Apostila de Aulas Práticas de Bioquímica de Microrganismos

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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ

CAMPUS PONTA GROSSA
DEPARTAMENTO ACADÊMICO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSO E
BIOTECNOLOGIA
LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS
BIOQUÍMICA DE MICRORGANISMOS – BP34G
Profª Drª Maria Carolina de Oliveira Ribeiro
2023
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SUMÁRIO
INTRODUÇÃO –
AULA 1. Teste de oxidação-fermentação da glicose (dextrose)

AULA 2. Teste de fermentação de carboidratos
AULA 3. Teste de Vermelho de Metila (VM)
AULA 4. Prova do Citrato e Prova da Catalase
AULA 5. Prova da urease e gelatinase
AULA 6. Prova da amilase
AULA 7. Prova de enzimas lipolíticas
AULA 8. Descarboxilação de aminoácidos
AULA 9. Desaminação de aminoácidos/ Prova do indol
AULA 10. Desaminação da fenilalanina
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INTRODUÇÃO
As aulas práticas de bioquímica de microrganismos, têm como objetivo ensinar ao estudante os

princípios e métodos empregados no estudo das características metabólicas de microrganismos provenientes de
pesquisa de novas linhagens e em testes confirmativos para diversos seguimentos em que a microbiologia está
presente. Nessas aulas trabalharemos com uma variedade de microrganismos sendo algumas comensais e outras
patogênicas para o homem, animais e plantas. Portanto, é essencial seguir as normas de higiene pessoal e
segurança estabelecidas para um laboratório de microbiologia para que o trabalho seja eficiente sem oferecer
riscos.
REGRAS DE OURO DE HIGIENE PESSOAL PARA TRABALHAR NO LABORATÓRIO DE

MICROBIOLOGIA
1. Usar guarda-pó limpo, totalmente abotoado e de mangas compridas;

2. Cabelos compridos devem ser mantidos presos durante a permanência no laboratório;
3. Manter as unhas sempre curtas para o trabalho no laboratório;
4. Durante o trabalho no laboratório de microbiologia é proibido o uso de quaisquer adornos nas mãos e
braços;
NORMAS DE SEGURANÇA PARA TRABALHAR NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
1. NÃO FAZER BRINCADEIRAS NO LABORATÓRIO

2. Todo e qualquer material no laboratório deve conter identificação.
3. Lavar as mãos sempre no início e ao final das práticas, ao sair do laboratório e sempre que suspeitar de
contaminação.
4. Caso possua algum ferimento ou irritação nas mãos, usar luvas apropriadas para o trabalho no
laboratório.
5. Em caso de alergias ou problemas respiratórios, usar máscara para trabalhar com fungos filamentosos.
6. É expressamente proibido comer, fumar, manipular lentes de contato ou usar cosméticos no laboratório.
Se a bancada, equipamentos ou instrumentos tiverem sido contaminados acidentalmente com qualquer
microrganismo, estas ações podem ocasionar uma auto contaminação.
7. Desinfetar a bancada de trabalho no início e término de cada aula prática. Para essa finalidade, utiliza-
se álcool 70ºGL. Com este procedimento, os microrganismos que poderiam contaminar as culturas na
área de trabalho são removidos.
8. Cuidado ao acender e fechar o bico de Bunsen, fazer da forma correta. Verificar se não existem
substâncias inflamáveis por perto.
9. Flambar alças, agulhas e pinças antes e após o uso.
10. Não colocar materiais contaminados (pipetas, lâminas etc.) sobre a bancada. Estes materiais devem ser
colocados em recipientes apropriados que serão dispostos em cada bancada.
11. Seguir as normas de uso dos equipamentos.
12. Avisar ao professor em caso de contaminação acidental.
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AULA PRÁTICA N° 01 – Data:____/____/____
ASSUNTO
Teste de oxidação-fermentação da glicose (dextrose)
OBJETIVOS
 Observar se a bactéria possui a capacidade de catabolizar carboidratos;
 Verificar o tipo de metabolismo de carboidratos utilizado pela bactéria;
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
A utilização de carboidratos no metabolismo de produção de energia das bactérias pode ocorrer por dois
processos, o oxidativo (respiração celular) e fermentativo. O metabolismo oxidativo é um processo aeróbio para
a maioria das bactérias, O2 como aceptor final de elétrons, embora algumas espécies sejam capazes de crescer
substituindo o O2 por compostos inorgânicos como o nitrato e o sulfato (ex. microrganismos responsáveis pelos
ciclos do nitrogênio e enxofre), nestes casos o metabolismo oxidativo é chamado de respiração anaeróbia. O
metabolismo fermentativo é um processo anaeróbio e não depende da disponibilidade de oxigênio, conforme
Figura 1.
Figura 1. Visão geral da respiração e da fermentação

FONTE: TORTORA, FUNKE, CASE (2017)
As bactérias com metabolismo oxidativo são dependentes do oxigênio como aceptor final de elétrons
na cadeia respiratória, são consideradas aeróbias estritas. Já as bactérias que utilizam tanto o metabolismo
oxidativo quanto o fermentativo, são denominadas de anaeróbias facultativas.
O carboidrato normalmente adicionado aos meios teste de oxidação-fermentação é a glicose, por ser o
mais utilizado pelas bactérias no metabolismo oxidativo, fermentativo ou ambos. Este açúcar possui passagem
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livre pela membrana plasmática, enquanto outros carboidratos necessitam de um sistema enzimático específico
de transporte ativo para vencer a barreira da membrana.
No metabolismo oxidativo das bactérias aeróbias estritas, a glicose ou outro carboidrato é oxidada em
uma sequência de reações e ao final se obtém CO2, H2O e uma grande quantidade de energia (ATP). No
metabolismo fermentativo, a glicose também é oxidada para produzir energia, porém, não há participação do
oxigênio, a quantidade de energia obtida por molécula de glicose é menor e os produtos do processo variam em
função da espécie bacteriana e das condições ambientais.
Figura 2. Produtos de várias fermentações microbianas

Fonte: TORTORA (2017)
ROTEIRO DA PRÁTICA
Etapas iniciais
- Lavar as mãos;
- Desinfecção das bancadas de trabalho com álcool 70% antes do início da aula;
- Fazer a desinfecção das mãos antes do trabalho prático;
Materiais necessários
- 2 tubos para cada linhagem a ser testada com o meio empregado no teste (verificar o Gram), sem ser inclinado;
- Vaselina líquida ou óleo mineral estéril para selar a superfície do tubo (1-2mL/tubo);
-Agulha de inoculação estéril;
- Meios de cultura empregados no teste:
a. Meio de oxidação fermentação com 1% de glicose (OF) para bactérias Gram negativas;
b. Meio de oxidação fermentação com 1% de glicose (STAPH OF) para Staphylococcus, Micrococcus
e outras bactérias Gram positivas;
Meio de oxidação-fermentação para Gram negativos (OF)

