Biotecnologia

- Técnicas de utilização de organismos vivos/sistemas/processos biológicos para produção

de moléculas com interesse para a indústria alimentar, saúde, para benefícios humanos, ou
outros animais (Károly Ereky).
- Estes processos são mais seguros para a saúde humana e para o ambiente do que
processos sintéticos, e mais baratos.

Áreas de Aplicação
- Branca (industrial)
- Verde (agricultura)
- Azul (marinha)
- Vermelha (médica)
- Roxa (propriedades intelectuais)
- Castanha (diversidade do deserto)
- Dourada (bioinformática)
- Amarela (produtos nutricionais)
- Preta (bioterrorismo)
- Cinzenta (ambiental)

Ramo com maior impacto na economia relativa)

Ex. de organismos usados em biotecnologia

Medusas - Fonte natural de GFP (green fluorescent protein) – fluorocromo, proteína

fluorescente quando excitada com luz na gama dos azuis.

- A GFP utilizada em laboratório é produzida por bactérias, através de Engenharia Genética.

Salmão Transgénico – Salmão modificado geneticamente para: aumento 2x da velocidade

de crescimento. Também seria vantajoso aumentar a resistência a doenças, resistência à
alteração da temperatura da água do mar, aumento da biomassa, alteração do ciclo
reprodutor.

Leveduras (pão, cerveja, queijo) Plantas lenhosas (Quinino) Fungo Penicillium (penicilina)

Biotecnologia e Metabolitos

Produtos retirados dos sistemas biológicos:

Metabolitos Primários – Moléculas pequenas necessárias durante o crescimento celular.

(vitaminas, aminoácidos, açucares)

Metabolitos Secundários – Moléculas produzidas durante a fase estacionária do ciclo de

vida celular (esteroides, toxinas, antibióticos, etanol, ácido lático)

Microrganismos (não só) podem ser modificados para produzir compostos de interesse em
grande escala. Uma primeira modificação pode ser por seleção artificial, outra segunda por
engenharia genética.
- A primeira implica encontrar as strains mais eficazes; a segunda implica usar um
organismo que originalmente não produz a substância em estudo.

Ex. Glucose – (monossacárido) Base da nutrição para muitos organismos obtida nas
plantas, produzida através da atividade enzimática em processos fotossintéticos; Ciclo de
Calvin
– Os custos de incluir toda a quantidade de enzimas do Ciclo de Calvin numa bactéria não
compensa os de melhorar uma strain de uma planta que já as possui.
 Biotecnologia vs. Bioengenharia

Baseado na engenharia genética para Envolve métodos de engenharia para

produzir compostos de interesse (p.ex. produzir e analisar compostos
tecnologia recombinante) – produzidos pelos sistemas biológicos.
Biotecnologia Molecular Envolve formas de design específico e
modificação dos sistemas

História da Biotecnologia Molecular

1943 – Produção da penicilina a escala industrial
1953 – Determinação da estrutura do DNA (Watson e Crick)
1961-1966 – Descrição do código genético
1973 – Desenvolvimento de técnicas de recombinação de DNA (Boyer e Cohen)
1996 – Sequenciação completa do genoma de um eucarionte Saccharomyces cerevisiae
1981 – Aprovação do primeiro diagnóstico à base de anticorpos monoclonais
1988 – Publicação do método de PCR
2016 – Aprovação para testar a segurança da tecnologia de edição de genoma CRISPR

Vantagem na utilização de microrganismos na Biotecnologia

- Fáceis de manipular; - Poucas questões éticas envolvidas;
- Desenvolvem-se rapidamente; - Assexuais (pouca variação genética);
- Dimensões menores; - Sistemas limpos;
- Facilidade de recombinação genética (possuem plasmídeos)

- Plasmídeos (em bactérias,

fungos unicelulares, poucas
células eucariotas)

- O fragmento a clonar deve

ser cDNA - nas bactérias
não ocorre o splicing que
seria feito ao DNA nos
eucariontes;
Biotecnologia na Bioengenharia Microbial
Material Natural

Preparação do material natural (p.ex. nutrientes) e

do microrganismo Processo Upstream

Crescimento do microrganismo num bioreator e Fermentation and

produção (biotransformação) do produto desejado Biotransformation

Extração, Isolamento e Purificação do produto Processo

Downstream
desejado produzido no bioreator

Produto puro

Bactérias Modelo para Biotecnologia

• Gram negativa
• Cresce facilmente e rápido - grande turn-over*
Escherichia coli • Fácil de modificar geneticamente
• Produção emlarga escala de proteinas recombinantes
• Usada como biblioteca (armazenamento de sequências

• Gram positivas
• Usadas para produção de antibióticos naturais
Streptomyces spp.
• Difíceis de manipular
• Metabolismo secundário complexo

• Gram negativas do solo

• Usadas para transformação genética de plantas por
Agrobacterium spp.
serem um agente infecioso desse organismo
• Isere DNA (T-DNA) nas células do hospedeiro

*turn-over – quantidade de bactérias produzidas a partir da quantidade inicial; é tanto

maior quanto menor for a quantidade necessária de nutrientes para alcançar quantidade x
de bioproduto.

