Produção de anticorpos monoclonais para medicamentos

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Bruno Petenuci , Maria de Fátima Pires da Silva Machado

Endereços:
1
Sandoz do Brasil Indústria Farmacêutica Ltda, Cambé – Pr, Brasil.
2
Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular, Universidade Estadual de Maringá, Maringá – Pr, Brasil.

Autor para Correspondência: Bruno Petenuci (brunopetenuci@hotmail.com)

INTRODUÇÃO

Os anticorpos monoclonais (mAbs) são proteinas, como por exemplo a imunoglobulina G

(IgG) que são expressos por um grupo especifico de células (1). A formação de
imunoglobulinas ocorre em resposta a um patógeno ou a uma toxina e culmina com a
produção de moléculas de alta afinidade, com grande capacidade de distinção entre
espécies moleculares semelhantes. Essa característica levou à proposição de que essas
moléculas poderiam ser utilizadas como fármacos (2). Alguns mAbs têm sido introduzidos
na medicina para suprimir o sistema imune (como Muromomab-CD3, Omalizumab) e para
destruir ou inibir células malignas (por exemplo, Rituxima, Alemtuzumab). O mercado
farmacêutico de medicamentos biológicos representa hoje menos de 20% do mercado total,
porém é o que mais cresce no mundo, uma velocidade cinco vezes maior que o setor (3, 4).
Os medicamentos biológicos são caros e representam 46% dos gastos públicos, porém
representam apenas 2% do volume com importação (5, 6); é um mercado de US$ 160
bilhões no mundo, e de R$ 10 bilhões no Brasil. No núcleo do alto sucesso dos
medicamentos biológicos estão os mAbs que representa o maior e também o segmento que
mais cresce. Estima-se que em 2016, 10 das 20 drogas mais vendidas no mercado mundial
serão biológicas, sendo 7 baseados na tecnologia do anticorpo monoclonal. Em junho de
2011 havia no mercado mundial 28 mAbs aprovados pelo Estados Unidos e Europa que são
ativamente comercializados (1). A estrutura molecular dos mAbs é extremamente complexa
e, além disso, o componente ativo é heterogêneo. A produção de biofármacos requer uma
validação mais estrita, e permanente avaliação do produto ao longo do processo de
manufatura, já que há muito mais parâmetros que a afetam, e por ser muito mais complexa.

CLASSIFICAÇÃO DOS mAbs

Os anticorpos são um grupo de glicoproteínas produzidas por b-linfócitos em resposta a um

antígeno. Os anticorpos ligam-se aos antígenos através de associações não covalentes de
sua cadeia variável de modo a neutralizar ou eliminar os antígenos. Os receptores dos
anticorpos têm a capacidade de reconhecer apenas um aspecto (epítopo) do antígeno;
embora o repertório de antígenos reconhecidos pelo sistema imunológico seja enorme (7),
cada anticorpo específico, é produzido por um linfócito-B especifico. Se uma única célula
produtora de anticorpo puder ser isolada e cultivada in vitro, esta poderá ser considerada
uma fonte de mAbs (8).

De acordo com Vermasvuori (9), os mAbs podem ser agrupados baseados na origem
proteica.

• Murinos (camundongo): anticorpos que são 100% proteínas murinas e por isso tem
aplicações terapêuticas limitadas devido aos seus efeitos colaterais, meia-vida curta,
incapacidade de iniciar efeitos imunológicos em humanos.
• Quiméricos: são mAbs modificados geneticamente e contém componentes proteicos
murinos e humanos, aproximadamente um terço do anticorpo é composto de
proteínas murinas; pode desencadear reações alérgicas.
• Anticorpos humanizados são mAbs modificado geneticamente, constituído em sua
grande maioria por proteínas humanas e somente 5 – 10% de proteínas murinas.
 Estes anticorpos também podem desencadear reações alérgicas, porém em menor
intensidade.
• Anticorpos humanos são mAbs a partir de células humanas ou de células murinas
geneticamente modificadas. Estes anticorpos têm o menor perfil de efeito colateral, e
pequenas doses são necessárias, uma vez que eles não são eliminados como
proteína estranha ao corpo humano.

