CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIFACIMED

DISCIPLINA PATOLOGIA CLINICA

MICHAEL LEAL GONÇALVES

VALMIR DE SOUZA FILHO

TÉCNICA DE DETERMINAÇÃO DA FOSFATASE ALCALINA E

GAMAGLUTAMIL TRANSFERASE (GGT)

CACOAL-RO

2022
1. INTRODUÇÃO
A fosfatase alcalina é uma enzima encontrada em diversos tecidos do corpo, com
concentrações maiores no fígado e nos ossos. No fígado, existe principalmente nas
células que formam a parede dos ductos biliares, canais que conduzem a bile do
interior do fígado para o intestino, onde ela participa da digestão de lipídios. Nos
ossos, são produzidas pelos osteoblastos, células envolvidas na formação de tecido
ósseo novo, que refazem continuamente a estrutura dos ossos. As formas de
fosfatase alcalina produzidas nos diversos tecidos podem ser distinguidas no
laboratório e são chamadas isoenzimas.
Por que fazer este exame? Para investigar distúrbios hepáticos ou ósseos.
Quando fazer este exame? Quando há suspeita de distúrbios hepáticos ou ósseos.
Amostra: Uma amostra de sangue obtida de uma veia do braço.
É necessária alguma preparação? É recomendado jejum antes da colheita, mas não
é imprescindível.

2. GAMA-GLUTAMIL TRANSFERASE (GGT)

Esse teste mede o nível no sangue da gama-glutamil transferase (GGT),
uma enzima encontrada em muitos órgãos como rins, fígado, baço e pâncreas. A
principal fonte de GGT no sangue é o fígado. A GGT está aumentada na maioria das
doenças que provoquem dano agudo no fígado ou nos dutos biliares, mas não é útil
para distinguir entre as diferentes causas de lesão hepática. Por esse motivo, o uso
de GGT é controverso e as diretrizes.
Por que fazer este exame? Para diagnóstico diferencial entre doença hepática e
óssea como causa de elevação da fosfatase alcalina (ALP). Algumas vezes, como
auxiliar na detecção de doença hepática e/ou alcoolismo.
Quando fazer este exame? Em pacientes com sintomas de distúrbios hepáticos ou
no acompanhamento de quem tenha aumento nos níveis de ALP (fosfatase
alcalina).
Amostra: Amostra de sangue retirada de uma veia.
É necessária alguma preparação? Os níveis de GGT caem depois das refeições.
Portanto, é melhor colher a amostra após jejum de 8 horas.
3. TÉCNICA DE DETERMINAÇÃO DA FOSFATASE ALCALINA
3.1 Finalidade
O método para a determinação da Fosfatase Alcalina. Teste colorimétrico, somente
para uso diagnóstico in vitro.

3.2 Significado diagnóstico

A Fosfatase Alcalina está presente em altas concentrações nos ossos, fígado,
intestino e placenta. Constitui um útil indicador de doenças hepáticas e de doenças
ósseas associadas com hiperatividade osteoblástica. Condições em que a Fosfatase
Alcalina está aumentada: nas doenças hepáticas e do trato biliar, na metástase do
fígado e metástase óssea, na acromegalia, no hipertireoidismo, no raquitismo, na
mononucleose infecciosa, na doença de Paget (atividade osteoblástica) e no
crescimento ósseo fisiológico. Valores diminuídos da Fosfatase Alcalina podem ser
observados no hipotireoidismo, retardo de crescimento nas crianças, hipofosfatasia
(erro metabólico inato), desnutrição grave.

3.3 Princípio de ação metodologia: Roy Modificado

A Fosfatase Alcalina presente na amostra hidrolisa o Substrato de Timolftaleína
Monofosfato, liberando Timolftaleína e Fosfato Inorgânico, em um tempo pré-
determinado de 10 minutos. A atividade enzimática é proporcional à quantidade de
Timolftaleína formada, que é medida colorimetricamente. Com a adição do Reagente
de Cor, a reação enzimática é inativada e a Timolftaleína adquire cor azul. Como o
Substrato e o produto da reação apresentam cores diferentes, em meio alcalino, a
coloração final é constituída por uma mistura de cores.
Timolftaleína Monofosfato ALP Timolftaleína
------------->
+ H2 O Mg + + H3 PO4