Vantagens e desvantagens durante a escolha do microrganismo

- Para produzir um produto a partir de um gene completo (estrutura exónica e intrónica), e

proteínas complexas não se deve usar uma bactéria – mas sim um modelo eucariota;
- Manipular geneticamente um organismo eucariota é muito mais
complicado/problemático do que uma bactéria;
- Para isolar a proteína de interesse, é necessário destruir a bactéria por lise celular –
juntamente, pode ocorrer destruição do produto pois são libertadas proteases;
1. Isolamento do gene (cDNA) de interesse e
amplificação do fragmento, por PCR
2. Linearização do vetor de clonagem com
enzima de restrição

A abertura do vetor deve ser feita com atenção à

origem de replicação, à zona de início de
transcrição, à zona de controlo de transcrição
(promotor)...

3. Inserção do DNA no vetor de clonagem e

reconstrução do vetor
4. Introdução do DNA na célula hospedeira
5. Isolamento das células transformadas
P.ex. adicionado um gene de resistência para
selecionar as transformadas a partir do uso de
antibiótico
6. Produção do composto de interesse
Para confirmar que as bactérias estão a produzir, podem ser inseridos genes para
marcadores de fluorescência para a proteína clonada
7. Extração da proteína alvo

Expressão Genética nos Procariontes

Bactérias não possuem

intrões

mRNA policistrónico – um
mRNA codifica para várias
proteínas.

Fazem Splicing
Ex. Operão LAC

Na presença de Lactose, esta liga-se ao repressor que se

desliga do operador – A RNA polimerase vai transcrever o
mRNA policistrónico que codifica para a β-galactosidase
(quebra o dissacárido), lactose permease (transportador
membranar – facilita a entrada de lactose) e para
galactosídeo acetiltransferase (transforma o açúcar?)

Substituir os genes estruturais originais deste operão por

genes de interesse, permite controlar a transcrição. Na
presença de lactose, os genes clonados serão transcritos.

Expressão Heteróloga de Proteínas e Secreção em Bactérias

Ex. Escherichia coli é utilizada para produção heteróloga de insulina, uma proteína humana
que permite a entrada de glucose nas células.

Existem limitações na escolha dos hospedeiros aquando da clonagem de proteínas

complexas:

1. Folding – as bactérias não conseguem fazer o folding tão complexo como estas
proteínas requerem para a sua ativação.
- Utilizar leveduras ou células de mamíferos
2. Secreção da proteína – A secreção implica obter um produto mais puro (do que por
lise) além de reduzir o tempo e custos do processo Downstream. A parede celular das gram-
negativas é problemática.
- Utilizar eucariontes ou gram-positivas
 Biotecnologia Microbiana

Fungos - parede composta de quitina

- Polissacarídeo de glicose, assim como celulose, amido e glicogénio;

- Impermeável;
- Muito resistente;
- Após gemulação formam cicatrizes de plasmalema;
|
Devido à parede resistente, é difícil retirar substâncias do interior
da levedura. No entanto, estas cicatrizes podem então conter
transportadores de substâncias para o exterior.

Secreção de Proteínas Recombinantes em E. coli

Expressão de Proteína Fotorrecetora em E. coli – As bactérias transformantes deslocavam-

se para os locais onde há mais luz

Vantagens: - Fácil e barato de cultivar;

- Alto Rendimento;
- Genética bem conhecida – manipulação eficiente

Desvantagens: - O folding de proteínas pouco eficiente – leva à formação de corpos de

inclusão (agregados de proteína mal enrolada)
- O folding de proteínas extracelular é mais eficiente, mas a secreção é
problemática (gram negativa)
- Os lipopolissacáridos (LPS) da membrana extracelular são endotoxinas

Em gram-negativas, são mecanismos Two-Step:

General Secretion System (Sec)
As proteínas devem ter um peptídeo sinal (Tag) para reconhecimento do transportador

 Gram negativa - Uma proteína desenrolada no citoplasma atravessa o transportador

Sec para o espaço periplasmático (onde há uma pequena camada de peptidoglicano).
A proteína enrola-se e sai pela membrana permeabilizada artificialmente.
 Gram positiva – Uma proteína desenrolada no citoplasma atravessa o transportador
Sec diretamente para o exterior.

Twin-Arginine transport pathway (Tat)

As proteínas devem ter um peptídeo sinal (Tag) para reconhecimento do transportador

 Gram negativa – Uma proteína enrolada no citoplasma atravessa o transportador Tat

para o espaço periplasmático, onde encontra um transportador específico de proteína
para o exterior.
 Gram positiva – Uma proteína enrolada no citoplasma atravessa um transportador Tat
diretamente para o exterior

Em gram-negativas, o mecanismo One-Step:

 Um canal único, transporta uma proteína desenrolada e com peptídeo sinal do
citoplasma para o exterior.
Aspetos a considerar:
- Proteínas extracelulares têm maior rendimento a nível do produto de proteínas
heterólogas funcionais;
- Gram-negativas crescem mais rápido e barato, são geneticamente mais estáveis, mas a
secreção é complicada. Algumas são patogénicas.
- Gram-positivas são mais fáceis de manipular para secreção do produto, mas também de
proteases.

