MICRORGANISMOS

INDICADORES DE HIGIENE EM

ALIMENTOS

Profa. Solange T. Carpes

 “Preferências” microbianas
Os fatores extrínsecos dos alimentos (temperatura
de armazenamento, atmosfera, tipo de
embalagem) e os intrínsecos (características do
alimento como, acidez, umidade, composição, etc.)
vão determinar as “preferências”dos
microrganismos pelos alimentos.

Assim, nos grupos gerais dos microrganismos como fungos

(bolores e leveduras) “preferem” alimentos mais ácidos,
mais secos, aw baixa.... Enquanto que as bactérias
“preferem” os alimentos com pH próximo de 7. Baseado
nessas preferências, os exames microbiológicos são
direcionados.
Determinações microbiológicas

A Legislação tem parâmetros para cada tipo de

alimentos: patógenos e deterioradores que nos
darão uma idéia da qualidade microbiológica
dos alimentos (RDC-12/01/2001)
www.anvisa.gov.br/e-legis -
http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa
/2001/res0012_02_01_2001.html
Difícil fazer todos os patógenos: indicadores (associados a eles)
Alguns patógenos alimentares são
de difícil detecção e portanto,
podemos utilizar, para facilitar sua
detecção, os microrganismos
indicadores, cuja presença pode
indicar a possível presença de um
patógeno.
Definição de m.o. indicadores

São grupos ou espécies de m.o. que,

quando presentes em um alimento podem
fornecer informações importantes
sobre a ocorrência de contaminação fecal
CRITÉRIOS PARA INDICADORES
1. Fácil e rápida detecção (os coliformes no geral, são);
2. Facilmente distinguível de outros da microbiota do
alimento;
3. Não deve ser considerado contaminante natural do
alimento;
4. Deve estar presente quando o patógeno estiver
(E.coli e Salmonella tem o mesmo habitat: trato
gastrointestinal do homem e animais);
5. Seu número deve se associar ao patógeno;
6. Ter velocidade de crescimento semelhante à do
patógeno;
7. Velocidade de morte semelhante ao patógeno;
8. Ausentes quando o patógeno estiver ausente.
Porém nem todas essas condições são observadas.
 CLASSIFICAÇÃO DOS INDICADORES

1. Contaminação Fecal: Coliformes totais, Fecais e

Enterococos (sujeira dos esgostos);
2. Indicadores Gerais: Aeróbios mesófilos,
psicrotróficos, termófilos, anaeróbios, bolores e
leveduras (alimentos ácidos e mais secos);
3. Outros indicadores: S. aureus, Clostridios, esporos
de termófilos, (estudos de eficiência de processos),
bolores em equipamentos – são mais específicos
para cada caso.
 1. INDICADORES DE
CONTAMINAÇÃO FECAL

 1.1 Coliformes Totais

 1.2 Coliformes Fecais

 1.3 Enterobactérias (disturbios
gastrointestinal – europeus usam como
indicadores)

 1.4 Enterococos
 1.1 Coliformes Totais
 Bactérias da família Enterobacteriaceae, capazes
de fermentar a lactose com produção de gás
quando incubados a 35-370C/48h.
 São bastonetes gram-negativos, não-
formadores de esporos
 O grupo coliforme é formado por 4 Gêneros:
Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e
Klebsiella
 Destes somente a E. coli faz parte do TGI do
homem e animais
 Outros: Vegetais, solo e também fezes
 Prática: Não indica necessariamente contaminação fecal
recente ou ocorrência de enteropatógenos - sujeira
1.2 Coliformes Fecais e Escherichia coli

 São os coliformes totais que continuam

fermentando a lactose, com produção de
gases, quando incubados a 44-45,50C
 Nestas condições 90% de E. coli são
positivas e algumas cepas de
Enterobacter e Klebsiella mantém essa
característica.
 A denominação de "coliformes a 45ºC" é
equivalente à denominação de "coliformes
de origem fecal" e de "coliformes
termotolerantes
Condições para Indicador Fecal ideal
 Ter como habitat exclusivo o TGI do homem e de
outros animais;
 Deve ocorrer em números altos nas fezes
(109 UFC/g)
 Ter alta resistência ao ambiente extra-enteral
 Deve ser detectado por técnicas rápidas e
simples...
 E. coli – indicador fecal que mais preenche os
requisitos e foi proposto em 1892 como
indicador fecal da qualidade da água e até hoje é
utilizado.
TESTES DA COLIMETRIA
Coliformes pelo NMP Número Mais Provável

Dividido em:

 PRESUNTIVO
 CONFIRMATIVO
 COMPLETO
Teste presuntivo – LST (realizado tanto para
coliforme total como para coliforme fecal)

• Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com

tubos de Durham invertidos - três séries
de três tubos - Incubação :35-37◦C por
24-48 h.
• Células estressadas por tratamentos
térmicos, pelo congelamento ou por
outro motivo pode ser recuperadas nesta
fase.
• Princípio: oferece como fonte de carbono
apenas a lactose, a qual é fermentada
pelos coliformes com produção de ácidos
e gás, que é evidenciado nos tubos de
Durham. O meio ainda contém lauril
sulfato que inibe a flora acompanhante
• Leitura: Os coliformes utilizam a lactose
produzindo ácido e gás, sendo este
detectado no teste presuntivo através da
retenção de gás no tubo de Durham.
Teste Confirmativo – para Coliformes
totais
• Os tubos positivos no teste presuntivo são
semeados em Caldo Verde Brilhante Bile
Lactose (VBBL) com tubos de Durham em
seu interior - Incubação:35-37◦C por 24-48
h.
• O VBBL contém inibidores (bile e verde
brilhante) do crescimento da microflora
acompanhante, especialmente bactérias
Gram positivas, e a lactose , como única
fonte de carboidrato.
• Leitura: os tubos com produção de gás
indica que houve desenvolvimento de
bactérias Gram negativas que fermentam a
lactose, característicos do grupo coliformes
• Cálculo do Número Mais Provável (NMP)
para Coliformes Totais.
Teste Confirmativo – para Coliformes a
45°C (termotolerante)
• Tubos positivos no teste
presuntivo - Caldo Escherichia coli
(EC) contendo tubos de Durham
em seu interior - Incubação: 44,5
± 0,5°C por 24-48 h.
• O teste baseia-se na utilização de
um meio de cultura seletivo – os
tubos com produção de gás =
positivos para o teste confirmativo
• Cálculo do Número Mais Provável
(NMP) para Coliformes a 45°C.
25g de alimento em 225 mL H2O pte
9 mL H2O pte 9 mL H2O pte

1 mL 1 mL

1 mL 10 -3 1 mL
1 mL 10 -2
10 -1
Teste Presuntivo
LST com tubos de
Durham
Incubação 35°C/24 h

Teste Confirmativo Teste Confirmativo

Caldo Verde Caldo EC
brilhante Bile (VB) NMP de Coliformes
NMP de Coliformes termotolerantes /25 g ou 25 mL
Totais /25 g ou 25 mL Incubação 45°C/ 24-48 h
Incubação 35°C/48 h
Cada Tubo positivo. Todas as subculturas do
caldo EC são repicadas para ágar EMB – estrias
por esgotamento - EMB 35°C/ 18-24 h
De cada placa correspondente a cada tubo ,
repicar 2 a 3 colônias para ágar nutriente
inclinado e incubar por 18 a 24 h 35°C Efetuar Colônias verdes com brilho metálico esverdeado
em cada cultura em ágar nutriente as seguintes ou com centro metálico
provas bioquímicas: Indol; Vermelho de Metila
VM; Voges-Proskauer- VP; Citrato Este grupo
 1.3 Enterobactérias
 Atualmente, ao invés de enumerar
coliformes fecais e totais e E. coli, alguns
laboratórios estão preferindo enumerar as
bactérias pertencentes á família
Enterobacteriaceae como um todo, isto é:
as fermentadoras e não-fermentadoras de
lactose. (usados na Europa)
 Justificativa: acham que os coliformes são
mal definidos taxonomicamente; são
menos exigentes a Aw (consegue-se pegar
uma faixa maior de patógenos)
 os patógenos, coliformes, etc. podem estar
aqui!!!! – porque são oriundos do TGI
1.4 Enterococos
 Antes: um sub-grupo do gênero Streptococcus.
Apartir de 1984, passaram a pertencer ao gênero
Enterococcus
 São atualmente denominados: E faecium e E.
faecalis (os relevantes em saúde humana).
 Restrições: Também encontrados em ambientes
diferentes do TGI (ex. solo);
 Porém sobrevivem mais a tratamentos como
desidratação, flutuações de temperatura, etc. do
que os patógenos (formam pequenos grumos e se
protegem)
 Importância: Altos números indicam práticas
sanitárias inadequadas ou exposição a
temperaturas de abuso. (alimento: sorvete)
Entre os fecais qual então escolher?
Coliformes Totais, Fecais, E.
coli; Enterobacterias,
Enterococos ?????

 Depende da capacidade do laboratório,

pode ser todos ou no mínimo
coliformes totais e fecais;

 Pode apoiar na legislação: 1 ou 2

exames
2. Indicadores Gerais
 São grupos de microrganismos,
que quando presentes em
número elevados nos alimentos
poderão causar a deterioração
e/ou redução da vida de
prateleira;
 Na prática: nos fornecem
informações gerais sobre as
condições durante o
processamento do alimento.
 2.1 Contagem Total de Aeróbios
Mesófilos
 Objetivo: verificar a qualidade sanitária dos
alimentos
 Contagem padrão em placas meio P.C.A.
(plate count agar) ou Petrifilm
 Mesmo que os patógenos estejam ausentes e
o alimento ainda não se ache alterado, um
número elevado de microrganismos indica
condição insalubre do alimento.
 A partir de 105 é perceptível
organolepticamente mudança na textura e
sabor.
 Justificativa para o uso de
Contagem Total de Mesófilos

