Universidade de São Paulo

Instituto de Ciências Biomédicas Departamento de Microbiologia
BMM121 – Microbiologia Básica

Apostila de Aulas Práticas Profa. Elisabete José Vicente bevicent@usp.br 3091.7350 2004

MICROBIOLOGIA NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve ser comprido, de mangas compridas e estar abotoado; Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório; O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações; Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela aula prática; Descarte de material: a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada; c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes Terminados os trabalhos práticos: a) b) c) d) e) f) Esterilizar alças e fios de platina; Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; Desligar lâmpadas e microscópios; Limpar microscópios e cobri-los com a capa; Tirar o avental e guardar; Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

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Módulo I Introdução à microbiologia

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Módulo I ......................................................................................................................... 4 Introdução à microbiologia ............................................................................................. 4 Prática 1 - NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7 Técnica de semeadura ............................................................................................... 7 Objetivo .................................................................................................................... 10 Material ..................................................................................................................... 10 Procedimento e Resultados...................................................................................... 10 Questionário ............................................................................................................. 11 PRÁTICA 2 - COLORAÇÃO DE GRAM........................................................................... 12 Fixação e coloração de microrganismos................................................................... 12 Preparação de esfregaços e coloração pelo método de gram.................................. 13 A técnica ................................................................................................................... 15 Objetivo .................................................................................................................... 16 Material ..................................................................................................................... 16 Procedimento:........................................................................................................... 16 Resultados:............................................................................................................... 18 Questionário ............................................................................................................. 18 PRÁTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA..... 19 Objetivo .................................................................................................................... 19 Materiais ................................................................................................................... 19 Procedimento e resultados ....................................................................................... 19 A. Visualização de bactérias:.................................................................................... 19 B. Visualização de fungos......................................................................................... 20 PRÁTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21 Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21 Curvas de crescimento ............................................................................................. 22 Objetivo .................................................................................................................... 25 Material ..................................................................................................................... 25 Procedimento............................................................................................................ 25 Resultados................................................................................................................ 25 Questionário ............................................................................................................. 25 PRÁTICA 5 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO................................................................................................................... 26 Estimativa do número de células viáveis .................................................................. 26 Problema: ................................................................................................................. 27 5

................................................................................ 33 Questionário .................................................................................................................................................................................................... 28 PRÁTICA 6 ................................................................... 34 PRÁTICA 8 ......................................................................................................... 32 Objetivo ............ 33 Materiais .............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................POSTULADO DE KOCH............................................................................................................................................................................................................................................. 39 PRÁTICA 10 .........................................................................................................................Verificação de entendimento: .............................................................................................. 32 Questionário ............................... 36 Objetivo .......................................... 38 Resultados.............................................................................PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS............................................. 35 Objetivo .................................................................................. 29 Objetivos.............................................................................. 40 6 .................................................................................................................................................................................................................................... 29 Anti-sépticos e desinfetantes ............................................. 35 PRÁTICA 9 ................................................................................... 31 Material ........ ............... 35 Resultados................ 37 Material ..... 37 Procedimento........ 35 Material ................................................................................................................................................. 35 Questionário ............................................. 35 Procedimento........ 33 Procedimento................................................... 31 Procedimento...........................................................................................................................................................CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS..................AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE .......................................................... 32 Resultados........................................................... 40 Abordagem clássica .................................................................................... 32 PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA ................................................................ 32 Teoria ................................................................................. 35 Introdução.................. 36 Introdução........

Posição correta para a flambagem da alça 2. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. e evitar acidentes laboratoriais. seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura. Para retirar o material. TÉCNICA DE SEMEADURA Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos presentes no ambiente. Figura 1. esfriar previamente a alça.NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas. 1.PRÁTICA 1 . Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio. Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho (Figura 1). Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. deve-se flambar a 7 . Flambagem da alça ou fio de platina: Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura.

Não pousar os tampões sobre a bancada!!! Flambar a alça após o uso. semear na placa de Petri (fig. da mão que está segurando a alça ( Figura 2). 8 . As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas. torcer o papel na região central da pipeta. dentro de um cilindro metálico). e introduzi-la na cultura de bactéria. 4. retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta). Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo. As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. Após a retirada do material com a alça. Esta seqüência evite que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador.boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão). a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo solução desinfetante. flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa.3). Figura 2 – Removendo o tampão de algodão 3. 5. após flambar a alça até o rubro. Uma vez utilizada. Para uso. Na semeadura usando placas de Petri. são oferecidas embrulhadas em papel (às vezes.

e depois guardadas a 4˚C até a próxima aula. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa técnica é conhecida também por esgotamento. Após a primeira estria. 9 . girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria. As placas serão incubadas a 37˚C por 24h. Figura 4 – Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficiência no isolamento de colônias Não esqueça!!!!!! Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo. antes de colocar a alça em contato com a cultura. sempre invertida. lembre-se: ela está muito QUENTE!!! Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma. ou num pedaço do ágar sem cultura). 7. flambar novamente a alça.Figura 3 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias 6.

OBJETIVO Fazer semeaduras em meios líquido e sólido de cultura de Eschirichia coli. tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli. tubo de ensaio com meio completo líquido placa de Petri com meio completo sólido. PROCEDIMENTO E RESULTADOS Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo. e obter colônias isoladas MATERIAL alça de platina. não esquecendo de ilustrar os resultados obtidos A) SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO B) SEMEADURA EM PLACAS CONTENDO MEIO SÓLIDO 10 .

Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferência? 2. Qual a finalidade de se fazer várias estrias.C) OBTENÇÃO DE CULTURAS PURAS QUESTIONÁRIO 1. na semeadura em placa. contendo meio sólido? 11 . Por que deve-se manter sempre que possível a placa de Petri com meio sólido invertida? 3.

Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e Podem. já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos. A introdução de colorações. antes de ser corado. Um desse íons. por quatro razões principais: Permitem uma visualização melhor das células. Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. enquanto que os ácidos tem a cor do seu íon negativo. o que dá a cor. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta. no estudo dos microrganismos. eventualmente. o microrganismo deve ser fixado à lâmina. através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama.nessa coloração o corante reage diferentemente com 12 . veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia. azul de metileno e safranina . Porém. além de facilitar sua observação. permite a visualização de determinadas estruturas. os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares. Quanto aos tipos de coloração temos: 1) Coloração simples . A célula bacteriana é negativamente carregada. os corantes conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo. 2) Coloração diferencial . portanto atrai corantes básicos. Existem inúmeros métodos para coloração.cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis.PRÁTICA 2 . é chamado de radical cromóforo. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que. Então. em geral.COLORAÇÃO DE GRAM FIXAÇÃO E COLORAÇÃO DE MICRORGANISMOS A morfologia individual e as reações tintoriais constituem. identificar alguns grupos.

3) Coloração especial .ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais.diferentes tipos de bactérias. PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇOS E COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. e é o caso do iodo na coloração de Gram. frente ao Gram. A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. A coloração de Gram e a álcool . 5). Essas substâncias são chamadas mordentes. e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano. 13 . o que confere a característica de positividade ao Gram. iodo. flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas. mas sim com sua estrutura física. enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo).são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. Essa maneira de reagir diferentemente. com os reagentes cristal violeta. fixado pelo calor. em 1884. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo). é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. etanolacetona e fucsina básica. Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-) (Fig.

Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante. mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. quando corretamente realizada e interpretada. que é maior que a molécula de CV que penetrou. 14 . a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo. com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptídeoglicano Membrana plasmática Gram negativa Figura 5 – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano. que não consegue reter o complexo.Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano Gram positiva Membrana plasmática Complexo de membrana externa.

o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Grampositivas e provoca a contração dos poros do peptidioglicano. 15 . dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. Em seguida.A TÉCNICA O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%. seguido de tratamento com um fixador. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. células velhas. densidade. insolúvel. A retenção ou não do corante primário é. decorando as células. com um corante primário. Por outro lado. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido. a amostra é tratada com um corante secundário. portanto. o lugol. Ao microscópio. tornando-as impermeáveis ao complexo. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. a fucsina básica. Portanto. Por outro lado. em seus citoplasmas. O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). o uso de material fresco é importante. o corante primário é retido e as células permanecem coradas. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. o etanol-acetona (1:1 v:v). porosidade e integridade. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos. Células de bactérias Gram-positivas. O corante cristal violeta pode ser substituído. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. com os mesmos resultados. devem ser capazes de distinguir formas e arranjos. Paralelamente. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. A etapa da descoloração é crítica. podendo produzir resultados falsos. o cristal violeta. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador.

8) Realizar a coloração. 4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. fucsina básica. uma gota de água de torneira no centro da lâmina de vidro. solução diferenciadora. procurando obter um esfregaço fino. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixá-lo. 6) Secar à tempetatura ambiente. já flambada. lugol. 7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen. passando a lâmina algumas vêzes pela chama. PREPARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1) Flambar a alça corretamente 2) Esfriá-la nas paredes do tubo 3) Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. pelo método de Gram. MATERIAL alça de platina. 2) Flambar novamente a alça 16 . Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1) Colocar com a própria alça. OBS. placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido. PROCEDIMENTO: A. tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído. lâmina de vidro. sólido e líquido. 5) Espalhar o material sobre a lâmina.OBJETIVO Coloração de microrganismos provenientes de meios. cristal violeta a 1%.

7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos. rapidamente. 5) Homogeneizar este material com a gota de água.3) Esfriá-la na tampa da placa de Petri. B. 8) Lavar novamente em água corrente. 9) Secar a lâmina. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2) Lavar rapidamente em água corrente. com bactérias G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se fracamente. 4) Lavar rapidamente em água corrente. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração. pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. 6) Secar a lâmina por exposição ao ar. Evitar estas culturas! 17 . 3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto. devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. 5) Lavar uma ou duas vezes. Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada. Ela deve ser efetuada rapidamente. 7) Fixar o esfregaço. 4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. COLORAÇÃO 1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. 10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão. não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. 6) Lavar rapidamente em água corrente. tomando o cuidado de não remover o esfregaço. Porém. com a solução diferenciadora: álcool ou acetona. A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. ou no meio sólido numa região sem colônia. Os esfregaços não devem ser muito espessos.

RESULTADOS: ___________________ ____________________ __________________ ___________________ QUESTIONÁRIO 1. podendo inclusive levar a erros? 18 . Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram. Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? 2.