Composição base Quantidade (g)
Triptona 2,0
NaCl 5,0
K2HPO4 0,3
Azul de bromotimol (solução 0,2%) 40 mL da solução
Ágar bacteriológico 20,0
Água destilada 1000 mL
Corrigir pH 6,8 – 121ºC/15min
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Preparação: preparar o meio base e esterilizar a 121ºC/15 min, em porções de 100mL. Separadamente, preparar
uma solução 10% (p/v) de glicose ou outro carboidrato a ser testado e esterilizar por filtração (45 µm). Resfriar
o meio base aproximadamente 46-50ºC e adicionar assepticamente, a cada 100mL de base, 10mL da solução
do carboidrato, para obter concentração final de 1%. Distribuir assepticamente em tubos estéreis (5mL/tubo).
Resfriar sem inclinar.
Solução de Azul de Bromotimol: verificar preparo correto da solução.
Meio de oxidação-fermentação para Gram positivos (STAPH OF)
Composição base Quantidade (g)

Triptona 10,0
Extrato de levedura 1,0
Púrpura de Bromocresol (solução 1%) 0,001 – 0,1mL da solução
Ágar bacteriológico 20,0
Preparação: idem ao anterior

Solução de Púrpura de Bromocresol: Dissolve-se 1,0 g de púrpura de bromocresol em álcool e dilui-se com
água destilada até 100 mL.
Execução da técnica
- Preparar o inóculo com a linhagem a ser analisada em meio de cultura apropriado para provas bioquímicas
(ágar Kligler Ferro - KIA, ágar Tríplice Açúcar Ferro - TSI, ágar Nutriente – NA, ágar Tripticase de Soja –
TSA) sendo realizado uma reativação com 24 horas de antecedência em 35-37ºC (maioria das bactérias) ou
condições específicas quando o microrganismo exigir;
- Tomar inóculo leve da linhagem a ser testada, usando agulha de inoculação, e inocular por picada dois tubos
do meio de cultura definido (OF ou STAPH OF), sem atingir o fundo do tubo;
-Após a inoculação selar a superfície de um dos tubos com uma cada de vaselina líquida ou óleo mineral estéril
(difusão do O2 é retardada pelo selo formado, crescimento anaeróbio) e deixar o outro tubo aberto para gerar
crescimento aeróbio;
-Incubar os tubos a 35-37ºC/48 h, porém dependendo do microrganismo pode durar até 14 dias. Observar
periodicamente os resultados.
Etapas finais
-Realizar a desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70% ao término da aula;
-Lavar as mãos ao final do trabalho;
Interpretação dos resultados

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Quadro 1. Interpretação da prova de oxidação-fermentação da glicose
FONTE: VERMELHO (2019)
Anotações dos resultados (não esqueça de registrar as imagens para incluir no relatório)
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ASSUNTO
Teste de fermentação de carboidratos
OBJETIVOS
 Observar se a bactéria possui a capacidade de fermentar um determinado carboidrato;
 Verificar se ocorre produção de ácido e gás;
A fermentação é um processo metabólico no qual o aceptor final do elétron é uma molécula orgânica.
A fermentação da glicose começa tipicamente com a produção de ácido pirúvico pela via glicolítica. Algumas
bactérias podem usar, simultaneamente com a glicólise, uma rota alternativa denominada de via da pentose-
fosfato como exemplo do Bacillus subtilis, Escherichia coli, Leuconostoc mesenteroides e Enterococcus
faecalis. Outras bactérias têm as enzimas necessárias para a via Entner-Doudoroff e podem metabolizar a glicose
sem a glicólise ou a via da pentose-fosfato, algumas cepas Gram-negativas como Rhizobium, Pseudomonas e
Agrobacterium utilizam essa rota. Entretanto, em ambas as vias também ocorre a produção de ácido pirúvico.
Vários produtos da fermentação podem ser produzidos a partir do ácido pirúvico, incluindo uma
variedade de ácidos, gases como H2 ou CO2 e álcoois, sendo que os produtos dependem exatamente do
organismo e do substrato fermentado (Figura 2 – Aula 1).
A utilização de um ou outro carboidrato depende da disponibilidade, pelas bactérias, do aparato
metabólico envolvido na introdução do carboidrato na célula e sua utilização num processo fermentativo, como
fonte de carbono e energia.
Os carboidratos frequentemente testados incluem adonitol, arabinose, glicose, frutose, inositol, lactose,
melibiose, raminose, sorbitol e sacarose.
ROTEIRO DA PRÁTICA
Etapas iniciais
- Lavar as mãos;
- Fazer a desinfecção das mãos antes do trabalho prático;
- 1 tubo do caldo base suplementado para cada carboidrato a ser testado e para cada linhagem a ser avaliada;
-Alça de inoculação estéril;
c. Para preparo do inóculo: TSI, TSA ou NA;
d. Caldo vermelho de fenol suplementado com os carboidratos: frutose, glicose, xilose, sacarose,
lactose;
Caldo Vermelho de Fenol
Composição do caldo base Quantidade
Proteose peptona (peptona de carne) 10,0g
Extrato de carne (opcional) 1,0g
NaCl 5,0g
Sol.de vermelho de fenol 0,2% 9mL
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Preparação
Solução de vermelho de fenol 0,2% - dissolver 0,1g de vermelho de fenol em 4mL de NaOH 0,1N e completar
o volume para 50mL com água destilada.
Caldo base: dissolver os ingredientes do caldo base, acertar o pH em 7,4, distribuir em tubos de 10x100mm já
com tubinhos de Durhan invertidos o volume de 4mL/tubo, esterilizar a 121ºC/15min. Preparar separadamente
e esterilizar por filtração (0,45 ou 0,22µm) uma solução aquosa a 10% (p/v) do carboidrato a ser testado.
Adicionar assepticamente aos tubos estéreis com caldo base, o volume de 0,4mL da solução do carboidrato em
4mL de caldo base o que resulta na concentração final de 1% do carboidrato.
Se o carboidrato for o dulcitol, usa-se a concentração final de 0,5% (0,2mL sol. carboidrato/4mL de caldo base).
- Tomar inóculo pesado da linhagem a ser testada, usando alça de inoculação, e inocular os tubos com caldo
Vermelho de Fenol suplementado com o carboidrato a ser testado;
-Fazer um tubo controle com o caldo suplementado sem o microrganismo;
-Incubar os tubos a 35-37ºC/24-48h e observar os resultados.
Etapas finais
Quadro 2. Interpretação do teste de utilização de carboidrato em caldo vermelho de fenol.

