próxima aula.

tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli. não esquecendo de ilustrar os resultados obtidos A) SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO B) SEMEADURA EM PLACAS CONTENDO MEIO SÓLIDO 10 .OBJETIVO Fazer semeaduras em meios líquido e sólido de cultura de Eschirichia coli. e obter colônias isoladas MATERIAL alça de platina. PROCEDIMENTO E RESULTADOS Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo. tubo de ensaio com meio completo líquido placa de Petri com meio completo sólido.

Qual a finalidade de se fazer várias estrias. Por que deve-se manter sempre que possível a placa de Petri com meio sólido invertida? 3.C) OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS QUESTIONÁRIO 1. na semeadura em placa. contendo meio sólido? 11 . Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferência? 2.

já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos. Um desse íons. o que dá a cor. 2) Coloração diferencial . por quatro razões principais: Permitem uma visualização melhor das células. Porém. eventualmente. identificar alguns grupos. permite a visualização de determinadas estruturas. através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama.nessa coloração o corante reage diferentemente com 12 .cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. Existem inúmeros métodos para coloração. em geral. Quanto aos tipos de coloração temos: 1) Coloração simples . Então. além de facilitar sua observação. A célula bacteriana é negativamente carregada. é chamado de radical cromóforo. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares. Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta. no estudo dos microrganismos. o microrganismo deve ser fixado à lâmina. portanto atrai corantes básicos. os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia. azul de metileno e safranina .PRÁTICA 2 . A introdução de colorações.COLORAÇÃO DE GRAM FIXAÇÃO E COLORAÇÃO DE MICRORGANISMOS A morfologia individual e as reações tintoriais constituem. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que. antes de ser corado. enquanto que os ácidos tem a cor do seu íon negativo. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e Podem. os corantes conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo.

5). A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. iodo. Essas substâncias são chamadas mordentes. em 1884. e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano.são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias.ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas.diferentes tipos de bactérias. fixado pelo calor. frente ao Gram. com os reagentes cristal violeta. etanolacetona e fucsina básica. A coloração de Gram e a álcool . enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-) (Fig. Essa maneira de reagir diferentemente. PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇOS E COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. mas sim com sua estrutura física. 13 . o que confere a característica de positividade ao Gram. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). 3) Coloração especial . e é o caso do iodo na coloração de Gram.

Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Gram positiva Membrana plasmática Complexo de membrana externa. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Figura 5 – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. que é maior que a molécula de CV que penetrou. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. quando corretamente realizada e interpretada. e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. 14 . que não consegue reter o complexo. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta.

que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. com os mesmos resultados. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador. 15 . resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. O corante cristal violeta pode ser substituído. a fucsina básica. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. Portanto. podendo produzir resultados falsos. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. Ao microscópio. densidade.A TÉCNICA O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. A retenção ou não do corante primário é. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. células velhas. o etanol-acetona (1:1 v:v). o cristal violeta. em seus citoplasmas. decorando as células. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). Por outro lado. o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Grampositivas e provoca a contração dos poros do peptidioglicano. portanto. seguido de tratamento com um fixador. A etapa da descoloração é crítica. porosidade e integridade. Em seguida. o uso de material fresco é importante. Células de bactérias Gram-positivas. Por outro lado. insolúvel. o lugol. devem ser capazes de distinguir formas e arranjos. tornando-as impermeáveis ao complexo. a amostra é tratada com um corante secundário. com um corante primário. Paralelamente.

4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixá-lo. cristal violeta a 1%. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1) Flambar a alça corretamente 2) Esfriá-la nas paredes do tubo 3) Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. uma gota de água de torneira no centro da lâmina de vidro. 6) Secar à tempetatura ambiente. lugol. lâmina de vidro. MATERIAL alça de platina. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1) Colocar com a própria alça. procurando obter um esfregaço fino. fucsina básica. OBS. PROCEDIMENTO: A. sólido e líquido. solução diferenciadora. 7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. pelo método de Gram. 8) Realizar a coloração. já flambada. placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido. 2) Flambar novamente a alça 16 .OBJETIVO Coloração de microrganismos provenientes de meios. 5) Espalhar o material sobre a lâmina.

Evitar estas culturas! 17 . 5) Homogeneizar este material com a gota de água. Porém. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. Os esfregaços não devem ser muito espessos. tomando o cuidado de não remover o esfregaço. 6) Lavar rapidamente em água corrente. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. 4) Lavar rapidamente em água corrente. A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. 6) Secar a lâmina por exposição ao ar. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona.3) Esfriá-la na tampa da placa de Petri. Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2) Lavar rapidamente em água corrente. 7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos. rapidamente. 9) Secar a lâmina. 4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. 8) Lavar novamente em água corrente. B. 5) Lavar uma ou duas vezes. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. com bactérias G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se fracamente. Ela deve ser efetuada rapidamente. COLORAÇÃO 1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. 3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. 7) Fixar o esfregaço. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. 10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão. ou no meio sólido numa região sem colônia.

Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram. podendo inclusive levar a erros? 18 . Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? 2.RESULTADOS: ___________________ ____________________ __________________ ___________________ QUESTIONÁRIO 1.

: Pseudomonas aeruginosa 19 . PROCEDIMENTO E RESULTADOS Faça um esboço das características morfológicas e suas propriedades tintoriais de cada uma das bactérias apresentadas. Microscópio ótico.PRÁTICA 3 . Streptococcus pyogenes e dois tipos de fungos). A. MATERIAIS Lâminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus. Pseudomonas aeruginosa.MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA OBJETIVO Visualização das colônias crescidas em placas contendo meio sólido e análise por microscopia óptica e Morfologia de bactérias e de fungos . Bacillus subtilis. Visualização de bactérias: b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus c) Bacilos Gram + : Bacillus subtilis d) Bacilos Gram . Repita o procedimento para os fungos apresentados.

Visualização de fungos Filamentosos Leveduras 20 .e) Cocos Gram + : Streptococcus pyogenes B.

cada novo indivíduo pode catalisar a biossíntese de material celular adicional. o crescimento pode ser entendido como: aumento de tamanho de uma célula individual. Devido aos tempos de geração muito curtos. biomassa é sintetizada em uma taxa progressiva na população em crescimento.PRÁTICA 4 . O tempo de geração refere-se ao tempo requerido para uma célula bacteriana duplicar seu DNA e dividir-se. a cada 20 minutos uma nova geração de indivíduos é produzida. Sob condições ótimas de crescimento. A evolução ocorre através de mutações genéticas que produzem variações na descendência de um organismo e o ambiente determina que mutações são vantajosas no sentido de aumentar suas chances de sobrevivência e de sucesso reprodutivo (adaptação). cada célula bacteriana é uma unidade catalítica. A maior vantagem de um tempo de reprodução tão rápido é que as bactérias podem evoluir muito rapidamente e esta e a razão do seu sucesso no mundo vivo. aumento do número de células de uma população. Nos organismos unicelulares. aumento da massa de uma célula individual. Uma característica importante do crescimento bacteriano é o fato de que a maioria das espécies de bactérias é capaz de crescer em taxas bastante rápidas. ou seja.. o número de unidades catalíticas (células) aumenta com o tempo e.g. aumento da massa total de uma população. a cada 20 minutos) a população dobra de tamanho. O aumento em tamanho de uma célula bacteriana conduz à divisão celular e conseqüente aumento do número de indivíduos na população. muitas espécies bacterianas apresentam um tempo de geração médio de 20 minutos. as bactérias podem testar 21 .CURVA DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO BACTERIANO O crescimento de qualquer organismo pode ser definido como o aumento do número de suas células ou o aumento de sua massa. Do ponto de vista bioquímico. no qual o número de indivíduos dobra a cada geração. Este tipo de crescimento populacional é denominado de crescimento exponencial ou logarítmico. Assim. Quando uma bactéria se divide. pode-se presumir que a maioria delas esteja se dividindo ao mesmo tempo e a cada nova geração (e. Em uma população composta por milhares de bactérias em crescimento ativo. como conseqüência. seja em ambientes naturais (in vivo) ou em culturas de laboratório (in vitro).

osmolaridade. osmolaridade. quando se inocula uma população bacteriana em um frasco contendo uma quantidade inalterável de meio de cultura (sistema fechado). pH. Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condições nas quais seu crescimento atinge uma taxa ótima. presença ou ausência de oxigênio e temperatura de incubação. Para se estudar o crescimento de uma bactéria é preciso cultivá-la. em meios de cultura e condições ambientais que variam em condições químicas e físicas. Essas quatro fases estão representadas na Figura 6. como cultura pura. O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado através do aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (através de curvas de crescimento) ou da estimativa do número de células viáveis presentes na população (método de determinação do número de unidades formadoras de colônia). Figura 6 – Curva de crescimento bacteriano padrão em sistema fechado 22 . o crescimento bem sucedido de uma população bacteriana reflete seu grau de adaptação a um determinado ambiente e depende primariamente de sua composição: condições nutricionais. ambos os métodos apresentam vantagens e desvantagens. A escolha do método depende da situação particular que se apresente. Portanto. tais como fontes de nutrientes. As distintas espécies bacterianas diferem no âmbito de fatores dentro dos quais podem crescer. Estas são representações gráficas do aumento do número de indivíduos em um determinado período de tempo. Em condições experimentais. oxigênio e luz. pH. dependendo do ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador.bilhões de mutações em pequenos intervalos de tempo. temperatura. Não há método perfeito. CURVAS DE CRESCIMENTO Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano é a obtenção de curvas de crescimento. o crescimento dessa população passa por quatro fases características.

