Universidade de São Paulo

Instituto de Ciências Biomédicas Departamento de Microbiologia
BMM121 – Microbiologia Básica

Apostila de Aulas Práticas Profa. Elisabete José Vicente bevicent@usp.br 3091.7350 2004

MICROBIOLOGIA NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de mangas compridas e estar abotoado; Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório; O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações; Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula prática; Descarte de material: a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada; c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes Terminados os trabalhos práticos: a) b) c) d) e) f) Esterilizar alças e fios de platina; Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; Desligar lâmpadas e microscópios; Limpar microscópios e cobri-los com a capa; Tirar o avental e guardar; Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

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Módulo I Introdução à microbiologia

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Módulo I ......................................................................................................................... 4 Introdução à microbiologia ............................................................................................. 4 Prática 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7 Técnica de semeadura ............................................................................................... 7 Objetivo .................................................................................................................... 10 Material ..................................................................................................................... 10 Procedimento e Resultados...................................................................................... 10 Questionário ............................................................................................................. 11 PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM........................................................................... 12 Fixação e coloração de microrganismos................................................................... 12 Preparação de esfregaços e coloração pelo método de gram.................................. 13 A técnica ................................................................................................................... 15 Objetivo .................................................................................................................... 16 Material ..................................................................................................................... 16 Procedimento:........................................................................................................... 16 Resultados:............................................................................................................... 18 Questionário ............................................................................................................. 18 PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA..... 19 Objetivo .................................................................................................................... 19 Materiais ................................................................................................................... 19 Procedimento e resultados ....................................................................................... 19 A. Visualização de bactérias:.................................................................................... 19 B. Visualização de fungos......................................................................................... 20 PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21 Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21 Curvas de crescimento ............................................................................................. 22 Objetivo .................................................................................................................... 25 Material ..................................................................................................................... 25 Procedimento............................................................................................................ 25 Resultados................................................................................................................ 25 Questionário ............................................................................................................. 25 PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO................................................................................................................... 26 Estimativa do número de células viáveis .................................................................. 26 Problema: ................................................................................................................. 27 5

.......................... 35 Questionário .... 33 Procedimento............................................................. 36 Introdução............. ......................CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS. 37 Procedimento....... 40 Abordagem clássica .................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 35 Introdução................. 32 Teoria .......... 32 Resultados........................................................................................................................................................................AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE .......................................................................................................................................................................... 32 Objetivo . 36 Objetivo ....................................................................................POSTULADO DE KOCH.... 32 Questionário ..................................................................... 31 Procedimento....Verificação de entendimento: ..................................................... 35 Procedimento.................................................................................................................................................................... 35 Resultados......................................................................................................................... 35 Material ................................................................................................................................................................................................................................ 37 Material .................................................................................... 29 Anti-sépticos e desinfetantes ...... 34 PRÁTICA 8 ................................... 40 6 .................................................................. 32 PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA ........................................................................................................................................ 33 Questionário ................................ 38 Resultados................................ 39 PRÁTICA 10 ....PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS.................................................................................................................................................................................. 28 PRÁTICA 6 ............................................ 31 Material ................................ 35 PRÁTICA 9 ........................................................................................................................................................................................................... 35 Objetivo ............................................... 29 Objetivos..................... 33 Materiais .................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

TÉCNICA DE SEMEADURA Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos presentes no ambiente.NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas.PRÁTICA 1 . Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho (Figura 1). Flambagem da alça ou fio de platina: Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri. 1. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. Para retirar o material. deve-se flambar a 7 .Posição correta para a flambagem da alça 2. esfriar previamente a alça. Figura 1. seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura. e evitar acidentes laboratoriais.

boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão). Para uso. são oferecidas embrulhadas em papel (às vezes. flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. Figura 2 – Removendo o tampão de algodão 3. e introduzi-la na cultura de bactéria. retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta). da mão que está segurando a alça ( Figura 2). semear na placa de Petri (fig. As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar. 8 . Uma vez utilizada. Não pousar os tampões sobre a bancada!!! Flambar a alça após o uso. após flambar a alça até o rubro. Na semeadura usando placas de Petri. Esta seqüência evite que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. 4. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. 5. Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo. Após a retirada do material com a alça. As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas. torcer o papel na região central da pipeta. dentro de um cilindro metálico).3). a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo solução desinfetante.

Após a primeira estria. e depois guardadas a 4˚C até a próxima aula. ou num pedaço do ágar sem cultura). antes de colocar a alça em contato com a cultura. 7. lembre-se: ela está muito QUENTE!!! Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma. Figura 4 – Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficiência no isolamento de colônias Não esqueça!!!!!! Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo.Figura 3 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias 6. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa técnica é conhecida também por esgotamento. 9 . flambar novamente a alça. girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria. As placas serão incubadas a 37˚C por 24h. sempre invertida.

tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli. não esquecendo de ilustrar os resultados obtidos A) SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO B) SEMEADURA EM PLACAS CONTENDO MEIO SÓLIDO 10 . e obter colônias isoladas MATERIAL alça de platina. PROCEDIMENTO E RESULTADOS Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo.OBJETIVO Fazer semeaduras em meios líquido e sólido de cultura de Eschirichia coli. tubo de ensaio com meio completo líquido placa de Petri com meio completo sólido.

Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferência? 2. Por que deve-se manter sempre que possível a placa de Petri com meio sólido invertida? 3. contendo meio sólido? 11 . na semeadura em placa.C) OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS QUESTIONÁRIO 1. Qual a finalidade de se fazer várias estrias.

antes de ser corado. Existem inúmeros métodos para coloração. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e Podem. permite a visualização de determinadas estruturas. Porém. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares.nessa coloração o corante reage diferentemente com 12 . os corantes conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta. já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos. Um desse íons. enquanto que os ácidos tem a cor do seu íon negativo. além de facilitar sua observação. é chamado de radical cromóforo.PRÁTICA 2 . 2) Coloração diferencial . no estudo dos microrganismos.cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. Então. o que dá a cor. veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia.COLORAÇÃO DE GRAM FIXAÇÃO E COLORAÇÃO DE MICRORGANISMOS A morfologia individual e as reações tintoriais constituem. eventualmente. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que. identificar alguns grupos. azul de metileno e safranina . em geral. por quatro razões principais: Permitem uma visualização melhor das células. Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. A célula bacteriana é negativamente carregada. portanto atrai corantes básicos. Quanto aos tipos de coloração temos: 1) Coloração simples . através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. A introdução de colorações. o microrganismo deve ser fixado à lâmina.

Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). e é o caso do iodo na coloração de Gram. Essas substâncias são chamadas mordentes. mas sim com sua estrutura física. 13 . 3) Coloração especial . 5). frente ao Gram. PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇOS E COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. etanolacetona e fucsina básica. fixado pelo calor. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-) (Fig. A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração.são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas. o que confere a característica de positividade ao Gram. No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico.diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool . em 1884. com os reagentes cristal violeta. é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. iodo. e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano.ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. Essa maneira de reagir diferentemente.

É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Figura 5 – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente.Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Gram positiva Membrana plasmática Complexo de membrana externa. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. quando corretamente realizada e interpretada. a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. 14 . Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. que é maior que a molécula de CV que penetrou. que não consegue reter o complexo.

densidade. porosidade e integridade. o uso de material fresco é importante. tornando-as impermeáveis ao complexo. Células de bactérias Gram-positivas. decorando as células. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. seguido de tratamento com um fixador. A retenção ou não do corante primário é. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido.A TÉCNICA O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. Portanto. O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). células velhas. Por outro lado. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. devem ser capazes de distinguir formas e arranjos. com os mesmos resultados. a fucsina básica. a amostra é tratada com um corante secundário. A etapa da descoloração é crítica. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. o etanol-acetona (1:1 v:v). podendo produzir resultados falsos. Por outro lado. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. em seus citoplasmas. O corante cristal violeta pode ser substituído. Paralelamente. Ao microscópio. insolúvel. o lugol. Em seguida. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. 15 . o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Grampositivas e provoca a contração dos poros do peptidioglicano. com um corante primário. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. portanto. o cristal violeta. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador.

6) Secar à tempetatura ambiente. MATERIAL alça de platina. 7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. já flambada. solução diferenciadora. lugol. 5) Espalhar o material sobre a lâmina. placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido. PROCEDIMENTO: A. OBS. uma gota de água de torneira no centro da lâmina de vidro. 4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. lâmina de vidro.OBJETIVO Coloração de microrganismos provenientes de meios. fucsina básica. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. 2) Flambar novamente a alça 16 . pelo método de Gram. tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído. procurando obter um esfregaço fino. sólido e líquido. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1) Flambar a alça corretamente 2) Esfriá-la nas paredes do tubo 3) Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixá-lo. 8) Realizar a coloração. cristal violeta a 1%. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1) Colocar com a própria alça.

10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. 5) Homogeneizar este material com a gota de água. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. 4) Lavar rapidamente em água corrente. 9) Secar a lâmina.3) Esfriá-la na tampa da placa de Petri. ou no meio sólido numa região sem colônia. 4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. 5) Lavar uma ou duas vezes. tomando o cuidado de não remover o esfregaço. 6) Secar a lâmina por exposição ao ar. COLORAÇÃO 1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. 7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2) Lavar rapidamente em água corrente. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. Evitar estas culturas! 17 . 7) Fixar o esfregaço. com bactérias G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se fracamente. B. 8) Lavar novamente em água corrente. rapidamente. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. Ela deve ser efetuada rapidamente. A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. 6) Lavar rapidamente em água corrente. Os esfregaços não devem ser muito espessos. 3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. Porém. A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada.

RESULTADOS: ___________________ ____________________ __________________ ___________________ QUESTIONÁRIO 1. Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram. Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? 2. podendo inclusive levar a erros? 18 .

Pseudomonas aeruginosa. Visualização de bactérias: b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus c) Bacilos Gram + : Bacillus subtilis d) Bacilos Gram . Microscópio ótico. MATERIAIS Lâminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus. Bacillus subtilis. A.: Pseudomonas aeruginosa 19 .MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA OBJETIVO Visualização das colônias crescidas em placas contendo meio sólido e análise por microscopia óptica e Morfologia de bactérias e de fungos . PROCEDIMENTO E RESULTADOS Faça um esboço das características morfológicas e suas propriedades tintoriais de cada uma das bactérias apresentadas. Streptococcus pyogenes e dois tipos de fungos).PRÁTICA 3 . Repita o procedimento para os fungos apresentados.

