Processes of Recombinant DNA

Technology: Isolation, Restriction,

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A tecnologia de DNA recombinante (rDNA) refere-se ao processo de
unir moléculas de DNA de duas fontes diferentes e inseri-las em um
organismo hospedeiro, para gerar produtos para uso humano. Você
pode colocar as moléculas de DNA no organismo hospedeiro primeiro e
depois cortá-las e juntá-las? Não! Este processo envolve várias etapas
que devem prosseguir em uma sequência específica para gerar o
produto desejado. Vamos entender cada passo em detalhes.
Índice
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1. Isolamento de Material GenéticoJá sabemos que o material genético

de todos os organismos vivos é o 'ácido nucléico'. Na maioria dos
organismos, é DNA, enquanto em alguns é RNA. O primeiro passo na
tecnologia de rDNA é isolar o DNA desejado em sua forma pura, ou
seja, livre de outras macromoléculas.No entanto, em uma célula
normal, o DNA não existe apenas dentro da membrana celular, mas
também está presente junto com outras macromoléculas, como RNA,
polissacarídeos, proteínas e lipídios. Então, como abrimos a célula e
obtemos DNA livre de outras macromoléculas? Podemos usar as
seguintes enzimas para fins específicos:

Lisozima  – para quebrar a parede celular bacteriana.

Celulase  – para quebrar a parede celular da planta.

Quitinase  – para quebrar a parede celular fúngica.

Ribonuclease  – remove o RNA.

Protease – remove proteínas (como histonas associadas ao

DNA).
Outras macromoléculas são removíveis com outras enzimas ou
tratamentos. Por fim, a adição de etanol faz com que o DNA precipite
como fios finos. Este é então desenrolado para dar DNA purificado.

Etapas do isolamento de DNA [Fonte: Wikimedia Commons]2. Digestão

de Enzimas de RestriçãoAs enzimas de restrição agem como tesouras
moleculares que cortam o DNA em locais específicos. Essas reações
são chamadas de “digestões de enzimas de restrição”. Eles envolvem a
incubação do DNA purificado com a enzima de restrição selecionada,
em condições ótimas para aquela enzima específica.A técnica –
'Eletroforese em Gel de Agarose' revela o progresso da digestão com
enzimas de restrição. Esta técnica envolve a execução do DNA em um
gel de agarose. Na aplicação de corrente, o DNA carregado
negativamente viaja para o eletrodo positivo e é separado com base no
tamanho. Isso nos permite separar e cortar os fragmentos de DNA
digeridos. O DNA do vetor também é processado usando o mesmo
procedimento.
Imagem de DNA digerido após eletroforese em gel de agarose [Fonte:
Wikimedia Commons]3. Amplificação usando PCRA reação em cadeia
da polimerase ou PCR é um método de fazer várias cópias de uma
sequência de DNA usando a enzima – DNA polimerase. Ajuda a
amplificar uma única cópia ou algumas cópias de DNA em milhares ou
milhões de cópias. As reações de PCR são executadas em
'termocicladores' usando os seguintes componentes:
 Modelo - DNA a ser amplificado

Primers – pequenos oligonucleotídeos sintetizados

quimicamente que são complementares a uma região do
DNA.

Enzima – DNA polimerase

Nucleotídeos – necessários para estender os primers pela

enzima.

Termociclador [Fonte: Wikimedia Commons]Os fragmentos cortados de

DNA podem ser amplificados usando PCR e então ligados com o vetor
cortado conforme explicado abaixo. 4. Ligação de Moléculas de DNA
O DNA purificado e o vetor de interesse são cortados com a
mesma enzima de restrição. Isso nos dá o fragmento cortado
de DNA e o vetor cortado, que agora está aberto. O processo
de unir essas duas peças usando a enzima 'DNA ligase' é
'ligação'. O DNA resultante é ' DNA recombinante '.
Digestão com enzimas de restrição seguida de ligação. [Fonte:
Wikimedia Commons]5. Inserção de DNA recombinante no hospedeiro
Nesta etapa, o DNA recombinante é introduzido em uma
célula hospedeira receptora. Este processo é 'Transformação'.
As células bacterianas não aceitam DNA estranho facilmente.
Portanto, eles são tratados para torná-los 'competentes' para
aceitar o novo DNA. (O tópico – Ferramentas de
Biotecnologia explica algumas maneiras de tornar as células
competentes).

Durante a transformação, se um DNA recombinante contendo

um gene para resistência à ampicilina for transferido para 
células  receptoras de E. coli  , então as células de E. coli 
também se tornarão resistentes à ampicilina. Este aspecto é
útil na diferenciação de células transformadas de células não
transformadas.

Por exemplo, se espalharmos as células transformadas em placas de

ágar contendo ampicilina, apenas as células transformadas resistentes
à ampicilina crescerão, enquanto as células não transformadas
morrerão. Portanto, neste caso, o gene de resistência à ampicilina atua
como o 'marcador selecionável'.6. Obtenção de Produto Genético
Estrangeiro
O DNA recombinante se multiplica no hospedeiro e é
expresso como uma proteína, em condições ideais. Esta é
agora uma  proteína recombinante . Pequenos volumes de
culturas de células não renderão uma grande quantidade de
proteína recombinante. Portanto, a produção em larga escala
é necessária para gerar produtos que beneficiem os seres
humanos. Para isso,  são utilizados vasos chamados
biorreatores  .

Os biorreatores são grandes recipientes com sistema de cultivo

contínuo, onde o meio fresco é adicionado de um lado e o meio usado
é retirado do outro lado. Os biorreatores podem processar cerca de
100-1000 litros de culturas de células. Um biorreator fornece condições
ótimas (temperatura, oxigênio, pH, vitaminas, etc.)'Biorreator de tanque
agitado' é o tipo mais comum de biorreator. Geralmente é cilíndrico e
tem as seguintes partes:

Sistema agitador – para mexer o conteúdo uniformemente

Sistema de fornecimento de oxigênio - para introduzir ar no

sistema

Sistema de controle de espuma

Sistema de controle de temperatura

sistema de controle de pH

Portas de amostragem - para retirar pequenas quantidades de

cultura
Biorreator [Fonte: Wikimedia Commons]7. Processamento a
jusanteAntes de a proteína ser comercializada como produto final, ela é
submetida a um processamento a jusante que inclui:

Separação e purificação.

Formulação com conservantes adequados.

Ensaios clínicos para testar a eficácia e segurança do

produto.

Testes de controle de qualidade.

Nota: Esses processos diferem de produto para produto.Exemplo

resolvido para vocêPergunta: Organize as etapas da tecnologia de DNA
recombinante na ordem correta:

1. Transformação

2. Isolamento de DNA

3. ligadura