mede-se o aumento da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio líquido através de medidas da densidade óptica da cultura. Após um determinado período de crescimento exponencial.Fase lag: fase de adaptação metabólica ao novo ambiente. o que mantém constante o número de células viáveis na população. ausente de inóculo. Desta forma pode-se construir um gráfico representativo do progresso do crescimento. A fase lag será tão mais longa quanto maiores as diferenças de composição do ambiente anterior ou se a população for constituído de bactérias esporuladas. Para tal utiliza-se um espectrofotômetro onde o branco é o meio de cultura utilizado. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase estacionária. Para a construção de uma curva de crescimento bacteriano. Alíquotas da cultura em crescimento são retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbância da cultura contra um comprimento de onda de 600 nm. As células continuam metabolizando e se dividindo. as condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais. A duração dessa fase depende das condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente. Fase de declínio: fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. o metabolismo celular está direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas condições ambientais encontradas pelas células. 23 . podendo até mesmo decrescer. acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço. mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de morte celular. Cada medida obtida corresponde à densidade óptica (DO) da cultura em um dado momento do crescimento. A duração da fase estacionária depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. A curva de crescimento atinge um platô. O número de células viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população. relacionando-se a DO pelo tempo. O número de indivíduos não aumenta nesta fase. Fase exponencial ou logarítmica: fase na qual o número de células da população dobra a cada geração. A absorbância aumenta proporcionalmente ao aumento do número de células (biomassa) na população. Fase estacionária: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido às condições limitantes do meio.

Para a plotagem dos dados no gráfico deve-se multiplicar a DO obtida por 10. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura interferem na obtenção de resultados . o experimento não é cansativo. reduzida quantidade de material utilizado.0. células bacterianas agrupadas após a divisão celular não prejudicam os resultados. acima disto as leituras perdem a confiabilidade.Só são confiáveis medidas de DO até 2. só se obtêm leituras acuradas da DO até o valor de 2. Desvantagens e limitações não é possível a estimativa do número de células/ml da população. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais.0 deve-se fazer uma diluição 10-1 dessa amostra e registrar sua DO. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas. Se a leitura de uma amostra for maior que 2. células inviáveis. medidas prontamente obtidas: o resultado do experimento é conhecido ao seu final.0. Acima disto as leituras perdem a confiabilidade. a introdução de erros experimentais pelo operador é menor. Quadro 1. 24 . possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em gráfico). reduzindo a introdução de erros experimentais por parte do operador. Vantagens e desvantagens do método de medidas da densidade óptica Vantagens simplicidade da metodologia.

os demais pontos serão medidos pelos monitores e repassados para os grupos.OBJETIVO Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de através de medidas de densidade óptica. e suas unidades!!!) B) Identificar cada uma das fases de crescimento no gráfico. PROCEDIMENTO Durante a aulas serão obtidos apenas alguns pontos experimentais. 25 . E. Espectofotômetro. Tubos de ensaio. Quais os problemas observados na construção dos gráficos (em que etapa do crescimento)? Você diria que todos os pontos são confiáveis? Justifique sua resposta.(Não se esqueça de identificar os eixos. Solução salina. Pipetas. RESULTADOS A) Construir um gráfico a partir dos pontos obtidos. coli MATERIAL Cultura bacteriana pura. QUESTIONÁRIO 1.

no espalhamento. o resultado da contagem das colônias multiplicado pela quantidade de diluições decimais é a estimativa do número de bactérias presentes em um ml da cultura original. aquelas capazes de formarem colônias. Esse procedimento é repetido em diferentes intervalos de tempo e com os resultados pode-se construir um gráfico representando o progresso do crescimento Quadro 2. células bacterianas individuais ocuparão posições separadas na superfície do meio de maneira que cada uma dê origem a uma colônia bacteriana isolada. Esta técnica baseia-se na hipótese de que. As colônias crescendo no meio de cultura podem ser visualizadas e contadas pelo experimentador.DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO ESTIMATIVA DO NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS A estimativa do número de células viáveis comumente é feita através de diluições seriadas de uma cultura bacteriana. A célula individual que originou uma colônia é denominada de "Unidade Formadora de Colônia" ou UFC.PRÁTICA 5 . em solução salina. ou seja. muitos indivíduos viáveis podem não se replicar. seguido da semeadura de uma alíquota de cada diluição em placas de Petri contendo meio bacteriológico sólido. prejudicando o cálculo se as células da bactéria estudada mantém-se agrupadas após a divisão celular (cada colônia em meio sólido seria formada por mais de uma célula) se as diluições não forem homogeneizadas adequadamente se um número muito pequeno ou muito grande de colônias for usado na contagem se o operador não fizer o espalhamento rapidamente e de forma possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em um gráfico) pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais 26 . Como cada colônia supostamente originou-se da multiplicação um único indivíduo. Vantagens e desvantagens do método da contagem de células viáveis Vantagens permite uma estimativa do número de células viáveis/ml da população Desvantagens e limitações detecta somente as células viáveis e que se repliquem.

