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Universidade Federal do Espírito Santo Laboratório de Biotecnologia Aplicado ao Agronegócio Análise de expressão

Universidade Federal do Espírito Santo Laboratório de Biotecnologia Aplicado ao Agronegócio

do Espírito Santo Laboratório de Biotecnologia Aplicado ao Agronegócio Análise de expressão gênica Fernanda Bravim
Análise de expressão gênica
Análise de expressão gênica
Fernanda Bravim
Fernanda Bravim
EXPRESSÃO GÊNICA • Processo pelo qual a informação contida em um gene é traduzido em
EXPRESSÃO GÊNICA
EXPRESSÃO GÊNICA

Processo pelo qual a informação contida em um gene é traduzido em estruturas presentes em um determinado tipo celular (mRNA ou proteínas).

informação contida em um gene é traduzido em estruturas presentes em um determinado tipo celular (mRNA
CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA • Nos microrganismos controle da serve principalmente para permitir que as
CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA
CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA

Nos

microrganismos

controle

da

serve

principalmente para permitir que as células se ajustem às

seu

mudanças nutricionais no

crescimento e divisão sejam otimizados;

expressão

gênica

o

ambiente,

de

forma

que

o

Em organismos multicelulares a expressão gênica controlada regula um programa genético fundamental para o desenvolvimento embrionário e a diferenciação.

ERA “ÔMICA” Coleção de RNAs Estuda o conjunto de (transcritos) presentes proteínas e suas em
ERA “ÔMICA” Coleção de RNAs Estuda o conjunto de (transcritos) presentes proteínas e suas em
ERA “ÔMICA”
Coleção de RNAs Estuda
o conjunto de
(transcritos) presentes proteínas e suas
em uma célula/tecido isoformas contidas em
uma célula/tecido que
um dado momento são determinadas pelo
genoma da mesma
em
A metabolômica é o
estudo que visa
identificar e
quantificar o
conjunto de
metabólitos
produzidos e/ou
modificados por um
organismo
• O acumulo exponencial de sequencias gênicas e genomas depositados em bancos de dados públicos

O acumulo exponencial de sequencias gênicas e genomas depositados em bancos de dados públicos mundiais têm aumentado consideravelmente a demanda por metodologias que permitam sua identificação funcional ou confirmação de homologia, além da elucidação dos padrões de expressão

que permitam sua identificação funcional ou confirmação de homologia, além da elucidação dos padrões de expressão
ANÁLISE DE TRANSCRIPTOMA EM LARGA ESCALA • Identificação de todos os RNAs expressos em um
ANÁLISE DE TRANSCRIPTOMA EM LARGA ESCALA
ANÁLISE DE TRANSCRIPTOMA EM LARGA ESCALA

• Identificação de todos os RNAs expressos em um dado organismo ou tecido;

• Comparação do perfil de expressão gênica em diferentes condições ambientais, estados patológicos, fisiológicos ou de desenvolvimento;

• Caracterização de polimorfismos associados aos genes transcritos: formas

alternativas de splicing e SNPs (- Variações na sequencia de DNA dos humanos

pode afetar como eles desenvolvem as doenças e respondem aos patógenos, as drogas e as vacinas – medicina personalizada).

QUAIS INFORMAÇÕES PODEM SER OBTIDAS ATRAVÉS DA ANÁLISE DE TRANSCRIPTOMA?
QUAIS INFORMAÇÕES PODEM SER OBTIDAS
ATRAVÉS DA ANÁLISE DE TRANSCRIPTOMA?

• Identificação de genes e vias moleculares envolvidas em processos

biológicos: genes com perfil de expressão semelhante podem estar funcionalmente relacionados ou sob o mesmo mecanismo e controle;

- Manipulação de drogas;

- Melhoramento de plantas;

• Fornecer pistas sobre as funções de genes ainda não caracterizados a partir do estudo do padrão espacial (localização sub-celular) e temporal de expressão;

• Identificar marcadores para diagnóstico molecular de doenças;

•Podem ainda indicar alterações no proteoma e/ou metaboloma.