3.3.1 Reagentes
Número 1 – Substrato: Conservar entre 15 e 30ºC. Após o manuseio conservar entre
2 e 8ºC em frasco bem vedado para evitar evaporação. O reagente pode apresentar
turvação ou precipitado, fato que não interfere na sua qualidade. Agitar antes de
usar. Contém: Timolftaleína Monofosfato 40 mmol/L, solubilizante e estabilizador.
Número 2 – Tampão: Conservar entre 15 e 30ºC. Após o uso, fechar o frasco para
evitar contaminação com CO2 do ar. Contém: Dietanolamina 0,3 mol/L pH 9,9,
Citrato de Sódio 10 mmol/L, surfactante e ativador.
Número 3 - Reagente de Cor: Conservar entre 15 e 30ºC. Contém: Carbonato de
Sódio 150 mmol/L e Hidróxido de Sódio 100 mmol/L.
Número 4 - Padrão 40 U/L: Conservar entre 15 e 30°C. Após o manuseio conservar
entre 2 e 8ºC em frasco bem vedado para evitar evaporação. Contém: Timolftaleína
0,4 mmol/L (40 U/L) e solubilizante.

3.3.2 Equipamentos e insumos operacionais

Espectrofotômetro ou colorímetro, banho-maria 37ºC, relógio ou cronômetro,
pipetas, tubos de ensaio, Biocontrol N e Biocontrol P Bioclin. Encontram-se no
mercado especializado de artigos para Laboratórios de Análises Clínicas.

3.3.3 Condições de armazenamento e transporte

A temperatura de armazenamento e transporte deverá ser de 15 a 30ºC. Manter ao
abrigo da luz e evitar umidade.

3.3.4 Cuidados especiais

1- Somente para uso diagnóstico in vitro profissional.
2- Seguir com rigor a metodologia proposta para obtenção de resultados exatos.
3- A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes
contaminantes.
4- Colunas deionizadoras saturadas liberam água alcalina, íons diversos e agentes
oxidantes e redutores, que podem alterar de forma significativa os resultados.
5- O nível de água no banho-maria deve ser superior ao nível dos reagentes nos
tubos de ensaio.
6- O Reagente Nº 3 deve ser manuseado com cuidado, pois apresenta ação
corrosiva.
7- Recomendamos aplicar as normas locais, estaduais e federais de proteção
ambiental para que o descarte dos reagentes e do material biológico seja feito de
acordo com a legislação vigente.
8- Não utilizar o produto em caso de danos na embalagem.
3.3.4 Amostras
Soro ou plasma (heparina) obtido livre de hemólise. O analito é estável 07 dias entre
2 e 8ºC e 30 dias a 10ºC negativos.

3.4 Descrição do processo

A Bioclin recomenda, para uso do kit, utilizar como soro controle os kits Biocontrol N
e P Bioclin. Marcar 3 tubos de ensaio com as letras B (Branco), P (Padrão), A
(Amostra) e proceder como a seguir:
Branco Padrão Amostra
Reagente N° 1 50 mL --------- 50 mL -------- 50 mL
Reagente N° 2 500 mL -------- 500 mL ------- 500 mL
Reagente N° 3 ------------- 50 mL ------------
Incubar a 37ºC por 2 minutos.

Branco Padrão Amostra

Amostra ------- ------- 50 mL
Homogeneizar e incubar a 37ºC por exatamente 10 minutos.

Reagente N° 3 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL

Homogeneizar bem e determinar a absorbância da Amostra e do Padrão em 578 nm
(570 - 590), acertando o zero com o Branco. A cor é estável por 60 minutos.

3.5 Cálculos
Fosfatase Alcalina = Absorbância da amostra x 40
(U/L) Absorbância do padrão
Como a reação de cor segue a lei de Lambert Beer, pode-se usar o Fator de
calibração:
Fator de calibração = Concentração padrão (40 U/L)
Absorbância do padrão
U/L = Absorbância da amostra x Fator de calibração
Os resultados serão expressos em U/L.
4 TÉCNICA DE DETERMINAÇÃO DA (GGT)
Método (Szasz modificado) para a determinação de γ-glutamil transferase (GGT) em
soro ou plasma.

4.1 Significado clínico

A GGT é uma enzima que participa na transferência de aminoácidos e peptídeos
através da membrana celular e possivelmente no metabolismo da glutationa. A GGT
é encontrada em maior concentração nas células hepáticas no trato biliar, rins, baço,
coração, intestino, cérebro e glândula prostática. O teste é mais sensível para
evidenciar a disfunção hepática, a colestase e monitorar a intoxicação
medicamentosa. Esta enzima é usada para diferenciar doença hepatocelular e
doença óssea. O uso de drogas como glicocorticóides aumentam consideravelmente
a GGT, o que não ocorre com anticonvulsivantes. Aumentos de GGT podem sugerir
pancreatite que provocara obstrução extra-hepática do ducto biliar.