Você tem um estoque de uma super bactéria Escherichia coli (lac+).1ml (diluição 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. Qual é a concentração de E. o que prejudica a estimativa a grande quantidade de material utilizado a acuracidade dos resultados está diretamente relacionada à quantidade de material (principalmente placas de Petri) a limitação de material impõe um aumento do erro experimental o resultado do experimento é só conhecido após o crescimento das colônias isoladas nas placas de Petri A) BACTERIANA A determinanção da concentração de bactérias é feita geralmente pela técnica de determinação do Número de UFC (unidades formadoras de colônias). Você fez um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada. VOCE PRECISA RECUPERAR SUA BACTÉRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura não interferem na obtenção de resultados adequada. Neste caso você poderá: 0. QUE FAZER? 2.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e 0.células inviáveis.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e 0.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e contaminação e _________lac_________lac_________lac_________lac- 3. a cada diluição um erro experimental é introduzido pela instrumentação e pelo experimentador este método detecta apenas um número muito reduzido de células. PROBLEMA: 1. coli número de (UFC/ml da cultura original)? (X)_________ 27 . Mas digamos que você precisa ou deseja conhecer o nível de que a bactéria contaminante seja lac-.

Qual é a concentração da bactéria lac.4.contaminante (UFC/ml da cultura original)? ( Y) _________ Qual é porcentagem da contaminação? _( Y) / (X)_____________________ B) DE LEVEDURAS Pela técnica de contagem em câmara de ¨Neubauer¨ VERIFICAÇÃO DE ENTENDIMENTO: Várias técnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prática. Você saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos? 28 .

instrumental cirúrgico e anti-sepsia das feridas. Bem como as células bacterianas. A prévia remoção ou não de detritos e impurezas da superfície ou tecidos através do uso de sabões ou detergentes. mel. 29 . Coube a Lister. O agente microbiano e sua respectiva concentração. vinhos. número de microrganismos. evitando a infecção. sendo utilizado em 1847-49 em um hospital vienense quanto à demonstração prática da ação benéfica da anti-sepsia. USOS TERAPÊUTICOS DE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES Vários fatores podem influenciar na eficácia e/ou eficiência dos procedimentos ou agentes microbianos. a divulgação dos métodos de esterilização de bandagens. CONCEITOS GERAIS Um desinfetante é uma substância usada para destruir bactérias ou outros microrganismos infectantes. A presença ou não de resistência bacteriana ao agente antimicrobiano. As substâncias anti-sépticas são aplicadas ao tecidos para suprimir ou impedir a infecção bacteriana. Os anti-sépticos são valiosos no tratamento de infecções locais causadas por microrganismos refratários a quimioterapia sistêmica. O tempo de contato entre o microorganismo e o antimicrobiano. Uma substância anti–séptica não mata o microrganismo. tais como óleos voláteis. até matar o tecido normal do hospedeiro. inicialmente desenvolvidos com o intuito da preservação do corpo à ressurreição. vinagres. Os desinfetantes possuem atividade bactericida ou germicida e costumam ser aplicados em superfícies inanimadas. interferindo assim com o crescimento normal do tecido de granulação na cicatrização de feridas. consequentemente. Tais como: O microorganismo. A diferença entre um anti-séptico e um desinfetante pode ser uma questão de tempo de reação.AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES HISTÓRIA O uso de anti-sépticos e desinfetantes evolui desde o Antigo Egito. A presença ou não de uma limpeza mecânica prévia. Anos mais tarde Pasteur explicou sobre a fermentação bacteriana e a existência de agentes infectantes como responsáveis por processos patológicos. resinas oleosas. mas inibe sua velocidade de crescimento. seu número e sua suscetibilidade. mura. em 1865. bálsamo. em relação aos processos de embalsamento. Os egípcios e outros povos utilizaram várias misturas. além do fato de os vinhos e vinagres continuarem a serem utilizados durante a Idade Média ao recobrimento de feridas e. A concentração de anti-séptico em geral é baixa para evitar a lesão e irritação tecidual indesejáveis.PRÁTICA 6 . A descoberta do cloro na Idade Média foi amplamente utilizada como substância desodorante e anti-séptica. O aumento da concentração de um agente anti-séptico pode irritar e talvez. compressas cirúrgicas. concentração da droga e temperatura.