VISÃO GERAL DO PROCESSO DE FABRICAÇÃO DOS mAbs

Os mAbs tem aumentado as opções terapêuticas para diversas doenças. Esta competição
requer investimentos em pesquisa e desenvolvimento e também no processo de fabricação,
para minimizar o tempo de chegada destas novas terapias ao mercado. O custo do produto
final tem um importante papel na terapia, e pode ser afetado pela dosagem ou a
durabilidade do anticorpo in vitro, pelo rendimento de expressão, e pelo número de passos
de purificação (10, 11).
A escolha da célula hospedeira para a produção de mAbs tem um profundo impacto na
caracteristica do produto e no rendimento do processo. As reações quimicas que ocorrem
na células hospedeira conferem aos produtos as propriedades como solubilidade,
estabilidade, atividade biológica, o tempo de permanência no organismo humano, e a
segurança do produto. A célula escolhida também não deve permitir a propagação de
agentes patogênicos como vírus. Na perspectiva industrial, a célula deve possuir
capacidade de crescer em suspensão para uso em biorreatores, permitir introdução de DNA
estranho para modificações genéticas, e alta capacidade de expressão da proteína
desejada (12). Os mAbs são primariamente produzidos em células de mamíferos devido as
complexas reações que só ocorrem com eficiência dentro das células de mamíferos apesar
do longo tempo de desenvolvimento e processo de fabricação quando comparados a
células de bactérias. O primeiro medicamento biológico produzido com células de
mamíferos foi em 1987 pela Genentech Inc. Atualmente, a produção de medicamentos
biológicos em células de mamíferos domina o cenário mundial: dos 58 produtos
biofarmacêuticos aprovados entre 2006 e 2010, 32 foram produzidos com esta tecnologia e
os outros com tecnologia baseada em bactérias, fungos, animais e plantas transgênicos e
cultura de insetos (13,14). A produção de todos os anticorpos monoclonais seguem o
mesmo principio básico; dependendo do anticorpo e a da aplicação, pode não ser
necessário utilizar todos os estágios demonstrados no esquema da Figura 1 (15).
 Fluxo básico da produção de mAbs

Cromatografia com
Banco de células Células genéticamente modificadas Separação dos mAbs do meio celular
proteina A

Preparado de células na concentração Inativação viral com

Inoculação Inativação de vírus existentes
adequada baixo pH

Cromatografia de troca
Crescimento Adição de nutrientes Remoção de impurezas
ionica

filtração com retenção

Produção Fase onde ocorre a produção do mAbs Remoção dos vírus
de virus

Colheita
Remoção de células Ultrafiltração Filtração antes do envase.
(centrifugação/filtração)

Figura 1: Fluxograma básico do processo de fabricação dos mAbs. Adaptados a partir de (16,17)

A preparação do inoculo com as células geneticamente modificadas são conduzidos

geralmente em agitadores de frascos, que posteriormente é aumentado de tamanho e
volume. A inoculação então é realizada em biorreatores que recebe a adição de pequenas
quantidades de nutrientes para o crescimento celular além do controle de pH, oxigênio,
temperatura. Após o crescimento em diversos tamanhos de biorreatores, a massa celular é
transferida para a etapa de produção (17). Este processo típico de produção demora entre 7
– 14 dias (15). Este processo em biorreatores acumula o mAbs de interesse em uma
concentração de 1–5 g/L. Os biorreatores podem variar o volume de 5.000 L a 25.000 L. O
processo de purificação do anticorpo é iniciado na fase de “colheita” através da
centrifugação continua, seguida por outro processo de clarificação através de membrana
filtrante. Os mAbs são capturados do meio celular usando cromatografia de afinidade de
proteína A de Estafilococos. Esta etapa é baseada na afinidade entre a região especifica do
mAbs e a proteína A. Esta especificidade permite que as proteínas, DNA, e outras
impurezas da células hospedeira e do processo atravessem a fase estacionária, enquanto o
mAbs se liga a coluna cromatográfica, promovendo uma pureza > 98% em um único passo
(17). De acordo com Elvin et al (1) esta é a etapa de maior custo para indústria onde
milhares de litros de cultura celular precisam ser processados. Esta fase também inclui uma
eluição com baixo pH para inativação de vírus. Geralmente mais duas cromatografias de
trocas iônicas são requeridas para remover as impurezas relacionadas ao produto e
processo como proteínas provenientes das células hospedeiras. Em seguida uma filtração
capaz de reter vírus que garante a segurança do produto e uma ultra filtração final é
utilizada para concentrar o produto a ser utilizado na forma farmacêutica final. De um modo
geral o processo de purificação tem um rendimento de 70 – 80% e o concentrado de
anticorpo obtido no final é congelado ou mantido como líquido resfriado até seu envase com
produto final (15). O tipo de coluna, bem como a afinidade, a carga iônica, parâmetros de
coluna, produto, carga de impureza e meio eluente podem impactar na purificação. Cada
passo da purificação pode introduzir uma nova impureza como pedaços de filtros e coluna
ou mesmo componentes do meio eluente. Por isso o processo de downstream deve ser
desenvolvido de forma que o processo remova qualquer impureza e garanta a segurança do
produto final (13).
PRODUÇÃO DE mAbs A PARTIR DE CULTURA DE CÉLULAS DE MAMIFEROS

