UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA

Prof. Ermeton Duarte do Nascimento

Disciplina: Introdução ao Laboratório Clínico I
Discente: Flávio Maurílio dos Santos Lima.

AULA PRÁTICA: Dosagem de colesterol total e frações e Dosagem de triglicerídeos.

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA – DIA 24/09/2018

Dosagem de colesterol total. Metodologia: Enzimático – Trinder - Esterase-Oxidade (Reação

em Ponto Final); Fundamento: A determinação da concentração do colesterol total se baseia na
hidrólise dos ésteres de colesterol presentes nas lipoproteínas por esterases, o que promove a liberação
de colesterol livre, que é oxidado liberando peróxido de hidrogênio. Este reage com a 4-aminoantipirina
e fenol, através da ação da enzima peroxidase, formando antipirilquinonimina que é proporcional à
concentração do colesterol na amostra analisada. Descrição da técnica: Em 02 tubos de ensaio foi
pipetado 1,0 mL do Reagente 1 do Kit Colesterol Labtest ref.76 em cada tubo. Um deles para o Branco e
o outro para o Teste (o padrão já havia sido previamente deterninado). Em seguida, pipetou-se 0,01 mL
ou 10 uL do soro da amostra de uma paciente misturando com o reagente no tubo Teste. Após
homogeinização, os tubos foram colocados em banho-maria a 37 ºC por 10 minutos para na sequência
serem lidos no fotocolorímetro a 505 nm. Resultados: Branco Abs = 0,081 / Teste [ ] = 207 mg/dL.
Dosagem um pouco acima dos valores de referência.
Dosagem de colesterol HDL. Metodologia: Precipitação com ácido fosfotungstico e cloreto de
magnésio e posterior leitura em reação enzimática de ponto final (vide dosagem de colesterol total);
Fundamento: O isolamento da HDL é baseado na seletividade dos íons fosfotungstato e magnésio que
atuam precipitando todas as outras lipoproteínas de menor densidade (VLDL, LDL) exceto a fração HDL.
Após centrifugação, a HDL colesterol contida no sobrenadante é determinada pelo mesmo método
usado para o colesterol total. Descrição da técnica: Em um tubo de ensaio foi adicionado 0,25 mL (250
uL) do precipitante e 0,25mL (250uL) da amostra de soro. Na sequência a mistura foi agitada
vigorosamente em vortex durante 30 segundos. Após isso, centrifugamos a 3.500 rpm por 15 minutos
para obter o sobrenadante. Finalmente, após centrifugação pipetamos 0,1 mL (100uL) do sobrenadante
e o adcionamos em outro tubo contendo 1,0 mL do reagente colesterol total (ref.76 labtest) seguindo a
partir daí o mesmo procedimento (incubação 10 min. A 37 ºC e leitura no bioplus) para dosar o colesterol
HDL. Resultados: Branco Abs = 0,034 / Teste HDL [ ] = 78 mg/dL. Esse resultado se enquandra na
categoria “desejável” quando comparado aos valores de referência. O valor das outras lipoproteínas
foram obtidos através do cálculo de FriedWald. VLDL [ ] = Triglicérideos ÷ 5 → 225 ÷ 5 = 45 mg/dL; Já
o LDL [ ] = Colesterol total – (HDL + VLDL) → 207 – (78 + 45) = 84 mg/dL.
Dosagem de Triglicerídeos. Metodologia: Reação Enzimática Trinder – oxidase com leitura em
ponto final. Fundamento: Baseia-se na hidrólise dos triglicerídeos por lipases, o que promove a
liberação de glicerol, que é fosforilado através da enzima glicerolquinase. O produto, glicerol-3-fosfato, é
oxidado a dihidroxiacetona e peróxido de hidrogênio pela enzima glicerol-3-fosfato oxidase. O peróxido
de hidrogênio reage com a 4-aminoantipirina e 4-clorofenol, por meio da peroxidase, formando a
quinoneimina que é o composto que absorve luz no comprimento de onda entre 500-550 nm e sua
quantidade é proporcional à concentração de triglicerídeos na amostra analisada. Descrição da técnica:
em dois tubos de ensaio foram colocados 1,0 mL do reagente de trabalho (ref.87 labtest). Um para o
branco e outro para o teste. O padrão foi previamente determinado. No tubo para o Teste adicionamos
0,01 mL (10 uL) da amostra de soro, homogeineizamos e em seguida incubamos a 37 ºC por 10
minutos. Posteriormente, foi feita a leitura no fotocolorímetro a 505 nm. Resultados: Branco Abs = 0,079
/ Triglicérideos [ ] = 225 mg/dL. Resultado considerado elevado de acordo com os valores de referência.
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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA

Prof. Ermeton Duarte do Nascimento

Disciplina: Introdução ao Laboratório Clínico I
Discente: Flávio Maurílio dos Santos Lima.

