SEO III METABOLISMO MICROBIANO

METABOLISMO BACTERIANO (PROVAS BIOQUMICAS)

A investigao das atividades metablicas das bactrias in vitro chamada de Provas Bioqumicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou espcies de bactrias ou leveduras atravs da verificao das transformaes qumicas, que ocorrem num determinado substrato, pela ao das enzimas de um dado microrganismo. Como muitas vezes um determinado microrganismo possui um sistema enzimtico especfico, promovendo transformao bioqumica especfica, as provas bioqumicas podem ser utilizadas na prtica para a sua caracterizao. Para a realizao das provas bioqumicas necessrio utilizar meios de cultivo especiais contendo o substrato a ser analisado e fornecer ao microrganismo as condies nutritivas e ambientais necessrias ao seu desenvolvimento. Objetivos: executar e interpretar os resultados e as transformaes metablicas ocorridas em algumas provas bioqumicas empregadas para identificao de bactrias. As principais e mais utilizadas provas bioqumicas so: 1. Produo de catalase - Esta enzima atua sobre a gua oxigenada (perxido de hidrognio 3 a 5%) desdobrando-a em oxignio e gua. A prova feita colocando uma gota de soluo aquosa de perxido de hidrognio a 3-5% numa lmina e, em seguida, com uma ala de platina, colocar uma poro do crescimento bacteriano sobre a gota. Ou de outra forma, adicionando-se 0,5 ml da mesma soluo a uma cultura em meio lquido ou em gar inclinado. A prova considerada positiva quando h borbulhamento ou efervescncia devido liberao do oxignio. A catalase produzida por muitos microrganismos e usualmente empregada para diferenciar Staphylococcus, que so catalase positivos de Streptococcus, catalase negativos, ou os bacilos Gram positivos catalase negativos Lactobacillus e Erysipelothrix de Listeria e a maioria dos Corynebacterium catalase positivos.
CATALASE

2H202 Perxido de Hidrognio

2H20 gua

O2 Oxignio Livre

2. Prova da citocromo-oxidase - Este sistema enzimtico est relacionado com os citocromos da cadeia respiratria de alguns microrganismos. A prova consiste em colocar uma gota do reagente incolor tetrametil p-fenileno de amina, recm preparado e protegido da luz, em um papel de filtro. Em seguida, vrias colnias do microrganismo em estudo so espalhadas sobre a rea do papel de filtro contendo o reagente, utilizando uma ala de platina ou um basto de vidro. A prova considerada positiva quando na mistura do reagente com a massa bacteriana desenvolve-se a cor prpura em at 1 minuto. Na reao negativa no h desenvolvimento de cor prpura. As enterobactrias so oxidase negativas e podem ser diferenciadas de outros bacilos Gram negativos. A prova pode ser feita tambm em culturas em meios slidos, adicionando-se o reagente oxalato de p-aminodimetilanilina. A reao inicia-se com o desenvolvimento de cor rsea, marrom e finalmente uma colorao negra na superfcie das colnias indicativa da produo de citocromo-oxidase, representando um teste positivo. O teste negativo se no ocorrer alterao da cor ou houver o desenvolvimento de uma cor rsea plida.

E. coli

Pseudomonas

e. C e.e. COLI Figura 22. 3. Utilizao do citrato como nica fonte de carbono - Alguns microrganismos como a E. coli no possuem a permease do citrato, que faz o transporte do citrato para o interior da clula, no conseguindo portanto crescer no meio contendo como nica fonte de carbono o citrato, embora possuam as enzimas, intracelulares, que degradam o citrato. A prova feita semeando-se a bactria no meio slido inclinado de citrato de Simmons, contendo azul de bromotimol como indicador, o qual em pH 6,8 a 7,0 apresentase verde. A prova positiva resulta no transporte do citrato pela permease e a sua utilizao pela enzima citratase resulta na formao de oxaloacetato e acetato. O consumo do citrato induz a clivagem do fosfato de amnia, alcalinizando o meio. Tambm, com o metabolismo do citrato h formao de carbonatos que alcalinizam o meio, de modo que a cor do indicador vira para azul. Na prova negativa o meio no se altera pois no h crescimento microbiano. Por esse motivo a inoculao deve ser feita com agulha e em linha reta para no haver influncia de ingrediente do meio de onde se originou a cultura, dando resultados falso-positivos. Ac. Citrico + 2Na+ citrase NaCO3 oxaloacetato pH alcalino cido actico cido pirvico + CO2 (Excesso) cor se altera de verde para azul.