Visualização de fungos Filamentosos Leveduras 20 .e) Cocos Gram + : Streptococcus pyogenes B.

no qual o número de indivíduos dobra a cada geração. ou seja. a cada 20 minutos uma nova geração de indivíduos é produzida. muitas espécies bacterianas apresentam um tempo de geração médio de 20 minutos. A maior vantagem de um tempo de reprodução tão rápido é que as bactérias podem evoluir muito rapidamente e esta e a razão do seu sucesso no mundo vivo. aumento do número de células de uma população. Uma característica importante do crescimento bacteriano é o fato de que a maioria das espécies de bactérias é capaz de crescer em taxas bastante rápidas. como conseqüência. Sob condições ótimas de crescimento. seja em ambientes naturais (in vivo) ou em culturas de laboratório (in vitro).. Assim. Nos organismos unicelulares. A evolução ocorre através de mutações genéticas que produzem variações na descendência de um organismo e o ambiente determina que mutações são vantajosas no sentido de aumentar suas chances de sobrevivência e de sucesso reprodutivo (adaptação). Em uma população composta por milhares de bactérias em crescimento ativo.PRÁTICA 4 . Do ponto de vista bioquímico. a cada 20 minutos) a população dobra de tamanho. aumento da massa total de uma população. o número de unidades catalíticas (células) aumenta com o tempo e. as bactérias podem testar 21 . Quando uma bactéria se divide. cada célula bacteriana é uma unidade catalítica. Devido aos tempos de geração muito curtos. cada novo indivíduo pode catalisar a biossíntese de material celular adicional. biomassa é sintetizada em uma taxa progressiva na população em crescimento. O tempo de geração refere-se ao tempo requerido para uma célula bacteriana duplicar seu DNA e dividir-se. Este tipo de crescimento populacional é denominado de crescimento exponencial ou logarítmico. aumento da massa de uma célula individual. O aumento em tamanho de uma célula bacteriana conduz à divisão celular e conseqüente aumento do número de indivíduos na população.g. pode-se presumir que a maioria delas esteja se dividindo ao mesmo tempo e a cada nova geração (e. o crescimento pode ser entendido como: aumento de tamanho de uma célula individual.CURVA DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO BACTERIANO O crescimento de qualquer organismo pode ser definido como o aumento do número de suas células ou o aumento de sua massa.

tais como fontes de nutrientes. pH. como cultura pura. Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condições nas quais seu crescimento atinge uma taxa ótima. Não há método perfeito. osmolaridade. presença ou ausência de oxigênio e temperatura de incubação. quando se inocula uma população bacteriana em um frasco contendo uma quantidade inalterável de meio de cultura (sistema fechado). oxigênio e luz. pH. Essas quatro fases estão representadas na Figura 6. Em condições experimentais. O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado através do aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (através de curvas de crescimento) ou da estimativa do número de células viáveis presentes na população (método de determinação do número de unidades formadoras de colônia). ambos os métodos apresentam vantagens e desvantagens. o crescimento dessa população passa por quatro fases características. em meios de cultura e condições ambientais que variam em condições químicas e físicas. osmolaridade. Para se estudar o crescimento de uma bactéria é preciso cultivá-la. dependendo do ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador. temperatura. CURVAS DE CRESCIMENTO Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano é a obtenção de curvas de crescimento. Estas são representações gráficas do aumento do número de indivíduos em um determinado período de tempo. Figura 6 – Curva de crescimento bacteriano padrão em sistema fechado 22 .bilhões de mutações em pequenos intervalos de tempo. o crescimento bem sucedido de uma população bacteriana reflete seu grau de adaptação a um determinado ambiente e depende primariamente de sua composição: condições nutricionais. A escolha do método depende da situação particular que se apresente. As distintas espécies bacterianas diferem no âmbito de fatores dentro dos quais podem crescer. Portanto.

Desta forma pode-se construir um gráfico representativo do progresso do crescimento. ausente de inóculo. Para a construção de uma curva de crescimento bacteriano. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. A curva de crescimento atinge um platô. Após um determinado período de crescimento exponencial.Fase lag: fase de adaptação metabólica ao novo ambiente. A fase lag será tão mais longa quanto maiores as diferenças de composição do ambiente anterior ou se a população for constituído de bactérias esporuladas. o que mantém constante o número de células viáveis na população. A absorbância aumenta proporcionalmente ao aumento do número de células (biomassa) na população. Para tal utiliza-se um espectrofotômetro onde o branco é o meio de cultura utilizado. mede-se o aumento da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio líquido através de medidas da densidade óptica da cultura. podendo até mesmo decrescer. 23 . As células continuam metabolizando e se dividindo. Fase exponencial ou logarítmica: fase na qual o número de células da população dobra a cada geração. o metabolismo celular está direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas condições ambientais encontradas pelas células. O número de indivíduos não aumenta nesta fase. O número de células viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população. as condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais. mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de morte celular. Fase de declínio: fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. A duração da fase estacionária depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço. Fase estacionária: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido às condições limitantes do meio. Alíquotas da cultura em crescimento são retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbância da cultura contra um comprimento de onda de 600 nm. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase estacionária. A duração dessa fase depende das condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente. Cada medida obtida corresponde à densidade óptica (DO) da cultura em um dado momento do crescimento. relacionando-se a DO pelo tempo.