AULA PRÁTICA: Dosagem de glicose e hemoglobina glicada.

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA – DIA 01/10/2018

Dosagem de glicose. Metodologia: Reação Enzimática Colorimétrica – Trinder - Glicose-

Oxidade/Peroxidase – GOD/POD (com leitura em Ponto Final); Fundamento: Esse método consiste em
uma reação de duas etapas. A glicose (soro/plasma) é convertida em ácido glicônico e peróxido de
hidrogênio na presença de glicose oxidase e oxigênio. Na segunda parte da reação, na presença da
enzima peroxidase e de 4-Aminoantipirina+fenol, o H2O2 é convertido em água e o cromógeno
(antipirilquinonimina vermelha) cuja intensidade de cor é proporcional à concentração da glicose na
amostra analisada e pode ser medida por fotometria a 505 nm. Descrição da técnica: Em 02 tubos de
ensaio foi pipetado 1,0 mL do Reagente 1 do Kit Glicose Liquiform Labtest ref.133 em cada tubo. Um
deles para o Branco e o outro para o Teste (o padrão já havia sido previamente deterninado). Na
sequência, pipetou-se 0,01 mL ou 10 uL do soro da amostra de uma paciente misturando com o
reagente de trabalho no tubo Teste. Após homogeneização, ambos os tubos foram colocadas em
banho-maria a 37 ºC por 10 minutos para na sequência serem lidos no fotocolorímetro. Resultados:
Branco Abs = 0,346 / Teste Abs = 0,295; [ ] = 83 mg/dL. De acordo com os valores de referência a
glicemia dessa amostra é considerada normal.
Dosagem de Hemoglobina glicada. Metodologia: Cromatografia de Troca Iônica com leitura de
ponto final. Fundamento: O sangue total é hemolisado e a fração lábil é eliminada. O hemolisado é
então cromatografado em uma resina de troca catiônica em que as hemoglobinas são retidas e somente
a HbA1 é eluida de forma específica. A porcentagem da fração HbA1 em relação à hemoglobina total é
determinada por espectrofotometria em 415 nm. Descrição da técnica: Inicialmente foi preparado o
hemolisado pipetando-se em um tubo de ensaio 0,5 mL do reagente lisante (fornecido pelo kit Laborclin)
com 0,1 ml de sangue total, homogeneizando e aguardando 05 minutos até a hemólise completa. Na
sequência determinamos a absorbância da Hemoglobina Total (HbT): adicionando 0,02mL (20 uL) do
hemolisado a 5 mL de água destilada homogeneizando por mais 5 minutos. Esgotado esse tempo
calibramos o zero do equipamento com água destilada e determinamos então a absorbância da HbT.
Em seguida, procedemos com a extração da HbA1 pipetando 0,1 mL (100uL) do hemolisado em um
tubo de resina do kit, homogeneizando por outros 05 minutos. Depois, fizemos a separação da resina
com o separador (kit Laborclin) pressionando cuidadosamente contra a coluna de líquido compactando a
resina (cerca de 2/3) no tubo e extraindo o sobrenadante, acertando o branco com água destilada. Por
fim, medimos a absorbância do deste sobrenadante no bioplus a 405 nm. O Fator (Fc) foi obtido
previamente com o uso do padrão. Resultados: HbT Abs = 0,425; HbA1 Abs = 0,661; Fator = 3,75.
Então o resultado percentual da HbA1 foi determinado de acordo com o seguinte cálculo: HbA1% = (Abs
HbA1 teste/Abs HbT teste) x Fc → HbA1% = (0,661/0,425) x 3,75 = 5,83%. O valor encontrado para a
amostra corresponde à classificação de paciente não diabético de acordo com os valores de referência
estabelecidos no kit da Laborclin.
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CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA

Prof. Ermeton Duarte do Nascimento

Disciplina: Introdução ao Laboratório Clínico I
Discente: Flávio Maurílio dos Santos Lima.

AULA PRÁTICA: Dosagens de ácido úrico, ureia e creatinina.

