Conteúdo

Técnicas de DNA recombinante............................................................................................................................................2

 Clivagem do DNA......................................................................................................................................................2
 Ligação dos fragmentos de DNA...............................................................................................................................3
 Clonagem de DNA.....................................................................................................................................................3
 Transformação..........................................................................................................................................................4
 Vetores de expressão................................................................................................................................................4
 Organismos Geneticamente Modificados (OGM......................................................................................................5
Vantagens que levaram à criação de alimentos geneticamente modificados?.............................................................6
Exemplo de uma técnica que derivou da técnica do rDNA...................................................................................................6
DNA complementar (cDNA)..................................................................................................................................................7
PCR....................................................................................................................................................................................... 8
Conclusão............................................................................................................................................................................. 9
Bio/Webgrafia..................................................................................................................................................................... 11
Técnicas de DNA recombinante
As técnicas de rDNA permitem estudar diversos processos biológicos e obter benefícios em diversas áreas. Este consiste
na alteração do material genético fora do organismo para se obter características aprimoradas e desejadas aos
organismos vivos e outros produtos, o mesmo só é possível porque a estrutura química do DNA é partilhada por todos
os organismos diferindo, somente, na ordem dos nucleótidos. Além disso, sequências de DNA que não ocorrem de
forma natural podem ser criadas por síntese química do DNA.

As técnicas de DNA recombinante baseiam-se nas seguintes técnicas:

Clivagem do DNA
Clivagem do DNA em locais específicos através de enzimas de restrição, o que permite o isolamento a manipulação de
genes individuais.
o Enzimas de restrição
 As enzimas de restrição são endonucleases que reconhecem sequências específicas de 4 a 12
pares de bases e que cortam o DNA originando 3 tipos de extremidades: extremidades cegas ou
abruptas, ou seja, nenhuma das cadeias fica protuberante levando a problemas na
recombinação sendo um dos tipos de corte menos eficiente; ou extremidades coesivas no 3´ ou
5´, as quais emparelham muito mais facilmente, pois criam pontas em cadeia simples com
sequências que se complementam.
 Tipos de enzimas de restrição:
 Tipo I: dependem de ATP, Mg 2+¿¿ , reconhecem uma sequência particular e cortam num
ponto não específico dessa sequência;
 Tipo II: dependem de Mg 2+¿¿, cortam de forma específica uma sequência particular de
DNA;
 Isosquisómeros: estas são enzimas de restrição diferentes pois provem de espécies de
estirpes diferentes das anteriores e reconhecem e cortam a mesma sequência de DNA
sendo perfeitas ou imperfeitas.
 Sobre a EcoRI:
o Enzima isolada a partir de estirpes de Escherichia coli.
o Na área da biologia molecular ela é utilizada como uma enzima de restrição
originando extremidades coesiva na extremidade 5´de molécula de DNA.
o A EcoRI faz corte na sequência GAATTC do DNA.
o Utilizada em uma grande variedade de técnicas de genética molecular, desde a
clonagem até à supressão de segmentos de DNA in vitro.

Ligação dos fragmentos de DNA

Ligação dos fragmentos de DNA para a construção de moléculas que não estão presentes na natureza, a enzima que
possui como função facilitar a ligação dos fragmentos de DNA é a DNA ligase.

https://www.youtube.com/watch?v=glWEvARFueA

Clonagem de DNA
Clonagem do DNA através de clonagem de vetores ou PCR¸ para se originar cópias.
o Vetores de clonagem
 Os fragmentos obtidos após utilização de enzimas de restrição podem ser inseridos em
vetores, caso possuam sequencias complementares (têm de ser cortado com a mesma enzima)
e estejam na presença de uma DNA ligase.
 Uma pergunta relevante seria o porquê de não se usar a técnica de PCR para obter muitos
clones? A resposta encontra-se no facto do PCR dar origem a fragmentos diferentes e
pequenos. Caso quiséssemos clonar uma sequência comprida, o processo teria pouca eficiência.
Por isso, devem-se usar vetores.
 Para ser considerado um vetor de clonagem deve apresentar as seguintes características:
 Capacidade de incorporar DNA exógeno;
  Replicação autónoma;
 Existência de locais únicos de corte por enzimas de restrição;
 Mecanismos de seleção, por exemplo a resistência a um antibiótico;
 Fáceis de purificar;