0. Se a leitura de uma amostra for maior que 2.0 deve-se fazer uma diluição 10-1 dessa amostra e registrar sua DO. Acima disto as leituras perdem a confiabilidade. o experimento não é cansativo. células inviáveis.Só são confiáveis medidas de DO até 2. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais. só se obtêm leituras acuradas da DO até o valor de 2. Vantagens e desvantagens do método de medidas da densidade óptica Vantagens simplicidade da metodologia. células bacterianas agrupadas após a divisão celular não prejudicam os resultados. acima disto as leituras perdem a confiabilidade. Quadro 1. 24 . reduzida quantidade de material utilizado. possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em gráfico). medidas prontamente obtidas: o resultado do experimento é conhecido ao seu final. reduzindo a introdução de erros experimentais por parte do operador.0. pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas. Para a plotagem dos dados no gráfico deve-se multiplicar a DO obtida por 10. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura interferem na obtenção de resultados . Desvantagens e limitações não é possível a estimativa do número de células/ml da população. a introdução de erros experimentais pelo operador é menor.

(Não se esqueça de identificar os eixos. 25 . QUESTIONÁRIO 1. e suas unidades!!!) B) Identificar cada uma das fases de crescimento no gráfico. coli MATERIAL Cultura bacteriana pura. RESULTADOS A) Construir um gráfico a partir dos pontos obtidos. Pipetas. Espectofotômetro. os demais pontos serão medidos pelos monitores e repassados para os grupos. PROCEDIMENTO Durante a aulas serão obtidos apenas alguns pontos experimentais.OBJETIVO Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de através de medidas de densidade óptica. Solução salina. Quais os problemas observados na construção dos gráficos (em que etapa do crescimento)? Você diria que todos os pontos são confiáveis? Justifique sua resposta. E. Tubos de ensaio.

As colônias crescendo no meio de cultura podem ser visualizadas e contadas pelo experimentador.DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO ESTIMATIVA DO NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS A estimativa do número de células viáveis comumente é feita através de diluições seriadas de uma cultura bacteriana. Esse procedimento é repetido em diferentes intervalos de tempo e com os resultados pode-se construir um gráfico representando o progresso do crescimento Quadro 2. células bacterianas individuais ocuparão posições separadas na superfície do meio de maneira que cada uma dê origem a uma colônia bacteriana isolada. prejudicando o cálculo se as células da bactéria estudada mantém-se agrupadas após a divisão celular (cada colônia em meio sólido seria formada por mais de uma célula) se as diluições não forem homogeneizadas adequadamente se um número muito pequeno ou muito grande de colônias for usado na contagem se o operador não fizer o espalhamento rapidamente e de forma possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em um gráfico) pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais 26 . Esta técnica baseia-se na hipótese de que. Como cada colônia supostamente originou-se da multiplicação um único indivíduo. Vantagens e desvantagens do método da contagem de células viáveis Vantagens permite uma estimativa do número de células viáveis/ml da população Desvantagens e limitações detecta somente as células viáveis e que se repliquem. ou seja. muitos indivíduos viáveis podem não se replicar. seguido da semeadura de uma alíquota de cada diluição em placas de Petri contendo meio bacteriológico sólido. no espalhamento.PRÁTICA 5 . A célula individual que originou uma colônia é denominada de "Unidade Formadora de Colônia" ou UFC. o resultado da contagem das colônias multiplicado pela quantidade de diluições decimais é a estimativa do número de bactérias presentes em um ml da cultura original. em solução salina. aquelas capazes de formarem colônias.

Qual é a concentração de E. Você tem um estoque de uma super bactéria Escherichia coli (lac+).1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e 0.células inviáveis. Neste caso você poderá: 0. Mas digamos que você precisa ou deseja conhecer o nível de que a bactéria contaminante seja lac-. VOCE PRECISA RECUPERAR SUA BACTÉRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e contaminação e _________lac_________lac_________lac_________lac- 3. a cada diluição um erro experimental é introduzido pela instrumentação e pelo experimentador este método detecta apenas um número muito reduzido de células. Você fez um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura não interferem na obtenção de resultados adequada.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. QUE FAZER? 2. o que prejudica a estimativa a grande quantidade de material utilizado a acuracidade dos resultados está diretamente relacionada à quantidade de material (principalmente placas de Petri) a limitação de material impõe um aumento do erro experimental o resultado do experimento é só conhecido após o crescimento das colônias isoladas nas placas de Petri A) BACTERIANA A determinanção da concentração de bactérias é feita geralmente pela técnica de determinação do Número de UFC (unidades formadoras de colônias). PROBLEMA: 1. coli número de (UFC/ml da cultura original)? (X)_________ 27 .1ml (diluição 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e 0.

Você saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos? 28 .contaminante (UFC/ml da cultura original)? ( Y) _________ Qual é porcentagem da contaminação? _( Y) / (X)_____________________ B) DE LEVEDURAS Pela técnica de contagem em câmara de ¨Neubauer¨ VERIFICAÇÃO DE ENTENDIMENTO: Várias técnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prática. Qual é a concentração da bactéria lac.4.

AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES HISTÓRIA O uso de anti-sépticos e desinfetantes evolui desde o Antigo Egito. vinagres. número de microrganismos. A prévia remoção ou não de detritos e impurezas da superfície ou tecidos através do uso de sabões ou detergentes. Os anti-sépticos são valiosos no tratamento de infecções locais causadas por microrganismos refratários a quimioterapia sistêmica. Os egípcios e outros povos utilizaram várias misturas. instrumental cirúrgico e anti-sepsia das feridas. até matar o tecido normal do hospedeiro. concentração da droga e temperatura. A presença ou não de resistência bacteriana ao agente antimicrobiano. mel. inicialmente desenvolvidos com o intuito da preservação do corpo à ressurreição. A diferença entre um anti-séptico e um desinfetante pode ser uma questão de tempo de reação. bálsamo. USOS TERAPÊUTICOS DE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES Vários fatores podem influenciar na eficácia e/ou eficiência dos procedimentos ou agentes microbianos. em relação aos processos de embalsamento. Os desinfetantes possuem atividade bactericida ou germicida e costumam ser aplicados em superfícies inanimadas. compressas cirúrgicas. mura. interferindo assim com o crescimento normal do tecido de granulação na cicatrização de feridas. A concentração de anti-séptico em geral é baixa para evitar a lesão e irritação tecidual indesejáveis. As substâncias anti-sépticas são aplicadas ao tecidos para suprimir ou impedir a infecção bacteriana. sendo utilizado em 1847-49 em um hospital vienense quanto à demonstração prática da ação benéfica da anti-sepsia. além do fato de os vinhos e vinagres continuarem a serem utilizados durante a Idade Média ao recobrimento de feridas e.PRÁTICA 6 . mas inibe sua velocidade de crescimento. Bem como as células bacterianas. A descoberta do cloro na Idade Média foi amplamente utilizada como substância desodorante e anti-séptica. consequentemente. Tais como: O microorganismo. Coube a Lister. CONCEITOS GERAIS Um desinfetante é uma substância usada para destruir bactérias ou outros microrganismos infectantes. resinas oleosas. O aumento da concentração de um agente anti-séptico pode irritar e talvez. evitando a infecção. seu número e sua suscetibilidade. vinhos. O agente microbiano e sua respectiva concentração. 29 . Uma substância anti–séptica não mata o microrganismo. A presença ou não de uma limpeza mecânica prévia. a divulgação dos métodos de esterilização de bandagens. em 1865. O tempo de contato entre o microorganismo e o antimicrobiano. tais como óleos voláteis. Anos mais tarde Pasteur explicou sobre a fermentação bacteriana e a existência de agentes infectantes como responsáveis por processos patológicos.

pela borracha e materiais porosos. Bromo.ÁLCALIS Os álcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigüidade. anti-sépticos e desinfetantes. Gram positivas. fungicida ou esporocida. O mecanismo de ação está relacionado à concentração do íon hidroxila. na presença de matéria orgânica o mais ativo é o Iodo. há três tipos: Aniônicos : Os sabões são os mais importantes. São potentes bactericidas contra micobactérias. METAIS PESADOS 30 . de terem ação rápida. A presença de água é fundamental para a atividade dos álcoois (50-70%) e são mais eficazes na ausência de sujeiras e matéria orgânica. Um pH maior do que 9 inibirá a maioria das bactérias. 3º. Cloro. diminuindo assim. de apresentarem baixo custo e praticamente serem atóxicos. ÁLCOOIS Os álcoois alifáticos comuns são bons solventes. podem ser usados em soluções com água e álcool. baixa penetrabilidade. São utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes. Os surfactantes são adsorvidos em um grau significativo pelo algodão. As desvantagens são: baixa atividade fungicida e virucida. desidratantes. baixa toxicidade. não possuírem ação residual e não devem ser utilizados para limpezas de ferimentos abertos. Iodo. SURFACTANTES É um composto químico que diminui a tensão superficial de uma solução aquosa. a concentração eficiente e a eficácia antibacteriana. As atividades em soluções livres de matéria orgânica são. Não-iônicos. Catiônicos : Os compostos de amônio quaternário são os principais. Com base na posição hidrofóbica da molécula. em ordem decrescente: 1º. os detergentes catiônicos não possuem ação virucida. HALOGÊNIOS Possuem efeitos antibacterianos potentes devido à alta afinidade pelo protoplasma. Vantagens: Não são em geral irritantes para a pele e tecidos. fungos patogênicos. muitos vírus e não em esporos. são inodoros. Desvantagens: São neutralizados por surfactantes aniônicos (sabões). Já. eles são eficientes contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem ótimos solventes em relação a outros agentes germicidas. Apesar de possuírem efeitos limitados sobre os vírus. São antibacterianos contra microrganismos Gram negativos e ácido-resistentes. mucosas e trato respiratório. Gram negativas. mas em geral. não agem na presença de matéria orgânica e podem causar irritação quando em contato prolongado com a pele. 2º.