Bacillus subtilis. A. PROCEDIMENTO E RESULTADOS Faça um esboço das características morfológicas e suas propriedades tintoriais de cada uma das bactérias apresentadas.MORFOLOGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA MICROBIANA OBJETIVO Visualização das colônias crescidas em placas contendo meio sólido e análise por microscopia óptica e Morfologia de bactérias e de fungos . Pseudomonas aeruginosa. Visualização de bactérias: b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus c) Bacilos Gram + : Bacillus subtilis d) Bacilos Gram . Streptococcus pyogenes e dois tipos de fungos).PRÁTICA 3 .: Pseudomonas aeruginosa 19 . Repita o procedimento para os fungos apresentados. MATERIAIS Lâminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus. Microscópio ótico.

e) Cocos Gram + : Streptococcus pyogenes B. Visualização de fungos Filamentosos Leveduras 20 .

g. o crescimento pode ser entendido como: aumento de tamanho de uma célula individual. O aumento em tamanho de uma célula bacteriana conduz à divisão celular e conseqüente aumento do número de indivíduos na população. Do ponto de vista bioquímico. a cada 20 minutos uma nova geração de indivíduos é produzida. Sob condições ótimas de crescimento. Uma característica importante do crescimento bacteriano é o fato de que a maioria das espécies de bactérias é capaz de crescer em taxas bastante rápidas. aumento do número de células de uma população. Nos organismos unicelulares. Em uma população composta por milhares de bactérias em crescimento ativo. a cada 20 minutos) a população dobra de tamanho. cada novo indivíduo pode catalisar a biossíntese de material celular adicional. seja em ambientes naturais (in vivo) ou em culturas de laboratório (in vitro). A evolução ocorre através de mutações genéticas que produzem variações na descendência de um organismo e o ambiente determina que mutações são vantajosas no sentido de aumentar suas chances de sobrevivência e de sucesso reprodutivo (adaptação). Este tipo de crescimento populacional é denominado de crescimento exponencial ou logarítmico. pode-se presumir que a maioria delas esteja se dividindo ao mesmo tempo e a cada nova geração (e. aumento da massa total de uma população. Quando uma bactéria se divide. muitas espécies bacterianas apresentam um tempo de geração médio de 20 minutos.PRÁTICA 4 . no qual o número de indivíduos dobra a cada geração. aumento da massa de uma célula individual. ou seja.. as bactérias podem testar 21 .CURVA DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO BACTERIANO O crescimento de qualquer organismo pode ser definido como o aumento do número de suas células ou o aumento de sua massa. A maior vantagem de um tempo de reprodução tão rápido é que as bactérias podem evoluir muito rapidamente e esta e a razão do seu sucesso no mundo vivo. O tempo de geração refere-se ao tempo requerido para uma célula bacteriana duplicar seu DNA e dividir-se. biomassa é sintetizada em uma taxa progressiva na população em crescimento. como conseqüência. Assim. cada célula bacteriana é uma unidade catalítica. o número de unidades catalíticas (células) aumenta com o tempo e. Devido aos tempos de geração muito curtos.

presença ou ausência de oxigênio e temperatura de incubação. Estas são representações gráficas do aumento do número de indivíduos em um determinado período de tempo. como cultura pura. tais como fontes de nutrientes. osmolaridade. Portanto. Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condições nas quais seu crescimento atinge uma taxa ótima. temperatura. Não há método perfeito. Essas quatro fases estão representadas na Figura 6. em meios de cultura e condições ambientais que variam em condições químicas e físicas. Figura 6 – Curva de crescimento bacteriano padrão em sistema fechado 22 . A escolha do método depende da situação particular que se apresente. o crescimento dessa população passa por quatro fases características. ambos os métodos apresentam vantagens e desvantagens. osmolaridade. o crescimento bem sucedido de uma população bacteriana reflete seu grau de adaptação a um determinado ambiente e depende primariamente de sua composição: condições nutricionais. pH. pH. Para se estudar o crescimento de uma bactéria é preciso cultivá-la. CURVAS DE CRESCIMENTO Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano é a obtenção de curvas de crescimento. Em condições experimentais. oxigênio e luz. As distintas espécies bacterianas diferem no âmbito de fatores dentro dos quais podem crescer. quando se inocula uma população bacteriana em um frasco contendo uma quantidade inalterável de meio de cultura (sistema fechado). O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado através do aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (através de curvas de crescimento) ou da estimativa do número de células viáveis presentes na população (método de determinação do número de unidades formadoras de colônia).bilhões de mutações em pequenos intervalos de tempo. dependendo do ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador.

A curva de crescimento atinge um platô. A absorbância aumenta proporcionalmente ao aumento do número de células (biomassa) na população. podendo até mesmo decrescer. mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de morte celular. o metabolismo celular está direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas condições ambientais encontradas pelas células. ausente de inóculo. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase estacionária. o que mantém constante o número de células viáveis na população. A duração dessa fase depende das condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente. as condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais. Para tal utiliza-se um espectrofotômetro onde o branco é o meio de cultura utilizado. O número de células viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população. 23 . Alíquotas da cultura em crescimento são retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbância da cultura contra um comprimento de onda de 600 nm. Fase exponencial ou logarítmica: fase na qual o número de células da população dobra a cada geração. acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço. Desta forma pode-se construir um gráfico representativo do progresso do crescimento. relacionando-se a DO pelo tempo. O número de indivíduos não aumenta nesta fase. A fase lag será tão mais longa quanto maiores as diferenças de composição do ambiente anterior ou se a população for constituído de bactérias esporuladas. Para a construção de uma curva de crescimento bacteriano. Fase de declínio: fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. Após um determinado período de crescimento exponencial. mede-se o aumento da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio líquido através de medidas da densidade óptica da cultura. As células continuam metabolizando e se dividindo. A duração da fase estacionária depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis.Fase lag: fase de adaptação metabólica ao novo ambiente. Cada medida obtida corresponde à densidade óptica (DO) da cultura em um dado momento do crescimento. Fase estacionária: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido às condições limitantes do meio. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado.

