Ministério da Educação

Universidade Tecnológica Federal do Paraná

Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia

Teste de fermentação de carboidratos

Aula 02

Ponta Grossa
2023/1
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Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia

1. Introdução

Os testes de fermentação de carboidratos são aplicados para indicar a capacidade de um

microrganismo realizar a fermentação de um determinado carboidrato inserido a um básico,
que possa resultar na formação de ácido ou ácido e gás (SEELEY JR. Et al.,1991).
A produção e proporção de produtos procedentes da degradação do carboidrato, como por
exemplo, ácidos orgânicos (ácido lático e acético) e gases (dióxido de carbono e hidrogênio),
irão depender da espécie de microrganismo e do tipo de carboidrato que está sendo adotado
no teste. (SEELEY JR. Et al.,1991).
A capacidade de um organismo consumir ou não, um carboidrato (monossacarídeos,
dissacarídeos e/ou polissacarídeos), resultará em informações para uma possível identificação
e classificação do mesmo. Então, estes testes são proveitosos para fazer a distinção e a
identificação de espécies de bactérias (BETTELHEIM, 1994, MacFADDIN, 2000).
Os testes são realizados aplicando-se em um meio de cultura, adicionado de um indicador
de pH. O indicador mais aplicado a técnica é o vermelho de fenol, sendo conhecido também
por fenolsulfonftaleína ou PSP (sigla em inglês), a sua mudança de cor propiciada pela
alteração do pH, apontando alcalinidade em um pH aproximado a 8.5 e sua cor sendo
vermelho, em um pH 6.9, indica acidez do meio, e sua cor equivalendo a amarelo. Esta
transformação da cor, ocorre em consequência da perda de prótons do vermelho de fenol,
conforme o pH aumenta. Dentro do tubo contendo o microrganismo, o carboidrato e o
indicador, é posto um tudo de Durham, que deverá estar invertido, para verificar se ocorre a
presença da formação de gás, onde poderá se notar bolha dentro do tubo de Durham.
O intuito de execução dessa prática, é necessário preparar o caldo base, conforme a
recomendação do fabricante, e após adicionar o carboidrato que será experimentado, em uma
concentração de 1%, incubar a 37ºC por 24h-48h (SEELEY JR. Et al.,1991, MacFADDIN,
2000).
Para a observação dos resultados, deve-se levar em consideração que para resultado
positivo, a cor do meio mudará para amarelo, resultado negativo, o meio apresentará uma cor
vermelho. No que diz respeito à produção de gás, se houver bolhas dentro do tubo de Durham
o resultado é positivo, se não houver bolhas, o resultado é negativo (MacFADDIN, 2000).
Na prática “Teste de fermentação de carboidratos”, foi realizado utilizando um
microrganismo desconhecido, o qual devemos identificar com o decorrer dos testes
bioquímicos, e os carboidratos frutose, glicose, xilose, sacarose e lactose;
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2. Objetivos
 Objetivo desta prática consistia na visualização e identificação da produção de
ácido ou de gás em tubos de ensaio contendo frutose, glicose, xilose, sacarose
e lactose.
 Determinar se nosso microrganismo tinha a capacidade de degradar e
fermentar cada um dos carboidratos utilizados.
 Analisar se o microrganismo cresceu no meio, se produziu gás e/ou ácido.

3. Materiais e Métodos
3.1 Materiais
 6 tubos contendo caldo base suplementado, 5 utilizados para cada carboidrato
e 1 tubo para controle;
 5 Alças de inoculação estéril;
 Bico de Bunsen;
 Meios de cultura aplicado para o preparo do inóculo:
 TSI - ágar Tríplice Açúcar Ferro, TSA - ágar Tripticase de Soja e NA –
ágar nutriente;
 Caldo vermelho de fenol suplementado com os carboidratos:
 Frutose;
 Glicose;
 Xilose;
 Sacarose;
 Lactose.

3.2 Métodos
Os meios de culturas utilizados nesse trabalho foram preparados conforme o
fabricante e feita a reativação do inóculo a uma temperatura de 35º-37ºC, com 24h
antecipadamente à prática. Para o caldo base foram seguidos alguns métodos, como o
ajuste do pH do caldo base em 7.4 e acrescentado 4 ml por tubo já com os tubos de
Durham colocados invertidos dentro de cada tudo de ensaio, após foi feita a
esterilização a 121ºC/15min. Foi preparado e esterilizado à parte, a solução aquosa
contendo cada carboidrato a ser analisado, em uma proporção de 10% (p/v). Logo, foi
adicionado 0,4ml de solução aos tubos de ensaio contendo o caldo base, resultando na
concentração de 1% de carboidrato.
Para a solução de vermelho de fenol 0,2%, a metodologia aplicada foi, a dissolução de
0,1g da substância vermelho de fenol em 4m de NaOH 0,1M e completado o volume
com 50ml de água destilada.