Tubo A: tubo controle não inoculado;
Tubo B: açúcar negativo/gás positivo (a seta
mostra a presença de bolha dentro do tubo de
Durham);
Tubo C: açúcar negativo/gás negativo;
Tubo D: açúcar positivo/gás negativo
(observar a turbidez do tubo, o que indica
crescimento, com mudança de cor para o
amarelo, embora não exista e/ou formação de
gás)
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ASSUNTO
Teste de Vermelho de Metila (VM)
OBJETIVOS
 Verificar se o tipo de metabolismo fermentativo da bactéria é do tipo ácido misto;
Esta prova bioquímica demonstra a habilidade de um microrganismo em produzir ácidos orgânicos

relativamente estáveis pela fermentação da glicose, de modo a suplantar a capacidade tampão existente no meio
de cultivo (RIBEIRO; STELATO, 2011).
Segundo Da Silva (1996), a fermentação da glicose pelas bactérias pode resultar em diferentes produtos
de fermentação, sendo o tipo de metabolismo fermentativo uma característica das espécies. Na fermentação
ácido mista, o produto é uma mistura de ácidos que reduzem o pH do meio para menos de 4,5, conforme
apresenta a Figura 3.
Figura 3. Fermentação ácido-mista. Como produtos desse tipo de fermentação, estão listados os originados em
maior quantidade, lembrando que a maior parte do ácido fórmico é convertida nos gases H2 e CO2.
Fonte: VERMELHO (2019)
Essa redução acentuada do pH, que supera a capacidade tamponante do tampão fosfato presente, pode
ser detectada adicionando-se à cultura algumas gotas da solução de vermelho de metila, um indicador de pH
com ponto de viragem abaixo de 4,5. Em razão de muitos microrganismos produzirem ácidos em um período
de 18 a 24 horas, mas continuarem a catabolizá-los até compostos mais neutros, este teste deve ser lido após um
tempo de incubação de cerca de 2 a 5 dias para que se assegure a presença de ácidos estáveis.
Os principais gêneros que realizam esta fermentação são: Escherichia sp.; Salmonella sp.; Shigella sp.
e Proteus sp.
ROTEIRO DA PRÁTICA
Etapas iniciais
- Lavar as mãos;
- Fazer a higienização das mãos antes do trabalho prático;
- Alça de inoculação estéril;
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- 5 ponteiras de 1000µL estéreis (no momento da leitura do resultado);

- 2 tubos de ensaio com ou sem tampa (no momento da leitura do resultado);
a. Para preparo do inóculo: TSI, TSA ou NA;
b. Para a prova bioquímica será utilizado o caldo VM-VP e solução hidroalcóolica de vermelho de
metila;
Caldo VM-VP
Composição do caldo Quantidade g
Peptona 7,0g
Glicose 5,0g
Fosfato dipotássico (K2HPO4) 5,0g
FONTE: DA SILVA et. al. (2010)
Solução hidroalcóolica de Vermelho de Metila

Composição Quantidade
Vermelho de metila 0,1g
Etanol 95% 300mL
Água destilada Completar para 500mL
Preparação
Caldo VM-VP: dissolver os componentes da formulação em água destilada, corrigir o pH em 6,9 e distribuir
em tubos (5mL/tubo) e esterilizar a 121°C/15 min.
Solução de Vermelho de Metila: dissolver o vermelho de metila no etanol e completar o volume para 500mL
com água destilada. Estocar em frasco âmbar preferencialmente com conta-gotas, sob refrigeração.
Observação: Para finalizar esta técnica, no momento da leitura dos resultados, será necessário um tubo de ensaio
(com ou sem tampa não estéril) e ponteiras de 1000µL estéreis.
- Tomar inóculo leve da linhagem a ser testada, usando alça de inoculação, e inocular os tubos com caldo VM-
VP;
-Fazer um tubo controle com o caldo sem o microrganismo;
-Incubar os tubos a 35-37ºC/96h ou 30°C/72-120h com as tampas ligeiramente desrosqueadas. Para a realização
do teste, adicionar a uma alíquota de 2,5mL da cultura, 5 gotas da solução de vermelho de metila.
Etapas finais
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Após o período de incubação e adição do indicador vermelho de metila aos tubos, o que ficar vermelho
estará com pH inferior a 4,4, sendo, portanto, uma demonstração de positividade do teste VM (+), desta forma
se considera que o microrganismo fermentou a glicose produzindo ácidos e dando um pH final muito baixo
capaz de vencer o sistema tampão do fosfato e mantendo o meio ácido. Em valores de pH superiores a 6,0 a
solução irá se tornar amarela, sendo indicativo de um resultado negativo o que significa que o microrganismo
produz ácido, porém o pH é mais elevado porque eles continuam metabolizando os produtos iniciais da
fermentação por descarboxilação, produzindo acetoína. Uma coloração alaranjada não é considerada resultado
positivo, indicando que uma incubação por tempos mais prolongados pode ser necessária.
Quadro 3. Interpretação do teste de vermelho de metila
Tubo A: resultado negativo;