reduzida quantidade de material utilizado. células bacterianas agrupadas após a divisão celular não prejudicam os resultados. acima disto as leituras perdem a confiabilidade. a introdução de erros experimentais pelo operador é menor. o experimento não é cansativo.Só são confiáveis medidas de DO até 2. células inviáveis. Desvantagens e limitações não é possível a estimativa do número de células/ml da população.0 deve-se fazer uma diluição 10-1 dessa amostra e registrar sua DO. Para a plotagem dos dados no gráfico deve-se multiplicar a DO obtida por 10. só se obtêm leituras acuradas da DO até o valor de 2. Quadro 1. medidas prontamente obtidas: o resultado do experimento é conhecido ao seu final. Se a leitura de uma amostra for maior que 2. Vantagens e desvantagens do método de medidas da densidade óptica Vantagens simplicidade da metodologia. 24 . pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas.0. reduzindo a introdução de erros experimentais por parte do operador. possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em gráfico). pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais.0. Acima disto as leituras perdem a confiabilidade. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura interferem na obtenção de resultados .

25 . os demais pontos serão medidos pelos monitores e repassados para os grupos. PROCEDIMENTO Durante a aulas serão obtidos apenas alguns pontos experimentais. Tubos de ensaio. e suas unidades!!!) B) Identificar cada uma das fases de crescimento no gráfico. RESULTADOS A) Construir um gráfico a partir dos pontos obtidos.OBJETIVO Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de através de medidas de densidade óptica. Solução salina. Espectofotômetro. Quais os problemas observados na construção dos gráficos (em que etapa do crescimento)? Você diria que todos os pontos são confiáveis? Justifique sua resposta. coli MATERIAL Cultura bacteriana pura.(Não se esqueça de identificar os eixos. QUESTIONÁRIO 1. E. Pipetas.

muitos indivíduos viáveis podem não se replicar. Vantagens e desvantagens do método da contagem de células viáveis Vantagens permite uma estimativa do número de células viáveis/ml da população Desvantagens e limitações detecta somente as células viáveis e que se repliquem. Como cada colônia supostamente originou-se da multiplicação um único indivíduo.PRÁTICA 5 . seguido da semeadura de uma alíquota de cada diluição em placas de Petri contendo meio bacteriológico sólido. o resultado da contagem das colônias multiplicado pela quantidade de diluições decimais é a estimativa do número de bactérias presentes em um ml da cultura original. em solução salina. aquelas capazes de formarem colônias. prejudicando o cálculo se as células da bactéria estudada mantém-se agrupadas após a divisão celular (cada colônia em meio sólido seria formada por mais de uma célula) se as diluições não forem homogeneizadas adequadamente se um número muito pequeno ou muito grande de colônias for usado na contagem se o operador não fizer o espalhamento rapidamente e de forma possibilita o reconhecimento do padrão de crescimento da população bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em um gráfico) pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento de diferentes populações bacterianas pode-se estabelecer comparações do padrão de crescimento sob diferentes condições ambientais 26 .DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MICROBIANA NUMA SUSPENSÃO ESTIMATIVA DO NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS A estimativa do número de células viáveis comumente é feita através de diluições seriadas de uma cultura bacteriana. Esse procedimento é repetido em diferentes intervalos de tempo e com os resultados pode-se construir um gráfico representando o progresso do crescimento Quadro 2. A célula individual que originou uma colônia é denominada de "Unidade Formadora de Colônia" ou UFC. ou seja. As colônias crescendo no meio de cultura podem ser visualizadas e contadas pelo experimentador. Esta técnica baseia-se na hipótese de que. células bacterianas individuais ocuparão posições separadas na superfície do meio de maneira que cada uma dê origem a uma colônia bacteriana isolada. no espalhamento.

Qual é a concentração de E. Você fez um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada. VOCE PRECISA RECUPERAR SUA BACTÉRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. a cada diluição um erro experimental é introduzido pela instrumentação e pelo experimentador este método detecta apenas um número muito reduzido de células. fragmentos de células mortas e material difundido no meio de cultura não interferem na obtenção de resultados adequada.células inviáveis. Você tem um estoque de uma super bactéria Escherichia coli (lac+).1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e contaminação e _________lac_________lac_________lac_________lac- 3. Neste caso você poderá: 0.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. coli número de (UFC/ml da cultura original)? (X)_________ 27 . PROBLEMA: 1. QUE FAZER? 2. o que prejudica a estimativa a grande quantidade de material utilizado a acuracidade dos resultados está diretamente relacionada à quantidade de material (principalmente placas de Petri) a limitação de material impõe um aumento do erro experimental o resultado do experimento é só conhecido após o crescimento das colônias isoladas nas placas de Petri A) BACTERIANA A determinanção da concentração de bactérias é feita geralmente pela técnica de determinação do Número de UFC (unidades formadoras de colônias).1ml (diluição 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e 0. Mas digamos que você precisa ou deseja conhecer o nível de que a bactéria contaminante seja lac-.

