UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

FACULDADE DE BIOTECNOLOGIA

PRÁTICA DE TECNOLOGIA DAS FERMENTAÇÕES

Manaus/AM
2023
 UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOTECNOLOGIA

DISCENTES:
BRUNA DA SILVA SEIXAS - 21854858
HAYALLA DE QUEIROZ - 21853989
DEBORA MOREIRA LEAO MENEZES- 21850396
MILENA NASCIMENTO DE ARAUJO - 21854931
SAMANTHA ADIELY ALECRIM MENDONÇA - 21852435

IMOBILIZAÇÃO CELULAR

Relatório solicitado pelo Prof°

Edson Junior do Carmo para obtenção de
nota na disciplina de Tecnologia das
Fermentações - IBP 010 referente ao
segundo semestre de 2022 do curso de
Biotecnologia.

Manaus/AM
2023
 RESUMO

Uma das vantagens da utilização de células imobilizadas em processos fermentativos é

a facilidade de separação da célula do meio de cultivo. As alterações que a imobilização
causará no crescimento celular ou na atividade metabólica das células são imprevisíveis.
Nessa prática foi utilizado a encapsulação, em gel de alginato de sódio, é realizado um
homogenato entre as células e uma solução de alginato de sódio, e depois gotejada em uma
solução de íons , a reação é instantânea gerando pequenas cápsulas com uma ou mais células
aprisionadas, dependendo do tamanho da gota. No método utilizado, foi preparado um
solução contendo levedura S. cerevisiae e alginato de sódio, o método consiste em formação
de esferas gotejando em 113 gotas por minuto em CaCl2. A fácil separação das células do
meio fermentado é mais uma das vantagens da imobilização celular, além disso temos que
essas técnicas ajudam na manutenção e permite que o processo aconteça continuamente,
diminuindo o tempo morto com a lavagem e adição de mais mosto no fermentador.
 INTRODUÇÃO

A imobilização é um procedimento que consiste no confinamento físico de células

íntegras em um espaço com sistema reacional, onde são mantidas suas atividades catalíticas
(SANCHEZ, 1995). Um dos principais métodos de aprisionamento no interior de matriz
porosa é o que utiliza gel (hidrofílico) de alginato, na qual é uma matriz sólida, porosa e
inerte, com baixo custo e de fácil manuseio, e que garante uma boa viabilidade celular. O
alginato é um polissacarídeo que é extraído principalmente de algas, e sua composição
depende do tipo, idade, parte da alga que foi utilizada e do processo de extração, assim como
pode apresentar características interessantes que serão aplicadas em diversas áreas,
dependendo da sua origem. A relação entre o alginato de sódio e o cloreto de cálcio (CaCl2),
são suas trocas iônicas, uma vez que o alginato de sódio é solúvel em água e se torna
insolúvel na presença de cátions bivalentes como Ca++, por isso o gotejamento em cloreto de
cálcio para o processo de encapsulação celular (ORTIZ, 2017).
De acordo com BATISTA (2005), a escolha do bioprocesso é tão importante quanto a
escolha do microrganismo. O método de imobilização se destaca do método tradicional de
células livres, pois no método tradicional é necessário a inoculação de um número elevado de
células, e a imobilização mostra ser uma alternativa eficiente para esse problema. Além de
que alguns estudos apontam maiores vantagens em relação aos processos fermentativos
tradicionais, por exemplo, na utilização de altas densidades celulares por unidade de volume
do reator, resultando em uma maior produtividade e rendimento fermentativo.
A imobilização de leveduras pode ser utilizada em processos industriais
principalmente para produção de etanol (BATISTA, 2005). Um estudo de CASSIOLA (2001)
aponta que a imobilização de Saccharomyces cerevisiae em crisotila (resíduo da indústria de
cerâmica), mostrou ser um ótimo biocatalisador na produção de etanol, aumentando assim o
seu rendimento em relação à células livres. Em relação aos poros na matriz que são formados
durante o processo de imobilização, esses poros são menores do que as células que estão
contidas em seu interior, e em contato com o meio de cultura, há o estabelecimento de um
fluxo de substratos que vão para dentro das partículas de gel, onde são consumidos pelas
células imobilizadas. Os produtos formados no interior da matriz difundem-se através do gel
e se acumulam no meio de cultura. Alguns efeitos negativos desse método são a busca pelo
aperfeiçoamento da metodologia, uma vez que há limitações difusionais do substrato
(BATISTA, 2005) que afetam diretamente o produto na matriz de gel. O tamanho da
partícula, a difusividade através da matriz polimérica e a concentração celular na partícula
devem ser otimizadas.
Por isso, a escolha do suporte é muito importante, pois é necessário haver uma
compatibilidade biológica, resistência mecânica e difusão. E na literatura afirmam que o
aprisionamento de microrganismo por um gel é a técnica de imobilização mais utilizada, seu
destaque é devido a diminuição da contaminação do produto, uma maior estabilidade e
permite o reuso da biomassa (BATISTA, 2005). A encapsulação em matriz porosa é uma
alternativa para o melhoramento de bioprocessos, por isso há inúmeros trabalhos que estudam
esse processo para diversas finalidades (BASSANI, 2018).
 OBJETIVO GERAL