Tubo B: resultado positivo.
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ASSUNTO
Prova do Citrato e Prova da Catalase
OBJETIVOS
 Determinar se um microrganismo é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono no seu
crescimento;
 Verificar se o microrganismo é capaz de produzir a enzima catalase;
Prova do Citrato
Neste teste serão observadas as bactérias que metabolizam o substrato citrato pelo ciclo de Krebs
(oxidação) ou pelo ciclo de fermentação, resultando como produto final pH alcalino, acetato+formato (DA
SILVA, 1996).
Segundo Vermelho (2019) em algumas bactérias a energia pode ser gerada pela utilização do citrato
como única fonte de carbono. Se nos reportarmos ao ciclo dos ácidos tricarboxílicos, observamos que o citrato
é uma molécula orgânica produzida pela combinação de acetil-CoA e oxaloacetato, fazendo com que, desta
forma, a molécula de acetil-CoA possa entrar no ciclo. Sendo assim, o citrato pode e serve como uma molécula
doadora de energia, que pode ser utilizada pelas bactérias produtoras da enzima citrase, por exemplo,
Enterobacter aerogenes e Salmonella typhimurium. Vale ressaltar que a utilização do citrato como fonte de
carbono ocorre se nenhum carboidrato fermentável estiver presente. Para realização deste teste, o meio mais
comumente utilizado é o ágar citrato de Simmons, no qual o citrato de sódio é a única fonte de carbono e o íon
amônio, a única fonte de nitrogênio. O azul de bromotimol é incluído como indicador de pH. O meio é preparado
a um pH igual a 6,9 no qual a coloração do meio é verde. Em pH maiores que 7,6, o azul de bromotimol modifica
a coloração do meio para um azul bem intenso.
Prova da Catalase
A maioria das bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas produz peróxido de hidrogênio a partir de
flavoproteínas reduzidas via uma reação de transferência de elétrons, gerando oxigênio livre ao final da reação.
O peróxido de hidrogênio pode ser também produzido enzimaticamente em aeróbios e anaeróbios facultativos
pela ação da enzima superóxido dismutase, conforme a Figura 4.
Figura 4. Ilustração de reações de formação do peróxido de hidrogênio (H2O2). O peróxido de hidrogênio pode
ser formado através da transferência de hidrogênios de uma flavoproteína reduzida para o oxigênio ou pela ação
da superóxido dismutase.
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Se o peróxido de hidrogênio se acumula na célula, ele se torna tóxico porque o peróxido é uma molécula
altamente reativa que promove danos aos componentes celulares. A decomposição deste material pode ocorrer
através da ação das enzimas classificadas como hidroperoxidases, que incluem a peroxidade e a catalase.
Por essa razão, a maioria dos aeróbios e anaeróbios facultativos possui uma enzima denominada
catalase, que promove a quebra deste peróxido em água e oxigênio. A maioria das bactérias anaeróbias como
Clostridium sp., por exemplo, possuem peroxidase em lugar da catalase. As bactérias que não apresentam
catalase ou peroxidase não são capazes de decompor o peróxido de hidrogênio, tendo seu crescimento inibido
pelo acúmulo desse produto do seu próprio metabolismo.
ROTEIRO DA PRÁTICA
Etapas iniciais
- Lavar as mãos;
- 1 Alça de inoculação estéril;
- 1 Tubo de rosca com um volume de aproximadamente 5 mL da solução de peróxido de hidrogênio 3,0%;
- 1 Pipeta Pasteur;
d. Para a prova bioquímica do citrato será utilizado o ágar Citrato de Simmons e solução azul de
bromotimol 0,2%
e. Para a prova da catalase será utilizada solução de peróxido de hidrogênio a 3,0%;
f. Controle positivo para prova da catalase: com o mesmo meio de cultivo das demais cepas, preparar
um tubo com Staphylococcus aureus;
Ágar Citrato de Simmons

Composição do caldo Quantidade
Sulfato de magnésio 0,2g
Fosfato de amônia (NH4H2PO4) 1,0g
Fosfato dipotássico (K2HPO4) 1,0g
Citrato de sódio 2,0g
Cloreto de sódio 5,0g
Ágar bacteriológico 15,0g
Azul de bromotimol (Solução 0,2%) 40 mL
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Solução Azul de Bromotimol a 0,2%

Azul de bromotimol 0,1g
NaOH 0,1N 2,5mL
Peróxido de hidrogênio 3,0%

Peróxido de hidrogênio 30% 10,0mL
Preparação
Ágar Citrato de Simmons: dissolver os componentes da formulação em água destilada, corrigir o pH em 6,6 e
distribuir em tubos (5mL/tubo) e esterilizar a 121°C/15 min e inclinar.
Solução de Azul de Bromotimol: dissolver 0,1g do azul de bromotimol em 2,5mL de NaOH 0,1N e completar
o volume para 50mL com água destilada.
Peróxido de hidrogênio 3,0%: dissolver os 10,0mL de água oxigenada 30% na água destilada, completando o
volume para 100mL. Atenção!!! O peróxido de hidrogênio a 30% pode provocar queimaduras dolorosas,
devendo ser manuseado com luvas e óculos de proteção. Em caso de respingos na pele, lavar com etanol 70%
em abundância não lavar com água.
condições específicas quando o microrganismo exigir; Atenção, para a prova da catalase, nunca utilizar cultivos
em ágar sangue porque as células vermelhas do sangue contém catalase e podem produzir um resultado falso
positivo;
-Preparar um tubo, com S. aureus, como controle positivo para a prova da catalase;
Prova do Citrato (deve ser feito por primeiro)

-Tomar inóculo leve da linhagem a ser testada, usando alça de inoculação, e inocular os tubos com ágar Citrato
de Simmons inclinado, estriando a rampa; O inóculo deve ser leve, pois se for pesado pode resultar em falsos
resultados positivos;
-Fazer um tubo controle com o meio de cultivo, sem o microrganismo;
-Incubar os tubos a 35-37ºC/24-48h. Verificar o resultado, caso indique negativo no período de até 48h incubar
por até 4 dias.
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Prova da Catalase – método do tubo

-Adicionar diretamente às culturas cultivadas (teste) em tubos de caldo ou ágar inclinado, com crescimento
vigoroso, 1,0mL de peróxido de hidrogênio a 3,0%. Fechar os tubos e observar o borbulhamento imediato
(resultado positivo) ou não-borbulhamento (resultado negativo);
-Fazer o mesmo procedimento para um tubo com uma linhagem de S. aureus como controle positivo;
Etapas finais
Para a prova do citrato, o crescimento com viragem alcalina do indicador, alterando a cor do meio na
rampa de verde para azul, indica resultado positivo. O não crescimento e não alteração da cor do meio indicam
resultado negativo. Os tubos negativos devem ser incubados novamente por até 4 dias. Se for utilizado um
inóculo muito pesado, a cor da rampa pode passar de verde para amarelo claro, não indicando resultado positivo.
Quadro 4. Interpretação da prova do citrato (A) e catalase (B)

A
Tubo A: controle não inoculado;

Tubo B: resultado negativo;
Tubo C: positivo (os organismos mostram
crescimento e uma coloração azul no meio).
Tubo A: ausência de atividade da enzima

catalase (teste negativo)
Tubo B: presença de bolhas indica a
presença da enzima catalase e positividade
do teste
B
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ASSUNTO
Prova da urease e gelatinase
OBJETIVOS
 Determinar se um microrganismo é capaz de produzir a enzima urease e gelatinase;
Prova da Urease
A urease é uma enzima do grupo das amidases, que catalisam a hidrólise de amidas como a ureia, uma
diamida do ácido carbônico ou carbamida. A hidrólise de cada molécula de ureia resulta em duas moléculas de
amônia, conforme apresenta a Figura 5, que elevam o pH do meio de cultura e podem ser detectadas pelo
vermelho de fenol, um indicador de pH com ponto de viragem em pH8,4.
A urease é uma enzima microbiana muito importante relacionada com a decomposição dos componentes
orgânicos (VERMELLHO, 2019). Esta enzima é considerada constitutiva porque é sintetizada por certas
bactérias, independentemente da presença ou ausência do seu substrato (ureia). (RIBEIRO; SOARES, ANO).
Figura 5. Reação de hidrólise da ureia.