ANÁLISE FEITA DE MODO COMPARATIVO • Expressão do conjunto de genes em um tecido tumoral
ANÁLISE FEITA DE MODO COMPARATIVO
ANÁLISE FEITA DE MODO COMPARATIVO

Expressão do conjunto de genes em um tecido tumoral X os genes encontrados em amostras controle de tecido normal;

Traçar o perfil de expressão gênica em uma determinada anomalia, fazendo a investigação em um determinado nº de indivíduos (ou organismos) portadores dessa anomalia;

Identificação de genes envolvidos em numerosos processos biológicos;de indivíduos (ou organismos) portadores dessa anomalia; Identificação de genes expressos durante diferentes etapas

Identificação de genes expressos durante diferentes etapas do desenvolvimento; - Identificação e comparação de genes expressos diferencialmente em tecidos normais e malignos; - Diagnóstico, avaliação, prognóstico.(ou organismos) portadores dessa anomalia; Identificação de genes envolvidos em numerosos processos biológicos;

MÉTODOS PARA ESTUDO DE TRANSCRITOMA A quantidade de expressão de um gene em uma célula
MÉTODOS PARA ESTUDO DE TRANSCRITOMA
MÉTODOS PARA ESTUDO DE TRANSCRITOMA

A quantidade de expressão de um gene em uma célula pode ser medida pelo número de cópias de um transcrito de mRNA de um determinado gene presente em uma amostra. Para detectar e quantificar a expressão gênica de pequenas quantidades de RNA, a amplificação dos genes transcrito é necessária.

Permitem a quantificação do nível de expressão gênica

produzir É usado Uma técnica um para rápida a usada quantificação população para do de
produzir É usado Uma técnica um para rápida a usada quantificação população para do
de mRNA transcriptoma em uma amostra e análise de
interesse Next-generation na estutural forma de sequencing . pequenas
etiquetas que technology. corresponde a
fragmentos desses transcritos

• Northem Blot

RT-PCR – qRT-PCR;

• SAGE (Serial Analysis of Gene Expression);

• Microarrays de DNA;

• RNA-seq

A levedura Saccharomyces cerevisiae • Organismo-modelo Espécies diferentes Respostas no organismo modelo outras
A levedura Saccharomyces cerevisiae
A levedura Saccharomyces cerevisiae

Organismo-modelo

Espécies diferentes Respostas no organismo modelo outras

Espécies diferentes Respostas no organismo modelo outras Processos similares parcialmente aplicadas a

Processos similares parcialmente aplicadas a

Espécies diferentes Respostas no organismo modelo outras Processos similares parcialmente aplicadas a

1- Ascomiceto unicelular;

2- São muito utilizadas nas indústrias de fermentação, para a produção de bebidas, biocombustível e massas;

3- Linhagens laboratoriais são haploide;

4- São a E. coli do eucariotos:

de bebidas, biocombustível e massas; 3- Linhagens laboratoriais são haploide; 4- São a E. coli do
de bebidas, biocombustível e massas; 3- Linhagens laboratoriais são haploide; 4- São a E. coli do
de bebidas, biocombustível e massas; 3- Linhagens laboratoriais são haploide; 4- São a E. coli do
de bebidas, biocombustível e massas; 3- Linhagens laboratoriais são haploide; 4- São a E. coli do
A levedura Saccharomyces cerevisiae - São pequenas; - Completam seu ciclo de vida em 90
A levedura Saccharomyces cerevisiae
A levedura Saccharomyces cerevisiae

- São pequenas;

- Completam seu ciclo de vida em 90 min;

- Podem ser cultivadas em meios de cultura muito facilmente;

- Produzem colônias quando plaqueadas (mutações e “replica-plate”);

- Ciclo de divisão mitótico.