bico de Bunsen. A solução de Peróxido de Hidrogênio libera Oxigênio livre rapidamente ao entrar em contato com mucosas e superfícies sem pêlos que fornecem a enzima catalase. podendo haver repetições). O uso para anti-sepsia de superfícies e objetos inanimados parece imprudente já que há agentes com um modo de ação mais eficiente. adstringentes.Derivados do mercúrio Parecem ser primariamente bacteriostáticos e apenas levemente bactericidas. Quando é distribuído sobre ferida com exsudato. O Permanganato de Potássio libera Oxigênio em contato com a matéria orgânica. sabão. As soluções possuem uma grande ação antibacteriana. Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaeróbicos. mas não destroem esporos bacterianos. AGENTES OXIDANTES São compostos germicidas de ação breve sobre algumas bactérias aeróbicas Gram+ e Gram-. Liberam Oxigênio que se combina com a matéria orgânica se tornando inativos. anti-sépticos comerciais (anti-sépticos em geral disponíveis 1 para cada grupo. MATERIAL 4 Placas com Ágar-sangue : Meio base para ágar sangue ou TSB enriquecido com 5% sangue desfibrinado de carneiro. ou + 3 zaragatoas estéreis. A prata metálica precipita as proteínas e produz efeito irritante. álcool iodado. 31 . antibacterianos pela ação do íon de prata livre e produz desnaturação de proteínas. Alça de Platina . Compostos de Prata Produzem efeitos cáusticos. É valioso para limpar e desodorizar o tecido infectado. 3 cotonetes embrulhados em papel alumínio autoclavados. A sua ação antibacteriana está relacionada à inibição reversível da atividade enzimática essencial da bactéria e à capacidade de se combinar com íons de compostos metálicos orgânicos e inorgânicos. 4 zaragatoas (“Swab”) estéreis. a sua efervescência vai remover o pus e restos celulares e confere atividade germicida limitada. lâminas. Os preparados de Prata coloidal não são corrosivos nem irritantes e são usados sobre tecidos sensíveis. mertiolate. OBJETIVOS Verificar a ação de anti-sépticos no crescimento bacteriano. Possuem pouca atividade esporicida e são inativados por restos orgânicos. bateria de Gram. Microscópio óptico.

Umedecer um cotonete estéril em solução fisiológica e esfregar vigorosamente sobre as costas de uma das mãos. Descreva duas situações: uma em que você usaria um anti-séptico e uma em que usaria um desinfetante. numa área de mesmo diâmetro da primeira.Nesta lista deve conter o principal composto ativo. em estufa a 37°C. Incubar a placa por 24h. Tomar cuidado para não atingir a região não desinfectada. Observar os resultados e anotar. o nome comercial. Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio Ágar sangue. Analisar a Morfologia MACROSCÓPICA das colônias e MICROSPICA das bactérias após coloração de Gram.PROCEDIMENTO 1. 5. 2. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a 32 . Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar nas costas da outra mão. Marcar na placa o anti-séptico utilizado e o número do grupo que realizou o experimento. 4. 2. Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de diâmetro. Faça uma lista com pelo menos seis anti-sépticos e seis desinfetantes. PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA TEORIA Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos. Espalhar o conteúdo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo ágar-sangue. Esperar 4 minutos para que haja ação do anti-séptico e passar na área desinfectada um terceiro cotonete umedecido com solução fisiológica. 7. 2. (Não se esqueça de ilustrar o que você observou!) QUESTIONÁRIO 1. e o uso . RESULTADOS Na quinta-feira: 1. 3. 6.

A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível. 1.Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo. 2. pinças. Introduzir nas culturas um “swab” estéril. no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. PROCEDIMENTO 1. placas de Petri. retirar o excesso de líquido comprimindo a ponta do “swab” nas paredes do tubo. cultura líquida fresca de Eschirichia coli. régua. − Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC. com meio Mueller-Hinton sólido.Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. 33 .atividade de novos agentes.5 na escala padrão de turbidez (Escala de MacFarland). MATERIAIS “Swab” estéril. alguns fatores são essenciais: − Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton. coli a alguns antibióticos. e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes. ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). intermediário ou resistente. devendo-se realizar a coloração de Gram. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível. OBJETIVO Analisar pelo método de difusão a ressitência de E. Para a garantia desta técnica. discos de papel com antibióticos. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0. que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas.

Faça um esquema da parede de uma bactéria Gram-positiva e de uma bactéria Gram-negativa? 34 . Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos). QUESTIONÁRIO 1.2. Medir os halos formados (em mm). 5. de modo a obter um “tapete” de bactérias em toda a superfície do meio sólido. O que é antibiograma e para que serve? Quais são os antibióticos beta-lactâmicos? Qual o seu modo de ação? Qual a diferença entre agente bactericida e bacteriostático? Dos antibióticos testados na experiência acima qual seria o mais indicado para o tratamento da infecção causada pela linhagem E. 3. 4. Incubar em estufa a 37ºC . 4. Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar pinças). 3. Espalhar bem. Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa placa de Petri (meio Mueller-Hinton). 2. 6. coli testada? Por que? 5. registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela abaixo: Bactéria Oxacilina OX (1µg/mL) Carbemicilina CB (100µg/mL) Discos com antibióticos Kanamicina K (30µg/mL) Rifampicina RIF (30µg/mL) Sulfonamida SUL (300µg/mL) Estreptomicina EST (10µg/mL) Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padrões R< 10 S> 13 R< 13 S> 17 R< 12 S> 15 R< 16 S> 20 R< 12 S> 17 R< 11 S> 15 Relate os resultados obtidos e interprete comentando. por 16 a 24 horas.