Estudar o processo de imobilização celular a partir da suspensão de leveduras

Saccharomyces cerevisiae em solução de alginato de sódio através da técnica de
encapsulação, a fim de obter leveduras imobilizadas em esferas de alginato de Cálcio (0,1
M).

MATERIAL E MÉTODOS

1. IMOBILIZAÇÃO EM ALGINATO DE SÓDIO

Tabela 1. Materiais utilizados para imobilização de leveduras.

MATERIAIS REAGENTES

Balança Analítica Alginato de Sódio

Erlenmeyer CaCl2 (0,1 M)

Béquer ( 2000 ml, 3500 mL e 4000 mL) Levedura S. cerevisiae (Panificação)

Bastão de vidro Água MilliQ

Frasco de Mariotte Antibiótico Kamoran

Aquecedor Magnético -

Agitador Magnético -

Espátula de Inox -

Proveta 100 mL -

Gotejador -

A técnica de imobilização utilizada foi a do envolvimento, empregando-se o alginato

de cálcio como suporte, em um sistema para imobilização constituído por um frasco de
Mariotte acoplado a um gotejador, de modo que com um simples controle da vazão de
gotejamento foi possível quantificar-se o número de esferas produzidas. A suspensão de
células de S. cerevisiae em alginato de sódio (2% p/v) constantemente agitada por meio de
um agitador magnético para manter as células homogeneamente distribuídas na suspensão,
evitando-se a deposição das mesmas foi gotejada; e as gotas formadas recolhidas em frascos
Erlenmeyer de 500mL, contendo 250mL de uma solução de CaCl2 (0,1M). A vazão de
gotejamento, ou seja, o número de gotas formadas por unidade de tempo, é constante e
proporcional à viscosidade da suspensão, à altura (h), é inversamente proporcional à perda de
carga do conjunto (borracha + gotejador). O diâmetro das esferas formadas depende do
diâmetro do gotejador, sendo facilmente medida por um paquímetro.

- Inicialmente prepara-se uma solução de Alginato de Sódio a 2% (p/v), e com a ajuda

de uma balança analítica e uma espátula pesa-se cerca de 30 g desse reagente, e logo
em seguida foi adicion-se em conjunto cerca de 1500 mL de água MilliQ dentro de
um béquer de 3500 mL, a solução precia de agitação e aquecimento constante no
equipamento de aquecedor magnético;
- Paralelamente, em um béquer de 4000 mL prepara-se uma suspensão de células com
350 g (peso seco) de levedura (S. cerevisiae) de panificação diluída em 250 mL de
água MilliQ, e com a ajuda de um bastão de vidro mistura-se toda a solução até que
esteja em uma consistência líquida;
- Em seguida, após o preparo da suspensão de células em alginato de sódio, a solução
deve ser homogeneizada e vertida no frasco de Mariotte de 2000 mL, sob uma
agitação constante;
- Feito isso, goteja-se cerca de 300 mL de uma solução de CaCl2 a 0,1 M, contidos em
Erlenmeyer de 500 mL, com uma vazão de 100 gostas/ minuto;
- Com a solução já vertida, calcula-se aproximadamente uma faixa de 1500 esferas
obtidas por minuto em cada frasco de Erlenmeyer de cada equipe;
- Por fim, foi precisa manter as amostras obtidas sob refrigeração por 12 horas
(overnight) para melhorar a consistência e a homogeneidade das estruturas.