5- Não são patogênicas;

6- Genoma sequenciado desde 1996.
6- Genoma sequenciado desde 1996.
e “replica-plate”); - Ciclo de divisão mitótico. 5- Não são patogênicas; 6- Genoma sequenciado desde 1996.
e “replica-plate”); - Ciclo de divisão mitótico. 5- Não são patogênicas; 6- Genoma sequenciado desde 1996.
e “replica-plate”); - Ciclo de divisão mitótico. 5- Não são patogênicas; 6- Genoma sequenciado desde 1996.
e “replica-plate”); - Ciclo de divisão mitótico. 5- Não são patogênicas; 6- Genoma sequenciado desde 1996.
A levedura Saccharomyces cerevisiae • Principais contribuições : 1- Ciclo celular : - Etapas específicas
A levedura Saccharomyces cerevisiae
A levedura Saccharomyces cerevisiae

Principais contribuições:

Saccharomyces cerevisiae • Principais contribuições : 1- Ciclo celular : - Etapas específicas na progressão do

1- Ciclo celular:

- Etapas específicas na progressão do ciclo celular;

- Controles anormais da divisão celular que levam ao câncer humano.

2- Recombinação: :

- Crossing over.

3- Genética mitocondrial:

- Estrutura do genoma mitocondrial.

Genética mitocondrial : - Estrutura do genoma mitocondrial. 4- Genética do tipo reprodutivo : - Transdução

4- Genética do tipo reprodutivo:

- Transdução de sinal durante a detecção e

resposta aos hormônios reprodutivos do tipo oposto.

5- Genética da senescência

de sinal durante a detecção e resposta aos hormônios reprodutivos do tipo oposto. 5- Genética da
de sinal durante a detecção e resposta aos hormônios reprodutivos do tipo oposto. 5- Genética da
de sinal durante a detecção e resposta aos hormônios reprodutivos do tipo oposto. 5- Genética da
de sinal durante a detecção e resposta aos hormônios reprodutivos do tipo oposto. 5- Genética da
Saccharomyces cerevisiae AND cell cycle AND cancer http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term

Saccharomyces cerevisiae AND cell cycle AND cancer

Saccharomyces cerevisiae AND cell cycle AND cancer http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term

=saccharomyces+cerevisiae+AND+cell+cy

cle+AND+cancer

GENOMA Genoma sequenciado desde 1996.
GENOMA
GENOMA
Genoma sequenciado desde 1996.
Genoma sequenciado desde 1996.
GENOMA Genoma sequenciado desde 1996.
GENOMA Genoma sequenciado desde 1996.
GENOMA Genoma sequenciado desde 1996.
GENOMA Genoma sequenciado desde 1996.
GENOMA 1- RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) • Um dos variantes da PCR; Utilizada
GENOMA
GENOMA

1- RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

•

Um dos variantes da PCR;

Utilizada em biologia molecular para detectar os níveis de expressão de RNA;Polymerase Chain Reaction) • Um dos variantes da PCR; • Para a reação o RNA é

•

Para a reação o RNA é primeiro convertido em cDNA usando a transcriptase reversa;

•

O cDNA será usado como template para a amplificação exponencial usando PCR;

Qualquer gene pode ser detectado por esta técnica??

como template para a amplificação exponencial usando PCR; • Qualquer gene pode ser detectado por esta
 RT-PCR semiquantitativo ou relativo : • Envolve a amplificação de um controle interno simultaneamente

RT-PCR semiquantitativo ou relativo:

Envolve a amplificação de um controle interno simultaneamente com o gene de interesse;

um controle interno simultaneamente com o gene de interesse; Controle interno Normalizar as amostras • Depois

Controle interno

Controle interno Normalizar as amostras

Normalizar as amostras

Depois de normalizado: comparação dos transcritos;

•

Comparar os níveis dos transcritos em diferentes amostras.

Aplicações : Aplicações:

-
-

Pesquisa;

- Diagnóstico de doenças genéticas;

- Detecção de câncer.

