Pduction

Process
Estágios do
Stages
Processo Produivo
Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia Pduction

Recuperação de Purificação de Bioprodutos

Process

Profª Francine Fioravanso Tramontina

Stages
Processos Industriais
Conjunto de operações realizadas em maior ou
menor tempo para poder criar, fabricar ou
transformar matéria-prima em produtos específicos e
adequados que possam satisfazer a demanda do
consumidor.

Matéria-
Produto
Prima
Bioprocesso
Aplicação industrial de reações ou vias biológicas mediadas por
células vivas inteiras de animais, plantas, microrganismos ou
enzimas sobre condições controladas para a biotransformação
de matérias primas em produtos;

Também pode ocorrer sem resultar em um produto direto –

biorremediação, desintoxicação de resíduos ou de efluentes com
ou sem subproduto ou derivados

Células Animais
Células Vegetais
Matéria-Prima Produto
Micro-Organismos
Enzimas
Classificação dos Bioprocessos
• Extrativos

• Reativos
• Fermentativos
• Enzimátios
Classificação dos Bioprocessos
Processo Processo
Enzimático Fermentativo

Agente das transformações que Agentes de transforação que

ocorrem no reator são uma ocorrem no reator são elementos
enzima ou uma mistura de vivos: micro-organismos, células
enzimas (purificadas ou não) animais, células vegetais ou vírus.

Também pode conter células As reações que se desenvolvem no

inativadas ou mortas que servem reator sõ consequência de atividade
como suporte das enzimas. vital .

Exemplo: ação das poimerases Exemplo: excreção do biopolímero

sobre o biopolímero xantana. xntana para o meio extracelular
Processo Fermentativo
Genérico
O que pode ser produzido
Processo Produtivo
Conjunto de operações de natureza produtiva necessárias
para transformar as matérias-primas em produto acabado.
Estágios do Processo Produtivo

UPSTREAM

FERMENTAÇÃO

DOWNSTREAM
Estágios do Processo Produtivo

Upstream Fermentação Downstream

• Tratamentos iniciais • Ocorre no reator, • Tratamentos finais

que antecedem a que é o elemento que englobam a
operação no reator; central do processo separação e a
• Objetivo: colocar o boiotecnológico purificação dos
sistema nas industrial; produtos e
condições • Ocorrem a subprodutos
previamente transformações de obtidos, bem como
escolhidas para que interesse o tratamento dos
as reações no reator resíduos formados.
se desenvolvam a
conento.
Estágios do Processo Produtivo
Estágios do Processo Produtivo
 UPSTREAM
Sistema de Expressão Uilizado
Melhoramento da Linhagem
Conservação da Linhagem
Meio de Cultura
Tipo de Biorreator
Condução do processo
DOWNSTREAM
 Pduction

Process

Processos
Stages

Upstream: USP
Pduction

Process

Stages
Processamento Upstream: USP
O processamento upstream se refere ao estágio de
bioprocessamento em que as células são cultivadas
até a quantidade desejada em biorreatores incluindo
todos os estágios relacionados a isso, como:

isolamento celular,
cultivo celular,
preparação de meio,
banco de células e
armazenamento para expansão da
cultura até a colheita.
Processamento Upstream - USP

• Basicamente, o
processamento
upstream é tudo
relacionado à
produção em massa
das células e do
produto.
Processamento Upstream - USP
Etapas do Processamento
Upstream
1 - Aspectos relacionados aos estágios de seleção, adaptação, preparação de
inóculo e estágios de pré-fermentação.
• Escolha do biocatalisador

2 - Otimização do meio cujo objetivo é maximizar o rendimento

• Preparo da matéria prima ou substrato a ser processado
• Preparação de meio e sua esterilização
• Alimentação do biorreator

• 3 - Otimizar o crescimento do microrganismo no processo fermentativo.