2. PRODUÇÃO DE ETANOL
Tabela 2. Materiais a serem utilizados na produção de etanol.

MATERIAIS

Balança analítica

Erlenmeyer
 Meio/Substrato

Sistema de incubadora

O protocolo para a produção de etanol consiste em um meio de: 100 g/L de glicose, 0,5
g/L de extrato de levedura, 1,0 g/L de fosfato monobásico de potássio e cerca de 1 g/L de
uréia, já para a fonte de carbono, utiliza-se 20 g/L. Com o pH do meio já ajustado, transfere-
se 100 mL do meio para os frascos de Erlenmeyers de 500 mL com o Airlock acoplado.
Posteriormente adiciona-se as leveduras (livres ou imobilizadas), transferindo-as para o
sistema de incubadora de piso com agitação orbital, a 35°C em 150/RPM, com intervalo de
20 minutos retira-se os fracos e realiza-se as análises de pesagem na balança analítica.
A levedura utilizada para a etapa de imobilização foi a Saccharomyces cerevisiae, o
que serviu diretamente para a etapa de produção de etanol, uma vez que elas são utilizadas
em processos que exigem altas temperaturas. Na literatura, há descrições existentes de que a
fermentação que utiliza esse tipo de levedura acontece mais rápido, levando poucos dias ou
semanas para terminar a produção de bebidas mais alcoólicas, densas e escuras. Além disso,
podemos observar que é possível produzir também os aromas frutados e as cervejas do tipo
Ale.
Analisando o mecanismo de ação durante a etapa de produção do etanol, entende-se que
a fermentação alcoólica é uma via anaeróbia realizada por leveduras, em que os açúcares
simples são convertidos em etanol e dióxido de carbono, como mostra a reação
abaixo:

C6H12O6+ 6H2O –> 2C2H5OH + 2CO2+ 2 ATP

A fermentação alcoólica que ocorreu neste experimento pode ser dividida em duas
fases, a primeira é a glicólise, onde ocorre um conjunto de reações iniciais para a
degradação da glicose, sendo semelhante em todos os tipos de fermentação e na
respiração aeróbia. Já a segunda fase é a redução do ácido pirúvico que resulta em ácido
acético, ácido láctico, álcool etílico e dióxido de carbono, dependendo do tipo de
organismo utilizado (TAIZ; ZEIGER, 2012). A glicólise é dividida em duas fases e dez
etapas. Na figura abaixo mostra a primeira fase: fase preparatória da glicose, onde ela é
ativada para acontecer posteriormente a quebra.
 Figura 1. Primeira etapa da glicólise: fase preparatória.
Fonte: Adaptado de Taiz e Zeiger (2012).

A segunda fase da glicólise é a fase de produção de energia, com mais cinco etapas,
mostrada na Figura 2:
 Figura 2. Segunda Fase da Glicólise: Produção de Energia.
Fonte: Adaptado de Taiz e Zeiger (2012).

Com o final da glicólise (primeira fase da fermentação alcoólica) obtém-se então 2

ATP, 2 NADH e dois ácidos pirúvicos. A imagem abaixo ilustra a segunda fase da
fermentação alcoólica, a etapa em que ocorre a redução do ácido pirúvico. O piruvato
formado na primeira fase sofre descarboxilação formando um acetaldeído, e esse sofre
redução, oxidando o NADH e formando então o nosso produto de interesse, nesse caso o
etanol.
 Figura 3. Redução do Ácido Pirúvico.
Fonte: Carvalho (2010).