4. Qual é a concentração da bactéria lac.contaminante (UFC/ml da cultura original)? ( Y) _________ Qual é porcentagem da contaminação? _( Y) / (X)_____________________ B) DE LEVEDURAS Pela técnica de contagem em câmara de ¨Neubauer¨ VERIFICAÇÃO DE ENTENDIMENTO: Várias técnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prática. Você saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos? 28 .

Os anti-sépticos são valiosos no tratamento de infecções locais causadas por microrganismos refratários a quimioterapia sistêmica. As substâncias anti-sépticas são aplicadas ao tecidos para suprimir ou impedir a infecção bacteriana. CONCEITOS GERAIS Um desinfetante é uma substância usada para destruir bactérias ou outros microrganismos infectantes. mura. interferindo assim com o crescimento normal do tecido de granulação na cicatrização de feridas. até matar o tecido normal do hospedeiro. em relação aos processos de embalsamento. inicialmente desenvolvidos com o intuito da preservação do corpo à ressurreição. 29 . bálsamo. seu número e sua suscetibilidade. além do fato de os vinhos e vinagres continuarem a serem utilizados durante a Idade Média ao recobrimento de feridas e. evitando a infecção. a divulgação dos métodos de esterilização de bandagens. Coube a Lister. tais como óleos voláteis. Tais como: O microorganismo. sendo utilizado em 1847-49 em um hospital vienense quanto à demonstração prática da ação benéfica da anti-sepsia. em 1865. número de microrganismos. Bem como as células bacterianas. A concentração de anti-séptico em geral é baixa para evitar a lesão e irritação tecidual indesejáveis. Os egípcios e outros povos utilizaram várias misturas. USOS TERAPÊUTICOS DE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES Vários fatores podem influenciar na eficácia e/ou eficiência dos procedimentos ou agentes microbianos. mas inibe sua velocidade de crescimento. concentração da droga e temperatura. A diferença entre um anti-séptico e um desinfetante pode ser uma questão de tempo de reação. A presença ou não de resistência bacteriana ao agente antimicrobiano. instrumental cirúrgico e anti-sepsia das feridas. resinas oleosas. O agente microbiano e sua respectiva concentração. compressas cirúrgicas.PRÁTICA 6 . Anos mais tarde Pasteur explicou sobre a fermentação bacteriana e a existência de agentes infectantes como responsáveis por processos patológicos. consequentemente. A presença ou não de uma limpeza mecânica prévia. O aumento da concentração de um agente anti-séptico pode irritar e talvez. vinhos. Os desinfetantes possuem atividade bactericida ou germicida e costumam ser aplicados em superfícies inanimadas. Uma substância anti–séptica não mata o microrganismo.AÇÃO DE ANTI-SÉPTICOS NA DESINFECÇÃO DA PELE ANTI-SÉPTICOS E DESINFETANTES HISTÓRIA O uso de anti-sépticos e desinfetantes evolui desde o Antigo Egito. A descoberta do cloro na Idade Média foi amplamente utilizada como substância desodorante e anti-séptica. vinagres. mel. A prévia remoção ou não de detritos e impurezas da superfície ou tecidos através do uso de sabões ou detergentes. O tempo de contato entre o microorganismo e o antimicrobiano.

há três tipos: Aniônicos : Os sabões são os mais importantes. podem ser usados em soluções com água e álcool. Iodo. 2º. São antibacterianos contra microrganismos Gram negativos e ácido-resistentes. Catiônicos : Os compostos de amônio quaternário são os principais. Um pH maior do que 9 inibirá a maioria das bactérias. fungos patogênicos. eles são eficientes contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. HALOGÊNIOS Possuem efeitos antibacterianos potentes devido à alta afinidade pelo protoplasma. São utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes. não possuírem ação residual e não devem ser utilizados para limpezas de ferimentos abertos. Os surfactantes são adsorvidos em um grau significativo pelo algodão. fungicida ou esporocida. baixa toxicidade. baixa penetrabilidade. Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem ótimos solventes em relação a outros agentes germicidas. Com base na posição hidrofóbica da molécula. A presença de água é fundamental para a atividade dos álcoois (50-70%) e são mais eficazes na ausência de sujeiras e matéria orgânica. 3º. na presença de matéria orgânica o mais ativo é o Iodo. Apesar de possuírem efeitos limitados sobre os vírus. Bromo. mas em geral. de terem ação rápida. não agem na presença de matéria orgânica e podem causar irritação quando em contato prolongado com a pele. desidratantes. anti-sépticos e desinfetantes. O mecanismo de ação está relacionado à concentração do íon hidroxila. pela borracha e materiais porosos. mucosas e trato respiratório. são inodoros. São potentes bactericidas contra micobactérias. de apresentarem baixo custo e praticamente serem atóxicos. SURFACTANTES É um composto químico que diminui a tensão superficial de uma solução aquosa. diminuindo assim.ÁLCALIS Os álcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigüidade. Gram positivas. Já. Gram negativas. Cloro. ÁLCOOIS Os álcoois alifáticos comuns são bons solventes. As atividades em soluções livres de matéria orgânica são. os detergentes catiônicos não possuem ação virucida. a concentração eficiente e a eficácia antibacteriana. muitos vírus e não em esporos. em ordem decrescente: 1º. Vantagens: Não são em geral irritantes para a pele e tecidos. METAIS PESADOS 30 . Não-iônicos. As desvantagens são: baixa atividade fungicida e virucida. Desvantagens: São neutralizados por surfactantes aniônicos (sabões).