• Regulação de temperatura, pH e pressão
• Inoculação da cultura no meio assepticamente
USP – Parâmetros de influência
• composição do meio de fermentação;
• as condições de crescimento celular;
• fase de produção;
• as características dos microrganismos segurança,
classificação, morfologia, estabilidade térmica,
tendência à floculação, tamanho, rigidez da parede
celular, e aderência a parede.
USP – Parâmetros de influência
• A localização do produto (intracelular, depositado
em vacúolos ou corpos de inclusão ou excretado no
meio de cultura) irá definir os passos iniciais de
separação e a estratégia de purificação.

• A estabilidade do produto dentro das células ou no

meio de cultura define o tipo de pré-tratamento
para inativação ou estabilização.
USP – Parâmetros de influência
• muitas vezes os meios de cultura obtidos a partir de
resíduos apresentam problemas, uma vez que são pouco
definidos com respeito a componentes desconhecidos como
traços de herbicidas ou pesticidas

• a produção de metabólitos secundários ou impurezas, como

qualquer adição ao meio (p. ex. anti-espumantes), pode
formar uma camada interfacial nas etapas de extração,
fornecendo picos em cromatogramas, bloqueando
membranas de ultrafiltração e equipamentos analíticos
USP – Escolha do
Biocatalizador
Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto;

Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concentração do

produto no caldo fermentado;

Não produzir substâncias incompatíveis com o produto;

Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico;

Não ser patogênico;

Não exigir condições de processo muito complexas;

Não exigir meios de cultura dispendiosos;

Permitir a rápida liberação do produto para o meio.

USP – Escolha do Biocatalizador
1 - Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto;
Matérias-primas incidem pesadamente no custo do produto final
(38 a 73% do custo total de produção)

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2

1 g glicose 0,511g de etanol

S. cerevisiae rendimento de 90% da reação de fermentação anaeróbia

Quando o produto é produzido em menor quantidade em relação ao açúcar

consumido (enzimas ou antibiótico) o custo com a recuperação do produtos são
mais onerosas.

24
USP – Escolha do Biocatalizador
2 - Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter
elevada concentração do produto no caldo fermentado;
Sem sofrer inibição mais acentuada em virtude deste acúmulo

3 -Não produzir substâncias incompatíveis com o produto;

Sem produzir proteases extracelulares
Linhagens que crescem relativamente menos, ou que acumulem
menos compostos intermediários incrementam a síntese do
produto

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USP – Escolha do Biocatalizador

3 -Não produzir substâncias incompatíveis com o produto;

Exemplo: Aspergillus produz glicoamilase

Amido Glicose (produto)

• Alguns microrganismos também sintetizam transglicosidase que

polimeriza a glicose novamente, porém de uma forma que não
são mais hidrolisadas pela glicoamilase

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USP – Escolha do
Biocatalizador
4. Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico

Característica importante: Estabilidade fisiológica da linhagem

Não basta uma linhagem hiperprodutora de uma substância, mas que

se conheça as técnicas mais adequadas para sua conservação e, mais
ainda, que ela se mantenha como excelente produtora da substância
de interesse ao longo de todas as etapas envolvidas desde sua
proliferação no laboratório, germinadores e biorreator principal

Para a célula há sempre a tendência de otimizar o crescimento, em

detrimento da síntese do produto, motivo pelo qual não basta
verificar se a célula cresce, mas se ela continua a acumular o produto
de maneira eficaz!! Durante a proliferação da célula há sempre
chances de mutações naturais!!
27
USP – Escolha do Biocatalizador
5. Não ser patogênico!!

Sem riscos ambientais, particularmente nas etapas seguintes

ao término da fermentação (downstream)

Se manuseasse microrganismos patogênicos em reatores de

dezenas de milhares de litros, os cuidados teriam de ser
bastante aumentados, o que incidiria em custos adicionais.

