MONITORAMENTO TERICO E PRTICO DA

FERMENTAO ETANLICA

MEIOS DE CULTURA PARA LEVEDURAS

COORDENADORES:

Profa. Dra. Dejanira Franceschi de Angelis

Prof. Dr. Octvio Antonio Valsechi

RIO CLARO 2006

MEIOS DE CULTURA PARA LEVEDURAS

Profa. Dra. Maria Ceclia F. Leite de Oliveira
Profa. Dra. Dejanira de Franceschi de Angelis

OBJETIVO: Desenvolvimento de tcnicas microbianas que possibilitem a identificao da

presena de bactrias contaminantes e leveduras diferentes daquelas usualmente
empregadas (Saccharomyces cerevisiae e S. uvarum) na fermentao etanlica.

1. MEIO WLN
1.1. Preparo do meio WLN Plaqueamento
Introduo sobre a finalidade:
- o que meio de cultura
- caracterstica principal dos meios verde de bromocresol
- necessidade de antibitico
- o que permite avaliar:
a) nmero total de clulas
b) diferenas morfolgicas entre colnias
c) produo de cido
- possibilidade de tornar o meio parcialmente seletivo pela adio de actidiona
- o que actidiona
- nveis de inibio sobre algumas leveduras
1.2. Preparo do meio
1.2.1. Composio do WLN-modificado (quantidade para 100mL):
Glicose................................................................................
KH2PO4...............................................................................
KCl......................................................................................
CaCl2.2H2O.........................................................................
MgSO4.7H2O......................................................................
FeCl3.6H2O.........................................................................
MnSO4.4H2O......................................................................
Peptona de casena............................. ................................
Extrato de levedura.............................................................
gar....................................................................................
Verde de bromocresol.........................................................
cido nalidxico.................................................................
Ampicilina..........................................................................
pH = 5,5 (HCl, 1 N)

5,0000g
0,0550g
0,0425g
0,0125g
0,0125g
0,2500g
0,2500g
0,5000g
0,4000g
2,0000g
0,0022g
5,0000mg
5,0000mg

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

(g)
(h)
(i)

Observao: os ingredientes a, b, c, d, e, f, g, h e i sero adicionados na forma de

soluo.

a) Soluo de KH2PO4 5,5 g/ 100 mL. Usar 1 mL para 100 mL de meio.

b) Soluo de KCl 4,25 g/ 100 mL. Usar 1 mL para 100 mL de meio.
c) Soluo de CaCl2.2H2O 1,25 g/ 100 mL. Usar 1 mL para cada 100 mL de meio.
d) Soluo de MgSO4.7H2O 1,25 g/ 100 mL. Usar 1 mL para cada 100 mL de meio.
e) Soluo de FeCl3.6H2O 0,5 g/ 200 mL. Usar 0,1 mL para cada 100 mL de meio.
f) Soluo de MnSO4.4H2O 0,5 g/ 200 mL. Usar 0,1 mL para cada 100 mL de meio.
g) Verde de bromocresol 220mg/ 100 mL. Dissolver em 5 mL de lcool e completar
para 100 mL com gua. Usar 1 mL para cada 100 mL de meio.

1.2.2. Procedimento

a) Pesar a glicose em um becker. Coletar gua em um becker (1/10 do volume total do

meio, isto , 10 mL) e acrescentar a glicose. Dissolver. Transferir para o tubo.
Etiquetar glicose 5 g/ 10 mL para 100 mL de WLN. Esterilizar, aps fechar com
tampo e folha de alumnio.
b) Coletar 83 mL de gua destilada em um becker, acrescentar a peptona de casena,
extrato de levedura e as solues. Dissolver em banho-maria, medir pH e ajustar com
HCl 1N, se necessrio. Acrescentar o gar e voltar ao banho-maria. Aps a
dissoluo, transferir para erlenmeyer de 250 mL e etiquetar WLN sem glicose.
Fechar com tampo de algodo e folha de alumnio. Esterilizar 10 minutos a 1
atmosfera (121oC).

