11/03/2015

Estgios no processo
produtivo

Aula 2 - Profa Dra Ilana L. B. C. Camargo

Cincias Fsicas e Biomoleculares
IFSC - USP

Estgios no processo
produtivo
1- Os trs estgios do bioprocesso

2- Biorreatores

3- Upstream

3.1 Escolha do Biocatalisador

3.2 Obteno do Biocatalisador

3.3 Conservao do Biocatalisador

1
 11/03/2015

1. Os trs Estgios do
bioprocesso

Biotecnologia do bioprocesso tem trs estgios:

Processo Upstream

Biorreatores e biorreao

Processo Downstream

2
 11/03/2015

Upstream

Biorreao
/Biorreator

Downstream

Estgios do processo produtivo

Bioprocesso aplicao industrial de reaes ou vias biolgicas

mediadas por clulas vivas inteiras de animais, plantas,
microrganismos ou enzimas sobre condies controladas para a
biotransformao de matrias primas em produtos

Bioprocesso tambm pode ocorrer sem resultar em um

produto direto biorremediao, desintoxicao de resduos
ou de efluentes com ou sem subproduto ou derivados

Produto alimento, medicamento ou composto industrial

Escala laboratorial Escala industrial

3
 11/03/2015

2. Biorreatores

Biorreator ou fermentador

Biorreatores, reatores

bioqumicos, reatores biolgicos

so os reatores qumicos nos

quais ocorrem uma srie de

reaes qumicas catalisadas por

biocatalisadores

4
 11/03/2015

Biorreator ou fermentador

Biorreator de bancada

Biorreator de 90L
http://en.wikipedia.org/wiki/Bioreactor http://www.faperj.br/boletim_interna.phtml?obj_id=3930

3- Processo Upstream

5
 11/03/2015

Processo Upstream

Escolha do biocatalisador
Preparo da matria prima ou substrato a ser processado
Preparao de meio e sua esterilizao
Alimentao do biorreator
Regulao de temperatura, pH e presso
Inoculao da cultura no meio assepticamente

Biorreao

Processo Upstream

Caractersticas gerais desejveis de microrganismos para

aplicao industrial:

1. Apresentar elevada eficincia na converso do substrato

em produto;
2. Permitir o acmulo do produto no meio, de forma a se ter
elevada concentrao do produto no caldo fermentado;
3. No produzir substncias incompatveis com o produto;
4. Apresentar constncia quanto ao comportamento
fisiolgico;
5. No ser patognico
6. No exigir condies de processo muito complexas;
7. No exigir meios de cultura dispendiosos;
8. Permitir a rpida liberao do produto para o meio.

6
 11/03/2015

Processo Upstream

1 - Apresentar elevada eficincia na converso do substrato em

produto;
Matrias-primas incidem pesadamente no custo do produto final
(38 a 73% do custo total de produo)

C6H12O6 2 C2H5OH + 2CO2

1 g glicose 0,511g de etanol
S. cerevisiae rendimento de 90% da reao de fermentao anaerbia
Destilao - perda

Quando o produto produzido em menor quantidade em relao ao acar

consumido (enzimas ou antibitico) o custo com a recuperao do
produtos so mais onerosas

Processo Upstream

2 - Permitir o acmulo do produto no meio, de forma a se ter

elevada concentrao do produto no caldo fermentado;

Sem sofrer inibio mais acentuada em virtude deste acmulo

3 -No produzir substncias incompatveis com o produto;

Sem produzir proteases extracelulares

Linhagens que crescem relativamente menos, ou que acumulem

menos compostos intermedirios incrementam a sntese do
produto

7
 11/03/2015

Processo Upstream

3 -No produzir substncias incompatveis com o produto;

Exemplo:

Aspergillus produz glicoamilase

glicoamilase
Amido Glicose

Vrias aplicaes (xaropes de glicose na

indstria de alimentos)

Alguns microrganismos tambm sintetizam transglicosidase

que polimeriza a glicose novamente, porm de uma forma que
no so mais hidrolisadas pela glicoamilase

Processo Upstream

4. Apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico

Caracterstica importante: Estabilidade fisiolgica da linhagem

No basta uma linhagem hiperprodutora de uma substncia,

mas que se conhea as tcnicas mais adequadas para sua
conservao e, mais ainda, que ela se mantenha como excelente
produtora da substncia de interesse ao longo de todas as
etapas envolvidas desde sua proliferao no laboratrio,
germinadores e biorreator principal

8
 11/03/2015

Processo Upstream

Para a clula h sempre a tendncia de otimizar o crescimento,

em detrimento da sntese do produto, motivo pelo qual no
basta verificar se a clula cresce, mas se ela continua a
acumular o produto de maneira eficaz!!