São utilizados patógenos para produção de vacinas em reatores

de pequeno porte (poucos milhares de litros), porém confinados
em câmaras assépticas, tomando-se precauções necessárias
para a não contaminação do meio ambiente

28
USP – Escolha do
Biocatalizador
• Técnicos do Instituto Butantan trabalham na área de
fermentação da linha de produção de vacinas

29
USP – Escolha do Biocatalizador
6. Não exigir condições de processo muito complexas

pH e Temperatura: em reatores de grande porte não há controle

preciso, por isso o ideal é que o microrganismo tenha uma faixa de
valores ótimos dessas grandezas e não valores pontuais,
particularmente no que se refere ao acúmulo do produto

30
USP – Escolha do Biocatalizador
6. Não exigir condições de processo muito complexas

pH e oxigênio: aumento da heterogeneidade ao longo da altura do

reator (reatores de grande porte - dezenas de milhares de L).
Importante: células devem manter seu desempenho dentro de
uma faixa de valores ótimos!!

Tensão de oxigênio: os microrganismos que

conseguem manter um bom
desempenho quando cultivados em baixas
concentrações de oxigênio são muito
interessantes.
Há maior gasto de energia para a agitação e
aeração do meio! 31
USP – Escolha do Biocatalizador
6. Não exigir condições de processo muito complexas

• Tensão de oxigênio: Microrganismos que crescem de forma

aglomerada (forma miceliar, por exemplo) são evitados, pois a
concentração de oxigênio no meio de cultivo terá de ser mais
elevada, a fim de que as células mais internas destes
aglomerados tenham acesso a este oxigênio, quando
comparadas às células que crescem isoladamente

32
USP – Escolha do Biocatalizador
6. Não exigir condições de processo muito complexas

Geração de espuma: não é conveniente trabalhar com linhagens

que excretam uma quantidade exagerada de proteínas para o
meio. Isso torna complexo os processos aeróbios devido à
necessidade de aerar e agitar o conteúdo do biorreator

33
USP – Escolha do Biocatalizador
7. Não exigir meio de cultura dispendioso
• Ser o mais barato possível;
• Atender às necessidades nutricionais do microrganismo;
• Auxiliar no controle do processo, como é o caso de ser
ligeiramente tamponado, o que evita variações drásticas do
pH, ou evitar uma excessiva formação de espuma;
• Não provocar problemas na recuperação do produto;
• Os componentes devem permitir algum tempo de
armazenagem, a fim de estarem disponíveis o tempo todo;
• Ter composição razoavelmente fixa;
• Não causar dificuldades no tratamento final do efluente.

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 USP – Escolha do
Biocatalizador
7. Não exigir meio de cultura dispendioso

Meios sintéticos ou definidos podem ser onerosos, mas tem

composição conhecida e podem ser reproduzidos a qualquer
instante.

Para células que apresentam bom desempenho em meios desse tipo,

espera-se a ocorrência de um sistema produtivo muito estável, além
de não apresentarem problemas quanto à recuperação e purificação
do produto final.

Meios definidos ou sintéticos podem ser preferidos se permitirem

uma maior economia nas etapas de recuperação do produto

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USP – Escolha do Biocatalizador
7. Não exigir meio de cultura dispendioso

Algumas linhagens precisam de fatores de crescimento como aminoácidos

ou vitaminas (biotina, timina, riboflavina etc)

Adiciona-se as substâncias puras para manter o meio em sua forma mais

definida –

No entanto... Isso pode se tornar inviável financeiramente quando as

instalações são de grande porte.

Alternativa: adicionar materiais complexos como extrato de levedura

(autolisado de levedura), extrato de carne, extrato de malte, peptona
(hidrolisado de proteínas) etc

Problema: substâncias caras, composição variável (ao longo do tempo de

armazenagem e na dependência do fabricante e do lote empregado) –
oscilação no processo fermentativo!!!
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USP – Escolha do Biocatalizador
7. Não exigir meio de cultura dispendioso

Meios mais complexos e menos caros empregados na maioria dos processos

fermentativos em grande escala:

Matérias-primas naturais: caldo de cana-de-açúcar, melaços, farinhas

diversas (farinha de trigo, milho, soja, cevada), água de maceração de milho
(Corn Steep Liquor) etc

•Composição química desconhecida

•Pode-se conhecer os teores de açucares disponíveis, nitrogênio,
fósforo, mas não se conhecem os teores dos sais minerais
•Sempre são completados com alguns sais (contento nitrogênio e
fósforo) Variação conforme: solo, variedade do vegetal, safra, clima,
processamento durante colheita e estocagem etc – oscilações no processo
fermentativo!!
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USP – Escolha do Biocatalizador
7. Não exigir meio de cultura dispendioso