- Produzir gram-negativas geneticamente modificadas para possuírem mecanismos de
translocação eficientes de One-step, ou associados aos mecanismos Sec ou Tat.

- Modificar gram-positivas para diminuir as enzimas ativas no espaço extracelular.

- Usar eucariontes.

Produção de Metabolitos Secundários para aplicações biotecnológicas

 A produção de pequenas moléculas não proteicas como pigmentos, fragrâncias,

alcaloides anti-tumorais, interferões e outros compostos é mais complexa

 Requer conhecer todas as pathways de biossíntese que envolvem muitas enzimas,

substratos, cofatores e parâmetros ambientais específicos. Manipulação genética
torna-se complicada, no entanto pode ser feita para aumentar o rendimento.

 Pode-se implementar co-culturas (p.ex. bactérias levam fungos a produzir

antibióticos)

 Aplica-se a biotecnologia de eucariontes e procariontes.

Expressão Heteróloga em Leveduras

Vantagens:
 Usa a maquinaria eucariota para folding correto de proteínas e modificações pós-
traducional (glucosidação, acetilação, clivagem...)
 Alta taxa de crescimento, bom rendimento, fácil de modificar geneticamente;
 A produção de proteínas extracelulares é preferível.

Expressão Genética e Maturação de Proteínas em Eucariontes

A regulação da expressão genética em eucariontes é mais complexa e precisa de

melhoramentos.

O super-encolhimento dom DNA, juntamente com as histonas e as modificações, número

de cromossomas, genomas duplicados, etc. são problemas a ter em consideração.

O retículo endoplasmático é muito importante para uma proteína corretamente enrolada e

na produção de vesículas para excreção das proteínas.
Enrolamento de Proteínas no Retículo Endoplasmático de Leveduras

No Retículo Endoplasmático, proteínas mal enroladas são recicladas, por feedback positivo,
para reuso dos aminoácidos.

Expressão heteróloga na levedura Saccharomyces cerevisiae normalmente envolve um vetor

de uma das três classes:

 YEP – yeast episomal plasmid – Muitas vezes desenhado para funcionar em E. coli e
em leveduras. Não é estável para produção em grandes sistemas.
 YIP – yeast integrating plasmid – A transformação ocorre com integração dos genes
no genoma da levedura usando um plasmídeo como vetor. Permite mais cópias por
célula.
 YAC – yeast artificial chromosome – Usado para clonar um segmento grande de DNA
(100kb). Possui uma zona CEN (centrómero - garante a divisão igual para a célula
filha); ARSI (sequência para autorreplicação) e TEL (telómeros), que permitem que o
plasmídeo se mantenha na célula como um novo cromossoma.

Transformação / Transfeção em células eucarióticas

É necessário fragilizar a membrana:

 Mecanismos físicos – microinjeção; eletroporação; biolística

 Mecanismos químicos – transfeção com fosfato de cálcio; transfeção com base em
lípidos
 Mecanismos virais – adenovírus; vírus adeno-associados; lentivírus; adenovírus canino

Tecnologia de Edição de Genoma

Permite modificar pequenas zonas no genoma.

ZFN – nucleases associadas a zinc-fingers. As zinc-fingers são modificadas para reconhecer

as regiões no DNA.

TALEN – nucleases associadas a caudas com a sequência complementar à sequência de

interesse.

CRISPR-Cas – A Cas9 associa-se ao RNA guia na célula. Esse complexo liga-se à zona do
DNA coincidente. O complexo corta o dsDNA, onde pode ser inserido DNA desejado.

Biotecnologia Marinha

TTX – neurotoxina

Cones magus – A partir do seu veneno foi desenvolvido um painkiller (Prialt, ziconotida),
derivado de uma -conotoxina recombinante.
- -conotoxina é um resíduo de ~25 aminoácidos, rico em cisteínas.

Yondelis – tratamento anticancerígena desenvolvido a partir de um metabolito secundário

(trabectidina) de um tunicate. Usado especialmente para sarcomas, associado com
doxorubicina.
- Trabectidina pode ser sintetizada em laboratório usando processos químicos a
partir da cianosafracina B. → caro e envolve químicos perigosos.
Chauliodus sloani – Possui fotóforos, que lhes atribui órgãos bioluminescentes.

Kelp – (algas gigantes) fonte de biomassa e alimentação.

Biotecnologia Azul

- Biotecnologia marinha – aplicações marinhas e aquáticas da biotecnologia.