O meio para o teste da urease (que pode ser sólido ou líquido) contém ureia, fatores essenciais para
crescimento e o indicador de pH vermelho fenol. O indicador possui uma coloração amarela ou amarelo/laranja
em pH abaixo de 8,4 e vermelho em pH acima de 8,4. O meio para o teste foi desenvolvido para determinar a
habilidade microbiana em converter ureia em amônia (que é utilizada pela bactéria como fonte de carbono para
produção de aminoácidos e nucleotídeos), que aumenta o pH do meio com consequente mudança de cor do
indicador.
Prova da Gelatinase
Este teste é utilizado para determinar a capacidade de um microrganismo produzir exoenzimas
hidrolíticas (enzimas proteolíticas), chamadas de gelatinases, que digerem e liquefazem a gelatina (colágeno
animal). Os produtos desta reação são aminoácidos que podem, evidentemente, ser transportados para o interior
da célula onde podem ser facilmente utilizados para o fornecimento de energia como formação de material
constitutivo do microrganismo. O teste pode ser utilizado para distinguir Staphylococcus aureus, patogênico e
positivo para o teste, de S. epidermidis, que não é patogênico e positiva o teste mais tardiamente. No caso das
enterobactérias, Serratia e Proteus são espécies tipicamente positivas, enquanto os outros representantes do
grupo são geralmente negativos. Bacillus anthracis, B. cereus e vários outros membros do gênero são gelatinase-
positivos, bem como Clostridium tetani e C. perfringens (RABINOVITCH; DE OLIVEIRA, 2015).
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ROTEIRO DA PRÁTICA
Etapas iniciais
- Lavar as mãos;
-Agulha de inoculação estéril;
b. Para a prova da urease, tubos com Ágar Ureia de Christensen inclinado em rampa longa;
c. Para a prova da gelatinase, tubos com Meio Gelatina sem inclinação;
Ágar Ureia de Christensen (Base)

Peptona 1,0g
Glicose 1,0g
Fosfato monopotássico (KH2PO4) 2,0g
Vermelho de fenol (Solução 0,2%) 6mL
Solução Vermelho Fenol a 0,2%

Vermelho de fenol 0,1g
NaOH 0,1N 4,0 mL
Meio Gelatina
Peptona de carne 5,0
Extrato de carne 3,0
Gelatina 120,0
Corrigir pH 6,9 – 121°C/15min
FONTE: RABINOVITVH; DE OLIVEIRA (2015)
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Preparação
Solução de Vermelho de Fenol: dissolver 0,1g de vermelho de fenol em 4,0mL de NaOH 0,1N e completar o
volume para 50mL com água destilada.
Ágar Ureia de Christensen (base): o meio base do Ágar Ureia de Christensen é formado por todos os outros
elementos da formulação, exceto a ureia que deve ser preparada separadamente. Preparar uma solução aquosa
de ureia a 40% e esterilizar por filtração. Preparar o ágar base, esterilizar e depois de resfriado a
aproximadamente 45-50°C adicionar, para cada litro, 50mL da solução de ureia estéril. Distribuir em tubos
estéreis e inclinar em rampa longa.
Meio Gelatina: dissolver a peptona de carne e o extrato de carne em 90% de água, ajustar o pH com NaOH
1N, completar o volume e adicionar a gelatina bacteriológica, fundir a 60ºC e distribuir 5 mL em tubos de
15x120 mm com tampa de rosca. Autoclavar a 121ºC durante 15 min e resfriar.
TSA) sendo realizada a reativação com 24 horas de antecedência em 35-37ºC (maioria das bactérias) ou
Prova da urease
-Tomar inóculo moderado da linhagem a ser testada, usando alça de inoculação, e inocular os tubos com ágar
Uréia de Christensen inclinado, estriando a rampa;
-Incubar os tubos a 35-37ºC/24-48h. Comparar o tubo inoculado ao tubo controle.
Prova da gelatinase
-Tomar inóculo moderado da linhagem a ser testada, usando agulha de inoculação estéril, e inocular os tubos
com meio gelatina no centro do meio de cultura, indo até o fundo do tubo.
-Incubar os tubos a 35-37ºC/24-48h (pode precisar até 14 dias). Após este período, verificar a hidrólise da
gelatina colocando o tubo inoculado juntamente com o tubo controle em refrigerador (temperatura de 3ºC ±
1ºC), durante 30 min. Haverá a hidrólise se, após esse tempo, o tubo inoculado permanecer líquido.
Etapas finais
Para a prova da urease, o teste positivo (rosa-escuro) significa que a bactéria possui a enzima urease,
que hidrolisa a ureia em amônia, alcalinizando o meio e virando o indicador de pH vermelho de fenol de amarelo
(pH6,8) para rosa escuro (pH8,0). No teste negativo, o meio permanece amarelo, mas com crescimento, porque
a bactéria se utiliza da peptona presente no meio.
Para a prova da gelatinase, os microrganismos gelatinase-positivos promovem liquefação do meio
contendo a gelatina, o que pode ser facilmente observado por uma leve inclinação do tubo-teste, ao passo que,
no caso de o teste ser negativo, o meio permanecerá sólido. Deve-se ter bastante cuidado com resultados
21
falsamente positivos, visto que a gelatina se liquefaz facilmente a temperaturas superiores a 28°C. Portanto,
após a incubação o tubo inoculado deve ser resfriado em geladeira e deve voltar ao estado gelificado (assim
como o tubo-teste negativo), o tubo que sofre ação das gelatinases (teste positivo) não voltará a se solidificar,
porque a gelatina foi hidrolisada a aminoácidos e não pode sofrer novamente gelificação.
Quadro 5. Interpretação da prova da urease (A) e gelatinase (B)

A
Tubo A: tubo controle, não inoculado;

Tubo B: resultado positivo;
B Tubo A: resultado positivo, com liquefação

Tubo B: tubo controle, não inoculado
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ASSUNTO
Prova da amilase
OBJETIVOS
 Determinar se um microrganismo é capaz de hidrolisar o amido por meio da enzima amilase;
O amido é um homopolissacarídeo, composto de repetidas subunidades de α-D-glicose. Ele se apresenta

como uma mistura, em que temos a presença de duas formas principais: uma linear, conhecida como amilose, e
uma outra ramificada, denominada amilopectina. Tanto na amilose quanto na amilopectina, as moléculas de
glicose são unidas por ligações do tipo acetal 1,4-α-glicosídica como apresenta a Figura 6.
Figura 6. Hidrólise do amido pela α-amilase e oligo-1,6-glicosidase

O amido possui uma estrutura muito grande para atravessar a membrana celular bacteriana e, por isso,
para se tornar uma fonte de energia valiosa para a bactéria, ele precisa ser reduzido a pequenos fragmentos ou
mesmo moléculas individuais de glicose para que possam funcionar como substratos energéticos. Organismos
que produzem e secretam as enzimas celulares α-amilase e oligo-1,6-glicosidase são capazes de hidrolisar o
amido através da quebra das ligações glicosídicas entre as subunidades de açúcar; embora este seja o passo
inicial do processo, várias outras enzimas (p. ex., enzimas da via glicolítica) são necessárias para que todo o
processo metabólico aconteça até a geração de ATP (VERMELHO, 2019).
ROTEIRO DA PRÁTICA
Etapas iniciais
- Lavar as mãos;
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- Pipeta Pasteur;
d. Para preparo do inóculo: TSI, TSA ou NA;
e. Para a prova da amilase, placas de Petri com Meio Ágar Amido;
f. Solução de Lugol (mesma Coloração Gram);
Meio Ágar Amido