3. DOSAGEM DE GLICOSE
- Primeiro coletou-se 1 mL do fermentado do Erlenmeyer e o colocou em um
microtubo previamente identificado.
- Centrifuga-se as amostras a 10.000 rpm, por 1 mL em temperatura ambiente.
- Transfere-se 10 uL do centrifugado para os microtubos de 2 mL em duplicata.
- Adiciona-se 1 mL do reagente GOD.
- Incubar-se por 15 minutos a 37 °C, após a incubação adicionou-se 1 mL de água
destilada.
- Por fim, foi feita a leitura de absorbância no espectrofotômetro no comprimento de
onda 505 nm, após zerar o equipamento com o tubo branco.

4. DESTILAÇÃO DO ETANOL
A destilação é uma operação de separação utilizada em quase todos os processos
industriais, ela se baseia na diferença dos pontos de ebulição dos componentes de uma
determinada mistura. O requisito básico para a separação dos componentes por destilação é
que a composição do vapor seja diferente da composição do líquido com o qual está em
equilíbrio no ponto de ebulição deste último. A destilação é baseada em soluções em que
todos os componentes são bastante voláteis, como soluções de etanol-água, nas quais ambos
os componentes também estão na fase de vapor. Com isso utilizamos um microdestilador de
álcool e seguiu todos os passos abaixo:
- Recuperou-se 50 mL da fermentação etanólica e o colocou em um tubo.
- Centrifugou-se por 15 minutos, 550 rpm a 4 ºC.
- Transferiu-se o fermentado clarificado para o reservatório do destilador.
- Por fim, destila-se a amostra em um microdestilador de álcool até obter-se 5 mL de
etanol.
Demorou-se cerca de 10 minutos desde a transferência dos 50 ml no vidro até obter os
5 ml finais de etanol.

Figura 4. Microdestilador de álcool.

RESULTADOS E DISCUSSÕES
 1. IMOBILIZAÇÃO CELULAR

1.1. SOLUÇÃO DE ALGINATO DE CÁLCIO

A solução de alginato de cálcio foi preparada conforme metodologia proposta e pode
ser observada na Figura 5, na qual a solução apresentou aspecto gelatinoso e ao todo foram
1,5 litros de solução. O alginato é um polissacarídeo, sendo um tipo de hidrogel inteiramente
hidrofílico que protege bastante a célula contra moléculas de solventes orgânicos
hidrofóbicos, isto porque há impedimentos para sua passagem através da barreira formada

por este gel. (QUN et al., 2002).

Figura 5. Solução de Alginato de Cálcio em água MILLIQ a 2% Cp/v

1.2. SUSPENSÃO DE LEVEDURAS

A figura 6, apresenta o resultado da suspensão celular. Inicialmente, era para ter sido
adicionado somente 250ml de água MILLQ, no entanto a suspensão ficou heterogênea,
precisando assim, ser adicionada mais 450ml de água a suspensão. Desse modo a solução
O resultado final foi de 700 ml de suspensão
 Figura 6. Suspensão de levedura contendo 350 g de levedura e 700ml de água MILLIQ.

1.3. IMOBILIZAÇÃO EM ALGINATO DE SÓDIO

Na figura 7, mostra o resultado do gotejamento, com 113 gotas/min, apresentando-se
com um aspecto esférico e firme, totalmente apta para futuros processos fermentativos.

Figura 7. Gotejamento de células de leveduras imobilizadas em alginato de cálcio

A imobilização provoca alterações quanto ao crescimento da célula, suas atividades