- Facilmente está associada às áreas da biotecnologia vermelha, amarela, branca, cinza...
- Multidisciplinar: do ecossistema aos genes;
- Organismos alvo incluem vários tipos desde bactérias, esponjas, peixes, microalgas...

“Crescimento Azul”

Toolbox: Bio descoberta; Biologia molecular; Bioquímica; Nanotecnologia; Bioinformática;

Ómicas

Produtos e Serviços: Drogas; Biocombustíveis; Eletricidade; Alimento; Enzimas; Compostos;

DNA blueprints; Gestão do ecossistema; Pesquisa básica; Biorremediação.

1. A biodiversidade do oceano é uma fonte quase inesgotável de bioprodutos/bioativos.

2. Bioprodutos marinhos podem oferecer alternativas mais seguras e baratas do que
os sintéticos.
3. Biotecnologia marinha promove exploração sustentável dos mares.

Biodiversidade Marinha

- ~40 filos de animais;

- Quase todos encontrados no mar (exceto Onychophora);
- Peixes são os vertebrados mais abundantes e diversificados;
- Actinomicetes são bactérias marinhas que produzem metabolitos secundários com muito
potencial biotecnológico.

Áreas de Interesse da Biotecnologia Marinha:

- Produção de Biomassa → Alimentação; Ração; Fertilizantes; Biocombustíveis; Biomateriais

e bioprodutos

- Bioprospeção para novos bioativos → Açucares e drogas mais seguras; Cosméticos e

PCP’s; Pesticidas e antivegetativos (impede crescimento de organismos agarrados)

Desafios e Restrições
- Como enfrentar a imensa biodiversidade dos oceanos?
- Como lidar com organismos com anotação genómica extremamente baixa?
- Como isolar e caracterizar compostos de interesse?
- Como sintetizar bioprodutos e aumentar a produção?
- Como divulgar as vias fisiológicas, toxicológicas e outras vias biomoleculares?
- A evolução, a fisiologia e a ecologia podem apontar para espécies de interesse;
- A interação da substância com os sistemas biológicos (por exemplo, toxicidade) deve ser
testada;
- “Multi-ómicas” pode ser implantado com sucesso para estudar organismos não
convencionais.
Abordagens integrativas que visam à construção de modelos previsíveis → Biologia Sistema
Biologia de Sistemas

Ciclo
Genómica Computação
Genómica;
Transcriptómica;
Proteómica;
Metabolómica...

Reconstrução de
Tecnologia Análises redes metabólicas

Previsão; Modelos quantitativos

Ex.: - Prever a produção/conversão de biomassa
- Prever a bio reatividade e toxicidade
- Prever a biossíntese de compostos específicos

Alvo das Ómicas

Genoma; Epigenoma; Transcriptoma; Proteoma; Metaboloma; Lipodoma.

- As Ómicas são metodologias que permitem o screening de múltiplas biomoléculas a partir
de uma única amostra.
- Esta caraterística permite revelar redes metabólicas.

Biomassa

- A biotecnologia marinha é uma grande contribuição para o desenvolvimento e descoberta

de novos biomateriais para recrear matrizes de culturas (agares, etc.)
- Produção de agarose a partir de algas (repetição de D-galactose + L-galactose)
- Salmão GM – modificado com hormonas de crescimento e proteínas anti congelação
- Peixe zebra GM com proteína bioluminiscente

Mixina (Myxine glutinosa) – organismo vertebrado; não possui mandíbulas; representantes

vivos dos antepassados dos peixes (pré-mandíbula); de profundidade;
- Liberta uma substância viscosa muito hidrofílica (em contacto com a água,
polimerizam e formam um gel) para defesa – antimicrobiano - e para formação de casulo
para evitar que outros apanhem a sua presa.

Bioprospeção

Existe muita diversidade, sendo necessário arranjar forma de avaliar a atividade individual
de cada um.

Tecnologias que permitem fazer screening muito complexo das moléculas a serem
produzidas, ao mesmo tempo.
Anémona (Anemonia viridis) – cnidários; Possuem células com cnidócitos, que são arpões
que são lançados quando estimulados. Libertam diversas toxinas – anticoagulantes;
neurotoxinas; hemolisinas, etc.

Sequenciação de Última Geração

- Colhem o RNA, que depois é fragmentado. É submetido a transcrição reversa e o cDNA é

sequenciado e depois alinhado, formando contigs. Esses contigs são mapeados no genoma.
- RNA-Seq é quantitativo;
- Obtém-se muitos transcritos válidos;
- É non-targeted (não se procura um RNA específico)
- Dependendo do comprimento e profundidade da sequenciação, fica menos viável com
mRNAs completos.