Amido 2,0g
Fosfato dissódico (Na2HPO4) 1,0g
Extrato de carne 10,0g
FONTE: USP (2020)
Solução de Lugol
Iodo 1,0g
Iodeto de Potássio 2,0g
Preparação
Meio Ágar Amido: dissolver os componentes da formulação em água destilada, corrigir o pH em 6,8 e esterilizar
a 121°C/15 min. Distribuir aproximadamente 20mL do ágar em placas de Petri estéreis, aguardar solidificar e
deixar repousar em refrigeração por 24 horas.
Solução de Lugol: colocar o iodeto de potássio num almofariz, adicionar o iodo e homogeneizar com o pistilo.
Adicionar, consecutivamente, porções de 1, 5 e 10mL de água destilada, homogeneizando a solução após cada
adição. Em seguida, transferir a solução para um frasco escuro, lavando o almofariz e o pistilo com o restante
da água destilada.
-Dividir a placa de Petri que contém o Ágar Amido, em duas porções;

-Tomar inóculo moderado da linhagem a ser testada, usando alça de inoculação, e inocular na parte central de
cada porção da placa utilizando estriamento contínuo;
24
-Fazer uma placa controle com o meio de cultivo, sem o microrganismo;

-Incubar os tubos a 35-37ºC/48h.
- Após o tempo estabelecido, cobrir a superfície da placa de Petri inoculada com 5-10mL da Solução de Lugol;
- Comparar a reação obtida com padrão proposto no Quadro 5.
Etapas finais

O meio utilizado para esse teste é um meio ágar simples que contém extrato de carne e peptona, para
promover o crescimento, e amido solúvel, que deve ser disposto em placas de Petri, as quais, após a solidificação
do meio, são utilizadas para a prova.
Quando organismos que produzem α-amilase e oligo-1,6-glicosidase crescem no meio rico em amido,
eles hidrolisam o amido, aumentando assim o crescimento no meio devido ao alto teor energético fornecido por
meio da liberação de grandes quantidades de glicose, que, juntamente com o extrato de carne e peptona,
favorecem substancialmente o desenvolvimento do microrganismo. Como tanto o amido quanto as subunidades
de açúcares são solúveis no meio, o iodo presente na solução é usado para detectar a presença ou a ausência de
amido na periferia ao redor do crescimento bacteriano, na superfície do meio de cultura. Já que o iodo reage
com o amido e produz uma coloração azul-violácea intensa, qualquer traço de hidrólise do amido realizada pela
bactéria será revelado como uma zona clara ao redor do crescimento, representando um resultado positivo para
o teste como demonstra o Quadro 5.
Quadro 6. Interpretação da prova da amilase.

A. Microrganismo produtor de
enzima amilolítica, resultado
positivo.
B. Microrganismo não produtor
da enzima amilolítica, resultado
negativo.
FONTE: USP (2020)
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ASSUNTO
Prova de enzimas lipolíticas
OBJETIVOS
 Determinar se um microrganismo é capaz de hidrolisar lipídios por meio da enzima amilase;
As enzimas produzidas pelos microrganismos podem ser intra ou extracelulares, no caso da produção
em escala industrial, as enzimas são preferencialmente secretadas no meio de cultivo, onde podem ser utilizadas
em diversos setores indústrias. O uso comercial das lipases, representa um seguimento de bilhões de dólares,
englobando diversas aplicações diferentes. Partindo dessa premissa, prevê-se que as lipases, estejam entre as
enzimas que mais vêm crescendo podendo atingir 590.2 milhões de dólares 2023, com base em suas aplicações
em processos incluindo síntese orgânica, produtos farmacêuticos, produção detergentes e de biocombustíveis
(JEAN-BAPTISTE, 2020).
As lipases (triacilglicerol acil-hidrolases EC: 3.1.1.3), são enzimas onipresentes, encontradas em
animais, plantas, fungos e bactérias, e possuem considerável significado fisiológico e potencial industrial. A
função biológica da lipase é catalisar a hidrólise de triacilgliceróis para fornecer ácidos graxos livres,
diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol como apresentada na Figura 7.
Figura 7. Reção sequencial de lipase sobre triacligliceróis

Fonte: VOLPATO (2009)
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ROTEIRO DA PRÁTICA
Etapas iniciais
- Lavar as mãos;
b. Para a prova da hidrólise de lipídios, placas de Petri com Meio Ágar Lipase Modificado;
Meio Ágar Lipase Modificado

Peptona bacteriológica 10,0g
Cloreto de cálcio dihidratado (CaCl2. 2H2O) 0,1g
Tween 80 10,0g
121ºC/15min
FONTE: TEIXEIRA et al. (2011)
Preparação
Meio Ágar Lipase Modificado: dissolver os componentes da formulação em água destilada e esterilizar a
121°C/15 min. Distribuir aproximadamente 20mL do ágar em placas de Petri estéreis, aguardar solidificar e
deixar repousar em refrigeração por 24 horas.
- Também serão empregados, nesta prática, isolados de fungos filamentosos, cultivados em ágar Saboraud em
25-27ºC pode 5-7 dias;
-Tomar inóculo moderado das linhagens a serem testadas, usando agulha de inoculação, e inocular por picada
na parte central da placa de Petri com o ágar;
- Incubar as placas com bactérias a 35-37ºC/48h e as placas com fungos a 25-27ºC/7 dias;
- Após o tempo estabelecido, verificar a presença/ausência da formação de halo ao redor das colônias;
- Para o microrganismo que indicar a formação de um halo opaco com formação de cristais, realizar a leitura do
diâmetro (mm) do halo formado e da colônia do microrganismo;
Etapas finais
27
Um microrganismo pode ou não ser produtor de enzimas que degradam lipídios, quando apresentam
esta atividade ela poderá ser avaliada de diversas formas. Esta metodologia propõe uma técnica que poderá ser
empregada como de triagem de microrganismos que possuem esta capacidade, não substituindo técnicas de
dosagem química específicas.
A avaliação da atividade enzimática do microrganismo, pode ser calculada pela equação a seguir,
𝐷𝑖â𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑜 ℎ𝑎𝑙𝑜
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 =
𝐷𝑖â𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑎 𝑐𝑜𝑙ô𝑛𝑖𝑎
Fonte: TEIXEIRA et al. (2011)
A formação de halos opacos com formação cristais é devido a insolubilidade dos sais de cálcio em
presença de ácidos graxos.
Quadro 7. Interpretação da prova da amilase.