Não-iônicos. podem ser usados em soluções com água e álcool. muitos vírus e não em esporos. na presença de matéria orgânica o mais ativo é o Iodo. Os surfactantes são adsorvidos em um grau significativo pelo algodão. Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem ótimos solventes em relação a outros agentes germicidas.ÁLCALIS Os álcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigüidade. Com base na posição hidrofóbica da molécula. METAIS PESADOS 30 . Bromo. desidratantes. os detergentes catiônicos não possuem ação virucida. ÁLCOOIS Os álcoois alifáticos comuns são bons solventes. pela borracha e materiais porosos. mas em geral. de apresentarem baixo custo e praticamente serem atóxicos. 3º. Catiônicos : Os compostos de amônio quaternário são os principais. A presença de água é fundamental para a atividade dos álcoois (50-70%) e são mais eficazes na ausência de sujeiras e matéria orgânica. baixa toxicidade. São antibacterianos contra microrganismos Gram negativos e ácido-resistentes. a concentração eficiente e a eficácia antibacteriana. Iodo. baixa penetrabilidade. de terem ação rápida. Já. anti-sépticos e desinfetantes. fungos patogênicos. mucosas e trato respiratório. O mecanismo de ação está relacionado à concentração do íon hidroxila. em ordem decrescente: 1º. fungicida ou esporocida. Gram positivas. Um pH maior do que 9 inibirá a maioria das bactérias. SURFACTANTES É um composto químico que diminui a tensão superficial de uma solução aquosa. eles são eficientes contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. As atividades em soluções livres de matéria orgânica são. não possuírem ação residual e não devem ser utilizados para limpezas de ferimentos abertos. 2º. diminuindo assim. São utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes. Apesar de possuírem efeitos limitados sobre os vírus. são inodoros. Desvantagens: São neutralizados por surfactantes aniônicos (sabões). não agem na presença de matéria orgânica e podem causar irritação quando em contato prolongado com a pele. Gram negativas. HALOGÊNIOS Possuem efeitos antibacterianos potentes devido à alta afinidade pelo protoplasma. As desvantagens são: baixa atividade fungicida e virucida. Vantagens: Não são em geral irritantes para a pele e tecidos. há três tipos: Aniônicos : Os sabões são os mais importantes. São potentes bactericidas contra micobactérias. Cloro.

mertiolate. MATERIAL 4 Placas com Ágar-sangue : Meio base para ágar sangue ou TSB enriquecido com 5% sangue desfibrinado de carneiro. bico de Bunsen. ou + 3 zaragatoas estéreis. lâminas. mas não destroem esporos bacterianos. A prata metálica precipita as proteínas e produz efeito irritante. Liberam Oxigênio que se combina com a matéria orgânica se tornando inativos. álcool iodado. Os preparados de Prata coloidal não são corrosivos nem irritantes e são usados sobre tecidos sensíveis. É valioso para limpar e desodorizar o tecido infectado. antibacterianos pela ação do íon de prata livre e produz desnaturação de proteínas. Quando é distribuído sobre ferida com exsudato. A sua ação antibacteriana está relacionada à inibição reversível da atividade enzimática essencial da bactéria e à capacidade de se combinar com íons de compostos metálicos orgânicos e inorgânicos. a sua efervescência vai remover o pus e restos celulares e confere atividade germicida limitada. Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaeróbicos. 4 zaragatoas (“Swab”) estéreis. anti-sépticos comerciais (anti-sépticos em geral disponíveis 1 para cada grupo. O Permanganato de Potássio libera Oxigênio em contato com a matéria orgânica. 3 cotonetes embrulhados em papel alumínio autoclavados. adstringentes. sabão. A solução de Peróxido de Hidrogênio libera Oxigênio livre rapidamente ao entrar em contato com mucosas e superfícies sem pêlos que fornecem a enzima catalase. Microscópio óptico. As soluções possuem uma grande ação antibacteriana. Alça de Platina . O uso para anti-sepsia de superfícies e objetos inanimados parece imprudente já que há agentes com um modo de ação mais eficiente. Compostos de Prata Produzem efeitos cáusticos. 31 .Derivados do mercúrio Parecem ser primariamente bacteriostáticos e apenas levemente bactericidas. Possuem pouca atividade esporicida e são inativados por restos orgânicos. bateria de Gram. podendo haver repetições). OBJETIVOS Verificar a ação de anti-sépticos no crescimento bacteriano. AGENTES OXIDANTES São compostos germicidas de ação breve sobre algumas bactérias aeróbicas Gram+ e Gram-.