A célula de mamífero mais comumente usada para produção de mAbs é a célula de ovário
de hamster chinês (CHO) que foi isolada em 1950. No inicio da década de 1980, dois
derivados das células de CHO (CHO-K1 e CHO pro-3), deram inicio as duas linhas
celulares utilizadas até hoje, a DUKX-X11 e DG44. Ambas as linhas celulares foram
modificadas geneticamente para não conter a enzima dihidrofolato redutase (DHFR). As
células deficientes da atividade da DHFR requerem a adição de glicina, hipoxantina e
timidina (GHT) no meio de cultura para sobrevivência, o que permite a implementação de
um sistema baseado na inserção de um gene DHFR clonado, combinado com o gene que
expressa a proteína de interesse. Quando em um meio ausente de GHT, somente as
células que contém o vetor recombinante sobrevivem e produzem a proteína de interesse.
Contando com um pequeno número de células de mamíferos disponíveis no mercado
mundial os cientistas tem colocado esforços em modificar geneticamente as células e
otimizar os processos produtivos. Pressionado pela crescente demanda do mercado de
produtos biofarmacêuticos, as linhas celulares de CHO tem aumentado sua capacidade
produtiva em mais de 20 vezes. Na década de 1980 um processo produtivo de
medicamento biológico durava cerca de 7 dias e atingia 1–2 milhões de células/mL que
produzia algo em torno de 50–100 mg/L. Atualmente um processo típico demora mais
tempo, algo em torno de 21 dias, porém atinge 10-15 milhões de células/mL que produz 1–5
g/L de mAbs (14). Este ganho de produtividade pode ser atribuído a otimização para
seleção de um clone ideal e também composição do meio e condições do
bioprocessamento como temperatura, pH, pressão osmótica e adição de pequenos
compostos químicos como butirato, sulfato de zinco, etc que sustentam o crescimento
celular em alta densidade (18).
As células CHO possuem diversos atrativos como o crescimento rápido, alta expressão, e a
habilidade de se adaptar em meios de culturas artificiais, não replicar vírus como HIV, gripe,
herpes, etc. Um extensivo histórico de estudos de segurança da cultura de células CHO
acumulados durante duas décadas, mostrou que o mais importante é sua adaptabilidade a
manipulação genética (12). Em 2007, a capacidade mundial de produção com células de
mamíferos era de 2,3 milhões de litros, e espera-se atingir em 2013 o equivalente a 4
milhões de litro. Considerando uma produtividade de 5 g/L de mAbs e com rendimento de
purificação de 75% chega-se a uma produção estimada de 300 toneladas/ano de mAbs em
2013 (15).

PRODUÇÃO DE mAbs A PARTIR DE CULTURA DE BACTÉRIAS

As culturas de bactérias ainda não podem ser veículo de produção de mAbs humanizados,
pela complexidade da estrutura de imunoglobulinas humanas e pela incapacidade de
promover as modificações secundárias apropriadamente executadas pelas células de
mamíferos (19).

PRODUÇÃO DE mAbs A PARTIR DE ANIMAIS TRANSGÊNICOS

Através da incorporação de genes que expressam mAbs em embrião de animais, já tem

sido produzidos mAbs em leite da vaca ou de cabra, bem como em ovos de galinha.
Diversas vantagens têm sido apontadas para os ovos de galinha, como a ausência de
príons, imunoglobulinas semelhantes às humanas, e a barreira entre humanos e pássaros
que pode limitar uma potencial zoonose. Os custos de produção são comparáveis as
células de mamíferos embora o investimento inicial seja muito menor e o custo operacional
seja por volta de um terço. Uma produção de 2 a 6 g/L de imunoglobulinas tem sido
reportada no leite de cabras transgênicas (8). Entretanto, o leite é um material biológico
complexo, que contém gordura, lactose, anticorpos do animal de origem, contaminantes
como células somáticas, bactérias e vírus, uma variedade de outras proteínas, vitaminas e
minerais, complicando o processamento, bem como sua validação, essencial para a
aprovação de um produto biológico para uso clínico (10). Ainda não existe nenhum produto
aprovado pelos órgãos sanitários mundiais, pois a indústria farmacêutica está um pouco
cautelosa com este método devido à possibilidade de contaminação por vírus e príons,
demonstração de bioequivalência, modificações pós-produção, e finalmente o impacto
social e politico pelo uso e modificação genética de animais (8).

