Atividade acompanhada – Engenharia Genética

Alunos: Gabriel Stevanin e José Ricardo Martins Júnior

Página 360
1. Que vantagem a produção de insulina humana por bactérias
geneticamente construídas tem sobre a extração de insulina a partir
de tecido pancreático bovino?
A produção de insulina a partir do tecido pancreático bovino pode ser de
difícil aceitação pelo sistema imunológico de alguns humanos, já a produção
através de bactérias é menos complexa (mais facilmente sintetizada em
laboratório) e há replicação da insulina humana, que não sofre com a rejeição.
2. Quais são as limitações do uso de culturas de células animais e
vegetais para a produção de compostos úteis na medicina, tal
como a insulina?
Células animais e vegetais usualmente não podem ser cultivadas para a
produção de compostos utilizados na medicina, tal como a insulina. Por
exemplo, as células tissulares que sintetizam insulina em seres humanos
normais perdem habilidade em produzir esse hormônio quando são isoladas e
cultivadas em laboratório. Além disso, o cultivo de células de tecido em
laboratório é dispendioso e requer meios complexos altamente enriquecidos.
3. Quanto tempo a biologia molecular levou para evoluir de um
método promissor de pesquisa para o mercado de insulina humana
sintetizada por engenharia genética?
Em 1974, os cientistas estimaram que levaria de cinco a dez anos para
colocar-se o gene humano para produção de insulina dentro de uma bactéria.
Entretanto, isto foi feito com sucesso após um ano.
Página 366
1. Quais são as etapas básicas para construir uma bactéria pela
engenharia genética?
Diferentes métodos são usados para combinar o material genético de dois
tipos celulares distintos, mas os procedimentos gerais se assemelham uns com
os outros. As seguintes etapas básicas são utilizadas para produzir uma
bactéria geneticamente construída:
1. O conteúdo de DNA de um determinado gene a ser transferido é obtido de
um organismo doador ou, em alguns casos, pode ser sintetizado a partir de
nucleotídeos por técnicas laboratoriais.
2. O DNA plasmidial (DNA bacteriano cíclico extra cromossômico) é isolado
para servir como carreador de um determinado gene.
3. O DNA doador e o DNA plasmidial são tratados com a mesma enzima, uma
endonuclease de restrição, que cliva ou corta o DNA de maneira a formar fitas
simples com terminais complementares ("terminais coesivos"). Estes terminais
são capazes de ligar-se a outros fragmentos de DNA que apresentam o mesmo
final complementar das fitas simples.
4. O terminal coesivo de um fragmento do DNA doador liga-se com o terminal
coesivo do DNA plasmidial resultando, assim, um plasmídeo modificado que
agora carrega o fragmento do DNA doador.
5. O plasmídio é então adicionado a uma suspensão de bactérias receptoras
que adquirem o plasmídio pelo processo de transformação. As bactérias
contendo o plasmídeo são identificadas e isoladas.
6. As colônias das bactérias contendo o plasmídeo, que possuem o gene ou
podem elaborar o produto do gene transferido, são identificadas.
7. As bactérias geneticamente construídas são propagadas em grande
quantidade e o produto (proteína) codificado pelo gene transferido é extraído
das culturas e purificado.
2. Como o DNA plasmidial é isolado?
O DNA plasmidial é isolado pelo uso da técnica de centrifugação por
gradiente de densidade.
3. Qual é a função das endonucleases de restrição em bactérias?
Como uma célula bacteriana protege seu próprio DNA de suas
endonucleases de restrição? Como as endonucleases de restrição
são usadas para construir um plasmídio recombinante?
Sua função é identificar e destruir o "DNA estranho" que pode entrar na
célula. Elas reconhecem certos sítios (sequências nucleotídicas curtas de
quatro a seis pares de bases) em moléculas de DNA fita dupla e então fazem
um corte no esqueleto de desoxirribose-fosfato das duas fitas de DNA, como
uma tesoura cortando um pedaço de fita. Este processo destrói a atividade
biológica do DNA estranho.
Seria desastroso se uma célula usasse suas endonucleases de restrição para
destruir seu próprio DNA ("DNA self"). Consequentemente uma célula fornece
marcas de identificação para o seu próprio DNA na forma de grupos metil (-
CH3), que são adicionados a certos nucleotídeos dentro de uma sequência
específica. Este processo de adição de grupos metil é chamado de modificação
do DNA. Se uma sequência específica de DNA foi modificada por metilação,
então a cadeia de DNA não pode ser clivada por endonucleases de restrição
próprias da célula. Assim, uma célula pode distinguir DNA estranho não
modificado de seu próprio DNA modificado.
