Ministério da Educação

Universidade Tecnológica Federal do Paraná

Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
Bioquímica de Microrganismos

Desaminação de aminoácidos/ Prova do indol - PRÁTICA 9

Maisa Moraes Gonçalves Ferreira

Valdielly Cristine Santos da Silva

Ponta Grossa
2023/2
 1. INTRODUÇÃO

O propósito da prova do indol é avaliar a habilidade do microrganismo em

degradar o aminoácido triptofano (presente em praticamente todas as proteínas) até o
indol. O triptofano é um aminoácido essencial suscetível à oxidação por certas
atividades enzimáticas bacterianas. A conversão do triptofano em produtos metabólicos
é mediada pela enzima triptofanase.

Visto que a capacidade de hidrolisar o triptofano com a produção de indol (que

não é utilizado e se acumula no meio) não é uma característica presente em todos os
microrganismos, isso serve como um marcador bioquímico. Alguns microrganismos não
metabolizam o triptofano, enquanto outros realizam a metabolização completa desse
aminoácido sem gerar indol.

O procedimento envolve o uso de um meio de cultura contendo o aminoácido

triptofano, como água peptonada, por exemplo. Após o crescimento, a pesquisa pela
presença de indol é conduzida adicionando o reagente de Kovac’s (de cor amarela) ao
longo das paredes do tubo, de modo que não se misture com o meio de cultura. Esse
reagente reage com o indol, produzindo um composto rosado.

As culturas que resultam em um anel avermelhado na superfície do meio após a

adição do reagente são consideradas indol positivas. A persistência da coloração
amarela do reagente indica que o substrato triptofano não foi hidrolisado em indol,
indicando uma reação negativa.
 2. OBJETIVOS

● Objetivos Principais:
→ Determinar a capacidade de um microrganismo em desaminar o triptofano.
→ Avaliar a presença de indol como resultado da desaminação do triptofano.

● Objetivos Secundários:
→ Compreender o papel do complexo enzimático triptofanase na desaminação do
triptofano pelas bactérias.
→ Demonstrar a detecção de indol no meio de cultura por meio da reação química
com o reagente de Kovacs.
→ Realizar a interpretação dos resultados da prova de desaminação do triptofano
com base na formação de anéis coloridos na superfície do meio de cultura líquido.
→ Verificar a variabilidade nos resultados quando há formação de um anel de
coloração alaranjada devido ao escatol, precursor do indol.
 3. MATERIAIS E MÉTODOS

● Materiais utilizados na prática:

→ Alça de inoculação;
→ Meios de cultura empregados no teste:
a. Para o preparo do inóculo: TSI, TSA ou NA;
b. Para a prova de desaminação do triptofano será utilizado o Caldo Triptona
1% e o reativo de Kovacs;
Caldo Triptona

Composição do Caldo Quantidade

Triptona 10,0 g

Cloreto de Sódio 5,0 g

Água destilada 1000 mL

121°C/10min - pH 7,3 / Fonte: SILVA et. al. (2010)

● Procedimentos indispensáveis
→ Higienizar bem as mãos com água e sabão
→ Limpar as bancadas com álcool 70% antes e depois do experimento
→ Uso de guarda-pó limpo, abotoado e de mangas longas
→ Cabelos longos devem estar presos
→ Retirar possíveis adornos

● Preparação do Caldo Triptona:

Para a preparação do Caldo Triptona, inicia-se dissolvendo os componentes da
formulação em água destilada, ajustando o pH para 7,3. Em seguida, distribui-se
aproximadamente 4-5mL em tubos, seguido pelo processo de esterilização a 121°C/10
min.
● Reativo de Kovacs - Produto Comercial:
Na execução da técnica, o procedimento começa com a preparação do inóculo da
linhagem a ser analisada em meio de cultura apropriado para provas bioquímicas, como
ágar Kligler Ferro (KIA), ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI), ágar Nutriente (NA), ou ágar
Tripticase de Soja (TSA). A reativação é realizada com 24 horas de antecedência em
35-37°C, ou conforme as condições específicas exigidas pelo microrganismo.
 → Tomar um inóculo leve das linhagens a serem testadas, utilizando a alça de
inoculação.
→ Preparar um tubo controle sem o microrganismo a ser testado.
→ Incubar os tubos em 35-37°C por 24-48 horas, com as tampas levemente
desrosqueadas.

O teste pode ser concluído em 24 ou 48 horas. Para isso, retira-se assepticamente

uma alíquota de 2 mL da cultura, adiciona-se 5 gotas do Reativo de Kovacs, agita-se
levemente e observa-se o resultado. Se o resultado for negativo em 24 horas, o tubo
com a cultura é reincubado e o teste é repetido em 48 horas.

● Etapas Finais:
Ao término da prática, procede-se à desinfecção da bancada de trabalho com
álcool 70%. Posteriormente, é necessário lavar as mãos.

● Interpretação dos Resultados:

A interpretação dos resultados baseia-se no desenvolvimento de um anel
vermelho-violeta na superfície do meio de cultura, indicando resultado positivo. A
persistência do anel na cor do Reativo de Kovacs (amarelado) sugere um resultado
negativo. Caso ocorra a formação de um anel de coloração alaranjada devido ao
escatol, precursor do indol, o resultado é considerado variável.
 4. RESULTADOS

Para apresentação dos resultados começamos mostrando os tubos de

controle e o tubo antes de colocarmos o reativo de kovacs.

Para que o resultado fosse positivo, um anel vermelho - violeta deveria

aparecer na superfície do meio de cultura. Quando colocado o reativo de kovacs foi
notada uma leve coloração amarela o que indicou um resultado negativo, não houve
formação de anel na coloração alaranjada que indicaria escatol que é precursor do
indol esse resultado é variável. Na imagem a seguir podemos notar esses
resultados descritos.
 5. DISCUSSÃO

Como objetivo principal tínhamos que determinar a capacidade do

microrganismo em desanimar o triptofano avaliando também a presença de indol. como
podemos ver pelos resultados descrito esse resultado foi negativo mostrando assim que
o microrganismo não foi eficiente na desaminação do triptofano e também não produziu
indol.
Dos objetivos secundários compreender o papel da triptofanase nessa
desaminação e demonstra a detecção de indol por meio do reagente kovacs. Com a
ausência do indol sugere se algumas possíveis falhas na expressão ou atividade da
triptofanase, poderíamos investigar fatores genéticos ou regulatórios para poder explicar
essa ausência.
Também não foi possível a interpretação dos resultados da prova baseada nos
anéis coloridos houve ausência desses anéis. A falta de detecção de escatol tambem
reforça a conclusão de que o microrganismo não demonstrou efetiva atividade na
desaminação do triptofano.
6. REFERÊNCIAS

PROVAS BIOQUÍMICAS. Disponível em: Testes bioquimicos BGN Aula 15 (1)

| Passei Direto. Acesso em: 05 de dez. 2023.
UFG: Aulas práticas de bacteriologia Humana. Bacteriologia Humana (ufg.br).
Disponível em: 05 de dez. 2023.
PROVA DO INDOL: Microbiologia Brasil. Disponível em:.::Microbiologia::.:..
Acesso em: 05 de dez. 2023.
Microbiologia Brasil. Prova do Indol (microbiologiabrasil.blogspot.com).
Acesso em: 05 de dez. 2023.
UFPR: Provas bioquímicas. Microsoft Word - Documento1 (ufpr.br). Acesso
em: 05 de dez. 2023.