Os preparados de Prata coloidal não são corrosivos nem irritantes e são usados sobre tecidos sensíveis. MATERIAL 4 Placas com Ágar-sangue : Meio base para ágar sangue ou TSB enriquecido com 5% sangue desfibrinado de carneiro. álcool iodado. 31 . antibacterianos pela ação do íon de prata livre e produz desnaturação de proteínas. a sua efervescência vai remover o pus e restos celulares e confere atividade germicida limitada. mas não destroem esporos bacterianos. bico de Bunsen. anti-sépticos comerciais (anti-sépticos em geral disponíveis 1 para cada grupo. adstringentes. Quando é distribuído sobre ferida com exsudato. Compostos de Prata Produzem efeitos cáusticos. bateria de Gram. Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaeróbicos. ou + 3 zaragatoas estéreis. Liberam Oxigênio que se combina com a matéria orgânica se tornando inativos. lâminas. Microscópio óptico.Derivados do mercúrio Parecem ser primariamente bacteriostáticos e apenas levemente bactericidas. Possuem pouca atividade esporicida e são inativados por restos orgânicos. AGENTES OXIDANTES São compostos germicidas de ação breve sobre algumas bactérias aeróbicas Gram+ e Gram-. A sua ação antibacteriana está relacionada à inibição reversível da atividade enzimática essencial da bactéria e à capacidade de se combinar com íons de compostos metálicos orgânicos e inorgânicos. OBJETIVOS Verificar a ação de anti-sépticos no crescimento bacteriano. O Permanganato de Potássio libera Oxigênio em contato com a matéria orgânica. mertiolate. 3 cotonetes embrulhados em papel alumínio autoclavados. A solução de Peróxido de Hidrogênio libera Oxigênio livre rapidamente ao entrar em contato com mucosas e superfícies sem pêlos que fornecem a enzima catalase. O uso para anti-sepsia de superfícies e objetos inanimados parece imprudente já que há agentes com um modo de ação mais eficiente. É valioso para limpar e desodorizar o tecido infectado. As soluções possuem uma grande ação antibacteriana. A prata metálica precipita as proteínas e produz efeito irritante. podendo haver repetições). sabão. Alça de Platina . 4 zaragatoas (“Swab”) estéreis.

2. (Não se esqueça de ilustrar o que você observou!) QUESTIONÁRIO 1. 2. 6. Descreva duas situações: uma em que você usaria um anti-séptico e uma em que usaria um desinfetante. Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio Ágar sangue. Umedecer um cotonete estéril em solução fisiológica e esfregar vigorosamente sobre as costas de uma das mãos. Esperar 4 minutos para que haja ação do anti-séptico e passar na área desinfectada um terceiro cotonete umedecido com solução fisiológica. Espalhar o conteúdo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo ágar-sangue. e o uso . 4. Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de diâmetro. 2. em estufa a 37°C. Faça uma lista com pelo menos seis anti-sépticos e seis desinfetantes. RESULTADOS Na quinta-feira: 1. 7. o nome comercial. Marcar na placa o anti-séptico utilizado e o número do grupo que realizou o experimento. numa área de mesmo diâmetro da primeira. PRÁTICA 7 – ANTIBIOGRAMA TEORIA Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos.Nesta lista deve conter o principal composto ativo. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a 32 . 5. Analisar a Morfologia MACROSCÓPICA das colônias e MICROSPICA das bactérias após coloração de Gram. Tomar cuidado para não atingir a região não desinfectada. Observar os resultados e anotar. Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar nas costas da outra mão.PROCEDIMENTO 1. Incubar a placa por 24h. 3.

que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas. Introduzir nas culturas um “swab” estéril. discos de papel com antibióticos.Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo.atividade de novos agentes. com meio Mueller-Hinton sólido. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC.Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível. 1. Para a garantia desta técnica. 33 . − Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias. retirar o excesso de líquido comprimindo a ponta do “swab” nas paredes do tubo. régua. placas de Petri. intermediário ou resistente. MATERIAIS “Swab” estéril. formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. OBJETIVO Analisar pelo método de difusão a ressitência de E. e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes. alguns fatores são essenciais: − Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível. no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. 2. coli a alguns antibióticos. pinças. devendo-se realizar a coloração de Gram. cultura líquida fresca de Eschirichia coli. PROCEDIMENTO 1.5 na escala padrão de turbidez (Escala de MacFarland). ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration).

Incubar em estufa a 37ºC . registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela abaixo: Bactéria Oxacilina OX (1µg/mL) Carbemicilina CB (100µg/mL) Discos com antibióticos Kanamicina K (30µg/mL) Rifampicina RIF (30µg/mL) Sulfonamida SUL (300µg/mL) Estreptomicina EST (10µg/mL) Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padrões R< 10 S> 13 R< 13 S> 17 R< 12 S> 15 R< 16 S> 20 R< 12 S> 17 R< 11 S> 15 Relate os resultados obtidos e interprete comentando. Faça um esquema da parede de uma bactéria Gram-positiva e de uma bactéria Gram-negativa? 34 . Medir os halos formados (em mm). 3. 5. 2. por 16 a 24 horas. de modo a obter um “tapete” de bactérias em toda a superfície do meio sólido. coli testada? Por que? 5. 4. 3. Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos). 4.2. QUESTIONÁRIO 1. 6. O que é antibiograma e para que serve? Quais são os antibióticos beta-lactâmicos? Qual o seu modo de ação? Qual a diferença entre agente bactericida e bacteriostático? Dos antibióticos testados na experiência acima qual seria o mais indicado para o tratamento da infecção causada pela linhagem E. Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa placa de Petri (meio Mueller-Hinton). Espalhar bem. Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar pinças).