Durante a proliferao da clula h sempre chances de

mutaes naturais!!

Massa pequena de clulas no inculo

Biorreatores de dezenas de milhares de litros

10g de matria seca de clulas/ L

Processo Upstream

5. No ser patognico!!
Sem riscos ambientais, particularmente nas etapas
seguintes ao trmino da fermentao (downstream)

Se manuseasse microrganismos patognicos em reatores de

dezenas de milhares de litros, os cuidados teriam de ser bastante
aumentados, o que incidiria em custos adicionais

So utilizados patgenos para produo de vacinas em reatores de

pequeno porte (poucos milhares de litros), porm confinados em
cmaras asspticas, tomando-se precaues necessrias para a no
contaminao do meio ambiente

9
 11/03/2015

Tcnicos do
Instituto Butantan
trabalham na rea
de fermentao da
linha de produo de
vacinas

http://planetasustentavel.abril.com.br/album/albumFotos_301191.shtml?foto=3

Fort Dodge (Pfizer)

http://www.leptospirosenobrasil.com.br/index.php

10
 11/03/2015

Processo Upstream

6. No exigir condies de processo muito complexas

pH e Temperatura: em reatores de grande porte no h controle

preciso, por isso o ideal que o microrganismo tenha uma faixa
de valores timos dessas grandezas e no valores pontuais,
particularmente no que se refere ao acmulo do produto

Reatores de grandes portes

(dezenas de milhares de L)

pH e oxignio

Heterogeneidade ao longo da altura do reator

Importante: clulas devem manter seu

desempenho dentro de uma faixa de
valores timos!!

11
 11/03/2015

Biotecnologia do bioprocesso

Processo Upstream

6. No exigir condies de processo muito complexas

Tenso de oxignio: os microrganismos que conseguem manter

um bom desempenho quando cultivados em baixas concentraes
de oxignio so muito interessantes

H maior gasto de energia para

a agitao e aerao do meio!

Biotecnologia do bioprocesso

Processo Upstream

Tenso de oxignio:

Microrganismos que crescem de forma aglomerada (forma miceliar, por

exemplo) so evitados, pois a concentrao de oxignio no meio de
cultivo ter de ser mais elevada, a fim de que as clulas mais internas
destes aglomerados tenham acesso a este oxignio, quando
comparadas s clulas que crescem isoladamente

12
 11/03/2015

Biotecnologia do bioprocesso

Processo Upstream

6. No exigir condies de processo muito complexas

No conveniente trabalhar com linhagens que excretam uma

quantidade exagerada de protenas para o meio

Gerao de espuma.
Isso torna complexo os processos aerbios
devido necessidade de aerar e agitar o
contedo do biorreator

Biotecnologia do bioprocesso

Processo Upstream

7. No exigir meio de cultura dispendioso

1. Ser o mais barato possvel;

2. Atender s necessidades nutricionais do microrganismo;
3. Auxiliar no controle do processo, como o caso de ser
ligeiramente tamponado, o que evita variaes drsticas do
pH, ou evitar uma excessiva formao de espuma;
4. No provocar problemas na recuperao do produto;
5. Os componentes devem permitir algum tempo de
armazenagem, a fim de estarem disponveis o tempo todo;
6. Ter composio razoavelmente fixa;
7. No causar dificuldades no tratamento final do efluente.

13
 11/03/2015

Biotecnologia do bioprocesso

Processo Upstream

7. No exigir meio de cultura dispendioso

Meios sintticos ou definidos podem ser onerosos, mas tem composio
conhecida e podem ser reproduzidos a qualquer instante.