 Tipos de vetores de clonagem:

 Plasmídeos;(https://brasilescola.uol.com.br/o-que-e/biologia/o-que-sao-
plasmideos.htm)
o Os plasmídeos são definidos como pequenas moléculas de DNA circular
extracromossomial que são encontradas em bactérias e também em leveduras.
o Podem ser encontradas várias cópias de plasmídeos e que eles são
frequentemente transferidos de uma célula para outra.
o Possuem a capacidade de se replicar de maneira independente e, geralmente,
apresentam poucos genes.
o A produção in vitro através dos plasmídeos permite apenas a obtenção de
quantidades muito pequenas de proteínas, daí que se possa utilizar esta técnica
em estudos, mas não para a produção em grande escala.
 Fagos/Bacteriófagos; (https://www.infopedia.pt/apoio/artigos/$bacteriofago)
o Os bacteriófagos são vírus que infetam bactérias.
o Mais complexos que os plasmídeos pois possuem genes codificadores de
proteínas utilizadas na construção das suas próprias estruturas e pela
replicação;
o Dependem da célula hospedeira para efetivamente transportar para fora o seu
Rdna;
o Cada fago replica-se numa espécie bacteriana específica;
o Vantagens aos plasmídeos:
 São mais facilmente introduzidos nas bactérias;
 Grande variedade de combinações de genes que podem ser inseridos
no DNA do bacteriófago para criar moléculas recombinantes de DNA
estável;
 Incorporam facilmente DNA estranho
 50% de sucesso enquanto o plasmídeo ronda os 10%
o A maquinaria celular bacteriana sintetiza o vetor proteico e o DNA, mas a
bactéria é destruída quando os fagos são libertados
 Cosmídeos;
o O problema da utilização de fagos é o facto de o seu DNA ser linear, logo é
necessário criar um sistema que permitisse introduzi-lo como uma molécula
linear nos vírus e infetar as bactérias como uma molécula circular.
o Plasmídeo híbrido que contem uma sequência cos do fago lambda.
o Com este método, obtêm-se poucos clones, contudo podem infetar-se muitas
bactérias de modo a aumentar a eficiência do processo;

Transformação
O mecanismo pelo qual a bactéria absorve o DNA que pode ser ou não integrado no seu genoma é denominado
transformação

Vetores de expressão
Os vetores de expressão são utilizados para expressar uma proteína em grande quantidade, para o qual deve ter, um
local de origem de replicação, um promotor facilmente induzível, resistência a um antibiótico, um codão de iniciação,
local de ligação ao ribossoma e ser fácil de purificar.
Por exemplo, inicialmente utilizava-se o operão da lactose: o promotor era deixado intacto e colocava-se uma
nova sequência no meio do gene da beta-galactosidase, contudo isto produzia proteínas mistas e demasiado grandes.
Para além disso, esperava-se que só após a adição da lactose se produzisse a enzima, mas esta era produzida antes da
indução.

Aplicações do DNA recombinante

Terapeutica Comida e agricultura
Vacinas Frutas
Hormonas do crescimento Vegetais GM
Anticorpos Animais GM
Proteinas recombinantes Microbios GM
Medicamentos anticancro

Tecnologia do
DNA
Diagnostico recombinanteAplicações energéticas
Terapia genética Biohidrogénio
Dispositivos de monitorização Bioetanol
Estrategias terapeuticas Biometanol
Biobutanol

Saúde e doenças:
o Terapia genética – A terapia genética é uma técnica avançada com grande potencial nos serviços de
saúde. Por exemplo:
 Tratamento da ADA-SCID – imunodeficiência primaria.

Neste caso adiciona-se um gene às células estaminais hematopoiéticas através de um protocolo de transferência.
Atualmente, os vetores utilizados para a transferência e para a expressão do gene específico são utilizados lentivírus,
estes são vírus da família do HIV. Este vetor é o mais utilizado e o que possui maior taxa de sucesso para o tratamento
de doenças genéticas humanas.

o Imunoterapia – Esta é uma terapia que consiste em estimular as defesas naturais do corpo humano por
exemplo para combater diferentes tipos o cancro sendo eles o de pulmões, o de ovários, de pele, de
rins, de tumores malignos no SNC, gastrointestinais e cancros do foro hematológico.
 Melanoma metastático
 Leucemia linfoide crônica