1.2.3. Uso de antibitico e preparao das solues

Para minimizar o crescimento bacteriano que prejudicaria os resultados, o meio

WLN sofre a adio de antibiticos. Na rotina dos laboratrios III e IV do Departamento
de Bioqumica e Microbiologia do Instituto de Biocincias sa UNESP-Rio Claro,
verificou-se a eficincia da combinao do antibitico cido nalidxico com ampicilina.
a) Preparo da soluo de cido nalidxico (Soluo h)

Triturar 1 comprimido de 500 mg de cido nalidxico farmacutico em almofariz.

Dissolver a soluo de NaOH 0,05N completando o volume para 100 mL. Guardar
em geladeira. Usar 1 mL para cada 100 mL de meio de forma a obter 50 ppm (50
microgramas/ mililitro). A soluo de cido nalidxico autoclavvel, podendo ser
acrescentado ao meio antes da esterilizao.
b) Preparo da soluo do antibitico ampicilina (Soluo I):
Triturar 1 comprimido de 500 mg de ampicilina (farmacutica) num almofariz.
Dissolver em gua destilada, completando o volume para 100 mL. Usar 1 mL para
100 mL de meio, de forma a obter a concentrao final de 50 ppm (50 microgramas/
mililitro). Pode ser autoclavado.

2. MEIO WLN SEM BROMOCRESOL

A preparao idntica descrita em 1.2.1 e 1.2.2, exceto que no se acrescente o
verde de bromocresol.

3. MEIO WLN COM ACTIDIONA

O meio WLN pode sofrer a adio de actidiona a um nvel suficiente para inibir o
crescimento de leveduras de processo e permitir o desenvolvimento daquelas espcies
presentes que tenham menor sensibilidade ao produto. Vale lembrar que algumas
espcies de leveduras so insensveis a 1000 ppm. A actidiona inibe Saccharomyces
cerevisiae e S. uvarum nas concentraes de 2,5 e 0,17 ppm. Por medida de segurana,
trabalha-se com 5 ppm de actidiona.

Preparao da soluo de actidiona

A actidiona deve ser manipulada com mxima cautela, com o objetivo de evitar sua
ingesto ou contato com a pele.

Soluo estoque A:
Pesar 0,2 g e dissolver em 1 mL de acetona. Juntar 9 mL de gua e esterilizar por
filtrao em membrana millipore GSWP-01300, 0,22 micrometros. Essa soluo ter a
concentrao de 20 mg/ mL. Guardar em geladeira.

Soluo de trabalho B:
Transferir 5 mL da soluo A e adicionar 95 mL de gua destilada estril.
A soluo de trabalho ter a concentrao de 1mg/ mL. Usar 0,5 mL para cada
100 mL de meio j esterilizado e fundido. Guardar em geladeira.

4. PREPARAO DA AMOSTRA

Toma-se um volume medido da amostra (por exemplo, 10 mL). Centrifuga-se

com assepsia, ressuspende-se em 9 mL de soluo salina estril. Aps nova
centrifugao, o sobrenadante descartado e a massa celular ressuspensa em salina de
forma a se reconstituir o volume inicial da amostra.
A suspenso sofrer diluio em srie at 10-7. O plaqueamento em meio WLN
sem actidiona feito em duplicata, nas diluies 10-5, 10-6 e 10-7. O plaqueamento nos
demais meios feito nas diluies 10-1, 10-2 e 10-3.
Observao: a prtica de cada laboratrio indicar as melhores diluies.

5. PLAQUEAMENTO

Plaquear em superfcie 0,1 mL de suspenso de clulas por placa, espalhando com

esptula de Drigalsky. Incubar em estufa a 28oC e proceder s leituras de 2 a 5 dias.