Proteómica
Transcriptómica / Proteómica → Identificação e quantificação da expressão das proteínas
de interesse (1) a partir dos genes ativos (2) por sequenciação dos aminoácidos.
- Avaliar diretamente as proteínas não dá rendimento tão alto, mas permite identificar a
proteína, por espetrofotometria em massa.
- Pode ser quantitativo;
- Pode ser targeted ou non-targeted. A última é usada para screening de bioproduto;

Metabolómica
- Para avaliação de metabolitos secundários. Existem muitas classes (lípidos, derivados de
açucares, aminoácidos, enzimas, etc.)
- Tende para targeted; - cada classe de moléculas requer métodos específicos de
caraterização, identificação e quantificação.

Metagenômica
- Identificação e quantificação de fungos e bactérias de interesse.

Genómica
Sequenciação do genoma total do organismo de interesse.

Ómicas – resumo

- Permitem avaliar várias moléculas de uma única amostra;

- Podem ser usadas em casos de pouca informação sobre o genoma;
- Multi-ómicas preenchem os espaços;
- Envolvem muita bioinformática. Em modelos in-silico não substitui a testagem biológica,
pode ajudar a prever.
Gene Enrichment

Para fazer um organismo produzir uma molécula heteróloga, é necessário conhecer as

pathways originais de produção dessa molécula (enzimas envolvidas) e caso sejam possíveis
de inserir no organismo hospedeiro, como é que elas vão atuar.

Pistas do Comportamento e Ecologia

Speleonectes tulumensis – crustáceo; o estudo da sua microanatomia, onde encontraram

um órgão appendix articulado que permite ejetar veneno. Contem enzimas que
permeabilizam o tecido do alvo, para uma neurotoxina entrar.
- Avaliação por RNA-Seq permitiu um screening das proteínas constituintes do veneno, a
partir do mRNA.
- Encontraram mRNAs típicos de componentes de venenos ao comparar as sequências com
bases de dados de diversos organismos (especialmente artrópodes).

A Filogenética e Evolução são necessárias para a Bioprospeção.

- Valida os achados.
- Guia para os organismos de interesse.
Evolução convergente – evoluíram para a mesma função (ex. escamas dos peixes e répteis)
Evolução divergente – evoluíram para diferentes funções
Estruturas homólogas – Mesma origem filogenética (ex. penas das aves, pêlos e escamas
dos répteis)

Riftia pachyptila – minhoca de profundidade do oceano, perto de fontes marinhas

hidrotermais (lançam bolhas que aquecem a água até ~400ºC)
- O Ecossistema permite produção de energia química e térmica.
- Estabelecem muitas relações simbióticas – protegem bactérias e fornecem nutrientes, as
bactérias devolvem matéria orgânica.
- Apresentam genoma bacteriano e viral.
 Biotecnologia para a Saúde

É a área de pesquisa e desenvolvimento da biotecnologia com mais fundos;

As áreas terapêuticas de mais interesse são: Oncologia; Doenças infeciosas; Neurologia


Anticorpos monoclonais

Produtos Farmacêuticos produzidos por microrganismos: Insulina (diabetes);

Anticorpos monoclonais (cancro, artrite reumatoide); Vacinas terapêuticas; Hormona
crescimento...

Nem sempre é vantajoso clonar um organismo para produzir o produto, sendo possível
modificar o organismo original para uma maior produção.

A maioria dos produtos biofarmacêuticos é produzido através de células de mamífero.

Modificações pós-traducionais de biofármacos em diferentes plataformas de produção

Células eucariontes possuem maquinarias de modificações pós-traducionais mais

complexas e necessárias para a síntese correta de muitas proteínas.
- Ex: folding, secreção, modificações pós-traducionais...
- As mais complexas são as de mamíferos e plantas, mas também insetos e leveduras

Produção de Anticorpos Monoclonais

Necessário:

 Células imortais (em divisão constante – p.ex. células do mieloma)

 Produção de antigenes do baço
 Fusão de ambas as células em cultura – formação de hibridoma

As células do mieloma não possuem a enzima HGPRT que permite gerar nucleótidos
purinas através da salvage purine pathway. São colocadas num meio HAT que possui um
inibidor de síntese de novo de ácidos nucleicos. Sem a fusão com as células do baço, as
células do mieloma não têm nenhuma forma de produzir ácidos nucleicos e não sobrevivem.
Os clones positivos são injetados nos ratos para produção dos anticorpos.

Culturas de Células Animais

Microrganismos Animais
Parede Celular Sim Não
Resistência Mecânica Alta Baixa
Tamanho 0.1 – 2 µm 10 – 100 µm
Tempo duplicação 0.3 – 10 h 15 – 70 h
Produtividade mg – g / 1 / dia pg – µg / 1 / dia
Concentração celular máx 109 – 1010 células / ml 106 – 108 células / ml
Meio de cultura Simples Complexo
Custo do Meio de cultura Baixo Alto
Contaminação Difícil Fácil
Metabolitos tóxicos Pouco importante Importante
Precisão de controlo Baixo Alto
Custo do equipamento Médio Alto
 Vantagens
Produção de Proteínas complexas – devido
à maquinaria de modificações pós-
traducionais
Desvantagens
Pouca resistência mecânica;
Meio de Cultura complexo;
Sensíveis a bactérias tóxicas no meio;
Pouca produtividade;
Produção mais cara;
Necessidade de aderência para crescimento