+ H2O

Figura 23. Resultado da prova do citrato. Direita: reao positiva. Esquerda: reao negativa 4. Prova da produo de urease - A urease uma enzima que degrada a uria em duas molculas de amnia e uma de anidrido carbnico. A prova consiste em transferir uma poro do crescimento bacteriano com uma ala para o meio contendo uria, pH neutro e um indicador de pH, o vermelho fenol. Aps o crescimento a prova revelada positiva quando a urease ataca a uria alcalinizando o meio que toma a colorao rosa choque. Na prova negativa no h alterao da cor do meio. Os organismos do gnero Proteus so urease positivos diferentemente da maioria das enterobactrias. 4. Prova da produo de indol - O indol resultante da degradao do aminocido triptofano pela enzima triptofanase. A prova realizada inoculando-se o meio contendo excesso de triptofano. Aps a incubao colocar 0,5 ml do reagente de Kovac ou o reativo de Ehrlich (soluo aquosa ou alcolica de p-dimetil aminobenzaldedo, respectivamente) atravs da parede interna do tubo. A prova positiva quando na poro superior, i.e. na interface da cultura e o reagente, desenvolve-se um anel de cor rsea dentro de no mximo 5 minutos. Este resultado devido complexao do indol com o aldedo, em meio cido, formando o composto colorido. A prova negativa com qualquer outra tonalidade de cor (original do meio ou marrom) Figura 24. O indol reage com o reagente formando um composto colorido rseo.

triptofanase Triptofano

Indol + piruvato e amnia

5. Prova da produo de gs sulfdrico ou sulfeto de hidrognio Existem duas vias fermentativas principais atravs das quais alguns microrganismos podem produzir sulfeto de hidrognio. Pela primeira via, o gs sulfdrico produzido por reduo do enxofre orgnico presente no aminocido cistena (reao de hidrogenao), o qual um componente das peptonas contidas no meio. Essas peptonas so degradadas pelas enzimas microbianas a aminocidos. Atravs da ao da enzima desulfurase da cistena o aminocido cistena perde o tomo de enxofre, que por sua vez reduzido pela adio de hidrognio da gua para formar o gs sulfeto de hidrognio, conforme ilustrado abaixo. Uma tira de papel de filtro impregnada com soluo saturada de acetato de chumbo colocada suspensa sobre o meio contendo o aminocido sulfurado. Esteriliza-se o meio, inocula-se com a cultura teste e incuba-se apropriadamente. Na prova positiva, o H2S produzido voltil e incolor, mas ao reagir com o acetato de chumbo forma-se sulfeto de chumbo, que enegrece a extremidade do papel de filtro. Na prova negativa a fita permanece branca. Pela segunda via, o gs sulfdrico tambm pode ser produzido pela reduo de compostos inorgnicos de enxofre tais como o tiossulfato, sulfato ou sulfito. Os microrganismos capazes de produzir a enzima redutase do tiossulfato convertem o tiossulfato em sulfito com liberao de sulfeto de hidrognio. Os tomos de enxofre atuam como aceptores de hidrognio durante a oxidao do composto inorgnico conforme abaixo. Para esse teste pode ser empregado o meio de TSI (trplice sugar and iron) ou o de meio de SIM (sulfito, indol e motilidade). Utilizando o meio de SIM, que tem o tiossulfato como fonte de enxofre e o sulfato ferroso como indicador da produo de sulfeto de hidrognio. O meio semi-slido para permitir a respirao anaerbia. Nesse caso, inocula-se o meio por punctura e incuba-se em aerobiose por 24h a 35oC. Nas duas vias, o sulfeto de hidrognio produzido reage com o metal pesado formando sulfetos que apresentam colorao negra. Tiossulfato (3S2O3= ) + 4H++ 4eRedutase do tiossulfato 2SO3= + 2H2S +( metal pesado) (Precipitado preto)