fisiológicas e metabólicas. Vários fatores estão envolvidos nestas alterações, tais como:
Limitações na transferência de massa pela difusão; Distúrbios no crescimento padrão; Tensão
superficial e efeitos da pressão osmótica; Redução da atividade da água; Comunicação célula-
a-célula; Mudanças na morfologia da célula; Alterações na permeabilidade da membrana e
disponibilidade dos componentes do meio. A viabilidade celular das células imobilizadas,
bem como sua atividade, são aumentadas quando estas são estocadas por longos períodos, em
baixas temperaturas.
O objetivo da prática foi alcançar 1500 esferas por frasco, logo, foi contabilizado que
a cada um minuto, 113 esferas eram formadas e caiam dentro da vidraria, ou seja, precisou de
±14 min para alcançar o valor estimado de 1500 esferas imobilizadas. No término do
experimento, as amostras foram mantidas sob refrigeração por 12h para que fossem
melhorada a consistência e a homogeneidade das estruturas.
 2. PRODUÇÃO DE ETANOL
Após a imobilização das leveduras, foram adicionadas aos frascos de Erlenmeyers
(figura 8) seguindo o protocolo obtendo o peso inicial com 367,31g. Após 120 minutos de
agitação a 35°C em 150/RPM (figura 9), com análise intercalada de 20 minutos, obteve-se o
peso final de 365,34 g. Utilizando o princípio de cálculo para analisar a produção de CO2 e
Etanol.
Onde, para a obtenção do Co2 calcula-se a diferença do peso inicial (P1) e o final (Px)
produzido:

[Co2]= P1-P2

Já para a análise do etanol produzido em cada etapa, utiliza-se a seguinte equação:

[ETOL]= ([Co2] * 0,511/ 0,48

Seguindo os princípios de cálculo, obteve-se os seguintes resultados por etapa:

Tabela 3. Tabela de resultados obtidos (em azul) com intervalos de 20 minutos.

TEMPO PESO [CO2] [ETOH]

0 367,31 g 0 0

20 366,70 g 0,61 0,649

40 366,41 g 0,9 0,958

60 366,11 g 1,2 1,277

80 365,86 g 1,45 1,54

100 365,61 g 1,7 1,809

120 365,34 g 1,97 2,097

 Figura 8.

Leveduras imobilizadas sendo colocadas em

Erlenmeyers; E posteriormente em um sistema de incubadora de piso com agitação orbital.

Figura 9. Frasco de Erlenmeyers de 500 mL com o Airlock acoplado; Terceira pesagem do sistema
com 40 minutos, o peso obtido foi 366,41 g.

3. DOSAGEM DE GLICOSE
Para realizar a dosagem de glicose do fermentado que estava presente no Erlenmeyer
Grupo 2 (G2) da figura 10, primeiro foi feito a transferência de 1 mL para o microtubo
(figura 7) e depois foi necessário fazer quatro tubos (figura 11): dois tubos com amostra
fermentada (duplicata), um tubo padrão (substituído amostra por glicose 100 mg /dL) e um
tubo para o branco (substituído amostra por água). Utilizou se o reagente GOD, em que a
reação da glicose é determinada após oxidação enzimática na presença da enzima glicose
oxidase (GOD), O peróxido de hidrogênio formado reage sob catálise de peroxidase ( POD )
com fenol e 4-aminofenazona originando a quinoneimina que é um cromógeno vermelho
violeta.

(produção de etanol); Ao lado os microtubos com o líquido fermentado.

Figura 11. Etapa de incubação das amostras; Ao lado os tubos com as amostras duplicatas (RI e RII),
glicose-padrão (G) e branco (B), respectivamente.
 Os resultados obtidos com a absorbância após o equipamento ter sido zerado com o
tubo branco, foram de 295 para o tubo padrão de glicose, e para as duplicatas: RI foi 96 de
absorbância e RII 117 de absorbância. Foi utilizado a absorbância do padrão de glicose como
parâmetro e a média entre as amostras RI e RII que foi de 106,5. Aplicado ao seguinte
cálculo:
Glicose ( g / L ) = Absorbância da amostra / Absorbância do padrão.
Obtivemos então 0,361 como resultado para dosagem de glicose.