Meio de Cultura

Componentes: Aminoácidos; Vitaminas; Sais; Proteínas; outros

- Outros: Agentes antibacterianos; Vermelho de fenol (indicador de pH); Soro
- Proteínas: Fatores de crescimento; Enzimas;
Algumas células não crescem / diferenciam se não houver componentes da matriz
extracelular (colagénio, fibronectina)

Meios contendo Soro

- Pouco utilizado para evitar usar soro bovino (associado à doença das vacas loucas);
- Já preparado; Mais simples de usar;
- Algumas células requerem fatores de crescimento não incluídos no soro e que devem ser
adicionados
- precursores de glóbulos vermelhos requerem eritropoietina;
- linfócitos T requerem interleucina 2

Estes fatores de crescimento interagem com a proteínas recetoras na membrana
plasmática, estando envolvidas na sinalização intracelular

Meios não contendo Soro

- Necessário adicionar os compostos em falta do soro; Mais processos

- O meio pode ser criado de acordo com a tipologia de células

Células Aderentes

Requerem uma superfície para conseguir crescer

Células Não Aderentes

Conseguem crescer em suspensão num meio

Splitting

Células de mamíferos, principalmente as aderentes, têm preferência a crescer em colónias,

no entanto quando a densidade da cultura aumenta muito (>80% confluência) a taxa de
morte acelera.
- Aderentes – Tripsinização e transferência (após contagem das células) de uma parte
das células para outros frascos-T com novo meio.
- Suspensas – diluição da cultura (após contagem das células) para um frasco com novo
meio
Splitting

Quando as células têm 80% de confluência, adiciona-se glicerol ou DMSO (humanas) e são
contaminadas com nitrogénio líquido e mantidas a -130ºC – criopreservação;

Contaminações

25%-30% das células estão contaminadas com micoplasma e mais de 6% estão contaminas
com bactérias.
Podem ser difíceis de detetar
Podem levar à perda de cultura: Mudança no pH; → Vermelho de fenol fica amarelo
Mudanças no Metabolismo;
Aberrações nos cromossomas;
Decréscimo da taxa de crescimento;
Alteração na produção da proteína.

Consequências

Perda de tempo, dinheiro e esforço;

Efeitos adversos nas culturas;
Resultados experimentais inconcretos ou errados;
Perda de produtos valiosos;
Humilhação pessoal.

Fontes de Contaminação

- Células contaminadas
- Meio e Soro;
- Germes do ar;
- Equipamento de Laboratório;
- Influencia direta do utilizador (normalmente da flora bucal);
Por gotículas de saliva; Falta de desinfeção; Trabalho técnico descuidado

Tipos de Contaminações

Contaminações Químicas (impurezas no meio, água, endotoxinas, detergentes, etc.)

- Evitar uso de plásticos;
- Nos meios e soros, ter em atenção concentrações de metais e endotoxinas;
- Cuidado com os produtos e detergentes usados na limpeza do material;
- Impurezas nos gases usados nas incubadoras de CO2;

Contaminações Biológicas (p.ex. bactérias, fungos, vírus, micoplasma, outras linhagens de

células, etc.)
- Mais fáceis de detetar – bactérias, fungos e leveduras;
- Mais difíceis de detetar – vírus, micoplasma, outras linhagens de células (cross-
contamination)
Bactérias
- Microrganismos unicelulares; Diversidade de formas; Alta taxa de crescimento;
- Contaminação detetada por inspeção visual da cultura após poucos dias da contaminação;
Normalmente as culturas ficam turvas;
O pH do meio diminui → O meio contendo vermelho de fenol, mantem-se vermelho
num pH ~7,2.Se o pH aumenta, fica mais roxo (problema com os níveis de CO2), na presença
de bactérias, o pH diminui, o meio fica amarelo.

Leveduras
- Eucariontes unicelulares;
- Culturas contaminadas ficam turvas (principalmente em estados mais avançados);
- No microscópio têm forma de “ovo” ou esféricas.

Outros fungos
- Filamentosos (com hifas) – micélio;
- O pH mantém-se estável no início da contaminação, mas depois diminui rapidamente e a
cultura torna-se turva;
- No microscópio o micélio aparece fino, e por vezes possuem esporos.

Vírus
- Agentes infeciosos que se apoderam da maquinaria das células hospedeiras para se
reproduzirem;
- Muito difícil de detetar nas culturas (extremamente pequenos);
- A maioria é específica ao hospedeiro, por isso não contamina culturas de outras espécies;
- Culturas contaminadas podem ser um grande risco para as pessoas no laboratório,
especialmente se houver células humanas ou primárias.
- A contaminação é detetada por microscopia eletrónica, com um painel de anticorpos ou
por PCR (primers desenhados para regiões do vírus).