Para clulas que apresentam bom desempenho em meios desse tipo,

espera-se a ocorrncia de um sistema produtivo muito estvel, alm de
no apresentarem problemas quanto recuperao e purificao do
produto final.

Meios definidos ou sintticos podem ser preferidos se permitirem uma

maior economia nas etapas de recuperao do produto

Biotecnologia do bioprocesso

Processo Upstream

7. No exigir meio de cultura dispendioso

Algumas linhagens precisam de fatores de crescimento como

aminocidos ou vitaminas (biotina, timina, riboflavina etc)

Adiciona-se as substncias puras para manter o meio em sua forma

mais definida No entanto... Isso pode se tornar invivel
financeiramente quando as instalaes so de grande porte.

Alternativa: adicionar materiais complexos como extrato de

levedura (autolisado de levedura), extrato de carne, extrato de
malte, peptona (hidrolisado de protenas) etc

Problema: substncias caras, composio varivel (ao longo do

tempo de armazenagem e na dependncia do fabricante e do lote
empregado) oscilao no processo fermentativo!!!

14
 11/03/2015

Biotecnologia do bioprocesso

Processo Upstream

7. No exigir meio de cultura dispendioso

Meios mais complexos e menos caros empregados na maioria dos

processos fermentativos em grande escala:

Matrias-primas naturais: caldo de cana-de-acar, melaos, farinhas

diversas (farinha de trigo, milho, soja, cevada), gua de macerao de
milho (Corn Steep Liquor) etc

Composio qumica desconhecida

Pode-se conhecer os teores de aucares disponveis, nitrognio, fsforo,
mas no se conhecem os teores dos sais minerais
Sempre so completados com alguns sais (contento nitrognio e fsforo)

Variao conforme: solo, variedade do vegetal, safra, clima,

processamento durante colheita e estocagem etc oscilaes no processo
fermentativo!!

Biotecnologia do bioprocesso

Processo Upstream

7. No exigir meio de cultura dispendioso

Empresas que produzem antibiticos ou enzimas e que utilizam essas

matrias primas naturais, principalmente a gua de macerao de milho,
devem manter uma planta piloto para o ajuste da composio do meio a
cada novo lote de matria-prima recebida para evitar surpresas nos
biorreatores de grande porte

Por serem as mais baratas so as mais utilizadas

Porm podem causar problemas adicionais na recuperao e purificao

do produto final, bem como problemas nos tratamentos das guas
residurias

15
 11/03/2015

Biotecnologia do bioprocesso

Processo Upstream

8. Permitir a rpida liberao do produto para o meio

Se o produto liberado no meio, ele poder ser recuperado nas

etapas seguintes de uma forma mais simples, sem a necessidade de
lise celular e outras reaes que elevam o custo

Se algum produto permanecer dentro das clulas ele poder ser

perdido aps a separao das clulas do meio aps a fermentao

Pode haver uma eventual inibio do prprio microrganismo pela

reteno de um dado produto do metabolismo

Reteno de certos produtos nas clulas depende entre outros

fatores de: linhagem empregada, da composio do meio de cultura e
das condies impostas (pH, temperatura, etc)

Processo Upstream

3.2. Obteno de Biocatalisadores

16
 11/03/2015

Processo Upstream

3.2. Obteno de Biocatalisadores

Biocatalisadores que possam ter interesse industrial podem ser
obtidos basicamente das seguintes formas:

Isolamento a partir de recursos naturais

Compra em colees de culturas (ATCC, NCTC...)
Manipulaes genticas:
1. Obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais
2. Fuso de protoplastos
3. Obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de
engenharia gentica

Biotecnologia do bioprocesso

Processo Upstream

Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais

Solo
gua
Plantas

Muito trabalho experimental

Custo relativamente elevado

Atividade de grande importncia para obteno de novas

linhagens de interesse industrial como linhagens melhor
produtoras de um dado produto. Alm disso, pode conduzir
descoberta de novos produtos, o que confere a esta
prtica uma relevncia inequestionvel

17
 11/03/2015

Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais

Compra em colees de culturas

Disponveis em vrios pases

Compra bastante vivel
Facilidade atravs dos recursos da Internet
Agricultural Research Service Culture Collection - (EUA)