Neste caso a técnica do DNA recombinante é aplicado no acréscimo de um gene que, por sua vez, faz a expressão
especifica de um gene (Melanoma metastático). Outra aplicação desta técnica é no tratamento da leucemia linfoide
crônica em que é feita a manipulação genética dos linfócitos – T para expressar um recetor de antigénio com
especificação para um antigénio dos linfócitos – B (LLC).
As estratégias mais importantes que foram empregadas até agora são a vacinação com células tumorais projetadas para
expressar moléculas imunoestimuladoras, a vacinação com vetores virais recombinantes que codificam antigénios
tumorais e a vacinação com células hospedeiras projetadas para expressar os antigénios tumorais.

Produção de anticorpos e derivados – produção de anticorpos para ajuda no diagnostico e terapia de tumores e
outras doenças.
 Doenças em que há a produção de testosterona por hCG estimulado pode ser inibida por um
certo tipo de anticorpos.
 Reconhecimento do antigénio responsável por carcinomas através do anticorpo monoclonal
T84.66. (diagnóstico)
Investigação do metabolismo das drogas – por exemplo na investigação da eficácia e do efeito das drogas
através da expressão genética de uma enzima modificada através da técnica do rDNA.
Desenvolvimento de Vacinas e Hormonas recombinantes – quando se compara as vacinas recombinadas com
as convencionais estas apresentam um elevada eficácia e especificidade. Por exemplo:
 Vacinas em que o vetor é um adenovírus no qual esta codificado o antigénio de um patógeno,
por exemplo, o vírus influenza.
 Produção in vitro da hormona folículo estimulante (FSH) que é importantes para as técnicas de
apoio à gravidez.
 Produção da Insulina através da inserção do gene da produção da insulina num plasmídeo que
posteriormente é inserido na E.Coli. A mesma também pode ser produzida através de alfaces
geneticamente modificadas, entre outros. (Vacas transgénicas que produzem insulina através
do leite)
Ambiente – A técnica do DNA recombinante é aplicada na manipulação de bactérias para o tratamento de
problemas ambientais. Por exemplo nas ETAR´s em que se usa bactérias para decompor os dejetos.
 Energia:
 manipulação genética das cianobactérias para a produção de hidrogénio;
 produção de bioetanol
 biometanol
 biobutano
Organismos Geneti camente Modifi cados (OGM )
o Com o desenvolvimento do mundo e das populações, criou-se e desenvolveu-se em 1945 a indústria
agro-alimentar.
o Segundo a União Europeia, “Organismo Geneticamente Modificado (OMG)” é qualquer organismo cujo
material genético tenha sido modificado de uma forma que não ocorre naturalmente. As células têm os
seus cromossomas, os quais por sua vez têm zonas que determinam as características de qualquer
organismo - os genes. Esta tecnologia é por vezes designada por “biotecnologia moderna” ou
“engenharia genética” e permite a transferência de genes individuais selecionados de um organismo
para outro.

Vantagens que levaram à criação de alimentos geneticamente modificados?

 Resistência às espécies. (o cultivo das plantas geneticamente modificadas irá ajudar a eliminar a utilização
de pesticidas químicos e a reduzir o tempo e custo de trazer os alimentos ao mercado).
 Nutrição. (o cultivo de alimentos enriquecidos com vitaminas e minerais especialmente em zonas de
pobreza generalizada.)
 Tolerância às secas. (em zonas com menos terreno disponível para cultivar, as plantas geneticamente
modificadas poderiam ser cultivadas em terrenos antes considerados impróprios.)

Desvantagens:

Ambiental:

 Danos não intencionais a outros organismos: o pólen das plantas GM pode conter toxinas que matam insetos
naquela cultivação e noutros à volta.
 Eficácia reduzida de pesticidas: existe a preocupação que os insetos ficarão resistentes às plantas GM e aos
pesticidas criados especificamente para estas plantas.
 Riscos para a saúde pública:

 Resistência a antibióticos: utilizam-se genes de resistência a antibióticos de forma a facilitar as técnicas de

transferência e o resultado é que as células desses alimentos passarão a ter essa informação genética.
 Alergenicidade: existe a possibilidade de ao introduzir um novo gene numa planta, esta possa vir a criar um
novo alérgeno ou causar uma reação alérgica. Um exemplo disto é a soja obtida com transferência genética da
castanha do Pará. Foi demonstrado que uma parte das pessoas alérgicas à castanha do Pará passa a ser alérgica
também à soja transgénica.