50 MPa 15 3 0 Controle 60
50 MPa 15 3 0 Controle 60
50 MPa 15 3 0 Controle 60

50 MPa

15

30

Controle

60

50 MPa 15 3 0 Controle 60
 qRT-PCR : Real-time RT-PCR / Real-time PCR • É usada para amplificar e simultaneamente

qRT-PCR: Real-time RT-PCR / Real-time PCR

É usada para amplificar e simultaneamente quantificar uma molécula de DNA alvo;

Detecção e quantificação;

•

Quantificação: absoluta ou relativa;

•

Técnica EFICIENTE, SENSÍVEL e RÁPIDA;

• Técnica EFICIENTE, SENSÍVEL e RÁPIDA ; Segue o mesmo principio da PCR – Porém a

Segue o mesmo principio da PCR – Porém a detecção acontece em tempo real (na fase exponencial da ciclagem);• Técnica EFICIENTE, SENSÍVEL e RÁPIDA ; • A quantidade de DNA é medida depois de

A quantidade de DNA é medida depois de cada ciclo pelas sondas fluorescentes;

• Equipamento : capacidade de ciclagem termal e de capturar a fluorescência das sondas; •

Equipamento: capacidade de ciclagem termal e de capturar a fluorescência das sondas;

•

Plot de amplificação: representa o acumulo de produto pela duração da reação

a fluorescência das sondas; • Plot de amplificação : representa o acumulo de produto pela duração
a fluorescência das sondas; • Plot de amplificação : representa o acumulo de produto pela duração
a fluorescência das sondas; • Plot de amplificação : representa o acumulo de produto pela duração
• Sondas fluorescentes :  Não-específicas : se ligam a qualquer fita dupla de DNA

Sondas fluorescentes:

• Sondas fluorescentes :  Não-específicas : se ligam a qualquer fita dupla de DNA •

Não-específicas: se ligam a qualquer fita dupla de DNA

Um aumento na quantidade de DNA/RNA conduz a um aumento na intensidade de fluorescência e Um aumento na quantidade de DNA/RNA conduz a um aumento na intensidade de fluorescência e é medido a cada ciclo;

•

SYBR Green;

•

Produtos de PCR não específicos: dímeros

•

1 Par de primers: redução do custo.

Green; • Produtos de PCR não específicos : dímeros • 1 Par de primers : redução
• Sondas fluorescentes :  Sequencias-específicas : detecta apenas o DNA contido na sequencia da

Sondas fluorescentes:

• Sondas fluorescentes :  Sequencias-específicas : detecta apenas o DNA contido na sequencia da sonda

Sequencias-específicas: detecta apenas o DNA contido na sequencia da sonda

2 primer e a sonda TaqMan; Especificidade maior.

: detecta apenas o DNA contido na sequencia da sonda • 2 primer e a sonda
Barras brancas: 50 MPa Barras pretas: 50 MPa + 15 min
Barras brancas: 50 MPa Barras pretas: 50 MPa + 15 min

Barras brancas: 50 MPa Barras pretas: 50 MPa + 15 min

2- Microarray ou DNA chip • Medir o nível de expressão de vários genes simultaneamente;

2- Microarray ou DNA chip

•

Medir o nível de expressão de vários genes simultaneamente;

Os arranjos pré-definidos de moléculas de DNA são quimicamente ligadas à uma superfície sólida (lâminas de microscópio);o nível de expressão de vários genes simultaneamente; • As amostras são postas para hibridar com

•

As amostras são postas para hibridar com o DNA fixado no array (complementariedade de bases). A detecção é possível pois as amostras são "marcadas" com fluorocromos cianina 3 (Cy3) ou cianina 5 (Cy5)

A detecção é possível pois as amostras são "marcadas" com fluorocromos cianina 3 (Cy3) ou cianina
Vermelho: expressos Verde: reprimidos Preto: não há diferença na expressão
Vermelho: expressos Verde: reprimidos Preto: não há diferença na expressão