numa área de mesmo diâmetro da primeira. em estufa a 37°C. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a 32 . Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio Ágar sangue. Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar nas costas da outra mão. e o uso . o nome comercial. 3. PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA TEORIA Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos. Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de diâmetro. Umedecer um cotonete estéril em solução fisiológica e esfregar vigorosamente sobre as costas de uma das mãos.Nesta lista deve conter o principal composto ativo. 6. 2. RESULTADOS Na quinta-feira: 1. Faça uma lista com pelo menos seis anti-sépticos e seis desinfetantes. Espalhar o conteúdo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo ágar-sangue. Incubar a placa por 24h. Tomar cuidado para não atingir a região não desinfectada. 5. (Não se esqueça de ilustrar o que você observou!) QUESTIONÁRIO 1. 2. Descreva duas situações: uma em que você usaria um anti-séptico e uma em que usaria um desinfetante.PROCEDIMENTO 1. 2. Analisar a Morfologia MACROSCÓPICA das colônias e MICROSPICA das bactérias após coloração de Gram. 7. 4. Esperar 4 minutos para que haja ação do anti-séptico e passar na área desinfectada um terceiro cotonete umedecido com solução fisiológica. Observar os resultados e anotar. Marcar na placa o anti-séptico utilizado e o número do grupo que realizou o experimento.

intermediário ou resistente. alguns fatores são essenciais: − Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton. devendo-se realizar a coloração de Gram. MATERIAIS “Swab” estéril. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0. placas de Petri.atividade de novos agentes. e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes. 33 .5 na escala padrão de turbidez (Escala de MacFarland). Para a garantia desta técnica. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível. Introduzir nas culturas um “swab” estéril. discos de papel com antibióticos. formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. OBJETIVO Analisar pelo método de difusão a ressitência de E. que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas. no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. PROCEDIMENTO 1. − Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível. coli a alguns antibióticos. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC. retirar o excesso de líquido comprimindo a ponta do “swab” nas paredes do tubo.Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. pinças. 2. com meio Mueller-Hinton sólido.Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo. cultura líquida fresca de Eschirichia coli. régua. ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). 1.

4. de modo a obter um “tapete” de bactérias em toda a superfície do meio sólido.2. Espalhar bem. 3. Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar pinças). Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa placa de Petri (meio Mueller-Hinton). Incubar em estufa a 37ºC . 2. 4. QUESTIONÁRIO 1. Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos). O que é antibiograma e para que serve? Quais são os antibióticos beta-lactâmicos? Qual o seu modo de ação? Qual a diferença entre agente bactericida e bacteriostático? Dos antibióticos testados na experiência acima qual seria o mais indicado para o tratamento da infecção causada pela linhagem E. registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela abaixo: Bactéria Oxacilina OX (1µg/mL) Carbemicilina CB (100µg/mL) Discos com antibióticos Kanamicina K (30µg/mL) Rifampicina RIF (30µg/mL) Sulfonamida SUL (300µg/mL) Estreptomicina EST (10µg/mL) Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padrões R< 10 S> 13 R< 13 S> 17 R< 12 S> 15 R< 16 S> 20 R< 12 S> 17 R< 11 S> 15 Relate os resultados obtidos e interprete comentando. coli testada? Por que? 5. 3. 6. Faça um esquema da parede de uma bactéria Gram-positiva e de uma bactéria Gram-negativa? 34 . Medir os halos formados (em mm). 5. por 16 a 24 horas.

MATERIAL Placas de ágar Sabouraud. Mergulhar o cotonete na suspensão do microrganismo. separadamente.PRÁTICA 8 .PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS. em graal. A presença de substâncias antimicrobianas pode ser verificada através de extratos ou partes homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos. Graal e pistilo. 4. 2. 35 . Pode ser algum já relatado na literatura ou algum de conhecimento popular. Cotonetes. OBJETIVO Estudar a presença de compostos antimicrobianos em vegetais. Macerar o alho e a cebola. coli. INTRODUÇÃO Muitos vegetais contêm compostos que são inibidores de crescimento de microrganismos e exercem papel importante na resistência destes vegetais a patógenos. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e colocá-los sobre a superfície do meio semeado. Espalhar sobre a superfície do meio com o próprio cotonete embebido na cultura. 3. Um importante exemplo deste processo é o alho. Incubar a 25°C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibição. RESULTADOS Descreva as observações feitas ao final da incubação. Discos de papel de filtro. Alho e cebola. 5. Culturas: Staphylococcus sp e E. QUESTIONÁRIO Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . PROCEDIMENTO 1.

