Tecnologias high-throughput:

Genoma, Transcriptoma,
Proteoma e biotecnologia

Biotecnologia

Genomas

Genomas eucariticos

As estratgias para sequenciar o genoma

Estratgias de sequenciamento
Positional sequencing
Shot-gun sequencing

Marcadores para sequenciamento

Classes gnicas

Sequenciamento manual

Sequenciamento Automtico
C
C
G

DNA marcado, cada

nucleotdeo com um
fluorforo de uma cor

A
T
Migrao do DNA

Laser
Detector

Evoluo do sequenciamento

Sequenciamento

Manual

Automatico

Pyrosequenciamento

bp/reao

200/300 bp

500/1000 bp

50 bp

Total de bp/dia

300 bp

1x104 bp

8x106 bp

Tempo estimado para

sequenciar o genoma
inteiro

indeterminado

anos

meses

Sequenciamento do genoma humano

Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

Alelo 1
- SNP alterao de uma base no
DNA em uma populao;
- No genoma estima-se que existem
cerca de 10 milhes de SNP;
- Os
SNPs
podem
conferir
susceptibilidade a certas doenas,
patgenos e at resistncia a drogas.
- Tipos de SNP: Substituio, deleo
ou adio.
Alelo 2

Copy Number Variation (CNV)

- CNV so perdas ou ganhos de grandes regies de DNA, essas variaes
podem variar entre centenas a 5 milhes de pb.

- CNV pode estar associado a diversas doenas:

- Elevadas CNV do gene CCL3L1 diminui susceptibilidade de infeco
por HIV;
- Baixas CNV de FCGR3B esta associado a susceptibilidade doenas
auto-imunes, como Lupus.

Estudos em larga escala

Genmica Funcional

Transcriptoma
Estudo dos transcritos expressos no genoma em
uma situao fisiolgica ou patolgica especfica.

Proteoma
Estudo das protenas expressas no genoma em
uma situao fisiolgica ou patolgica especfica.

Mtodos para estudar expresso gnica

Differential Display

Differential display (DD)

Microarray

Farmacogenmica

Plataforma de Microarray
Software

Forno de hibridizao
Lavagens

Chip

Scanner

Microarray
em
leucemias

Identificando subtipos leucmicos

Biomarcadores

Biotecnologia

Tcnicas / Bens
Gentica, Bioqumica, Biologia Celular,
Biologia Molecular,Genmica
Tecnologia de Processos
Nanotecnologia
Bioinformtica
Robotica

HISTRICO
6000 2000 aC panificao e bebidas
fermentadas por egpcios,sumrios,
babilnicos e gregos
1875 dC Louis Pasteur : queda da Teoria
da Gerao Espontnea e incio dos
processos de fermentao/esterilizao.

HISTRICO
Processos fermentativos e produo de
antibiticos em larga escala

Histrico
1928 Experimentos de transformao no
pneumococo
1953 descoberta da estrutura do DNA
Dcada de 70 e 80 avanos na tecnologia do DNA
(Paul Berg, Stanley N. Cohen, Herbert Boyer)

Tcnicas de clonagem, expresso de genes

sequenciamento genmico

Histrico
Descoberta e utilizao de exonucleases de
restrio (enzimas de restrio)
(endonucleases do tipo II
BamHI, EcoRI, SmaI, NotI)

Descoberta e utilizao das ligases

(T4 DNA ligase por exemplo)

A deficincia de hormnio do crescimento faz

com que a pessoa fique com uma estatura
baixa. Nesses casos, necessrio o uso
hormnio do crescimento para que o
crescimento dessas crianas melhore.
O hormnio do crescimento foi um dos
primeiros produtos da engenharia gentica.
Ele foi produzido em E. coli a partir de um
gene humano fusionado com elementos
reguladores bacterianos.
Esse foi o segundo produto farmacutico
aprovado pelo FDA, em 1985.

O primeiro foi a insulina humana, em 1982.

Como amplificar um
gene de interesse

Tipo de DNA doador

DNA genmico

cDNA DNA complementar

cDNA
contm apenas
os xons

DNA de interesse

vetor

Formao de uma
molcula de DNA
recombinante

Enzimas de Restrio

Tcnicas de Manipulao de
DNA
Clonagem e expresso de Genes
Vetores de clonagem e expresso
Vetores virais (cosmdios e fagos)
Vetores cromossmicos

Vetores de Clonagem
Vetores Plasmidiais

Vetores Plasmidiais
Fragmentos de at 15000 pb
Necessidade de insero em linhagens
bacterianas para replicao do inserto
clonado no plasmdio
Preparao de receptores competentes

VETORES
Plasmdeos: so molculas de
DNA circulares,
extracromossmicas, presentes em
microrganismos, sendo que muitos
se replicam autonomamente.

Estrutura de dois plasmdeos

Como funciona a
amplificao

pBR322
Seleo por perda de
resistncia
Insertos de maiores
tamanhos (cerca de at
5Kb)

pUC18/19
Seleo por perda de
colorao das colnias
com plasmdios contendo
o inserto de interesse
Fragmentos de at 3kb
(perda de eficincia da
ligao)
Facilidade em sequenciar
os fragmentos clonados

Vetores de expresso
Insero do gene de interesse sobre o
controle de um promotor forte (expresso
da protena alvo);
Fuso do gene alvo com genes reporters,
sequncias proticas (lacZ, gfp, his-tag)

pGEMT Easy Clone

Vetores de Expresso

Vetores de natureza viral

Cosmdios e Fagos

Vetores Virais
Insertos maiores que em plasmdios (at
23000 pb para fagos)
Empacotamento do fago in vitro

Cosmdios
Derivados principalmente do fago ;
Clonagem de grandes fragmentos
cromossmicos ou de DNA (45000pb);
Empacotamento in vitro (regio cos)
Pode ser inserido em bactrias por
transformao ou induo de ciclo ltico
(fago)

Cosmdios

Ap

ori

Regio cos : empacotamento

das pastculas virais
Ciclo Ltico necessrio
Utilizao em bactria e fag
(shuttle)
Regio de polylinker
Genes de seleo
por resistncia antibiticos

Vetores Cromossmicos
YAC (Yeast Artificial Chromosomes)

BAC (bacterial artificial chromosomes)

PAC (plant artificial chromosomes)

Vetores Cromossmicos
Clonagem de maiores fragmentos de DNA
Possibilidade de glicosilao aps
transcrio da protena alvo

YACs

YACs

BACs