Universidade Federal de Ouro Preto/ Microbiologia – CBI-618

Microbiologia Prática – UnidadeII

Aulas Práticas N°6,7 e 8

Profa. Dra.Maria Célia da Silva Lanna
Microbiologia Prática - Profa. Maria Célia da Silva Lanna

Aula Prática N°6:

 OBJETIVOS:

OBJETIVOS GERAIS DA UNIDADE II

ESTUDO DAS BACTERIAS BASTONETES GRAM NEGATIVOS

da FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE da Microbiota Intestinal

e sua importancia nas Ciências dos Alimentos e Doenças Humanas

OBJETIVO DA AULA No. 6 :

Isolar Culturas Puras de Espécies da Familia Enterobacteriaceae de diferentes
materiais clínicos e de alimentos utilizando Ágar Eosine Methylene Blue (Agar EMB)

ATIVIDADES:
Quatro Amostras (A-1, A-2, A-3 e A-4) de materiais enriquecidos em
Caldo Nutriente são distribuidos para a turma: Cada dupla de alunos recebe uma
amostra e deverá entregar o Relatório No. 2 no final do semestre letivo.
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CONTINUAÇÃO DA Aula Prática N°6:

ÁGAR EOSINE METHYLENE BLUE(ÁGAR EMB):

“Meio seletivo para familia Enterobacteriaceae”

Composição do Meio:
1)Peptona (nutrientes)
2)Azul de Methylene e Eosine(Inibidores e Reagentes)
3)Lactose
4)Indicador de pH “Vermelho Neutro”(Para detectar os generos
fermentadores e os não fermentadores de Lactose)
(pHneutro:incolor/ pHácido:vermelho escuro/ pHmuitoácido:BrilhoMetálico)
5)Ágar
6)Agua
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CONTINUAÇÃO DA Aula Prática N°6:

DESENVOLVIMENTO DAS ATIVIDADES:

DESENVOLVIMENTO DAS ATIVIDADES

Quatro Amostras (A-1, A-2, A-3 e A-4) de materiais enriquecidos em Caldo

Nutriente são distribuidos para a turma: Cada dupla de alunos recebe uma
amostra e deverá entregar o Relatório No. 2 no final do semestre letivo.

A-1:Tubo com Amostra de água enriquecida

A-2:Tubo com Amostra de fezes diarreicas enriquecida
A-3 :Tubo com Amostra de urina de paciente com infecção urinaria enriquecida
A-4:Tubo com Amostra de queijo contaminado enriquecida

Cada Amostra deverá ser inoculada em Agar EMB

“Semeadura por esgotamento”
Em seguida estas culturas deverão ser incubadas em estufa a 37º C / 24 h.
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CONTINUAÇÃO DA Aula Prática N°6:

TÉCNICA PARA A INOCULAÇÃO POR ESGOTAMENTO EM

ÁGAR EOSINE METHYLENE BLUE (ÁGAR EMB)

Cuidados:
A alça de níquel-cromo deverá ser
esterilizada por flambagem antes e
após qualquer inoculação. Deve-se tomar o
cuidado de esfriá-la antes da coleta.
Os recipientes devem sempre ser abertos
próximos à chama do bico de Bunsen.

Após a “Semeadura por esgotamento”

estas culturas deverão ser incubadas em estufa a 37º C / 24 h.
Desenvolvimento das aulas práticas - Profa. Maria Célia da Silva Lanna

Aula Prática N°7:

OBJETIVOS:
Aula Prática N°7:
OBJETIVO :

Obtenção das Culturas Puras de Espécies da Familia Enterobacteriaceae de diferentes

materiais clínicos e de alimentos crescidas no Ágar eosine methylene blue (Agar EMB)
e estas serão inoculadas em Meios com diferentes substratos em Série Bioquímica –
Simplificada para Identificação dos gêneros e espécies da familia Enterobacteriaceae.

ATIVIDADES:
Cada Cultura Pura das Amostras (A-1, A-2, A-3 e A-4) será
inoculada em uma respectiva Serie Bioquimica, identificada e incubada em estufa
a 37º C / 24 h.
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CONTINUAÇÃO DA Aula Prática N°8:

SÉRIE BIOQUÍMICA: Testes/Leituras de Resultados após incubação 37ºC

Tubo 1: Teste Fermentação da Glicose: Ácido com Gás/ou Acido sem Gás
Tubo 2: Teste Fermentação da Lactose: Ácido(+) ou não(-).
Tubo 3: Teste Utilização Citrato de Simmons: Alcalino(+) ou não(-).
Tubo 4: Teste Utilização da Uréia: Alcalino(+) ou não(-).
Tubo 5 SIM : Teste S : Produção de H2S (+) ou não (-).
Tubo 5 SIM : Teste I : Produção de indol (+) ou não (-).
Tubo 5 SIM : Teste M : Motilidade (+) ou não (-).
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CONTINUAÇÃO DA Aula Prática N°8:

EXPLICAÇÃO DOS MECANISMOS DOS TESTES DA SÉRIE BIOQUIMICA:

Tubo 1: Teste Fermentação da Glicose: Reação fermentativa da glicose. É
observada a capacidade fermentativa da bactéria para glicose. O caldo glicosado
contém peptona, NaCl isotonico, glicose e o indicador de pH vermelho de fenol, que em
meio ácido é amarelo, meio neutro é vermelho e em meio alcalino é vinho). Se a
bactéria fermenta o carboidrato, produzirá ácido que vira o indicador para amarelo e se
não fermenta o meio continua vermelho. Para o teste da glicose, coloca-se também no
tubo, um tubinho de DURHAM invertido para captar gás, caso este seja produzido na
fermentação. Algumas bacterias(Ex. E.coli possui enzima hidrogenliaseformica)
fermenta, produz ácido com gás mas outras (Ex. Shigella) produzem ácido sem gás.
Tubo 2: Teste Fermentação da Lactose: Reação fermentativa da lactose. Se a
bactéria tem o OPERON LAC produz a enzima betagalactosidase e fermenta a lactose.
O caldo lactosado contém peptona, NaCl isotonico, lactose e o indicador de pH
vermelho de fenol, que em meio ácido é amarelo, meio neutro é vermelho e em meio
alcalino é vinho). Se a bactéria fermenta o carboidrato, produzirá ácido que vira o
indicador para amarelo, se não fermenta o meio continua vermelho.
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CONTINUAÇÃO DA Aula Prática N°8:

Continuação da EXPLICAÇÃO DOS MECANISMOS DA SÉRIE BIOQUIMICA:

Tubo 3 : Teste Utilização Citrato de Simmons:Reação para verificar a utilização
do citrato de sódio como única fonte de carbono por via oxidativa-> Para se estudar a
utilização do citrato: em um tubo do meio sólido contendo citrato de sódio, além de
fosfato de amônio e um indicador de pH (azul de bromotimol, que em meio alcalino é
azul e em meio neutro é verde). A reação é positiva se o meio apresentar cor azul,
evidenciando que a bactéria utiliza o citrato como única fonte de carbono e
concomitantemente o fosfato de amônio como única fonte de nitrogênio produzindo
compostos aminados que alcalinizam o meio. A reação é negativa se a cor do meio
permanecer inalterada (verde).
Tubo 4 : Teste Utilização da Uréia:Reação para verificar a utilização da uréia
como única fonte de nitrogênio: meio sólido em tubo contendo uréia como única fonte
de nitrogênio e um indicador de pH (ex: vermelho de fenol, que em meio alcalino é vinho
e em meio ácido é amarelo). A reação é positiva se a cultura apresentar cor vinho. A
bactéria neste caso, utiliza a uréia e produz compostos aminados que alcalinizam o
meio. A reação é negativa se a cor do meio não se alterar (amarela).
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CONTINUAÇÃO DA Aula Prática N°8:

Continuação da EXPLICAÇÃO DOS MECANISMOS DA SÉRIE BIOQUIMICA:

Tubo 5 SIM : Teste S : Produção de H2S: Pesquisa de ácido sulfídrico a partir da
utilização de aminoácidos sulfurados(cistina, cisteina) -> Usa-se meio de cultura contendo fonte
protéica com aminoácidos providos de enxofre e a capacidade bioquímica da bactéria de utilizar
estes aminoácidos é verificada pela sua produção de ácido sulfúrico que, em presença do acetato
de ferro do meio forma precipitado negro. Se a reação for positiva a cor do meio é negro. Se a
reação for negativa a cor do meio não se altera.

Tubo 5 SIM : Teste I : Produção de indol: Pesquisa de indol a partir da utilização do

aminoácido triptofano presente no meio. A reação será positiva se a bactéria inoculada utiliza o
triptofano (por possuir a enzima triptofanase), produzirá o gás incolor indol, que em presença do
reativo paradimetiloaminobenzaldeído (ex: reativo de Kovacs), forma um complexo químico
vermelho. Se for negativo a cor do reativo não se altera (amarelo).

Tubo 5 SIM : Teste M : Motilidade: Utilizando-se um meio de cultivo semi-sólido no qual

a cultura é inoculada com agulha por picada até a metade do tubo. Após o cultivo se a reação for
positiva o meio se apresentará turvo em toda sua extensão. A motilidade da bactéria é detectada
pelo seu crescimento difuso(Ex. Salmonella sp, E.coli). Se a reação for negativa o meio se
apresentará límpido, transparente(Ex. Shigella), a bactéria cresce apenas no local de inoculação.
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Aula Prática N°8:

OBJETIVOS:

OBJETIVO DA AULA No. 8 :

Realizar a Leitura e Interpretação das Series Bioquimicas cultivadas com as
Amostras A-1, A-2, A-3 e A-4 para Identificação dos gêneros e espécies da familia
Enterobacteriaceae.

ATIVIDADES:

A TABELA DE IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA DA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE será

utilizada para identificar os gêneros e espécies presentes nas amostras de
alimentos e amostras clinicas investigadas neste trabalho.

Principais gêneros e especies da familia Enterobacteriaceae:

1)Escherichia ( especie Escherichia coli subespecie comensal e subespecies
patogenicas) 2)Enterobacter(especies não patogenicas) 3)Salmonella(três especies todas
patogenicas) 4)Shigella(três espécies patogenicas) 5)Proteus(especies patogenicas) 6)
Klebsiella (espécies patogenicas) e outros gêneros.