Esta célula doadora é diferenciada durante a conjugação pela presença de um apêndice na sua superfície chamado de pili F. refere-se aos genes mob. A transferência do DNA é iniciada pela ação de um gene mob que tem a atividade em romper (nicking) em uma única fita da molécula do DNA. os quais especificam proteínas envolvidas na mobilização do DNA. os produtos dos genes mob preparam o DNA para serem transferidos. Os autotransmissíveis carregam um conjunto de genes. O processo de conjugação foi descoberto em E.PRÁTICA 9 . pode ser transferida para a célula aceptora e a outra fita permanece na célula doadora. o sítio de oriT deve ser compatível com as funcões mob presentes nas células doadoras. Os genes tra podem ser divididos em dois grandes grupos: um grupo. ainda que os produtos dos genes tra promovem o contacto das células doadora-aceptora e promovem um contexto físico (formação dos poros) para esta transferência. para que o plasmídio possa ser transferido. somente uma fita. somente um dos conjuntos das funções encontradas nos plasmídios auto-transmissíveis para concluir a transferência. coli K12 e o elemento extra-cromossômico responsável foi chamado de fator F (de fertilidade) ou plasmídio F. Um exemplo de plasmídio mobilizável é o plasmído natural ColE1 ou colicinogênico que codifica as atividades dos genes mob e seu oriT. Como a interação mob-oriT é específica. ela deve conter um plasmídio conjugativo (elemento extra-cromossômico). Para que uma linhagem bacteriana seja doadora. chamado de oriT e catalisa o desenrolamento da dupla hélice. Por outro lado. Ambas servem como molde para sintetizar a fita complementar. o plasmídio mobilizável deve conter um ori T. os genes tra. descoberta por Lederberg e Tatum (1946) é o processo “sexual"de transferência de genes de uma bactéria doadora para outra receptora. especifica proteínas envolvidas não só na interação superficial (contacto) entre as células doadora e aceptora. Experimentos genéticos demonstraram que todas as três classes de funcões de 36 . em um sítio específico. bem como. Contudo.CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS INTRODUÇÃO A conjugação bacteriana. O outro grupo. cujos produtos promovem a transferência deste plasmídio para uma célula aceptora. os plasmídios mobilizáveis codificam. Concluindo. Como resultado. Há dois tipos de plasmídios conjugativos: os plasmídios auto-transmissíveis e os mobilizáveis. na formação dos poros na membrana.

Raramente. Nalr). OBJETIVO Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmídio que carrega o gene que confere resistência a tetraciclina. normalmente no cromossomo bacteriano. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. Os plasmídios conjugativos após serem transferidos e replicados podem permanecerem livres (autônomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano (chamados de estado integrado). O fator F também é raramente transferido. 37 . a linhagem bacteriana é chamada de F+ e no segundo Hfr ( a integração do fator F parece ser mediada por pequenas sequências chamadas de elementos IS). Tetr ). a linhagem Hfr cujo fator F está integrado ao cromossomo bacteriano. Por outro lado. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. Hospeda um plasmídio que carrega o marcador que confere resistência a tetraciclina (Tcr ). Após a descoberta do fator F. tra. Estes plasmídios possuem marcadores para a resistência às drogas antibacterianas e não integram-se. para a Escherichia coli K12 . transfere. Estes plasmídios ColE1 codificam proteínas chamadas de colicinas que matam algumas linhagens sensíveis de E. o fator F media a transferência do cromossoma da célula Hfr para a célula F-. b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ . As células F+ após contato com as células F-. Neste estado. transferem em alta frequência para esta última uma réplica ou cópia do plasmídio F. Raramente. Placas com meio sólido. mas podem ser mobilizados por outros plasmídios conjugativos. coli. sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugação entre bactérias e bactérias e leveduras. Linhagens a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac. Alguns plasmídios não promovem conjugação.. tornando-a F+. No primeiro caso. O fenótipo de resistência ao ácido Nalidíxico deve-se a uma mutação cromossomal.conjugação. MATERIAL Tubos de ensaio . outros plasmídios conjugativos foram sendo descobertos como é o caso dos fatores ou plasmídios R ou RTF (fator de transferência de resistência).