Cistena Prova positiva

Cistena desulfurase

cido pirvico + amnia + H2S (+ metal pesado) (Precipitado preto)

Figura 25 6. Prova da fermentao de carboidratos - Esta prova pode ser realizada de vrias maneiras. A mais usual envolve a utilizao de um meio com glicose ou outro acar e/ou lcool com pH neutro e um indicador de pH (Indicador de Andrade, prpura de bromocresol). Alm disso utiliza-se um tubo de Durham, invertido, imerso no meio. O meio inoculado com a cultura teste e incubado. A prova positiva indicada pela viragem da cor do meio de incolor com Indicador de Andrade ou prpura com prpura de bromocresol, para vermelho ou amarelo, respectivamente, devido a produo de cidos, com abaixamento do pH do meio. Alm disso, se a bactria possuir o sistema enzimtico hidrognio-frmico-liase, o cido frmico transformado em C0 e Hidrognio, os quais so coletados pelo tubo de Durham, expulsando o meio e ficando a extremidade superior desse tubo transparente, cheia dos gases citados. A prova negativa revelada pela ausncia de mudana de cor ou at mesmo pela acentuao da cor prpura quando o reativo o prpura de bromocresol, indicando utilizao dos aminocidos, com alcalinizao do meio. Deve-se lembrar que, para produzir esse meio bem como aquele usado para pesquisa da produo de urease, os acares e a uria devem ser esterilizados previamente por filtrao e, posteriormente, colocados assepticamente no meio bsico. Enterobactrias produzem cido e gs da glicose (exceto Shigella, que s
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produz cido). As pseudomonas no fermentam carboidratos. Algumas vezes necessrio verificar se a bactria produz vrios cidos (fermentao cido mista), comum para E. coli, atravs do teste chamado de vermelho de metila (VM) ou se apresenta fermentao butileno-gliclica revelada pela deteco de acetona atravs do teste conhecido como VP ou Voges-Proskauer, comum em Enterobacter, mas no em E.coli, permitindo diferenciar essas bactrias muito parecidas biolgica e bioqumicamente. Figura 26. 7. Prova do Vermelho de metila (VM) prova efetuada para determinar a capacidade do microrganismo de oxidar a glicose com produo e estabilizao de altas concentraes de produtos finais cidos. Serve para diferenciar organismos entricos, em particular E. coli de E. aerogenes E. coli Glicose + H20 cidos ltico, actico e frmico + CO2 + H2 + Vermelho de metila cor vermelha (2,3-butanodiol e Acetilmetilcarbinol) + CO2 + H2 (pH 6,0) 40% KOH (Oxidao) 8. Prova de Voges-Proskauer (VP) 9. Reduo de nitratos diacetil (CH3-CO-CO-CH3 + Guanidina NH2-C=NH (grupo de peptona) Rosa NH-R