Microrganismos produtor de enzimas
lipolíticas, devido a formação de halo em
torno das colônias
FONTE: MOTA et al. (2020)
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ASSUNTO
Descarboxilação de aminoácidos
OBJETIVOS
 Determinar se um microrganismo é capaz de descarboxilar aminoácidos;
A descarboxilação é um processo no qual as bactérias que possuem enzimas descarboxilases específicas

são capazes de atuar nos grupos carboxila-terminal (-COOH) dos aminoácidos, produzindo uma amina ou
diamina e dióxido de carbono, conforme apresentado na Figura 8. A descarboxilação é um processo irreversível
não oxidativo, ocorre anaerobicamente e requer uma coenzima comum, o piridoxal fosfato. Esta prova
bioquímica utilizando os aminoácidos Lisina, Arginina e Ornitina é empregada na identificação de
enterobactérias.
A disponibilidade de uma ou mais descarboxilases varia entre as espécies e representa uma característica
útil na diferenciação. Estas enzimas são adaptativas, porque são formadas pelos microrganismos somente
quando estes são cultivados em ambiente ácido, na presença do substrato específico.
Figura 8. Reação de descarboxilação de aminoácidos.

ROTEIRO DA PRÁTICA
Etapas iniciais
- Lavar as mãos;
d. Para a prova da descarboxilação de aminoácidos será utilizado o Caldo Descarboxilase de
Falkow e os aminoácidos: L- lisina; L-tirosina e L-cisteína;
29
Caldo Descarboxilase de Falkow

Peptona bacteriológica 5,0g
Extrato de levedura 3,0g
Dextrose 1,0g
Púrpura de bromocresol (2mL solução 1%) 0,02g
Aminoácido 0,5g
121ºC/10min - pH6,8
FONTE: RIBEIRO; STELATO (2011)
Preparação
Caldo Descarboxilase de Falkow: dissolver os componentes da formulação em água destilada, caso seja uma
mistura de L e D-aminoácido adicionar a concentração de 1% e se for somente uma forma (L/D) usar 0,5%.
Corrigir para pH6,8, distribuir aproximadamente 4-5mL em tubos e esterilizar a 121°C/10 min.
-Tomar inóculo leve das linhagens a serem testadas, usando alça de inoculação.
-Prepara um tubo controle sem o microrganismo a ser testado;
-Selar todos os tubos (teste e controle) com aproximadamente 1,5-2 mL de vaselina estéril;
- Incubar os tubos em 35-37ºC/1-14 dias com observação diária das alterações do tubo;
- Após o tempo estabelecido, verificar a alteração de cor que passará para amarelo e depois para roxo;
Etapas finais

Nas etapas iniciais do crescimento, a utilização da glicose presente no meio vai provocar uma viragem
ácida do indicador, alterando a cor do meio de púrpura escuro (roxo) para amarelo. Após o esgotamento da
glicose, a utilização do aminoácido vai elevar o pH novamente, revertendo a reação ácida. Assim, a viragem do
indicador (amarela) indica resultado negativo, enquanto a reversão da cor do meio para a cor original, indica
resultado positivo.
30
Quadro 8. Interpretação da prova da descarboxilação de aminoácidos

Tubo A: positivo;
tubo B: controle não inoculado;
tubo C: negativo
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31
ASSUNTO
Desaminação de aminoácidos/ Prova do indol
OBJETIVOS
 Determinar se um microrganismo é capaz de desaminar o triptofano;
A desaminação do triptofano depende da disponibilidade pelas bactérias do complexo enzimático

triptofanase, que desamina o triptofano resultando em indol, ácido pirúvico, amônia e energia. O indol liberado
para o meio de cultura pode ser detectado por uma reação química com o aldeído presente no reagente de Kovacs
para o teste do indol (p-dimetilamino benzaldeído), que resulta em produtos de condensação coloridos. Esses
compostos, de cor vermelho-vileta, ficam concentrados na fase alcoólica do reagente, formando um anel na
superfície do meio de cultura líquido.
Figura 9. Catabolismo do triptofano em microrganismos indol-positivos.

ROTEIRO DA PRÁTICA
Etapas iniciais
- Lavar as mãos;
- Alça de inoculação;
b. Para a prova da desaminação do triptofano será utilizado o Caldo Triptona 1% e o reativo de
Kovacs;
Caldo Triptona
Triptona 10,0
Cloreto de sódio 5,0
121ºC/10min – pH7,3
FONTE: SILVA et al. (2010)
32
Preparação
Caldo Triptona: dissolver os componentes da formulação em água destilada, corrigir para pH7,3, distribuir
aproximadamente 4-5mL em tubos e esterilizar a 121°C/10 min.
Reativo de Kovacs - produto comercial
-Tomar inóculo leve das linhagens a serem testadas, usando alça de inoculação.
- Incubar os tubos em 35-37ºC/24-48 horas com as tampas levemente desrosqueadas;
-O teste pode ser finalizado com 24 ou 48 horas, para isso retirar assepticamente uma alíquota de 2mL da cultura,
adicionar 5 gotas do Reativo de Kovacs, agitar levemente e observar o resultado; Caso em 24 horas o resultado
seja negativo, incubar novamente o tubo com a cultura e repetir com 48 horas o teste.
Etapas finais

O desenvolvimento de um anel vermelho-violeta na superfície do meio de cultura indica resultado
positivo, a permanência do anel superficial na cor do Reativo de Kovacs (amarelado) indica resultado negativo.
Se houver a formação de um anel de coloração alaranjada devido ao escatol, precursor do indol, o resultado é
variável.
Quadro 9. Interpretação da prova da desaminação do triptofano

Tubo A: positivo;
Tubo B: negativo
B
Fonte:https://www.ufrgs.br/aulaspraticasdemip/?qsm_quiz=testes-bioquimicos-para-identificacao-de-bacterias
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33
ASSUNTO
Desaminação da fenilalanina
OBJETIVOS
 Determinar se um microrganismo é capaz de desaminar a fenilalanina;
A desaminação da fenilalanina pelas bactérias ocorre na presença de oxigênio, sob a ação de uma enzima
oxidase, flavoproteína que catalisa a conversão de uma molécula de fenilalanina em um molécula de ácido
fenilpirúvico e uma molécula de amônia. O ácido fenilpirúvico pode ser detectado no meio de cultura através
da adição do cloreto férrico, que reage com este ácido formando um produto colorido, a fenilhidrazona.
Figura 10. Reação de desaminação da fenilalanina.