Embeber os discos de papel de filtro no macerado e colocá-los sobre a superfície do meio semeado. Macerar o alho e a cebola. Um importante exemplo deste processo é o alho. Alho e cebola. 2. MATERIAL Placas de ágar Sabouraud. Culturas: Staphylococcus sp e E.PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS. 35 . OBJETIVO Estudar a presença de compostos antimicrobianos em vegetais. Espalhar sobre a superfície do meio com o próprio cotonete embebido na cultura. Mergulhar o cotonete na suspensão do microrganismo. PROCEDIMENTO 1. RESULTADOS Descreva as observações feitas ao final da incubação. 4. 3. Discos de papel de filtro. Cotonetes. INTRODUÇÃO Muitos vegetais contêm compostos que são inibidores de crescimento de microrganismos e exercem papel importante na resistência destes vegetais a patógenos. A presença de substâncias antimicrobianas pode ser verificada através de extratos ou partes homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos. Pode ser algum já relatado na literatura ou algum de conhecimento popular. coli.PRÁTICA 8 . QUESTIONÁRIO Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . 5. Graal e pistilo. em graal. separadamente. Incubar a 25°C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibição.

Como a interação mob-oriT é específica. especifica proteínas envolvidas não só na interação superficial (contacto) entre as células doadora e aceptora. ainda que os produtos dos genes tra promovem o contacto das células doadora-aceptora e promovem um contexto físico (formação dos poros) para esta transferência. coli K12 e o elemento extra-cromossômico responsável foi chamado de fator F (de fertilidade) ou plasmídio F. Concluindo. os plasmídios mobilizáveis codificam. o plasmídio mobilizável deve conter um ori T. Por outro lado. Os genes tra podem ser divididos em dois grandes grupos: um grupo. Um exemplo de plasmídio mobilizável é o plasmído natural ColE1 ou colicinogênico que codifica as atividades dos genes mob e seu oriT. refere-se aos genes mob. para que o plasmídio possa ser transferido. bem como. chamado de oriT e catalisa o desenrolamento da dupla hélice. O processo de conjugação foi descoberto em E. Os autotransmissíveis carregam um conjunto de genes.PRÁTICA 9 . O outro grupo. Esta célula doadora é diferenciada durante a conjugação pela presença de um apêndice na sua superfície chamado de pili F. cujos produtos promovem a transferência deste plasmídio para uma célula aceptora. Há dois tipos de plasmídios conjugativos: os plasmídios auto-transmissíveis e os mobilizáveis. somente uma fita. somente um dos conjuntos das funções encontradas nos plasmídios auto-transmissíveis para concluir a transferência. A transferência do DNA é iniciada pela ação de um gene mob que tem a atividade em romper (nicking) em uma única fita da molécula do DNA. Experimentos genéticos demonstraram que todas as três classes de funcões de 36 .CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS INTRODUÇÃO A conjugação bacteriana. Como resultado. pode ser transferida para a célula aceptora e a outra fita permanece na célula doadora. ela deve conter um plasmídio conjugativo (elemento extra-cromossômico). os genes tra. os produtos dos genes mob preparam o DNA para serem transferidos. Ambas servem como molde para sintetizar a fita complementar. na formação dos poros na membrana. Contudo. em um sítio específico. descoberta por Lederberg e Tatum (1946) é o processo “sexual"de transferência de genes de uma bactéria doadora para outra receptora. o sítio de oriT deve ser compatível com as funcões mob presentes nas células doadoras. Para que uma linhagem bacteriana seja doadora. os quais especificam proteínas envolvidas na mobilização do DNA.

a linhagem bacteriana é chamada de F+ e no segundo Hfr ( a integração do fator F parece ser mediada por pequenas sequências chamadas de elementos IS). Raramente. a linhagem Hfr cujo fator F está integrado ao cromossomo bacteriano. Tetr ). Neste estado. mas podem ser mobilizados por outros plasmídios conjugativos. outros plasmídios conjugativos foram sendo descobertos como é o caso dos fatores ou plasmídios R ou RTF (fator de transferência de resistência). Alguns plasmídios não promovem conjugação. 37 . Hospeda um plasmídio que carrega o marcador que confere resistência a tetraciclina (Tcr ). transfere. coli. MATERIAL Tubos de ensaio . mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugação entre bactérias e bactérias e leveduras. O fenótipo de resistência ao ácido Nalidíxico deve-se a uma mutação cromossomal.conjugação. normalmente no cromossomo bacteriano. As células F+ após contato com as células F-. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. Raramente. OBJETIVO Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmídio que carrega o gene que confere resistência a tetraciclina. No primeiro caso. Estes plasmídios ColE1 codificam proteínas chamadas de colicinas que matam algumas linhagens sensíveis de E. sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. o fator F media a transferência do cromossoma da célula Hfr para a célula F-. Após a descoberta do fator F. tornando-a F+.. Nalr). Linhagens a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac. Placas com meio sólido. Estes plasmídios possuem marcadores para a resistência às drogas antibacterianas e não integram-se. b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ . Por outro lado. O fator F também é raramente transferido. tra. Os plasmídios conjugativos após serem transferidos e replicados podem permanecerem livres (autônomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano (chamados de estado integrado). o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. transferem em alta frequência para esta última uma réplica ou cópia do plasmídio F. para a Escherichia coli K12 .