Com a descoberta das endonucleases de restrição, é possível tratar dois tipos
diferentes de DNA com a mesma enzima, assim cada DNA apresenta terminais
coesivos similares. Portanto, os dois DNA podem ser ligados para formar uma
molécula de DNA única. Em 1973, Stanley Cohen e Annie Chang, da Escola de
Medicina da Universidade de Stanford, e Herbert Boyer e Robert Helling, da
Universidade da Califórnia, San Francisco, foram os primeiros a demonstrar
que os plasmídios contendo dois diferentes tipos de DNA (plasmídios
recombinantes) podiam ser construídos.
4. Qual é a importância de usar cDNA para a clonagem de genes
eucarióticos em células procarióticas? Como o cDNA é obtido?
O gene de um eucarioto como o da rã pode ser inserido em um plasmídio,
porém pode não ser necessariamente expresso. Isto significa que a bactéria
que eventualmente recebe o plasmídio pode não ser capaz de sintetizar o
produto codificado pelo gene eucariótico específico porque:
1. As sequências de DNA em células eucarióticas que iniciam e interrompem a
expressão gênica não funcionam da mesma maneira nas células bacterianas.
Para resolver esse problema, é necessário inserir genes eucarióticos no
plasmídio de maneira que sua expressão possa ser governada por sequências
de DNA que são apropriadas para a expressão do gene bacteriano.
2. Os genes eucarióticos, ao contrário dos genes bacterianos, usualmente
contêm íntrons (regiões que não codificam proteínas), além dos exons (regiões
que codificam proteínas). Após a transcrição dos genes contendo íntrons em
mRNA, células eucarióticas processam o mRNA e, assim, os íntrons são
removidos. Os exons são ligados, originando um RNA mensageiro apropriado
que pode ser traduzido em proteína. Infelizmente, as bactérias não realizam o
processamento do mRNA. Isto significa que 'simplesmente colocar um
plasmídio recombinante contendo um gene eucariótico em uma célula
bacteriana provavelmente não resultará em transcrição do gene em um RNA
mensageiro apropriado. A solução é isolar o RNA mensageiro em vez do DNA
das células eucarióticas. Este RNA mensageiro é então utilizado no laboratório
como um molde para a construção de uma molécula de DNA correspondente
que pode ser inserida em um plasmídio. A construção da molécula de DNA é
realizada por meio de uma enzima denominada trancriptase reversa (DNA
polimerase RNA dependente).
Assim, o DNA complementar, ou cDNA, artificialmente produzido é inserido no
plasmídio, em vez do DNA obtido diretamente das células eucarióticas, e
eventualmente é incorporado pela célula bacteriana.
5. Qual a contribuição da transformação pelo cloreto de cálcio para a
engenharia genética?
O método usual para inserir os plasmídios na bactéria receptora é a
transformação. Infelizmente, a maioria das bactérias não absorve prontamente
o DNA plasmidial. Porém, um método denominado transformação pelo cloreto
de cálcio (CaCl2) tem-se mostrado efetivo. Ele envolve o tratamento de células
receptores com CaCI2, sob baixas temperaturas (0 a 4°C para a E. coli), adição
do plasmídio recombinante e aquecimento das células (42°C para E. coli) para
dar-lhes um choque térmico.
 6. Como as bactérias que sintetizam o produto de um determinado
gene clonado podem ser identificadas?
A identificação, pela seleção das colônias, derivadas de milhares de
bactérias transformadas, para determinar qual delas sintetiza o produto de um
gene particular pode ser muito vagarosa. Todavia, vários métodos têm sido
projetados para acelerar a pesquisa. Por exemplo, se o gene de interesse é o
que codifica a insulina humana, pode-se injetar uma pequena quantidade de
insulina (derivada do tecido humano) em um coelho. O coelho, por sua vez,
produz anticorpos (proteínas específicas) em seu soro sanguíneo, que se ligam
à insulina humana. Estes anticorpos podem ser purificados do soro de coelho e
ser marcados com um elemento radioativo. Assim, podem ser usados para
identificar as colônias de bactérias que apresentam o gene para insulina,
porque os anticorpos ligam-se à insulina produzida pelas bactérias e podem ser
detectados por um aparelho que mede radioatividade.
Página 367
1. Que problemas na clonagem genética podem ser atribuídos ao tipo
de endonuclease de restrição utilizada?