PRODUÇÃO DE mAbs A PARTIR DE PLANTAS TRANGÊNICAS

Muitas empresas têm desenvolvido tecnologias para produzir proteínas animais através de
plantas. As espécies de tabaco e milho são as preferidas para pesquisa. O gene de
interesse é associado a um marcador que então é inserido na planta, que expressa à
proteína de interesse durante a fase de crescimento. A produção de mAbs usando plantas
transgênicas pode levar algo em torno de 10 meses. Após extração da proteína de interesse
por solvente e purificação, pode se chegar a um rendimento de 1 mg/g de material. A
ausência de patógenos capaz de migrar das plantas para humanos, juntamente com
facilidade e a velocidade de aumento de produtividade, tem tornado este método bem
atrativo (8). Uma das desvantagens é a falta de legislação sanitária para este sistema
produtivo, e também a diferença da glicosilação realizada entre as células de mamíferos e
as células vegetais, que pode desencadear respostas imunogênicas ou mesmo alergênicas
(20). Uma excelente revisão sobre o uso de plantas, diferentes métodos produtivos para
anticorpos, enzimas e biopolímeros tem sido publicado recentemente por Xu et al (21).

VIAS DE ADMINISTRAÇÃO DE mAbs

Em geral os anticorpos são moléculas pesadas (tipicamente 150 kDa) e complexas (a

maioria é glicosilada) e deve ser administrada em altas doses para ser efetivo (geralmente
gramas por dose). As formulações por terem grande volume, geralmente são administradas
por via intravenosa. Os mAbs de um modo geral degradam-se quando exposto ao calor,
congelamento, luz, pH extremos, agitação e alguns metais e solventes orgânicos. A melhor
composição para o desenvolvimento de um produto final a base de mAbs é aquele que
minimiza os diversos tipos de degradação que uma proteína pode sofrer. Uma das
alternativas é encontrar um pH (sistema tampão) onde ocorre quantidade mínima de
degradação, como deaminação e oxidação. Outra estratégia é o uso da liofilização, mas em
alguns casos podem ocorrer agregados que danificam os mAbs durante o processo de
congelamento ou reconstituição (10). Por ser de origem natural, os mAbs estão sujeitos a
uma heterogeneidade natural devido a um processamento celular imperfeito, mudanças
químicas e enzimáticas durante a fabricação, e mudanças adicionais durante o
armazenamento. O conjunto destas pequenas mudanças é chamado de micro
heterogeneidade. O controle destas micro alterações devem ser detectadas por
metodologias analíticas usadas nos laboratório de controle de qualidade de modo a garantir
a qualidade final do produto de acordo com as boas práticas de fabricação de
medicamentos (22).

CONCLUSÃO:

Dos mAbs em fase de desenvolvimento a grande maioria será para a área de oncologia e
imunologia, seguido por doenças infecciosas e por um menor número de indicações (23,
24). De acordo com Reichert e Dhimolea (25) existe 165 mAbs em desenvolvimento para
o tratamento de câncer. Destes existem 25 mAbs no estágio clinico final para logo entrar no
Mercado farmacêutico (1). A cultura de células de mamíferos é considerada uma tecnologia
bem conhecida, porém novas tecnologias estão sendo exploradas para tornar o processo
de fabricação de mAbs cada vez mais robusto, e reduzir o custo de operação (26). Em
síntese, os mAbs permitem tratamentos eficientes para doenças crônicas que não tinham
terapias ou não eram suficientemente bem-sucedidas ou efetivas para todo tipo de
pacientes. O entendimento do metabolismo celular, a expressão proteica é fator primordial
no aumento do rendimento do processo produtivo dos mAbs. Avanços nas técnicas de
purificação e concentração dos mAbs também são esperadas para melhorar a estabilização
proteica e estabilidade dos mAbs. Portanto, apesar do potencial e da importância dos mAbs
para a indústria farmacêutica serem elementos inquestionáveis, ainda existem muitos
fatores e parâmetros técnicos que limitam a proposta de uma ampla produção.

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