coli K12 (receptora) 2.1ml (sem diluição) em meio MacConkey-Nal 0. 2°Dia 1.3 Mistura de conjugação (Transconjugantes): 0.Antibióticos a) Ácido Nalidíxico (Nal) usar a concentração de 10µg/ml b) Tetraciclina (Tc) usar a concentração de 50 µg/ml PROCEDIMENTO 1° Dia 1. coli K12 0. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitação à temperatura de 37°C. 38 .2 Célula receptora: E. 3.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Tc 0.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Nal 3.1ml (diluição 10-4 ) em meio MacConkey -Nal 0.0 ml da linhagem S.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey -Tc 0.1ml (sem diluição) em meio YT-Nal-Tc 0.1ml (sem diluição) em meio MacConkey -Nal-Tc 0. typhimurium MG031 (doadora) e 1.0ml de TSB ou LB as seguintes culturas: 1. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio sólido: 3.0 ml da linhagem E.1ml (diluição 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc 0. Incubar em estufa à temperatura de 37°C por 16-24 horas (durante uma noite). Incubar à temperatura de 37°C por uma noite. typhimurium MG031 0.1ml (diluição 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc 4.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Tc 3. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1.1 Célula doadora: S.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Nal 0.0ml de meio TSB. Fazer os pré-inóculos das linhagens doadoras e receptoras em 4.

A freqüência é determinada dividindo o número de células transconjugantes pelo número total de células receptoras.RESULTADOS 3°Dia Analisar os resultados e determinar a freqüência de conjugação. 39 .

ABORDAGEM CLÁSSICA Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relação casual entre um microrganismo em particular e uma doença. 2.PRÁTICA 10 . A cultura pura quando inoculada em voluntário humano susceptível ou animal experimental deve produzir os sintomas da doença. A mesma bactéria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivíduos intencionalmente infectados. infecção por HIV ou diabetes e que podem ser infectados por bactérias incapazes de causar infecção em pessoas sadias. 1. 2. O segundo postulado enfatiza a obtenção de culturas puras do patógeno. ao tempo de Koch. contudo. Na realidade. dos mecanismos que regem a infectividade bacteriana. Os postulados de Koch implicam que a virulência é uma característica exclusiva das bactérias e independente do hospedeiro. 4. 3. Estes postulados apresentam. Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactérias causadoras de epidemias como a cólera e a tuberculose. A bactéria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doença. a susceptibilidade do hospedeiro é tão ou mais importante que as características de virulência da bactéria: Indivíduos cujo sistema imunológico esteja seriamente comprometido por quimioterapia anti-câncer. a bactéria ou seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doença. uma série de limitações devido ao precário conhecimento. A bactéria deve ser isolada de lesões de uma pessoa infectada e mantida em culturas puras. tratamento com corticosteróides.POSTULADO DE KOCH Como provar que um microrganismo é responsável por uma doença? A resposta clássica é um conjunto de quatro postulados formulados por Robert Koch e posteriormente revisados com o desenvolvimento da Microbiologia. 1. Há algumas 40 . Epidemiologia e da Genética Molecular. A mesma bactéria pode ou não satisfazer os postulados de Koch dependendo da sub-população usada como ponto de referência. Estes se constituíram nas primeiras abordagens que forneceram bases científicas para o estudo das doenças infecciosas.

os casos nos quais uma única espécie de bactéria é a única responsável por uma doença parece mais uma exceção do que uma regra. disponível: Há consideráveis evidências para implicar as bactérias Treponema pallidum e Mycobacterium leprae como causadoras da sífilis e hanseníase. 3. Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espécie bacteriana são igualmente virulentos e que somente uma única espécie causa uma determinada doença.doenças cujo agente causativo não pode ser cultivado em meios de laboratório ou cujo meio adequando não é. respectivamente. se houver um disponível. Em muitos casos não é possível a utilização de voluntários humanos e a única alternativa é a utilização de um modelo animal. Alguns patógenos humanos não causam doenças em animais ou provocam sintomas diferentes daqueles observados em humanos. o cultivo de uma bactéria em meio de laboratório pode causar a "perda" do fator de virulência: não expressão dos genes nas condições ambientais do meio. A combinação das tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR) com as de seqüenciamento de ácidos nucléicos possibilita a detecção e identificação de bactérias não-cultiváveis e revela o agente causativo de muitas doenças. ainda. Antibióticos que causam o desaparecimento de sintomas também causam a eliminação da bactéria do tecido infectado. O terceiro postulado requer que a bactéria seja reinoculada em um voluntário humano ou em um animal experimental e que a reinoculação cause os sintomas da doença. 4. uma resposta imunológica dos indivíduos infectados contra os antígenos de superfície das bactérias observadas nas lesões provocadas pela doença. diferentes linhagens de uma espécie bacteriana não somente variam consideravelmente em virulência como podem causar doenças distintas. Há também. 41 . os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espécies de bactérias e há doenças cujas lesões são causados por uma mistura de diferentes linhagens (infecções polimicrobianas).

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