4.2 Fundamento do método

A γ-glutamil transferase é uma carboxipeptidase que catalisa a seguinte reação:
L-γ-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida + glicilglicina
L-g-glutamilglicilglicina + 5-amino-2 nitrobenzoato

4.3 Reagentes fornecidos

Reagente A: solução de tampão Tris contendo glicilglicina.
Reagente B: solução de L-g-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida.
Concentrações finais tampão Tris..........................................................138 mmol/L;
pH 8,25 L-γ-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida.................................. 23 mmol/L
Reagentes não fornecidos Solução fisiológica (NaCl 9 g/L).
Reagente A: pronto para uso.
Reagentes Fornecidos: prontos para uso. Os reagentes podem ser usados
separadamente ou como Reagente único, misturando 4 partes de Reagente A com 1
parte de Reagente B (ex. 4 mL Reagente A + 1 mL Reagente B).

4.4 Precauções
Os reagentes são para uso diagnóstico in vitro veterinário. Utilizar os reagentes
observando as precauções habituais de trabalho no laboratório de análises clínicas.
Todos os reagentes e as amostras devem ser descartados conforme a regulação
local vigente.

4.4.1 Estabilidade e instruções de armazenamento

Reagentes Fornecidos: são estáveis sob refrigeração (2-8ºC) até a data de
vencimento indicada na embalagem.
Reagente único (pré-misturado): é estável por 4 semanas sob refrigeração (2-8ºC)
protegido da luz.

4.4.2 Indícios de instabilidade ou deterioração dos reagentes

Quando o espectrofotômetro for zerado com água destilada, leituras de absorbância
do Reagente único superiores a 1300 D.O. são indício de deterioração. Amostra
Soro ou plasma.
a) Coleta: deve ser realizada de forma habitual.
b) Aditivos: caso seja utilizado o plasma como amostra, recomenda-se, para sua
obtenção, o uso de EDTA como anticoagulante.
c) Estabilidade e instruções de armazenamento: a γ-GT no soro é estável por até 2
semanas sob refrigeração (2-8ºC), e até 6 meses congelada (-20ºC).

4.4.3 Interferências
Não são observadas interferências por bilirrubina até 28 mg/dL, triglicerídeos até 540
mg/dL e hemoglobina até 0,39 g/dL (390 mg/dL).

4.5 Material necessário

- Espectrofotômetro;
- Micropipetas e pipetas capazes de medir os volumes indicados;
- Cubetas espectrofotométricas de faces paralelas.
- Banho-maria à temperatura indicada no procedimento e,
- Cronômetro.

4.6 Condições da reação

- Comprimento de onda: 405 nm
- Temperatura de reação: 37ºC
- Tempo de Reação: 3 minutos.
- Volume de amostra: 100 µL
- Volume do Reagente único: 1,1 mL

4.7 Procedimento
Em uma cubeta mantida a 37ºC, colocar: Reagente único 1,0 mL Pré-incubar por 3 a
4 minutos. Adicionar a seguir: Amostra 100 µL. Misturar imediatamente e disparar
simultaneamente o cronômetro. Ler a absorbância nos tempos 1, 2 e 3 minutos.
Determinar a diferença média de absorbância (ΔA/min) subtraindo cada leitura da
anterior e calculando a média dos valores. Utilizar este valor para os cálculos.

4.8 Cálculo dos resultados

γ-glutamil transferase (U/L) = ΔA/min x 1,158

4.9 Método de controle de qualidade

Processar 2 níveis de um material de controle de qualidade (Laborcontrol Vet 1 e 2)
com atividades conhecidas de γ-GT, com cada determinação. [γ-GT calibrador]
ΔA/min calibrador 117 U/L 0,100 γ-GT 895212400/00 pág. 2 de 2 γ-Glutamil
Transferase (GGT).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1 - COLEMAN, C. M.; STROJE, R. C.: Clin. Chem. Acta 13: 401, 1966.

2 - ROY, A. V.: Clin. Chem. 16:431, 1970.

3 - ZAK, B.: Clin Chim. Acta 3: 328, 1958.

4 - BRITTENHAM, G.: Clin Chim. Acta. 91: 203, 1979

5 - TONKS, D. B.: Chim. Acta 2: 393, 1983.

6 - CARL, A. B. and EDWARD, R. A.: Tietz Textbook of Clinical Chem 2nd ed., 1994,
1942-1943.