American Type Culture Collection (ATCC) - (EUA)

http://www.atcc.org/

Coleo de Culturas Tropical (Campinas-SP)

http://www.cct.org.br

National Collection of Type Cultures (NCTC) - (Reino Unido)

http://www.hpacultures.org.uk/aboutus/nctc.jsp

German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Alemanha)

Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade - INCQS

Lab. de Microrganismos de Referncia - Fundao Oswaldo Cruz - FIOCRUZ

Microrganismos produtores de antibiticos, em geral, no esto

disponveis em uma coleo de culturas

Oriundos de programas de melhoramento gentico

18
 11/03/2015

Biotecnologia do bioprocesso

Processo Upstream

Manipulaes genticas

1. Obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais

2. Fuso de protoplastos
3. Obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de
engenharia gentica

Obteno de mutantes induzidos por

mtodos convencionais

Proliferao celular mutao natural

Mutao deleo ou adio de

uma ou mais partes qumicas Isolados
da molcula do DNA

Potencialidade de produo
- Mutantes naturais muito tempo

- Mtodos que foram a mutao: radiaes ultra-violeta, substncias

qumicas (nitrosoguanidina)

Destri-se a maioria das clulas e recuperam-se as mutadas

Verifica-se se a mutao ocorreu na direo desejada

19
 11/03/2015

Mutao pode levar perda da funo de

caractersticas indesejadas ou aumento da
produo por perda das funes de controle

Raramente leva ao aparecimento de novas

funes ou propriedades

Utilizar em microrganismo com a

caracterstica desejada para melhoramento

Penicillium chrysogenum NRRL 1951

Modificada por mutaes
Produo de penicilina aumentou de
120 UI para 2658 UI (~20x)

Fuso de protoplastos Protoplastos

Frgeis sem parede celular
Sem capacidade reprodutiva

Sem parede celular, a

probabilidade de fuso
celular entre diferentes
espcies aumenta

20
 11/03/2015

Protoplasto
Protoplasto de
fuso da clula
da folha com a
da ptala

Digesto da
parede celular

Protoplastos Meio isotnico

de clulas das
folhas de
petnias

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Protoplast_fusion.jpg

Fuso de protoplastos

Muito utilizados com leveduras, fungos filamentosos e plantas

1. Protoplastos so preparados cultivando as clulas em meios

isotnicos enquanto tratam-nas com enzimas;

2. Os protoplastos so regenerados usando estabilizadores osmticos

como a sacarose;

3. Se a fuso ocorre para formar hbridos, os recombinantes desejados

so identificados atravs de meios seletivos;

4. Aps a regenerao da parede celular, o microrganismo pode ser

utilizado para futuros estudos.

21
 11/03/2015

Fuso de protoplastos
- Fuso pode ser realada usando polietileno glicol e
tratamento das preparaes com irradiao ultravioleta

- Fuso de clulas humanas ou de animais

-Usado para o melhoramento da produo de antibiticos por

combinar mutaes de diferentes linhagens ou at mesmo
espcies

-Facilita a transferncia de DNA recombinante

-Mtodo de associar grupos inteiros de genes entre diferentes

linhagens de macro- e microrganismos

Fuso de protoplastos
Fuso de clulas de mamferos que levam produo de
anticorpos monoclonais.

Anticorpos so a principal defesa dos mamferos. Uma clula de linfcito

B produz um nico tipo de anticorpo

A produo de linfcitos B em meios de cultura no teve sucesso pois

eles ou morriam ou paravam de produzir anticorpos

1975 Georges Khler e Cesar Milstein

demonstraram a produo de anticorpos monoclonais de um hibridoma
(produto de fuso) de Linfcitos B (clulas produtoras de anticorpos) e
clulas tumorais de mieloma

1984 Prmio Nobel

1990s o valor comercial de terapias por anticorpos sozinha valia

US$ 6 bilhes!!!