6. MEIO DE LISINA

6.1.Introduo sobre a finalidade do uso

-

caracterstica principal do meio de lisina

necessidade de antibitico

o que permite avaliar

6.2. Preparo do meio

2.1. Composio do meio de lisina modificado (para 100 mL de meio)
YCB (Yeast Carbon Base).......................................................1,17 g
Lisina........................................................................................0,10 g

gar..........................................................................................2,00 g
Ampicilina................................................................................5,00 g
cido nalidxico.......................................................................5,00 g

6.2.1. Preparo do meio

a) Preparo da soluo YCB concentrada 10 vezes.
Tomar 11,7 g de YCB e preparar 100 mL de soluo concentrada 10 vezes, usando gua
morna. Esterilizar atravs de membrana millipore GSWP-04700 (0,22 micrmetros) e
pr-filtro AP15-04700. Esta quantidade suficiente para preparar 1000 mL de meio.

b) Preparo do meio slido

Dissolver 2,0 g de gar e 0,1 g (100 mL) de lisina em 88 mL de gua destilada em banhomaria. Adicionar 1 mL de soluo de ampicilina e 1 mL de soluo de cido nalidxico
preparados como nos itens 1.2.3.b. Autoclavar 10 minutos a 1 atmosfera (1210C). Aps
autoclavagem, adicionar assepticamente 10 mL da soluo de YCB concentrada 10
vezes.

6.3. Preparo da amostra e plaqueamento

Seguir instrues dos itens 4 e 5.

7. MEIO DE PRESERVAO DE LEVEDURAS

7.1.Meio Slido de Sabouraud 4%

- Peptona ou triptona...............................................................................10 g
- Glicose..................................................................................................40 g
- gar ......................................................................................................17 g
- gua destilada...............................................................................1000 mL
Misturar os componentes e fundir em banho-maria. a seguir, distribuir em
frascos ou tubos, tampar e esterilizar em autoclave por 10 minutos a 1 atmosfera (1210C).
Observao: este meio pode ser preparado com 20 g de glicose.

7.2.Meio YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose)

- Glicose..................................................................................................20 g
- Peptona..................................................................................................20 g
- Extrato de levedura....................10g ou 20 mL de hidrolisado de levedura
- gar...............................................................................................15 a 17 g
- gua destilada...............................................................................1000 mL
Misturar os componentes, fundir em banho-maria e a seguir, distribuir em
frascos ou tubos. Esterilizar durante 10 minutos a 1 atm de presso.

7.3.Extrato de malte 2%

- Extrato de malte....................................................................................20 g
-gar................................................................................................15 a 17 g
-gua destilada................................................................................1000 mL
Dissolver em banho-maria o extrato de malte e o gar. A seguir distribuir
em frascos ou tubos, tamponar e esterilizar durante 15 minutos a 1 atm de presso (121o)

Foto 1: Leveduras de dorna cultivada no meio WLN com

verde de bromocresol onde verifica-se diferentes biotipos.

Foto 2: Leveduras selvagens cultivadas em meio WLN

com verde de bromocresol e actidiona, onde verifica-se
diferentes biotipos.

CONTAGEM DIRETA E DETERMINAO DA VIABILIDADE CELULAR EM

LEVEDURAS

Os mtodos de contagem direta so simples e rpidos, exigem um mnimode

equipamento e permitem que seja observada simultaneamente, a morfologia celular.
No controle da viabilidade celular na fermentao alcolica, a colorao das
clulas com azul de metileno ou eritrosina e o cultivo por plaqueamento so os mais
empregados.
A porcentagem e o nmero de clulas viveis determinado transferindo-se com
uma pipeta de Pasteurs a mostra para a cmara de Neubauer . Trata-se de uma lmina
especial, precisamente dividida em quadrados de 1mm2 de rea; a lmina coberta com
uma lamnula, que deixa um volume, sobre cada quadrado, de 10-4 cm3 ou 0,1 mm3
(equivalente a 1 mL).

Figura 1. Cmara de Neubauer