Graal e pistilo. MATERIAL Placas de ágar Sabouraud. Pode ser algum já relatado na literatura ou algum de conhecimento popular. em graal. QUESTIONÁRIO Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . OBJETIVO Estudar a presença de compostos antimicrobianos em vegetais. RESULTADOS Descreva as observações feitas ao final da incubação. INTRODUÇÃO Muitos vegetais contêm compostos que são inibidores de crescimento de microrganismos e exercem papel importante na resistência destes vegetais a patógenos. A presença de substâncias antimicrobianas pode ser verificada através de extratos ou partes homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos. 5. Espalhar sobre a superfície do meio com o próprio cotonete embebido na cultura. 4. Discos de papel de filtro. Alho e cebola. Incubar a 25°C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibição. 2. PROCEDIMENTO 1.PRÁTICA 8 . 35 . 3. coli. Mergulhar o cotonete na suspensão do microrganismo. Cotonetes. Um importante exemplo deste processo é o alho. separadamente.PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS. Culturas: Staphylococcus sp e E. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e colocá-los sobre a superfície do meio semeado. Macerar o alho e a cebola.

Os genes tra podem ser divididos em dois grandes grupos: um grupo. Como a interação mob-oriT é específica. pode ser transferida para a célula aceptora e a outra fita permanece na célula doadora. Por outro lado. descoberta por Lederberg e Tatum (1946) é o processo “sexual"de transferência de genes de uma bactéria doadora para outra receptora. somente um dos conjuntos das funções encontradas nos plasmídios auto-transmissíveis para concluir a transferência. Experimentos genéticos demonstraram que todas as três classes de funcões de 36 . Um exemplo de plasmídio mobilizável é o plasmído natural ColE1 ou colicinogênico que codifica as atividades dos genes mob e seu oriT. cujos produtos promovem a transferência deste plasmídio para uma célula aceptora. os plasmídios mobilizáveis codificam. Concluindo. ela deve conter um plasmídio conjugativo (elemento extra-cromossômico).PRÁTICA 9 . Ambas servem como molde para sintetizar a fita complementar.CONJUGAÇÃO DE BACTÉRIAS INTRODUÇÃO A conjugação bacteriana. o plasmídio mobilizável deve conter um ori T. o sítio de oriT deve ser compatível com as funcões mob presentes nas células doadoras. Há dois tipos de plasmídios conjugativos: os plasmídios auto-transmissíveis e os mobilizáveis. Para que uma linhagem bacteriana seja doadora. Esta célula doadora é diferenciada durante a conjugação pela presença de um apêndice na sua superfície chamado de pili F. ainda que os produtos dos genes tra promovem o contacto das células doadora-aceptora e promovem um contexto físico (formação dos poros) para esta transferência. na formação dos poros na membrana. em um sítio específico. somente uma fita. chamado de oriT e catalisa o desenrolamento da dupla hélice. Os autotransmissíveis carregam um conjunto de genes. os genes tra. bem como. A transferência do DNA é iniciada pela ação de um gene mob que tem a atividade em romper (nicking) em uma única fita da molécula do DNA. Como resultado. para que o plasmídio possa ser transferido. especifica proteínas envolvidas não só na interação superficial (contacto) entre as células doadora e aceptora. refere-se aos genes mob. coli K12 e o elemento extra-cromossômico responsável foi chamado de fator F (de fertilidade) ou plasmídio F. O processo de conjugação foi descoberto em E. os produtos dos genes mob preparam o DNA para serem transferidos. os quais especificam proteínas envolvidas na mobilização do DNA. O outro grupo. Contudo.

coli. a linhagem Hfr cujo fator F está integrado ao cromossomo bacteriano. transferem em alta frequência para esta última uma réplica ou cópia do plasmídio F. mas podem ser mobilizados por outros plasmídios conjugativos.. Após a descoberta do fator F.conjugação. MATERIAL Tubos de ensaio . Tetr ). normalmente no cromossomo bacteriano. para a Escherichia coli K12 . tra. As células F+ após contato com as células F-. Por outro lado. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. No primeiro caso. Estes plasmídios possuem marcadores para a resistência às drogas antibacterianas e não integram-se. Linhagens a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac. Alguns plasmídios não promovem conjugação. o cromossomo inteiro da célula Hfr é transferido. o fator F media a transferência do cromossoma da célula Hfr para a célula F-. O fenótipo de resistência ao ácido Nalidíxico deve-se a uma mutação cromossomal. mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugação entre bactérias e bactérias e leveduras. 37 . OBJETIVO Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmídio que carrega o gene que confere resistência a tetraciclina. transfere. b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ . Placas com meio sólido. a linhagem bacteriana é chamada de F+ e no segundo Hfr ( a integração do fator F parece ser mediada por pequenas sequências chamadas de elementos IS). Raramente. Neste estado. Os plasmídios conjugativos após serem transferidos e replicados podem permanecerem livres (autônomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano (chamados de estado integrado). Hospeda um plasmídio que carrega o marcador que confere resistência a tetraciclina (Tcr ). O fator F também é raramente transferido. Raramente. outros plasmídios conjugativos foram sendo descobertos como é o caso dos fatores ou plasmídios R ou RTF (fator de transferência de resistência). Estes plasmídios ColE1 codificam proteínas chamadas de colicinas que matam algumas linhagens sensíveis de E. sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. Nalr). tornando-a F+.

