Introdução a

Biotecnologia
3º Unidade
AULA 1: Processo Produtivo dos Biofármacos
Profa. Cristiane Fernandes de Assis
https://youtu.be/a3qlCahAFCY
Medicamentos Biológicos

Medicamentos Biológicos são medicamentos obtidos a partir

da utilização de células geneticamente modificadas para a
produção de proteínas terapêuticas.
Histórico da Biotecnologia
Recapitulando...
Biotecnologia Clássica
Produção de Produtos Biotecnológicos

DIAGNÓSTICO IN
BIOFÁRMACOS
VIVO E IN VITRO

BIOTECNOLOGIA NA
SAÚDE

TERAPIA CELULAR
VACINA E CÉLULAS
TRONCO

TERAPIA GÊNICA
Sistema de expressão de Medicamentos
Biológicos

Procarionte Eucarionte
Sistemas de expressões dos
Medicamentos Biológicos
 Bactérias
 Fungos e leveduras
 Células de insetos
 Células de mamíferos
 Plantas transgênicas
 Animais transgênicos
Produção
Sistemas de Expressão

 BACTÉRIAS
 Vantagens
 Bem estabelecidos;
 Rápido crescimento;
 Baixo custo de meio;
 Alto rendimento
Produção
Sistemas de Expressão

 BACTÉRIAS
 Desvantagens
 Mudanças pós-traducionais ;
 Presença de lipopolissacarídeos de natureza pirogênica;
 Sistema fraco de secreção no sistema;
 Acumulo intracelular (corpos de inclusão)
 Contaminação por fagos
 Necessidade de tags (Tag) para melhor purificação
Produção
Sistemas de Expressão

 BACTÉRIAS
 Escherichia coli, Bacillus subtillis
Produtos Comerciais Obtidos por E. Coli
Produção
Sistemas de Expressão

 FUNGOS E LEVEDURAS
 Vantagens:
 Características genéticas bem conhecidas
 Manipulação genética fácil
 Boa aplicação Industrial
 Melhor expressão pós traducional do que E. coli
 Não tem endotoxinas
 Não tem risco de agentes adventícios
Produção
Sistemas de Expressão

 LEVEDURAS
 Saccharomyces cerevisae, Pichia pastori

 Fungos
 Aspergillus, Trichoderma
Produção
Sistemas de Expressão

 FUNGOS E LEVEDURAS
 Desvantagens:
 Protease endógenas
 Glicosilção diferente das células eucarióticas - alta [manose]
 Sistema de expressão ideal para produção de vacinas mas não para
biofarmácos
 Alta imunogenicidade
Produção dos Biofarmacos
Sistemas de Expressão

 Células de mamíferos

 Vantagens:

 Melhor expressão pós-traducional (carboxilação, hidroxilação,

sulfatação, fosforilação e especialmente glicosilação)

 Expressão de proteínas para o exterior – facilidade na purificação

 Aumenta a atividade biológica e estabilidade e diminui

imunogenicidade.
 Produção
Sistemas de Expressão

 Células de Mamíferos
 Desvantagens
 Fácil contaminação
 Difícil manipulação em grandes volumes
 Presença de agentes adventícios (vírus, príons)
 Custo elevado
 Exemplo:
 Células do ovário de hamster chinês (CHO)
 Padrão de glicosilção adequado
 Baixa suceptibilidade a vírus que afeta humanos.
 Processo Produtivo dos Biofármacos

Geração da
linhagem
produtora
Produção e
caracterização
do Banco celular
Desenvolv./
Escalonamento
do processo fermentativo
Purificação da proteína
Upstream
Formulação final

Downstream Controle de Qualidade

Etapas do Bioprocesso com células
animais
 Obtenção e controle da célula original para a produção de biotecnológicos
 Linhagens celulares – Coleções comerciais de cultura de células
 ATCC – American Type Culture Collection
 ECACC – European Collection of Animal Cell Culture
 DSMZ – Resource Centre for Biological Material
 OMS (1987) publicou as primeiras orientações para trabalhos com células
diploides e contínuas na produção de biológicos
 FDA E Conferência Internacional de Harmonização dos Requerimentos
Técnicos para o Registro de Produtos Farmacêuticos para Uso Humano –
orienta as normas adequadas para a preparação e caracterização de um banco
de células para produção de biotecnológicos.
 Obtenção e Controle de Banco de
Células
Transfecção Expansão

Seleção

Crescimento e
Recuperação
Avaliação,
Crescimento
Otimização do
processo
Amplificação
Banco de Células
Mestre
Triagem
Banco de Células de Trabalho
 Testes de Qualificação para o Banco de
Células
Banco de células mestre
 Viabilidade (0-24 h)
 Teste de esterilidade (bactérias e
fungos)
 Cariotipagem
 Análise de perfil de DNA
(fingerprinting)
 Análise de isoenzimas
 Teste do micoplasma
 Ausência de agentes adventícios
 Estabilidade
Banco de células de trabalho
 Viabilidade (0-24 h)
 Teste de esterilidade (bactérias e
fungos)
 Análise de perfil de DNA
(fingerprinting)
 Teste do micoplasma
 Ausência de agentes adventícios
 Estabilidade
 Cariotipagem

✓ Realizada em intervalões regulares

✓ Observação do conteúdo cromossômico das linhagens celulares
✓ Permite detecção de aberrações cromossômicas no número de cromossomos ou morfologia
✓ Indicada para células diploides
Análise de Isoenzimas

 Isoenzimas – são enzimas que apresentam a mesma função

porém diferem na sequencia de aa.

 LDH – Lactato desidrogenase

 G6PD – Glicose 6 fosfato desidrogenase

 Perfil característico de mobilidade de cada isoenzima

 Detecta fase inicial de uma contaminação

DNA fingerprinting

 Métodos de DNA fingerprinting geram um “perfil” ou “impressão

digital” (marcadores moleculares) do ácido nucléico, com técnicas
que analisam polimorfismos relacionados às repetições em tandem de
número variável (Variable Number of Tandem Repeats ou VNTR), os
quais tendem a ser únicos para cada organismo.
Estabilidade

 Vai averiguar a produção consistente da proteína e retenção da

capacidade de produção durante o armazenamento

 Análise comparativa da estabilidade

 Genética das células produtoras (BCM) e células mantidas in

vitro

 São realizadas análises de PCR para ser feito o sequenciamento

do DNA, para detectar qualquer inserção ou deleção de
sequência.
Teste do Micoplasma

 Bactérias do gênero Mycoplasma (tamanho com cerca de 0,3µm), não

tem parede celular.
 Verificar a contaminação do produto e perda do banco de células.
 Testes realizados para detecção de micoplasma

 Método imunológico (Elisa ou Imunofluorescência direta)

 Método genético (PCR)

 Isolamento direto em meio de cultivo próprio

Agentes Adventícios

 Ensaios mais difíceis de realizar

 Presença de vírus na cultura celular

 Pode ser proveniente da própria cultura

Processos Upstream
Processos Upstream
Processos Downstream
Desenvolvimento do Processo