 Contagem elevada em alimentos não-

perecíveis: matéria-prima contaminada
 Contagem elevada em alimentos
perecíveis: abuso no armazenamento em
relação ao tempo e temperatura
 A maioria das bactérias patogênicas são
mesófilas: alta contagem indica que
houve condição para elas se
multiplicarem também.
RESTRIÇÃO A CONTAGEM TOTAL

 Para alimentos fermentados onde

a contagem de células viáveis é
ao redor de 108 UFC/g ou mL de
alimento
 Mesófilos: onde se usa
 Controle sanitários dos alimentos
 Histórico de um processamento
 Alguns produtos da legislação RDC 12/2001
pedem:
1) Alimentos infantis como água de preparo
da mamadeira, leite materno de bancos de leite
(102 UFC/g – limite), lactária, berçario.
2) Dietas enterais em pó, e módulos de
nutrientes para composição da dieta enteral: 103
UFC/g. Ex: farinha de leite de soja que vai entrar
na formulação da dieta.
Toxinfecção por mesófilos????

 Existem relatos de casos por cepas

de Proteus, Enterococus e
Pseudomonas quando presentes em
um número elevado causaram a
toxinfecção.
(depende da pessoa)
2.2. Contagem total de Psicrotrófilos
(Psicrotróficos) e Termófilos
Aeróbios
 Deterioração de produtos
refrigerados (70C por 10 dias) e
termoprocessados (450C/2 dias)
 Meio P.C.A
 Crescem em temperatura de
refrigeração
 Estudo de vida de prateleira (ex.
alface embalada a vácuo – análise
diária até que se deteriore)
 Definição de Psicrotróficos
Microrganismos que crescem em alimentos sob
refrigeração (0-7º C), mas apresentam temperatura ótima
acima de 20º C são chamados de psicrotróficos ou
psicrotrófilos.
São definidos como microrganismos capazes de
produzir crescimento visível a 7º C no prazo de 7 a 10
dias, independente de sua temperatura ótima.
Na classificação tradicional dos microrganismos em
função da temperatura – termófilos, mesófilos e psicrófilos

Os psicrotróficos são um subgrupo dos mesófilos, não

dos psicrófilos, porque são esses últimos geralmente
morrem à temperatura ambiente.
Os psicrotróficos, ao contrário, se multiplicam em
alimentos refrigerados mas crescem melhor nas
temperaturas da faixa mesófila.
 Bactérias deterioradoras psicrotróficas
Deteriorantes de produtos lácteos Pseudomonas,
Flavobacterium, Alcaligenes, Acinetobacter, Klebsiella, Bacillus e
Lactobacillus são
Alimentos embalados sob vácuo ou atmosferas modificadas
Brochothrix, Lactobacillus, Leuconostoc e membros da família
Enterobacteriaceae
Amolecimento e deterioração de vegetais refrigerados
Espécies de Bacillus, Clostridium, Enterobacter, Flavobacterium,
Pseudomonas e Yersinia
Deterioração em pescados Alteromonas, Photobacterium e
Vibrio são importantes deterioradores em pescados.
Deterioração em carnes Pseudomonas, Bacillus, Aeromonas,
Listeria etc…
Bactérias patogênicas psicrotróficas

Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica,

Aeromonas hydrophila, Vibrio cholerae, algumas
cepas de Escherichia coli enteropatogênica,
algumas cepas de Bacillus cereus, algumas
cepas de Clostridium botulinum tipo E e tipos B
e F não proteolíticos
 2.3 Contagem Total de Bolores e
Leveduras
 Crescimento mais lento do que as bactérias,
alimentos de baixa acidez e alta Aw;
 Em alimentos ácidos e mais secos, o
crescimento de fungos é maior, deteriorando
frutas frescas, vegetais e cereais, também
sucos de frutas, picles, queijos, e alimentos
congelados.
 Perigo: micotoxinas por bolores
 Análise: 25g de alimento em placas com meio
adequado: PDA com antibiótico, DRBC etc.
 Inoculação:superfície, incubação: 250C/3-5 dias
 BOLORES & LEVEDURAS
 Medidas de segurança para prevenir o
surgimento de bolores e leveduras:
 Boas Práticas de Higiene reduzem os
esporos
 Congelados devem se manter a - 120C
 Ácidos ou conservadores químicos como
benzoatos e sorbatos para retardar o
crescimento
 Eliminar ou reduzir contato com ar através
de embalagem
 3. Outros Indicadores
 S. aureus: presença em alto número -
manipulação inadequada pelo operador na
linha do processo;
 Clostridios: verificação de higiene de
processo ou de um estudo de tratamento
térmico
 Esporos de termófilos: estudos de eficiência
de sanificação em alguns vegetais
(enlatados)
 Bolores em equipamentos: indicador de
sanificação de operações de processamento
em alimentos (swab – sujeira em
equipamentos)