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA – DIA 10/10/2018

Dosagem de Ácido úrico. Metodologia: Reação Enzimática – Uricase Colorimétrico com leitura em
Ponto Final. Fundamento: Para a determinação da concentração de ácido úrico no soro/plasma sanguíneo,
utiliza-se a oxidação do mesmo a alantoína, pela enzima uricase, com formação de peróxido de hidrogênio.
Este reage com a 4-aminoantipirina, e o 3,5-dicloro-2hidroxibenzenosulfonato (DHBS), através da ação da
enzima peroxidase, formando a Antipirilquinonimina que é o composto que absorve luz no comprimento de
onda entre 500 – 550 nm. A quantidade desse composto formado é proporcional à concentração de ácido
úrico na amostra analisada. Descrição da técnica: O primeiro passo é preparar o RT (Reagente de
Trabalho) na proporção de 01 parte do reagente R1 com 04 partes do R2 (fornecidos pelo kit Labtest
ref.140). O RT foi previamente preparado pela técnica do laboratório. Em 02 tubos de ensaio pipetamos 1,0
mL do RT sendo um deles para o Branco e o outro para o Teste (o padrão também já havia sido previamente
deterninado). Em seguida, adicionamos 0,02 mL ou 20 uL do soro da amostra nº 14 (sexo ♀) no tubo teste e
homogeneizamos antes de coloca-los no banho-maria a 37ºC por 5 minutos. Por fim, determinamos a
absorbância do teste, zerando o equipamento com o branco, em 505 nm no fotocolorímetro. Resultados:
Branco Abs = 0,008 / Teste Abs = 0,100; Teste [ ] = 3,8 mg/dL. O valor obtido se encontra dentro do intervalo
normal de referência para mulher adulta de acordo com o kit Labtest.
Dosagem de Ureia. Metodologia: Reação Cinética de tempo fixo – Urease UV. Fundamento: A
determinação da ureia é baseada em sua hidrólise pela urease, o que promove a liberação de CO2 e amônia.
Esta, em meio alcalino, reage com o 2-cetoglutarato e NADH catalisada pela glutamato desidrogenase
(GLDH), oxidando o NADH a NAD. A consequente redução da absorbância é medida em 340 nm por
espectofotometria e sua quantidade é proporcional â concentração da ureia na amostra analisada. Descrição
da técnica: Inicialmente foi preparado o RT (Reagente de Trabalho) misturando-se 04 partes do Reagente 1
com 01 parte do Reagente 2 (kit Bioclin ref. K056). O RT já havia sido previamente preparado pela técnica do
laboratório, bem como a calibração do aparelho com o padrão do kit. Na sequência, em um tubo de ensaio foi
adicionado 1,0 mL do RT juntamente com 0,01 mL (10 uL) da amostra nº 14 do paciente, homogeneizado e
feita a aspiração imediata no bioplus para leitura das absorbâncias entre os dois tempos (delta) que foram
utilizados para obtenção dos resultados. Resultados: Branco Abs = 1,549 / Teste Abs = 1.541; Teste [ ] = 54
mg/dL. Esse resultado se está um pouco acima dos valores normais de referência de acordo com o kit
Bioclin.
Dosagem de Creatinina. Metodologia: Reação de Jaffé – Reação Cinética de 2 pontos. Picrato sem
precipitação. Fundamento: A creatinina do soro/plasma reage com o picrato alcalino formando um complexo
de cor vermelha (picrato de creatinina) que é lido por espectrofotometria no intervalo de 500 – 540 nm.
Descrição da técnica: Inicialmente é feito o Reagente de Trabalho (RT) Picrato Alcalino misturando 04
volumes de NaOH (Reag. 1) com 01 volume de Ácido Pícrico (Reag.2) ambos fornecidos pelo kit Labtest
ref.96 creatinina K). Esta etapa foi preparada previamente pela técinca do laboratório, assim como a
determinação do padrão. Na sequência, em dois tubos de ensaio foram colocados 1,0 mL do Picrato Alcalino.
Um para o branco e outro para o teste. No tubo para o Teste adicionamos 0,1 mL (100 uL) da amostra de
soro, homogeneizamos e imediatamente aspirando no fotocolorímetro (505 nm) para leitura das
absorbâncias. Resultados: Branco Picrato Alcalino Abs = 0,073; Teste Abs1 = 0,798; Teste Abs2 = 0,780; [ ]
Teste = 0. Diante deste resultado realizamos a diluição* da amostra na proporção de 1:10 e repetimos a
leitura obtendo os seguintes resultados: Teste Abs1* = 0,142; Teste Abs2* = 0,141; [ ] Teste* = 0.
Persistindo esse resultado estudamos as instruções do kit onde observamos que alguns outros metabólitos
podem interferir negativamente a dosagem de creatinina, como é o caso da bilirrubina quando acima de 5
mg/dL. E a dosagem de bilirrubina total da amostra analisa apontou valores de 37 mg/dL e direta de 24,8
mg/dL. A partir daí inferimos que a dosagem foi comprometida pela hiperbilirrubenemia na amostra.