Após todo o processo já descrito anteriormente obtêm-se os seguintes resultados por grupo,
através dos cálculos já descritos.
Tabela 4. Tabela de resultados obtidos (em azul) por grupos.
PESO PRODUTO
GRUPO INICIAL PESO FINAL SUB INICIAL SUB FINAL CO2 ETANOL
G1 374,95 369,59 100 0,8 5,36 5,7
G2 367,31 360,51 100 0,359 6,8 7,23
G3 371,74 364,81 100 0,0352 6,9 7,37
G4 444,23 431,98 100 0,48 12,25 13,04
G5 390,25 382,57 100 0,561 7,68 8,17
G6 374,88 366,85 100 0,707 8,03 8,54

4. DESTILAÇÃO DE ETANOL
Utilizamos 50 mL do fermentado que foram recuperados da etapa de obtenção de
etanol (figura 12). A destilação foi finalizada quando obtivemos 5 mL de etanol, durou cerca
de 10 minutos ao todo, ao fim da prática essa amostra foi preparada para ser quantificada.
Figura 12. Tubos contendo o fermentado pronto para serem destilados.
 CONCLUSÃO

A técnica de imobilização celular da levedura em alginato de Sódio demonstrou

elevada eficiência na imobilização celular. Essa técnica facilitará muito a separação da célula
em vários experimentos de interesse. Além disso, as cápsulas de alginato de Sódio
apresentaram boa durabilidade, podendo ser reutilizadas em vários ciclos fermentativos, o
que pode permitir o desenvolvimento de produtos estáveis para a aplicação em muitos
processos biotecnológicos, o que se destaca principalmente os de biorremediação. Portanto é
possível levarmos em consideração que a suspensão das células proporcionou que as células
obtivessem sua forma homogeneamente distribuída, propiciando no volume da esfera,
determinando sua consistência e resistência formadas das células aprisionadas, obtendo uma
forma mais esférica contida na solução, em fator da transferência de massa no gotejador. As
técnicas possibilitaram que a agitação do mosto obtivesse a formação do produto realizado
homogeneamente entre as células e a solução de alginato, contribuindo para a reação
instantânea das cápsulas nas células contidas no gotejador.

REFERÊNCIAS
1. BATISTA, Marcio de Andrade. Estudo da imobilização de células de Saccharomyces
cerevisiae em gel de alginato de cálcio no processo de fermentação alcoólica. 2005.
115 f. Dissertação (Mestrado em Engenharias) - Universidade Federal de Uberlândia,
Uberlândia, 2005.
2. BASSANI, Joseane Cristina. Imobilização de células microbianas em esferas de
alginato de cálcio e avaliação da viabilidade celular e estabilidade bioquímica em
diferentes condições de armazenamento. 2018. 77 f. Dissertação (Mestrado em
Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) - Universidade Tecnológica
Federal do Paraná, Pato Branco, 2018.
3. CASSIOLA, Flavia et al. Interaction between Saccharomyces cerevisiae and
chrysotile. European Cells and Materials, v. 2, p. 30-35, 2001.
4. KOVALESKI, Gabriela. Estudo da imobilização celular de Saccharomyces cerevisiae
em alginato de cálcio. 77 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade
Tecnológica Federal do Paraná, Ponta Grossa, 2019.
5. ORTIZ, Samara. Imobilização de Saccharomyces cerevisiae em alginato de cálcio
com nanopartículas magnéticas. Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa
Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química,
Florianópolis, 2017.
6. ROCHA, Maria De Fátima Farias. Imobilização celular e suas principais aplicações
em bioprocessos: uma revisão. Tecnologia, investigação, sustentabilidade e os
desafios do século XXI. Campina Grande: Realize Editora, 2020. p. 543-557.
Disponível em:
<https://www.editorarealize.com.br/index.php/artigo/visualizar/64942>. Acesso em:
14/01/2023
7. SANCHEZ, E.N. Desempenho de um Biorreator com Levedura Imobilizada na
Fermentação Alcoólica Contínua de Melaço-Vinhoto, Rio de Janeiro: UFRJ, 1995.
Dissertação de mestrado.
8. SCHMIDELL NETTO, Willibaldo e LIMA, Urgel de Almeida e AQUARONE,
Eugênio. Biotecnologia industrial: engenharia bioquímica. São Paulo: Edgard
Blucher, 2001.