Micoplasma
- Bactéria muito simples e muito pequena;
- Difícil de detetar até detetarem altas densidades;
- Crescimento lento;
- Podem se manter na cultura sem provocar morte das células na cultura, mas alteram o
comportamento e o metabolismo.
- A deteção é feita por marcação por fluorescência dos núcleos das células – se o citoplasma
e o meio aparecerem fluorescentes, há contaminação; ou por PCR (primers para o DNA
de micoplasma)

Cross Contamination
- Células contaminadas com outras linhagens celulares (diferentes espécies)
- Deteta-se por DNA fingerprinting, análise dos recetores.

Agentes Antimicrobianos e Antibióticos

- A utilização destes agentes previne a contaminação;
- Não devem ser usados em rotina – pode induzir resistência nas células;
- Devem ser usados como última opção e para aplicações curtas, e devem ser removidos;
Procedimentos para culturas celulares contaminadas
- Isolar a cultura imediatamente (eliminar se possível)
- Isolar e testar as amostras da cultura crio-conservadas;
- Informar o pessoal envolvido;
- Desinfetar o laboratório;
- Iniciar tratamento às culturas irrecuperáveis.

Princípios para Reduzir os Riscos de Contaminação

- Testar as culturas para contaminação antes de começar os protocolos;
- Manter novas culturas em quarentena antes de receber o teste negativo dos testes;
- Manter as superfícies de trabalho limpas;
- Não trabalhar com garrafas / contentores abertos;
- Lavar / desinfetar as mãos;
- Usar material novo e limpo, e desinfetar com álcool;
- Líquidos derramados devem ser limpos com álcool.

Tipos de Células de Mamíferos

Primárias (isoladas dos tecidos)

- Boa fonte de informação biológica;
- Finitas (número limitado de gerações)

Linhagem Celular Contínua (imortalizadas)

Culturas de Tecidos
- Cultura de células removidas de órgão ou tecido de animal ou planta, e cultivado ex vivo.
- Normalmente obtidas de tecidos soft (pele, baço, rins, músculos);
- Células de diferentes tecidos têm morfologias diferentes e é importante conhecê-las.

Cultura de Células Primárias Aderentes

Para colocá-las em cultura é necessário:

Dissociação Enzimática – digestão usando tripsina, colagenase ou outras proteases que
afetem a matriz extracelular;
Explant – colocar o tecido no meio por 24h e as células que se soltaram podem crescer.

Nos tecidos, as células interagem com a matriz extracelular por junções celulares
- Oferecem suporte e resistência;
- O colagénio ajuda a estabilizar as interações entre células no meio de cultura;

Microambiente Tumoral

Tipos de Culturas

Epitelial – Superfície externa e interna dos órgãos e tecidos;

Linfoblasto

Fibroblasto – São as que mais proliferam

Tipos de células: Osso, Cartilagem, Tecido conectivo, Sangue, Imunitárias

(Aderentes) (Suspensão)
Fases no Estabelecimento de uma Linhagem Humana

Fase I - No início algumas células

morrem, e outras começam a
crescer (aumento da taxa de
crescimento);

Fase II – A cultura cresce durante

~50 gerações com uma taxa de
crescimento constante;

Fase III – O crescimento para e

aumenta a mortalidade.

Linhagens celulares derivadas de tumores podem crescer por mais de 100 gerações.

Medula Óssea

- Fonte de células estaminais – taxa de divisão celular mais alta;

- Onde se produz todos os precursores das células do sistema hematopoiético (linfócitos,
hematócitos, basófilos, eritrócitos;
- Células em suspensão;
- Menos maturas, têm mais capacidade de se dividir;

Fusão de Células

- Formação de Hibridomas para a produção de anticorpos monoclonais;

- Facilitado na presença de vírus ou polietilenoglicol.

Aplicações
Biologia
Medicina
Engenharia

Desenvolvimento de novas terapias celulares;

Descoberta de Vacinas;
Desenvolvimento de Terapia de Genes;
Descoberta de Fármacos;
Pesquisas sobre Cancro;
 Células Estaminais

Células indiferenciadas que conseguem se dividir, proliferar e diferenciar em diferentes

tipos de células especializadas (músculo, sangue, etc.).

Existem em: Embrião (blastocisto); Fluido amniótico; Cordão umbilical; Tecidos adultos

Utilização: AVC, Cegueira, Cura de cicatrizes, Diabetes, Cancros, etc.

Potência = Plasticidade

Quanto mais indiferenciada, mais ela consegue dividir, logo é mais plástica;
- No embrião, formam o blastocisto, que consegue se diferenciar em quase todas as
tipologias de células, mas não consegue desenvolver o organismo todo.

Células Estaminais Embrionárias (ESC)

Células Pluripotentes;
Alta plasticidade;

Blastócitos
- As que são usadas em laboratório, vêm de clínicas de fertilização;
- Quando não são usados para fertilizar os dadores, podem ser:
Congelados; Deitar fora; Guardar para futuras gestações ou para pesquisa.

