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Sequenciamento de nova gerao

SEQUENCIAMENTODENOVAGERAOPARAANLISESMETAGENMICAS:ENFOQUE
AOUSODOSEQUENCIADORILLUMINA

Por: Aline Horodesky

Publicado em 19/11/2014

Asnovastecnologiasdesequenciamento,denominadasdetecnologiasdesequenciamento
denovagerao(NextGenerationSequencingNGS),comearamasercomercializadasem2005
e esto evoluindo rapidamente. Todas essas tecnologias promovem o sequenciamento de DNA
em plataformas capazes de gerar informao sobre milhes de pares de bases em uma nica
corrida.

Apesar de se diferenciarem consideravelmente entre si todos os sequenciadores de NGS

se baseiam no processamento paralelo massivo de fragmentos de DNA. Enquanto, um
sequenciadordeeletroforeseprocessa,nomximo,96fragmentosporvez,ossequenciadoresde
novageraopodemleratbilhesdefragmentosaomesmotempo.

As plataformas de sequenciamento de nova gerao so uma alternativa poderosa para

estudosdegenmicaestruturalefuncional.

Atualmente, os sequenciadores esto divididos em 1 gerao (Degradao qumica e

InterrupodacadeiaSanger),2gerao(454Roche,IlluminaGenomeAnalyserHiSeq/MiSeqe
SOLID),3gerao(IonTorrentePacBioRS)e4gerao(Nanopore).

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Figura1:EquipamentosutilizadosparasequenciamentodeDNA.1gerao(A)Sanger2
gerao(B)454Roche,(C)IlluminaHiSeq,(D)IlluminaMiSeq,(E)Solid3gerao(F)Ion
Torrent,(G)PacBioe4gerao(H)Nanopore.

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Anlisesmetagenmicastradicionaisutilizamaamplificao,clonagemedeterminaoda
sequncianucleotdicadeDNAribossomal,pelomtododesequenciamentodeDNApropostopor
Sanger na dcada de 70. Para isso, utilizada polimerizao de DNA com incorporao de
didexinucleotdeos marcados, mtodo que foi grandemente automatizado na ltima dcada e
meia,permitindoaexecuodosdiversosprojetosgenoma.Porm,abordagensmetagenmicas
modernas aplicam distintas tcnicas de sequenciamento de segunda gerao, que permitem
estudargenomasmicrobianoscompletosapartirdeamostrasambientais,bemcomoidentificare
pesquisarclustersgnicosfuncionaiscodificandoenzimasmicrobianasdeinteressetecnolgico,
comolipases,despolimerasesouhidrolasesparapolmeroscomplexos.

O termo metagenmica caracterizado pela aplicao de tcnicas de biologia molecular

quepossibilitamaanliseecaracterizaodecomunidadesmicrobianasdiretamentedoambiente
natural, de forma independente do isolamento e cultivo dos microrganismos. Esse tipo de
abordagem vem aprimorando e enriquecendo estudos filogenticos sobre o potencial
biotecnolgicodemicrorganismosantesnoacessadose/oudesconhecidos.

Embora distintas, as tcnicas de Sanger e NGS apresentam vantagens e desvantagens,

assim como limitaes de custo/benefcio para obter e gerar dados. A escolha do mtodo
dependeprincipalmentedoobjetivodotrabalhoproposto.
A principal vantagem do mtodo de Sanger , sem dvida, o maior tamanho
dosreadsgeradoseaprecisodabasegerada(basecalling),quetendeaser10xmaiorquenos
mtodos NGS j para os mtodos de segunda gerao, a principal vantagem consiste na
construo in vitro de bibliotecas genmicas sem amplificao de fragmentos de DNA e sem
clonagem,comoporexemplo,emEscherichiacoli.Portanto,emanlisesmetagenmicas,vivel
a utilizao desses sequenciadores de segunda gerao, pois permite a construo de grandes
bibliotecas.UmdosprincipaissequenciadoresindicadoparaestetipodeanliseoIllumina.

O sequenciador Illumina Genome Analyzer (Figura 2) produzido em 2006, baseiase no

conceitodesequenciamentoporsnteseoqualrequerqueassequnciasaseremdeterminadas
sejam convertidas numa biblioteca de sequenciamento especial, permitindo a amplificao e
imobilizaodassequnciasparaseremsubmetidassequenciamento.Paraestepropsito,dois
adaptadoresdiferentessoadicionadossterminaes5e3detodasasmolculas.

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Figura2:SequenciadorIlluminaMiSeq/HiSeq.

A biblioteca de cadeia dupla desnaturada para obter DNAs de cadeia nica. Estas
cadeias simples so dispostas em concentraes muito baixas pelos canais de uma clula de
fluxo. Esta flow cell possui na sua superfcie dois tipos de oligonucleotdeos imobilizados
complementares aos dois adaptadores, utilizados para produzir a biblioteca de sequenciamento.
Estes oligonucleotdeos hibridizam com as molculas das cadeias das bibliotecas. Por sntese
reversa, comeando pela zona hibridizada, a nova molcula que est sendo criada encontrase
covalentementeligadaflowcell(Figura3).

Estanovamolculadobraseeligaseaoutrooligonucleotdeocomplementaraosegundo
adaptador que no est ligado placa, podendo ser usado para sintetizar uma segunda cadeia
ligadatambmcovalentementeplaca.Esteprocessodedobradamolculaedesntesereversa,
chamada de amplificao em ponte, repetida vrias vezes e cria aglomerados de milhares de
cpiasdasequnciaoriginal,muitoprximosnacluladefluxo.

Estes aglomerados distribudos aleatoriamente contm cpias idnticas da mesma

sequncia.Destemodoasbibliotecasestoprontasparaseremsequenciadas.

Figura3:OprocessodesequenciamentodoIllumina.

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Noanalisadordegenoma,milhesdeaglomeradossosequenciadossimultaneamente.As
molculas de DNA so sequenciadas base a base em paralelo usando quatro nucletideos
marcados com fluorescncia. As quatro bases completam umas com as outras para se ligar ao
alvo,estacompetionaturalgaranteaaltapreciso.Depoisdecadasnteseosfluorocromosso
excitados por um laser, a cor obtida identifica a base que foi adicionada. Este fluorocromo
depois retirado para que a prxima base possa se ligar ao template, e ento lida cada base
adicionadaemcadaciclo.

REFERNCIACONSULTADA

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