Preocupações económicas:

 A entrada de alimentos GM para o mercado é um processo lento e caro e as empresas de biotecnologia

querem obviamente assegurar um retorno do investimento.  Isto pode fazer com que as sementes das
plantas GM fiquem a preços inacessíveis aos pequenos agricultores e aos países do terceiro mundo.

Exemplos de OGM: a soja, o milho, o arroz e o algodão.

Exemplo de uma técnica que derivou da técnica do rDNA

A técnica do DNA recombinante foi empregada em outras áreas nomeadamente na tecnologia de fusão CBM
recombinante.

 Esta tecnologia consiste no uso da técnica do rDNA para clonar e na caracterização de novo CBMs Os CBMs são
módulos de ligação de carboidratos, estes são essenciais em diversos processos biológico, incluindo o
reconhecimento célula-célula, na adesão celular e nas interações entre hospedeiro e patógeno.

Existem diversas aplicações dos CBMs sendo elas:

INDUSTRIA DO PAPEL
aprimoramento das
propriedas físicas e
mecânicas do papel

INDUSTRIA TEXTIL
Biomedicina
melhoria da afinidade do
Funcionalização de corante
biomateriais

aplicações INDUSTRIA
dos CBMS ALIMENTAR
Biologia molecular Melhoria do valor
nutricional da ração animas
Combinação de produção
e purificação de proteínas Modulação do crescimento
das plantas

OUTROS
Ambiente Sondas moleculares,
microarranjos, imobilização de
Biorremediação
proteínas e células,
engenharia enzimática, etc
DNA complementar (cDNA)
 O DNA complementar (cDNA) é o DNA sintetizado a partir de um molde de mRNA maduro (isto é, molécula só
com exões, após terem sido removidos os intrões) numa reação catalisada por duas enzimas, a transcriptase
reversa e a polimerase do DNA.

 O cDNA é utilizado para clonar genes de eucariontes em procariontes. Isto porque os procariontes não têm
maturação do RNA logo fariam a redução de todo o DNA. Por exemplo, para expressar uma
determinada proteína numa célula onde geralmente não é expressa, transfere-se cDNA que codifica a proteína
para a célula alvo. O cDNA também pode ser produzido por retrovírus, que o utilizam como mecanismo de
infeção.

 Os procariontes são organismos muito utilizados em Engenharia Genética como recetores de DNA estranho
porque são fáceis de cultivar, têm um crescimento rápido e processos bioquímicos bem conhecidos. No
entanto, não processam o RNAm e, quando recebem genes com intrões, estes não são retirados e a proteína
produzida não é funcional.

Síntese de DNA complementar numa célula eucariótica:

 O método mais utilizado é a partir de mRNA maduro catalisado pela enzima transcriptase reversa. A enzima
atua no mRNA de cadeia simples gerando uma cadeia de DNA complementar.

Processos:

1. o DNA é transcrito em mRNA;

2. o mRNA sofre maturação e são removidos os intrões, e adicionados uma poli-A à extremidade 5’ e um grupo metil-
guanina extremidade 5’;
3. as várias moléculas de mRNA maduro são extraídas da célula;
4. adiciona-se transcriptase reversa e nucleótidos, e a síntese do cDNA propriamente dita é iniciada;
5. para sintetizar cadeias de DNA adicionais é necessário digerir a cadeia de RNA usando uma enzima;
6. após a digestão do RNA, o DNA de cadeia simples enrola dado que as cadeias simples de ácidos nucleicos têm
propriedades hidrofóbicas.

 Todos os cDNA que se sintetizam a partir do RNA podem ser clonados em bactérias, originando uma biblioteca
de cDNA, em que toda a informação (genes que se encontravam a ser transcritos – expressos – num dado
momento), fica armazenada em bactérias por longos períodos de tempo, desde que sejam fornecidas todas as
condições indispensáveis para a sua manutenção.

 É importante referir ainda que a descoberta da transcriptase reversa e do seu mecanismo de ação e,
consequentemente, da tecnologia do cDNA, abriu um importante caminho na biologia molecular. A molécula de
RNA é extremamente instável e, dependendo do RNA em questão, o número de cópias pode estar muito
limitado.