3.1 Célula doadora: S.0ml de TSB ou LB as seguintes culturas: 1. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio sólido: 3.Antibióticos a) Ácido Nalidíxico (Nal) usar a concentração de 10µg/ml b) Tetraciclina (Tc) usar a concentração de 50 µg/ml PROCEDIMENTO 1° Dia 1.1ml (sem diluição) em meio YT-Nal-Tc 0. 38 .0 ml da linhagem S.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Tc 0.2 Célula receptora: E. 2°Dia 1. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1.1ml (sem diluição) em meio MacConkey-Nal 0.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Tc 3. typhimurium MG031 (doadora) e 1. Incubar em estufa à temperatura de 37°C por 16-24 horas (durante uma noite).0ml de meio TSB.1ml (sem diluição) em meio MacConkey -Nal-Tc 0. Incubar à temperatura de 37°C por uma noite. coli K12 (receptora) 2. Fazer os pré-inóculos das linhagens doadoras e receptoras em 4.0 ml da linhagem E. coli K12 0.1ml (diluição 10-5) em meio MacConkey -Nal 0.3 Mistura de conjugação (Transconjugantes): 0. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitação à temperatura de 37°C.1ml (diluição 10-4 ) em meio MacConkey -Nal 0.1ml (diluição 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc 0.1ml (diluição 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc 4.1ml (diluição 10-4) em meio MacConkey -Tc 0.1ml (diluição 10-6) em meio MacConkey -Nal 3. typhimurium MG031 0.

39 . A freqüência é determinada dividindo o número de células transconjugantes pelo número total de células receptoras.RESULTADOS 3°Dia Analisar os resultados e determinar a freqüência de conjugação.

ao tempo de Koch. uma série de limitações devido ao precário conhecimento. 1. Estes postulados apresentam. Os postulados de Koch implicam que a virulência é uma característica exclusiva das bactérias e independente do hospedeiro. Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactérias causadoras de epidemias como a cólera e a tuberculose. tratamento com corticosteróides. 3. infecção por HIV ou diabetes e que podem ser infectados por bactérias incapazes de causar infecção em pessoas sadias. Na realidade. Há algumas 40 .POSTULADO DE KOCH Como provar que um microrganismo é responsável por uma doença? A resposta clássica é um conjunto de quatro postulados formulados por Robert Koch e posteriormente revisados com o desenvolvimento da Microbiologia. A bactéria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doença. a bactéria ou seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doença. A bactéria deve ser isolada de lesões de uma pessoa infectada e mantida em culturas puras. 1. O segundo postulado enfatiza a obtenção de culturas puras do patógeno. a susceptibilidade do hospedeiro é tão ou mais importante que as características de virulência da bactéria: Indivíduos cujo sistema imunológico esteja seriamente comprometido por quimioterapia anti-câncer. contudo. 2.PRÁTICA 10 . A cultura pura quando inoculada em voluntário humano susceptível ou animal experimental deve produzir os sintomas da doença. A mesma bactéria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivíduos intencionalmente infectados. dos mecanismos que regem a infectividade bacteriana. A mesma bactéria pode ou não satisfazer os postulados de Koch dependendo da sub-população usada como ponto de referência. Epidemiologia e da Genética Molecular. 4. Estes se constituíram nas primeiras abordagens que forneceram bases científicas para o estudo das doenças infecciosas. ABORDAGEM CLÁSSICA Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relação casual entre um microrganismo em particular e uma doença. 2.

Antibióticos que causam o desaparecimento de sintomas também causam a eliminação da bactéria do tecido infectado. disponível: Há consideráveis evidências para implicar as bactérias Treponema pallidum e Mycobacterium leprae como causadoras da sífilis e hanseníase. uma resposta imunológica dos indivíduos infectados contra os antígenos de superfície das bactérias observadas nas lesões provocadas pela doença. O terceiro postulado requer que a bactéria seja reinoculada em um voluntário humano ou em um animal experimental e que a reinoculação cause os sintomas da doença. Alguns patógenos humanos não causam doenças em animais ou provocam sintomas diferentes daqueles observados em humanos. os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espécies de bactérias e há doenças cujas lesões são causados por uma mistura de diferentes linhagens (infecções polimicrobianas). ainda. A combinação das tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR) com as de seqüenciamento de ácidos nucléicos possibilita a detecção e identificação de bactérias não-cultiváveis e revela o agente causativo de muitas doenças. os casos nos quais uma única espécie de bactéria é a única responsável por uma doença parece mais uma exceção do que uma regra. respectivamente. 41 . 4.doenças cujo agente causativo não pode ser cultivado em meios de laboratório ou cujo meio adequando não é. o cultivo de uma bactéria em meio de laboratório pode causar a "perda" do fator de virulência: não expressão dos genes nas condições ambientais do meio. Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espécie bacteriana são igualmente virulentos e que somente uma única espécie causa uma determinada doença. Há também. se houver um disponível. 3. diferentes linhagens de uma espécie bacteriana não somente variam consideravelmente em virulência como podem causar doenças distintas. Em muitos casos não é possível a utilização de voluntários humanos e a única alternativa é a utilização de um modelo animal.

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