Vermelho: expressos Verde: reprimidos Preto: não há diferença na expressão

Vermelho: expressos Verde: reprimidos Preto: não há diferença na expressão
Vermelho: expressos Verde: reprimidos Preto: não há diferença na expressão

Vermelho: expressos Verde: reprimidos Preto: não há diferença na expressão

 Análise dos dados por análise de bioinformática • Quantidade grande de dados geradas

Análise dos dados por análise de bioinformática

Quantidade grande de dados geradas

 Análise dos dados por análise de bioinformática • Quantidade grande de dados geradas
 Análise dos dados por análise de bioinformática • Quantidade grande de dados geradas
 Análise dos dados por análise de bioinformática • Quantidade grande de dados geradas
Genes classificados em diferentes categoria do MIPS-CYGD • Poucas variações na expressão imediatamente após o

Genes classificados em diferentes categoria do MIPS-CYGD

Poucas variações na expressão imediatamente após o tratamento e aumento após o tratamento;

Classe 4: Defesa celular (estresse oxidativo e osmótico) Classe 9: energia – Ácido cítrico, fermentação e fosforilação oxidativa, genes relacionados a síntese de metionina e glutamato.

– Ácido cítrico, fermentação e fosforilação oxidativa, genes relacionados a síntese de metionina e glutamato.
Este artigo identificou os fatores de transcrição ativados durante um tratamento sub-letal de pressão hidrostática,
Este artigo identificou os fatores de transcrição ativados durante um tratamento sub-letal de pressão hidrostática,

Este artigo identificou os fatores de transcrição ativados durante um tratamento sub-letal de pressão hidrostática, utilizando diferentes ferramentas de bioinformática.

Foram identificados os fatores de transcrição e seu correspondentes motivos de DNA e RNA em resposta a alta pressão hidrostática.

Além disso, foi observado que diferentes motivos estão presentes na promoção de genes induzidos ou reprimidos durante o tratamento de pressão hidrostática.

Os genes ativados imediatamente após a pressão estão relacionados com a adaptação e ao crescimento, enquanto genes envolvidos na parada do ciclo celular e metabolismo energético continuam expressos 15 min após o tratamento.

• Os genes que fazem parte de um módulo altamente conectado normalmente fazem parte de
• Os genes que fazem parte de um
módulo altamente conectado
normalmente fazem parte de
importantes processos biológicos;
• Motivos relacionados a genes
associados com metabolismo de energia
e resposta a estresse;
• Estes genes normalmente estão
superexpressos
• Cor do círculo: maior abundância de
conexões

Genes relacionados ao complexo proteossomico compartilham o mesmo motivo em ambos os módulos.

Msn2/4 pode estar relacionados na transcrição de genes envolvidos na degradação de proteínas via proteossomo.

• O módulo B: • Motivos relacionados a genes requeridos para a síntese de RNA
• O módulo B: • Motivos relacionados a genes requeridos para a síntese de RNA

O módulo B:

• O módulo B: • Motivos relacionados a genes requeridos para a síntese de RNA ,

Motivos relacionados a genes requeridos para a síntese de RNA , DNA e proteínas.

B: • Motivos relacionados a genes requeridos para a síntese de RNA , DNA e proteínas.

Maioria está reprimida.

B: • Motivos relacionados a genes requeridos para a síntese de RNA , DNA e proteínas.
Rgm1p: envolvido na repressão de processos necessários para o crescimento celular normal; Cin5: resposta a

Rgm1p: envolvido na repressão de processos necessários para o crescimento celular normal; Cin5: resposta a estresses; Abf1p: controle do crescimento celular; Oaf1p: beta-oxidação de ácido graxo.

normal; Cin5: resposta a estresses; Abf1p: controle do crescimento celular; Oaf1p: beta -oxidação de ácido graxo.
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS

OBRIGADA!

AGRADECIMENTOS OBRIGADA! Fernanda Bravim bravimf@gmail.com

Fernanda Bravim bravimf@gmail.com