22
 11/03/2015

Fuso de protoplastos

Mudana:

Clulas secretoras de
anticorpos
com tempo de vida limitado

Clulas com capacidade

contnua de crescimento
(imortais) que mantm o
potencial de secretar
anticorpos

Fuso de protoplastos

Hibridomas podem ser congelados e re-utilizados mais tarde

Aplicaes do anticorpo monoclonal:

-Diagnstico in vitro em sade humana, plantas e agricultura

animal

-Futuro: terapia com anticorpos para carregar uma droga

citotxica para o stio de clulas cancergenas

-Biotecnologia industrial: usados como ligantes de alta

afinidade para ligar e purificar produtos caros

23
 11/03/2015

Aplicaes do anticorpo monoclonal

Diagnstico imunolgico

Obteno de microrganismos recombinantes por

tcnicas de engenharia gentica

24
 11/03/2015

Obteno de microrganismos recombinantes por

tcnicas de engenharia gentica

Linhagens instveis limitam o emprego de sistemas de

fermentao mais eficientes, como processos contnuos, pois
poder acontecer, ao longo do tempo, a seleo de clulas que
privilegiem o crescimento em detrimento do acmulo do produto

Linhagens naturais
Linhagens mutantes

Clulas recombinantes por introduo de plasmdeos podem

ser instveis

25
 11/03/2015

3.3 - Conservao do
Biocatalisador

Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no

bioprocesso, ela deve ser conservada

Tcnicas de conservao:

1) Transferncia ou sub-cultura peridica em tubos ou placas

de Petri com meio de cultura slido (viabilidade: semanas)

2) Congelamento em freezers -20 C ou -70 C (anos)

3) Ultracongelamento: -196C, N lquido (anos)
4) Liofilizao: desidratao por sublimao da gua,
sob vcuo (anos ou dcadas)

26
 11/03/2015

Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no

bioprocesso, elas devem ser conservadas

... 100

... 100

Walsh G., Pharmaceutical Biotechnology, Willey ed., 2007

27
 11/03/2015

Criotubos

Congelamento

Bactrias

Lento Desequilbrio
osmtico

Clulas de mamferos
Fromao de
Rpido cristais
intracelulares
lise

28
 11/03/2015

Congelamento
Congelamento rpido minimiza os efeitos de
concentrao do soluto pois o gelo forma
uniformemente

Congelamento lento, por outro lado, resulta

em grandes perdas de gua da clula e
menos gelo intraceclular, mas aumenta os
efeitos da soluo

Manual de Criopreservao Nunc

29
 11/03/2015

Congelamento

Agente de criopreservao
agente qumico que protege as clulas durante o
congelamento. Pode minimizar os efeitos prejudiciais do
aumento da concentrao do soluto e formao de cristal

Mais comuns:
Dimetilsulfxido (DMSO) e glicerol (menos txico que DMSO).

Escolha depende da clula!!

Agentes de criopreservao podem penetrar na clula e causar um

congelamento lento intracelular e diminuir os efeitos de soluo.
DMSO - Diminui a temperatura de congelamento e permite melhor
desitradao da clula antes do congelamento intracelular.

DMSO penetra melhor nas clulas e geralmente mais usado para

clulas maiores, mais complexas como os protistas.

4 - Produo de etanol

30
 11/03/2015

Upstream

Biorreao
/Biorreator

Downstream

Exemplo prtico: Produo de etanol

Obteno da matria prima;

Upstream
Tratamento/preparo

Escolha do microrganismo

Preparo do pr-inculo e
inculo

Downstream

Resduos dos gros

31
 11/03/2015

Biotecnologia do bioprocesso

Pr-inculo

Biorreao
Biorreatores

Inculo

Smith J E, Biotechnology, ed. Cambridge, 2004

32
11/03/2015

33
 11/03/2015

Biotecnologia do bioprocesso

Prximas aulas!!

- Obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de

engenharia gentica

- Biorreatores

- Biorreao

-Processo Downstream

Referncias

Manual de criopreservao Nunc ver site da disciplina

Captulo 3 - Genetics and biotecnology (John Smith Biotechnology)

ver site da disciplina

Prescott, Harley and Klein. 2002 Microbiology, 5th edition, The McGraw-
Hill (Chapter 42- Biochemistry - Industrial Microbiology And
Biotechnology) ver site da disciplina

Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia

Industrial: Engenharia Bioqumica. Volume 2. Ed Edgard Blcher
LTDA, So Paulo, 2001. Cap. 2.

34