Fonte: https://microbiologynote.com/pt/teste-fenilalanina-desaminase
ROTEIRO DA PRÁTICA
Etapas iniciais
- Lavar as mãos;
- Alça de inoculação;
d. Para a prova da desaminação da fenilalanina será utilizado o Meio de Fenilalanina e solução de
cloreto férrico a 10%.
Meio de Fenilalanina
DL- fenilalanina 2,0g
Extrato de levedura 3,0g
34

Fosfato dissódico ou dipotássico 1,0g
121ºC/10min – pH7,3
FONTE: SILVA (1996)
Preparação
Meio de Fenilalanina: dissolver os componentes da formulação em água destilada, corrigir para pH7,3, distribuir
em tubos, esterilizar a 121°C/10 min e inclinar fazendo rampa longa.
Solução de cloreto férrico 10%: dissolver o sal em água destilada no volume desejado e transferir para frasco
âmbar.
-Tomar inóculo pesado das linhagens a serem testadas, estriando toda a rampa, não é necessário picar o fundo
do tubo;
- Incubar os tubos em 35-37ºC/18-24 horas;
- Após o tempo estabelecido, adicionar diretamente sobre a cultura de 4 a 5 gotas da solução de cloreto férrico,
movimentando o reagente por toda a rampa;
Etapas finais

Desenvolvimento de uma coloração verde no intervalo de 1-5 minutos indica resultado positivo, o não
desenvolvimento de cor, mantendo a condição inicial do reagente (amarelo), indica resultado negativo
Quadro 10. Interpretação da prova da desaminação da fenilalanina

Tubo A: positivo;
Tubo B: negativo;
A B
Fonte:https://www.ufrgs.br/aulaspraticasdemip/?qsm_quiz=testes-bioquimicos-para-identificacao-de-bacterias
35
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BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
MADIGAN, Michael T.; MARTINKO, John M.; BENDER, Kelly S.; et al. Microbiologia de Brock. [Digite o
Local da Editora]: Grupo A, 2016. E-book. ISBN 9788582712986. Disponível em:
https://integrada.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788582712986/. Acesso em: 09 ago. 2023.
TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia. [Digite o Local da Editora]:
Grupo A, 2017. E-book. ISBN 9788582713549. Disponível em:
https://integrada.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788582713549/. Acesso em: 09 ago. 2023.
VERMELHO, Alane B. Práticas de Microbiologia. [Digite o Local da Editora]: Grupo GEN, 2019. E-book.
ISBN 9788527735575. Disponível em: https://integrada.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788527735575/.
Acesso em: 09 ago. 2023.
SILVA, Neusely da; JUNQUEIRA, Valéria C A.; SILVEIRA, Neliane F. de A.; AL, et. Manual de métodos de
análise microbiológica de alimentos e água. [Digite o Local da Editora]: Editora Blucher, 2017. E-book. ISBN
9788521212263. Disponível em: https://integrada.minhabiblioteca.com.br/#/books/9788521212263/. Acesso
em: 09 ago. 2023.

Apostila de Aulas Práticas de Bioquímica de Microrganismos

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1

UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ

APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS

BIOQUÍMICA DE MICRORGANISMOS – BP34G

Profª Drª Maria Carolina de Oliveira Ribeiro

AULA 1. Teste de oxidação-fermentação da glicose (dextrose)

As aulas práticas de bioquímica de microrganismos, têm como objetivo ensinar ao estudante os

REGRAS DE OURO DE HIGIENE PESSOAL PARA TRABALHAR NO LABORATÓRIO DE

1. Usar guarda-pó limpo, totalmente abotoado e de mangas compridas;

NORMAS DE SEGURANÇA PARA TRABALHAR NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

1. NÃO FAZER BRINCADEIRAS NO LABORATÓRIO

AULA PRÁTICA N° 01 – Data:____/____/____

Figura 1. Visão geral da respiração e da fermentação

Figura 2. Produtos de várias fermentações microbianas

Meio de oxidação-fermentação para Gram negativos (OF)

Meio de oxidação-fermentação para Gram positivos (STAPH OF)

Composição base Quantidade (g)

Preparação: idem ao anterior

Interpretação dos resultados

Quadro 1. Interpretação da prova de oxidação-fermentação da glicose

FONTE: VERMELHO (2019)

AULA PRÁTICA N° 02 – Data:____/____/____

Interpretação dos resultados

Quadro 2. Interpretação do teste de utilização de carboidrato em caldo vermelho de fenol.

FONTE: VERMELHO (2019)

AULA PRÁTICA N° 03 – Data:____/____/____

Esta prova bioquímica demonstra a habilidade de um microrganismo em produzir ácidos orgânicos

- 5 ponteiras de 1000µL estéreis (no momento da leitura do resultado);

Solução hidroalcóolica de Vermelho de Metila

-Lavar as mãos ao final do trabalho;

Interpretação dos resultados

Quadro 3. Interpretação do teste de vermelho de metila

Tubo A: resultado negativo;

FONTE: VERMELHO (2019)

AULA PRÁTICA N° 04 – Data:____/____/____

Ágar Citrato de Simmons

Solução Azul de Bromotimol a 0,2%

Peróxido de hidrogênio 3,0%

Prova do Citrato (deve ser feito por primeiro)

Prova da Catalase – método do tubo

Interpretação dos resultados

Quadro 4. Interpretação da prova do citrato (A) e catalase (B)

Tubo A: controle não inoculado;

Tubo A: ausência de atividade da enzima

AULA PRÁTICA N° 05 – Data:____/____/____

Figura 5. Reação de hidrólise da ureia.

Ágar Ureia de Christensen (Base)

Solução Vermelho Fenol a 0,2%

Interpretação dos resultados

Quadro 5. Interpretação da prova da urease (A) e gelatinase (B)

Tubo A: tubo controle, não inoculado;

B Tubo A: resultado positivo, com liquefação

FONTE: VERMELHO (2019)

AULA PRÁTICA N° 06 – Data:____/____/____

O amido é um homopolissacarídeo, composto de repetidas subunidades de α-D-glicose. Ele se apresenta

Figura 6. Hidrólise do amido pela α-amilase e oligo-1,6-glicosidase

Meio Ágar Amido

-Dividir a placa de Petri que contém o Ágar Amido, em duas porções;

-Fazer uma placa controle com o meio de cultivo, sem o microrganismo;

Interpretação dos resultados

Quadro 6. Interpretação da prova da amilase.

FONTE: USP (2020)

AULA PRÁTICA N° 07 – Data:____/____/____

AULA PRÁTICA N° 01 – Data://

AULA PRÁTICA N° 02 – Data://

AULA PRÁTICA N° 03 – Data://

AULA PRÁTICA N° 04 – Data://

AULA PRÁTICA N° 05 – Data://

AULA PRÁTICA N° 06 – Data://

AULA PRÁTICA N° 07 – Data://

AULA PRÁTICA N° 08 – Data://

AULA PRÁTICA N° 09 – Data://

AULA PRÁTICA N° 10 – Data://