O uso de uma endonuclease de restrição inadequada na clonagem genética
pode levar a problemas como corte inadequado, corte excessivo, problemas de
compatibilidade e dificuldades na identificação do fragmento de interesse. É
importante selecionar cuidadosamente a enzima de restrição e otimizar as
condições de corte para minimizar esses problemas.
2. Suponha que um gene tenha sido clonado adequadamente em um
plasmídio vetor e que tenha sido inserido com sucesso em uma
célula bacteriana. O que pode ser responsável pela falha em obter
um produto útil a partir da bactéria?
A falha na obtenção de um produto útil a partir de uma bactéria após a
clonagem bem-sucedida de um gene em um plasmídeo vetor e sua inserção
em uma célula bacteriana pode ser causada por vários fatores, incluindo
incompatibilidade do vetor, baixa eficiência da expressão, contaminação da
cultura, seleção inadequada e mutação do gene clonado.
3. Qual a vantagem de clonar genes em leveduras em vez de células
bacterianas?
Clonar genes em leveduras apresenta vantagens em relação à produção de
proteínas recombinantes em células bacterianas, como a capacidade de
produzir proteínas complexas com modificações pós-traducionais semelhantes
às encontradas em organismos superiores, maior controle da expressão do
gene recombinante, capacidade de clonar genes maiores e compartilhar vias
metabólicas com organismos superiores.
Página 370
 1. Como as vacinas geneticamente construídas contra a febre aftosa e
a hepatite B foram desenvolvidas?
As vacinas contra a febre aftosa e a hepatite B foram desenvolvidas
usando técnicas de engenharia genética. A vacina contra a febre aftosa foi
criada usando vírus inativados geneticamente modificados para produzir
proteínas virais específicas. A vacina contra a hepatite B foi produzida
usando proteínas recombinantes produzidas por leveduras geneticamente
modificadas.
2. Como a engenharia genética foi usada para melhorar a produção
industrial do ácido ascórbico?
A engenharia genética foi usada para melhorar a produção industrial do
ácido ascórbico. Essa técnica envolveu a introdução de genes que codificam
enzimas necessárias para a biossíntese do ácido ascórbico em bactérias de
produção em larga escala, como a Escherichia coli. Além disso, foram feitas
modificações em outros genes para aumentar a capacidade das células de
produzir precursores necessários para a síntese do ácido ascórbico. Essas
técnicas de engenharia genética levaram a um aumento significativo na
produção de ácido ascórbico a um custo mais baixo, tornando-o mais acessível
como suplemento vitamínico.
3. Como uma cepa bacteriana alterada geneticamente pode ser usada
para proteger as frutas contra os danos da geada?
Uma cepa bacteriana alterada geneticamente pode ser usada para proteger
as frutas contra os danos da geada através da produção de proteínas antifrios.
A proteína antifrio é produzida a partir de genes de organismos que podem
sobreviver em ambientes extremamente frios e é então introduzida na bactéria
modificada. Quando a bactéria é aplicada nas plantas, as proteínas antifrios
produzidas ajudam a proteger as células das plantas contra o frio extremo e
reduzem o dano da geada nas frutas. Essa técnica pode ser uma alternativa
sustentável para os métodos convencionais de proteção das plantas contra o
frio, como o uso de produtos químicos, que podem ser prejudiciais ao meio
ambiente.
4. Quais são alguns dos riscos em potencial da engenharia genética?
A engenharia genética apresenta alguns riscos potenciais que precisam ser
considerados. A modificação de organismos vivos pode causar efeitos
imprevisíveis no ambiente, especialmente se esses organismos são liberados
no ambiente natural. Além disso, a modificação de organismos pode levar à
criação de novos patógenos ou à resistência a antibióticos. Ainda é necessário
estabelecer um regulamento adequado para monitorar a produção e o uso de
organismos geneticamente modificados, bem como avaliar os riscos potenciais
antes de sua liberação no ambiente natural. É importante considerar esses
riscos e tomar as medidas necessárias para minimizá-los, a fim de garantir a
segurança e a sustentabilidade da engenharia genética.
 5. Com que rigor deve ser feita a regulamentação da engenharia
genética? A segurança absoluta contra todos os prejuízos futuros e
imaginados devem tornar-se o objetivo de todo controle?
A regulamentação da engenharia genética deve ser rigorosa para garantir a
segurança dos seres vivos e do meio ambiente. No entanto, é importante
lembrar que a segurança absoluta é impossível de ser alcançada e que o
objetivo deve ser minimizar os riscos e danos potenciais, mantendo um
equilíbrio com os benefícios que a tecnologia pode trazer.