Empresas que produzem antibióticos ou enzimas e que utilizam

essas matérias primas naturais, principalmente a água de
maceração de milho, devem manter uma planta piloto para o
ajuste da composição do meio a cada novo lote de matéria-
prima recebida para evitar surpresas nos biorreatores de grande
porte
• Por serem as mais baratas são as mais utilizadas
• Porém podem causar problemas adicionais na recuperação e
purificação do produto final, bem como problemas nos
tratamentos das águas residuárias

38
USP - Obtenção de Biocatalizadores

Obtenção de Biocatalisadores
Biocatalisadores que possam ter interesse industrial podem ser
obtidos basicamente das seguintes formas:

•Isolamento a partir de recursos naturais

•Compra em coleções de culturas (ATCC, NCTC...)
•Manipulações genéticas:
Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais
Fusão de protoplastos
Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de
engenharia genética

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USP - Obtenção de Biocatalizadores
Obtenção de Biocatalisadores
Biocatalisadores que possam ter interesse industrial podem ser
obtidos basicamente das seguintes formas:

•Isolamento a partir de recursos naturais

•Compra em coleções de culturas (ATCC, NCTC...)
•Manipulações genéticas:
Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais
Fusão de protoplastos
Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de
engenharia genética

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USP - Obtenção de Biocatalizadores
Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais
• Solo
• Água
• Plantas

Atividade de grande importância para obtenção de novas linhagens

de interesse industrial como linhagens melhor produtoras de um
dado produto. Além disso, pode conduzir à descoberta de novos
produtos, o que confere a esta prática uma relevância
inequestionável

41
USP - Obtenção de Biocatalizadores

42
USP - Obtenção de Biocatalizadores

43
USP - Obtenção de Biocatalizadores
Compra em coleções de culturas
o Disponíveis em vários países
o Compra bastante viável
o Microrganismos produtores de antibióticos, em geral, não estão
disponíveis em uma coleção de culturas Oriundos de programas de
melhoramento genético
o Facilidade através dos recursos da Internet

o Agricultural Research Service Culture Collection - (EUA)

o American Type Culture Collection (ATCC) - (EUA) http://www.atcc.org/
o Coleção de Culturas Tropical – (Campinas-SP) http://www.cct.org.br
o National Collection of Type Cultures (NCTC) - (Reino Unido) http://www.hpacultures.org.uk/aboutus/nctc.jsp
German
o Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Alemanha) I
o Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde - INCQS Lab. de Microrganismos de Referência -
Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ
44
USP - Obtenção de Biocatalizadores

Manipulações genéticas
• 1.Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais
• 2.Fusão de protoplastos
• 3.Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de
engenharia genética

45
USP - Obtenção de Biocatalizadores

Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais

Proliferação celular mutação natural

Isolados Potencialidade de produção

Mutantes naturais – muito tempo

Métodos que forçam a mutação:
• Radiações ultra-violeta, substâncias químicas (nitrosoguanidina)
• Destrói-se a maioria das células e recuperam-se as mutadas
• Verifica-se se a mutação ocorreu mmmkna direção desejada

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USP - Obtenção de Biocatalizadores
• Mutação pode levar à perda da função
de características indesejadas ou
aumento da produção por perda das
funções de controle

• Raramente leva ao aparecimento de

novas funções ou propriedades Utilizar
em microrganismo com a
característica desejada para
melhoramento

Penicillium chrysogenum NRRL 1951

Modificada por mutações
Produção de penicilina aumentou de
120 UI para 2658 UI (~20x)

47
USP - Obtenção de Biocatalizadores

Fusão de protoplastos

Protoplastos
Frágeis
Sem parede celular
Sem capacidade reprodutiva

• Sem parede celular, a

probabilidade de fusão
celular entre diferentes
espécies aumenta

48
USP - Obtenção de Biocatalizadores

49
USP - Obtenção de Biocatalizadores
Fusão de protoplastos

Muito utilizados com leveduras, fungos filamentosos e

plantas

• Protoplastos são preparados cultivando as células em

meios isotônicos enquanto tratam-nas com enzimas;