Enterobacter aerogenes Glicose + O2 cido actico Acetilmetilcarbinol + naftol

11. Prova da Motilidade - A prova da motilidade indica indiretamente a produo de flagelos. No uma prova bioqumica e sim fisiolgica, mas auxilia a identificar bactrias. A prova efetuada inoculando-se em linha reta, atravs da tcnica da punctura (com agulha), 2/3 de um meio semi-slido. A prova indica motilidade quando os microrganismos crescem deslocando-se da linha de inoculao, turvando o meio. A prova negativa quando os microrganismos ficam restritos ao local da inoculao sem, contudo, turvar o meio. As provas bioqumicas so utilizadas rotineiramente para identificar enterobactrias como E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, dentre outras. A diferenciao dos gneros da familia Enterobacteriaceae feita atravs de provas bioqumicas ao passo que a diferenciao das espcies ou tipos feita sobretudo com base em caracteres sorolgicos (sorotipos), embora tambm possa ser baseada em caracteres bioqumicos ou na combinao de ambos. Finalmente, certos sorotipos podem subdividir-se bioquimicamente constituindo os biotipos ou ento serem agrupados em lisotipos (fagotipos) de acordo com suas reaes frente a bacterifagos especficos (Fagotipagem). Para identificar um determinado microrganismo, a rotina bacteriolgica consiste da coleta adequada da amostra e sua semeadura em meios de cultura (enriquecimento e meios seletivos diferencias, se necessrio). As colnias suspeitas sero semeadas em determinados meios chamados de triagem (p/ identificao preliminar, p.ex. TSI, LIA, Kliger, dentre outros), i.e., que oferecem concomitantemente vrias informaes de natureza bioqumica, permitindo estabelecer um diagnstico presuntivo imediato. A depender dos resultados obtidos nesses meios de triagem pode-se caracterizar imediatamente alguns grupos atravs de provas sorolgicas (aglutinao em lmina) ou proceder a sua identificao bioqumica,

complementada pela tipificao sorolgica quando necessrio. O meio de TSI fornece uma srie de reaes bioqumicas que do uma viso geral do metabolismo bacteriano. Por esse motivo, vamos apresentar esse meio e as transformaes que ocorrem. O TSI ou trplice acar e ferro um meio slido distribudo de tal sorte que apresenta uma base e uma inclinao. constitudo de glicose (0,1%), lactose (1,0%) e sacarose (1,0%), peptonas, aminocidos, incluindo sulfurados, tiossulfato de sdio e citrato frrico amoniacal (indicador da produo de H 2S), com pH neutro e um indicador de pH, o vermelho de fenol. O meio semeado com agulha por punctura na base e estrias na superfcie. Aps o crescimento da bactria pode-se observar os seguintes resultados: A bactria no fermenta qualquer dos acares, ficando inalterado o meio, ou at mesmo utiliza os aminoidos respirando-os com produo de aminas que alcalinizam o meio; fermenta somente a glicose de tal sorte que os cidos formados mudam o pH do meio apenas na base, que se torna amarela e a inclinao vermelha por utilizao dos aminocidos (por respirao), alcalinizando a mesma e neutralizando a pequena quantidade de cidos, pois a concentrao de glicose baixa - assim o resultado expresso como K/A (inclinao alcalina e base cida); fermenta a lactose ou a sacarose com viragem do indicador de todo o meio para amarelo, tanto a base como a inclinao permanecem cidas, pois os lcalis produzidos na inclinao so facilmente neutralizados pela grande quantidade de cidos produzidos na base, tendo em vista que a concentrao desses acares dez vezes maior que a da glicose - o resultado expresso como A/A (inclinao e base cidas). Nos dois ltimos casos, existe a possibilidade de detectar gases resultantes da degradao do cido frmico em hidrognio e anidrido carbnico, se a bactria possuir o sistema hidrognio frmico liase - os gases so indicados ou visualizados indiretamente por levantar ou fragmentar o meio - o resultado representado como A/A com gs. H tambm a possibilidade da bactria produzir H2S por respirar anaerobiamente o tiossulfato, captando eltrons atravs da tiossulfato redutase, resultando em gs sufdrico e sulfito. O sulfeto de hidrognio na presena de sais de ferro forma sulfeto ferroso, originando um precipitado negro insolvel - dessa forma o resultado dado como A/A com gs e H2S. Desse modo, pode-se observar num nico meio os processos fermentativos, respirao aerbia e anaerbia. A utilizao dos acares e aminocidos na inclinao se d apenas por respirao aerbia, enquanto que na base os processos so realizados por fermentao (incluindo tambm putrefao, quando da utilizao dos aminocidos bsicos, sulfurados, triptofano, com produo de gs sulfdrico, mercaptanas, aminas, dentre outras). J a utilizao do tiossulfato ocorre por respirao anaerbia, gerando tambm gs sulfdrico.