 Desta forma, a possibilidade de se trabalhar com o cDNA ao invés de RNA tem facilitado muito o trabalho dos
cientistas, já que o cDNA é uma molécula estável, de fácil manuseamento e a sua multiplicação é bastante
simples.

Aplicações:

 O cDNA pode ser utilizado para criar bibliotecas de cDNA, que são arquivos das sequências dos mRNAs de uma
dada célula ou organismo. Tendo a informação de uma biblioteca de cDNA para um organismo permite cloná-lo
noutro organismo, o que é de extrema importância para reproduzir, por exemplo, proteínas importantes para
os humanos em espécies não humanas.
PCR
A reação de polimerase em cadeia é um método rápido que permite a amplificação in vitro de um segmento
específico de DNA ou RNA.

Cada ciclo envolve:

Desnaturação do DNA de cadeia dupla por aquecimento;

Hibridação dos primers às sequências complementares;
Extensão dos primers com a DNA polimerase.

 A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de laboratório usada para fazer muitas cópias
(milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA. Essa região do DNA pode ser qualquer objeto de
interesse do pesquisador. Por exemplo, pode haver um gene cuja função o pesquisador queira compreender ou
um marcador genético usado pelos cientistas forenses para correlacionar o DNA da cena do crime com os
suspeitos.
 Ou então, um assunto muito atual que foi a COVID-19 em que realizamos o teste PCR que se tratava de um teste
molecular que amplifica o material genético do vírus (RNA) e daí ser uma das técnicas mais sensíveis e
especificas para detetar, rastrear e estudar este tipo de vírus.
 Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da região de interesse do DNA, de modo que
essa possa ser analisada e utilizada de alguma outra maneira.
Conclusão
A tecnologia de DNA recombinante é um desenvolvimento importante na ciência que tornou a vida humana muito mais
fácil. Nos últimos anos, avançou estratégias para aplicações biomédicas, como tratamento do cancro , doenças
genéticas, diabetes e vários distúrbios vegetais, especialmente resistência viral e fúngica.

As técnicas do rDNA, do cDNA e do PCR tem sido amplamente reconhecida. As melhorias que elas trouxeram não
apenas para os humanos, mas também para as plantas e os microrganismos são muito significativos. Especialmente na
indústria farmacêutica, há problemas sérios de rejeição do corpo humano. Do ponto de vista da saúde, a engenharia
genética tem ajudado no tratamento de várias doenças que não podem ser tratadas em condições normais, embora as
respostas imunes impeçam a obtenção de bons resultados.

Há várias preocupações com o desenvolvimento de Plantas geneticamente modificadas e outros produtos. É obvio que
as plantas geneticamente modificadas podem cruzar-se com plantas selvagens, espalhando assim seus genes
“projetados” no meio ambiente, contaminado nossa biodiversidade. Além disso, existem preocupações de que a
engenharia genética tenha implicações perigosas para a saúde. Assim, é necessária uma pesquisa mais extensa neste
campo para superar tais questões e resolver preocupações das pessoas comuns.
Bio/Webgrafia
https://www.ktb.pt/pt/mente-corpo-saude/Organismos-Geneticamente-Modificados-OGMs

https://rce.casadasciencias.org/rceapp/art/2014/097/

https://biohelp.blogs.sapo.pt/2575.html

https://pt.slideshare.net/ilopes1969/engenharia-gentica-2813620

https://pt.wikipedia.org/wiki/ADN_recombinante

https://www.science.org/doi/abs/10.1126/science.6337396

Resumo Biologia Molecular_2018/2019 Ana Rita Vieira, FCUP

https://www.journals.uchicago.edu/doi/abs/10.1086/368659?journalCode=osiris

http://graduacao.iqsc.usp.br/files/Aula07BioqII-Qui_TecDNARecomb.pdf

https://www.scielo.br/j/er/a/DsKsGvxdC3rycD74cPYCQgF/?lang=pt

https://www.science.org/doi/abs/10.1126/science.175.4025.949

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673686921926

https://www.science.org/doi/abs/10.1126/science.175.4025.949

https://www.hindawi.com/journals/ijg/2016/2405954/

http://repositorium.uminho.pt/bitstream/1822/35128/1/document_19825_1.pdf

(Todos os links foram consultados até o dia 20/01/2023)