Execução da técnica pelas alunas:

 Foi feita a desinfecção da bancada com álcool 70%.
 Ligado o bico de Bunsen;
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 Cada tubo de ensaio foi identificado:
Tubo controle;
Tubo 1 – Frutose;
Tubo 2 – Glicose;
Tubo 3 – Xilose;
Tubo 4 – Sacarose;
Tubo 5 – Lactose.
 Usando a alça de inoculação, foi transferida pequena quantidade de inóculo da
linhagem a ser analisada e testada para cada tubo contendo o caldo base, a solução de
vermelho fenol e o carboidrato.
 Inoculado em cada tubo (Tubo 1, tubo 2, tubo 3, tubo 4 e tubo 5)
 1 Tubo foi deixado para controle, para comparação de resultados.
 Os tubos com a tampa levemente afrouxada foram incubados a 35º-37º por 24h-48h, e
a cada período de tempo foi observado o resultado.

4. Resultados
Abaixo na figura 1, podemos observar os tubos contendo o caldo base, vermelho de
fenol e carboidratos antes da incubação.

Figura 1

Fonte: Autoria própria.

Na figura 2, apresenta os resultados nos tubos após as 48h.

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Figura 2 – Tubos após 48h.

Fonte: Autoria própria.

Na figura 3, observamos o tubo controle sem inóculo.

Figura 3 - Tubo Controle

Fonte: Autoria própria.

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Figura 4: Resultado após 48h, nos Tubos 1, 2, 3, 4 e 5.

Fonte: Autoria própria.

Conforme a metodologia, para ser um resultado açúcar positivo a cor do meio deveria mudar
para amarelo. Se os tubos apresentassem cor vermelha, o resultado seria negativo para açúcar.
Em relação a produção de gás, se positivo, deveria formar bolha dentro do tubo de Durham, e
negativo sem a formação da bolha. Na tabela abaixo podemos verificar os resultados obtidos
da prática.

Tabela 1 – Resultado para produção de ácido e gás.

Tubo Cor Gás
Tubo 1 – Frutose Amarelo Negativo
Tubo 2 – Glicose Amarelo Positivo
Tubo 3 – Xilose Amarelo Negativo
Tubo 4 – Sacarose Amarelo Positivo
Tubo 5 - Lactose Amarelo Negativo
Fonte: Autoria própria.

5. Discussão
Como pode-se observar na Tabela 1, o Tubo 2 contendo Glicose e Tubo 4 contendo
sacarose, é possível verificar a bolha dentro do tubo de Durham, sendo assim, positivo para
produção de gás.
E em relação a cor, todos os tubos apresentaram coloração amarelada,
consequentemente positivo para produção de ácido.
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Nos tubos, 1 – Frutose e 5 – Lactose, os tubos apresentaram uma aparência turva, o

que quer dizer que ocorreu crescimento microbiano, com a mudança de cor para o amarelo,
porém não houve a produção de gás.
Em concordância com o objetivo dessa prática, foi possível observar por meio do teste
de fermentação de carboidratos que houve a produção de ácido nos tubos 1, 3 e 5, nos tubos 2
e 4, ácido e gás.

6. Referências

- BETTELHEIM, K. A. Biochemical Characteristics of E. colli. In: Escherichia colli in

domestic animals and humans. Ed. Gyles, C. L.: guelph, Cab International, 1994.

- LEHNINGER, A.L.Bioquímica. Vol. 4 Edgard Blücher, 2004.

- MacFADDIN, J. F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3rd ed.

Philadelphia: Lippincott Willians & Wilkins, 2000.

- SEELEY, JR., H. W.; VANDERMARK, P. J.; LEE, J. J. Microbes in action. A Laboratory

Manual of Microbiolovgy. 4th ed. New York: W. H. Freeman and Company, 1991.

- Varghese, Naveena & Joy, P.P. (2014). Microbiology Laboratory Manual.

- Vieira, Darlene Ana de Paula V658m Microbiologia Geral / Darlene Ana de Paula Veira,
Nayara Cláudia de Assunção Queiroz. – – Inhumas: IFG; Santa Maria: Universidade Federal
de Santa Maria, 2012. 100 p.: il