2°Dia 1.0 ml da linhagem E. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitação à temperatura de 37°C. 3.2 Célula receptora: E.1ml (sem diluição) em meio MacConkey -Nal-Tc 0.1ml (sem diluição) em meio YT-Nal-Tc 0.1ml (diluição 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc 0. typhimurium MG031 0. typhimurium MG031 (doadora) e 1. coli K12 (receptora) 2.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Tc 3.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Tc 0. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey -Tc 0.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Nal 0.0 ml da linhagem S.1 Célula doadora: S. coli K12 0. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio sólido: 3.3 Mistura de conjugação (Transconjugantes): 0. Fazer os pré-inóculos das linhagens doadoras e receptoras em 4.Antibióticos a) Ácido Nalidíxico (Nal) usar a concentração de 10µg/ml b) Tetraciclina (Tc) usar a concentração de 50 µg/ml PROCEDIMENTO 1° Dia 1.1ml (diluição 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc 4.0ml de TSB ou LB as seguintes culturas: 1.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Nal 3.1ml (diluição 10-4 ) em meio MacConkey -Nal 0. 38 . Incubar à temperatura de 37°C por uma noite.0ml de meio TSB.1ml (sem diluição) em meio MacConkey-Nal 0. Incubar em estufa à temperatura de 37°C por 16-24 horas (durante uma noite).

A freqüência é determinada dividindo o número de células transconjugantes pelo número total de células receptoras. 39 .RESULTADOS 3°Dia Analisar os resultados e determinar a freqüência de conjugação.

Estes se constituíram nas primeiras abordagens que forneceram bases científicas para o estudo das doenças infecciosas. A cultura pura quando inoculada em voluntário humano susceptível ou animal experimental deve produzir os sintomas da doença. 2. A bactéria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doença. 1. Os postulados de Koch implicam que a virulência é uma característica exclusiva das bactérias e independente do hospedeiro. Estes postulados apresentam. dos mecanismos que regem a infectividade bacteriana. A bactéria deve ser isolada de lesões de uma pessoa infectada e mantida em culturas puras. A mesma bactéria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivíduos intencionalmente infectados. infecção por HIV ou diabetes e que podem ser infectados por bactérias incapazes de causar infecção em pessoas sadias. 1. ABORDAGEM CLÁSSICA Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relação casual entre um microrganismo em particular e uma doença. 3.PRÁTICA 10 . Na realidade. 2. Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactérias causadoras de epidemias como a cólera e a tuberculose. uma série de limitações devido ao precário conhecimento. Epidemiologia e da Genética Molecular. A mesma bactéria pode ou não satisfazer os postulados de Koch dependendo da sub-população usada como ponto de referência. tratamento com corticosteróides. 4. contudo.POSTULADO DE KOCH Como provar que um microrganismo é responsável por uma doença? A resposta clássica é um conjunto de quatro postulados formulados por Robert Koch e posteriormente revisados com o desenvolvimento da Microbiologia. ao tempo de Koch. a susceptibilidade do hospedeiro é tão ou mais importante que as características de virulência da bactéria: Indivíduos cujo sistema imunológico esteja seriamente comprometido por quimioterapia anti-câncer. a bactéria ou seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doença. O segundo postulado enfatiza a obtenção de culturas puras do patógeno. Há algumas 40 .

se houver um disponível. ainda. Alguns patógenos humanos não causam doenças em animais ou provocam sintomas diferentes daqueles observados em humanos. 4. Antibióticos que causam o desaparecimento de sintomas também causam a eliminação da bactéria do tecido infectado. uma resposta imunológica dos indivíduos infectados contra os antígenos de superfície das bactérias observadas nas lesões provocadas pela doença. O terceiro postulado requer que a bactéria seja reinoculada em um voluntário humano ou em um animal experimental e que a reinoculação cause os sintomas da doença. os casos nos quais uma única espécie de bactéria é a única responsável por uma doença parece mais uma exceção do que uma regra.doenças cujo agente causativo não pode ser cultivado em meios de laboratório ou cujo meio adequando não é. diferentes linhagens de uma espécie bacteriana não somente variam consideravelmente em virulência como podem causar doenças distintas. Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espécie bacteriana são igualmente virulentos e que somente uma única espécie causa uma determinada doença. disponível: Há consideráveis evidências para implicar as bactérias Treponema pallidum e Mycobacterium leprae como causadoras da sífilis e hanseníase. respectivamente. A combinação das tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR) com as de seqüenciamento de ácidos nucléicos possibilita a detecção e identificação de bactérias não-cultiváveis e revela o agente causativo de muitas doenças. Em muitos casos não é possível a utilização de voluntários humanos e a única alternativa é a utilização de um modelo animal. 3. Há também. 41 . os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espécies de bactérias e há doenças cujas lesões são causados por uma mistura de diferentes linhagens (infecções polimicrobianas). o cultivo de uma bactéria em meio de laboratório pode causar a "perda" do fator de virulência: não expressão dos genes nas condições ambientais do meio.

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