• Os protoplastos são regenerados usando estabilizadores

osmóticos como a sacarose;

• Se a fusão ocorre para formar híbridos, os recombinantes

desejados são identificados através de meios seletivos;

• Após a regeneração da parede celular, o microrganismo

pode ser utilizado para futuros estudos.
50
USP - Obtenção de Biocatalizadores
Fusão de protoplastos

• Fusão pode ser realçada usando polietileno glicol e

tratamento das preparações com irradiação ultravioleta -
Fusão de células humanas ou de animais

• Usado para o melhoramento da produção de antibióticos

por combinar mutações de diferentes linhagens ou até
mesmo espécies

• Facilita a transferência de DNA recombinante

• Método de associar grupos inteiros de genes entre

diferentes linhagens de macro- e microrganismos 51
USP - Obtenção de Biocatalizadores
Fusão de protoplastos

• Fusão de células de mamíferos que levam à produção de

anticorpos monoclonais.

• Anticorpos são a principal defesa dos mamíferos. Uma célula de

linfócito B produz um único tipo de anticorpo

• A produção de linfócitos B em meios de cultura não teve sucesso

pois eles ou morriam ou paravam de produzir anticorpos

• 1975 – Georges Köhler e Cesar Milstein demonstraram a produção

de anticorpos monoclonais de um hibridoma (produto de fusão) de
Linfócitos B (células produtoras de anticorpos) e células tumorais
de mieloma 52
USP - Obtenção de Biocatalizadores

Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas

de engenharia genética

Linhagens instáveis limitam o emprego de sistemas de

fermentação mais eficientes, como processos contínuos, pois
poderá acontecer, ao longo do tempo, a seleção de células
que privilegiem o crescimento em detrimento do acúmulo do
produto

• Linhagens naturais
• Linhagens mutantes Células recombinantes por introdução
de plasmídeos podem ser instáveis ]
53
USP - Obtenção de Biocatalizadores

Obtenção de
microrganismos
recombinantes por
técnicas de
engenharia
genética

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USP - Obtenção de Biocatalizadores
Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no
bioprocesso, ela deve ser conservada

Técnicas de conservação:

➢Transferência ou sub-cultura periódica em tubos ou placas

de Petri com meio de cultura sólido (viabilidade: semanas)

➢Congelamento em freezers -20 ˚C ou -70 ˚C (anos)

➢Ultracongelamento: -196˚C, N líquido (anos)

➢Liofilização: desidratação por sublimação da água, sob

vácuo (anos ou décadas)
55
USP - Conservação do
Biocatalizador

56
USP - Conservação do
Biocatalizador
Congelamento lento ou rápido?

57
USP - Conservação do
Biocatalizador
Congelamento lento ou rápido?

• Congelamento rápido minimiza os efeitos de concentração

do soluto pois o gelo forma uniformemente

• Congelamento lento, por outro lado, resulta em grandes

perdas de água da célula e menos gelo intraceclular, mas
aumenta os efeitos da solução

58
USP - Conservação do
Biocatalizador
Agente de criopreservação

Agente químico que protege as células durante o congelamento.

Pode minimizar os efeitos prejudiciais do aumento da concentração
do soluto e formação de cristal:

Dimetilsulfóxido (DMSO) e glicerol (menos tóxico que DMSO).

Escolha – depende da célula!!

Agentes de criopreservação podem penetrar na célula e causar um

congelamento lento intracelular e diminuir os efeitos de solução.

DMSO - Diminui a temperatura de congelamento e permite melhor

desitradação da célula antes do congelamento intracelular.

DMSO penetra melhor nas células e geralmente mais usado para

células maiores, mais complexas como os protistas. 59
• Rudakiya, Darshan. (2019). Strategies to Improve
Solid-State Fermentation Technology.
10.1016/B978-0-444-64223-3.00010-2.
• https://bioprocessingexplained.home.blog/categor
y/upstream-processing/