Feto
- Fluido Amniótico: nas mulheres grávidas é usado para testar defeitos nos cromossomas –
amniocentese
- Fonte de Células Estaminais;

Cordão Umbilical
- Fonte de células Estaminais mais imaturas que conseguem proliferar em cultura.
- Multi- ou pluripotentes?

NÃO se pode manipular as células embrionárias para manipulação de caraterísticas do

indivíduo, mas pode para fins terapêuticos.

Células Estaminais Adultas

- Encontram-se na pele, cordão umbilical, fígado, medula óssea, pâncreas, córnea, etc.
- Multipotentes – conseguem se diferenciar em vários tipos de células, mas limitadas às
células relacionadas com o tecido de onde foram retiradas;
- As células estaminais decrescem em número muito rapidamente e também perdem a
capacidade de regenerar;

Leite Materno

Possui células estaminais e imunitárias;

Células Estaminais Multipotentes

Hematopoiéticas – todos os tipos de células do sangue

Evoluem para células com recetores diferentes – marcação dos recetores com fluóforos para
identificar as células na cultura;
Mesenquimal – células estaminais da espinal medula;

Originam Osteoblastos (osso); Condrócitos (cartilagem); Adipócitos (gordura) e tecido

conjuntivo;

Medula Óssea

Conseguem originar Osteoblastos; Condrócitos; Fibroblastos; Adipócitos; Miócitos;

Endoteliais

Pele

Na camada basal da epiderme – originam queratinócitos;

E na base dos folículos do cabelo/pelo – originam folículos

Sistema Nervoso

Originam 3 tipos de células: Nervosas (neurónios); Astrócitos e Oligodendrócitos;

- As células nervosas perdem a capacidade de divisão

Epitelial

Encontra-se no interior do trato digestivo

Células Estaminais Unipotentes

São encontradas em tecido adulto e conseguem se diferenciar em células do mesmo tecido.

Compromisso

A partir de um certo momento na proliferação, a geração seguinte chega a um

compromisso de deixar de se proliferar e vai diferenciar;
- Dividem e proliferam enquanto houver sinais para isso (fatores de transcrição, etc.)

- Os fatores de transcrição induzem a produção de certas proteínas efetoras (c-Myc, b-Myb

comuns no cancro) que desencadeiam as pathways de sinalização dos fatores de
crescimento e induzir o ciclo celular.

Sinalização WNT, FGF, Notch, Hedgehog, TGFh/BMP

Manutenção da homeostase do tecido – permite a renovação das células estaminais,

proliferação e diferenciação;

Epigenética

Tem um papel principal na diferenciação ou não de uma célula estaminais específicas

(metilação de DNA, acetilação de histonas, remodelação da cromatina)

Multipotentes: 1970 – 1º transplante de medula óssea em pacientes com leucemia

Pluripotentes: 1998 – Células isoladas de embriões em excesso produzidos in vitro em

clínicas de fertilização (Dr. James Thompson)
Terapia Celular

Medicina Regenerativa; Utilização de células para modificações genéticas no sentido

de as usar para reparar ou substituir tecidos ou órgãos danificados;

Definição pela FDA: prevenção, tratamento, cura ou melhoramento de uma doença ou

ferida em humanos pela administração de células autólogas, alogénicas ou xenogénicas
que tenham sida manipuladas ou alteradas ex vivo.

Células Estaminais Embrionárias; do Líquido Amniótico; do Cordão Umbilical; Adultas

Transplante Alogénico – problemas com dadores compatíveis;

Células do Cordão Umbilical têm menos tendência a criar problemas pós cirurgia, mas é
uma fonte limitada de células;

Medicina Regenerativa

Engenharia Celular
- Propagação de células e expansão de culturas; Seleção das células;
- Tratamentos farmacológicos das células;
- Reativação biológica das células (reprogramar as células adultas para uma fase de
pluripotência – iPS)
- Química – as células não contêm transgenes;
- Biológica – as células contêm transgenes do vírus usado;

ESC e IPSC
Fenótipos e Morfologia semelhante;
Expressam marcadores de pluripotência;
Formam teratomas – agrupamento de células com diferentes diferenciações?
Diferenciam-se nas 3 “germ layers”.

Transferência Nuclear de Células Estomáticas

Remove-se o núcleo de ambas as células dadoras e recetoras; O núcleo da célula dadora é

inserido na célula recetora através de fusão com uma descarga elétrica.

Entrega Terapêutica de Genes nos Pacientes

Clonagem de vetores com o gene de interesse e introduzi-la na circulação sistémica ou

diretamente no órgão;

Matrizes

Necessidade de uma equipa multidisciplinar → Biologia, Química, Física, Eng. de Materiais

Aspetos a considerar: Porosidade; Biocompatibilidade;
Permeabilidade; Biodegradação;

Pesquisa

Identificar e testar fármacos;

Identificar alvos terapêuticos;
Estudar a diferenciação;
Estudar a prevenção de doenças ao nascimento