Engenharia Genética

A Engenharia Genética permite manipular diretamente os genes de determinados organismos com objetivos práticos
. A Engenharia Genética permitiu: conhecer melhor as doenças humanas; oferecer produtos interessantes à
indústria; libertar a agricultura da sua dependência dos adubos e pesticidas. São várias as aplicações da Engenharia
Genética e as técnicas utilizadas .

Estas técnicas/ferramentas(enzimas de restrição; tecnologia do DNA recombinante; DNA complementar; reações de

polimerização em cadeia) têm como objetivo melhorar ou criar produtos e organismos, procurando sempre um
melhoramento genético .

Enzimas de restrição

As enzimas de restrição reconhecem determinadas sequências de DNA e cortam a molécula nesses locais. As zonas
de restrição correspondem a sequências de DNA curtas e simétricas que se leem da mesma forma nas duas cadeias
na direção 5´-3´ .

A atividade das enzimas de restrição dá origem a fragmentos de DNA em dupla hélice com extremidades em cadeia
simples. Aos fragmentos de DNA que resultam da atividade das enzimas de restrição chamam-se fragmentos de
restrição e as extremidades em cadeia simples chamam-se extremidades coesivas . As extremidades coesivas
emparelham por ligações de hidrogénio entre bases complementares e unem-se pela atividade das ligases do DNA
que catalizam a formação de ligações fosfodiéster .

DNA recombinante

A técnica do DNA recombinante permite combinar na mesma molécula de DNA genes provenientes de fontes
diferentes, mas não necessariamente de espécies diferentes, dando origem a uma molécula de DNA recombinante. É
possível introduzir um gene humano em bactérias para que estas produzam, em larga escala, uma determinada
proteína humana . Além disso, o gene com interesse é clonado permitindo a sua conservação em diversas cópias
para posteriores utilizações-bibliotecas de genes.

Esta técnica baseia-se na utilização de ferramentas moleculares como as enzimas de restrição, as ligases do DNA e os
vetores .

Na transferência de genes é necessária a existência de um “transportador”, isto é, um vetor que leve o material
genético de um genoma para outro . Há diversos tipos de vetores sendo os plasmídeos(molécula de DNA circular)
das bactérias dos mais utilizados.

A obtenção e expressão de uma molécula de rDNA processa-se do seguinte modo:

1. Seleciona-se uma molécula de DNA dadora, contendo o gene com interesse que se pretende transferir e
clonar, e um vetor adequado.
2. A molécula de DNA e o vetor são tratados com a mesma enzima de restrição, que corta as duas moléculas
em regiões com a mesma sequência de nucleótidos .
3. Misturam-se os fragmentos de restrição da molécula de DNA e o vetor e juntam-se as ligases do DNA. O
vetor e os fragmentos de restrição emparelham pelas extremidades coesivas, que são complementares, e a
ligase estabelece a ligação .
4. O gene passa a fazer parte do plasmídeo que possui agora, para além dos seus genes, o gene estranho que
lhe foi inserido, isto é, possui um DNA recombinante.
5. O plasmídeo com DNA recombinante entra para algumas bactérias.
6. Estas bactérias funcionam como células hospedeiras e aceitam o plasmídeo, e com ele o novo gene.
7. Um meio seletivo ou testes químicos permitem identificar as células que exprimem o gene desejado. No
processo descrito formam-se fragmentos de restrição que não tem o gene desejado e nem todas as células
recetoras incorporam o DNA dador.
8. A partir do DNA recombinante, o gene inserido passa a comandar a síntese da proteína desejada.

Algumas aplicações desta técnica: obtenção de organismos geneticamente modificados; biorremediação; produção
de substâncias com aplicação industrial.
DNA complementar

Esta técnica permite obter DNA a partir de um mRNA maduro e facilita a obtenção de DNA no seu estado mais puro.

Os procariontes são organismos muito utilizados na engenharia genética como recetores de DNA estranho porque
são fáceis de cultivar, têm um crescimento rápido e processos bioquímicos bem conhecidos. No entanto, não
processam o mRNA e, quando recebem genes com intrões, estes não são retirados e a proteína não é funcional.

Este problema pode ser ultrapassado pela obtenção e transferência de DNA complementar. O DNA complementar é
uma molécula de DNA sem intrões que é diretamente transcrita numa molécula de mRNA funcional.

O processo de obtenção de cDNA é o seguinte:

1. Isola-se uma molécula de mRNA funcional das células.

2. Adiciona-se a transcriptase reversa. A transcriptase reversa cataliza a síntese de uma cadeia simples de DNA
a partir de um molde de mRNA.
3. Quando a síntese da cadeia simples de DNA se completa, o mRNA é removido, degradando-se.
4. Após a formação da primeira cadeira de cDNA, a DNA polimerase forma a cadeia complementar
constituindo-se uma molécula estável.

O DNA complementar pode ser inserido através de um vetor contendo o promotor e intrões. Ao ser inserido um
clone de cDNA garante-se a produção de uma proteína normal.

Algumas aplicações desta técnica: obtenção de cópias de genes que codificam produtos com interesse.

Reações de polimerização em cadeia(PCR)

Esta técnica permite amplificar qualquer porção de DNA fora das células. Consta das seguintes etapas:

1. Solução com DNA, primers, nucleótidos livres e DNA-polimerase.

2. Aquecimento.
3. Separação das cadeias de DNA.
4. Arrefecimento.
5. Ligação de alguns primers a zonas específicas da cadeia simples de DNA.
6. Reconstituição da dupla hélice de DNA a partir dos primers, uma vez que a DNA-polimerase reconhece os
primers como locais de iniciação de síntese.
7. O procedimento é repetido e em cada ciclo a quantidade de DNA duplica.

Esta técnica permite a obtenção de biliões de cópias de uma porção de DNA em poucas horas e é executada por
aparelhos.

Mariana Melo