Resumo Biologia Molecular_2018/2019 Ana Rita Vieira

Ao mesmo tempo, incorpora-se um promotor UAS num gene que codifica para a β-galactosidade. Como a
GAL-4 fica de novo ativa, liga-se e promove a transcrição do gene. A proteína é expressa e degrada o XGAL
que é colocado no meio, fiando corado de azul.
Se fizermos um array com uma colónia em cada poço, tendo as células o vetor com a primeira proteína e
também o gene com o UAS. Far-se-á uma transformação com um único vetor de biblioteca de cDNA em cada
poço. As colónias que ficam azuis significam que a proteína inicial e a codificada por aquele fragmento da
biblioteca interatuam.
Fazendo isso para todas as combinações possíveis, é possível traçar o mapa das interações proteicas dos
organismos.
Detetaram-se 31 grupos funcionais quando se testaram cerca de 1500 genes, sendo que cada grupo de
proteínas é mais ou menos autónomo.
• 70% das interações são entre proteínas do mesmo grupo;
• Muitas interações entre proteínas de grupos diferentes.

Há 3 grupos funcionais que apresentam interações com, pelo menos, 10 dos outros grupos funcionais. São
eles:
• Ciclo celular; Parecem ser as funções mais importantes das células, não só para seres unice-
• Estrutura do DNA; lulares, mas também para os mais desenvolvidos. A estes, ainda se associam as
• Transcrição; proteínas responsáveis pela oogénese.

10. Técnicas de DNA recombinante

Permitem estudar processos biológicos e obter benefícios em várias áreas: saúde, biologia, bioquímica,
microbiologia, genética, biotec-
nologia, agricultura.
As técnicas de DNA recombi-
nante baseiam-se nas seguintes
técnicas:
• Clivagem de DNA em sítios
específicos através de enzi-
mas de restrição, o que per-
mite a isolação e manipulação
de genes individuais;
• Ligação de fragmentos de
DNA para construção de mo-
léculas que não se encontram
na Natureza;
• Clonagem de DNA através de
clonagem de vetores ou PCR, para se criarem cópias;
• Hibridação, para se encontrar uma sequência específica;
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Resumo Biologia Molecular_2018/2019 Ana Rita Vieira

• Determinação da sequência genómica, para determinação dos genes e deduzir a possível sequência da
proteína que expressam;
• Monitorizar o nível de mRNA produzido, utilizando a técnica de microarrays.
A recombinação do DNA não é mais do que a introdução de um fragmento de DNA específico num vetor,
ambos tratados com as mesmas enzimas de restrição, seguindo-se as numerosas cópias dessa recombina-
ção. Também pode tomar o nome de clonagem.
10.1. Enzimas de restrição
As enzimas de restrição são endonucleases que reconhecem sequências específicas de 4 a 12 pb e que
cortam o DNA, formando 3 tipos de extremidades: extremidades cegas, ou seja, nenhuma das cadeias fica
protuberante; ou extremidades coesivas no 3’ ou 5’, as quais emparelham muito mais facilmente, pois criam
pontas em cadeia simples com sequências que se complementam.

Nota: enzimas usadas nos sistemas imunitários bacterianos para poder resistir à introdução de material
genético de bacteriófagos. Assim, não foram criadas, mas sim aproveitadas pelos operadores.

Os vários tipos de corte são:

Ocorrem todos por reconheci-
mento das sequências palindrómi-
cas (inversas e complementares) e
no mesmo local da duas cadeias.
• Extremidades coesivas 5’: o cor-
te ocorre tanto numa cadeia como
noutra, pós o primeiro nucleótido
a 5’. Ambas as extremidades coesi-
vas são a 5’ da molécula (palín-
droma).
• Extremidades coesivas 3’: em
tudo semelhante às extremidades
coesivas a 5’, sendo o corte um nu-
cleótido antes da extremidade 3’
do palíndroma.
• Extremidades cegas ou abruptas: corte ocorre exatamente a meio do palíndroma, sem formação de
estruturas em cadeia simples. Mesmo assim, há ligação entre extremidades aquando da recombinação,
mas é pouco eficaz.

Nota: as extremidades coesivas são as mais utilizadas porque ocorrem com menos erros durante a re-
combinação e permitem ainda que ocorram mais forças a estabilizar a estrutura recombinante. Ou seja,
primeiro ocorre emparelhamento das pontes de H e só depois atua a DNA ligase. O que não acontece
quando temos extremidades abruptas, acumulando erros caso a sincronização não seja adequada.

As enzimas de restrição podem reconhecer sequências degeneradas, originando extremidades coesivas a

5’.
Tipos de enzimas de restrição:
• Tipo I: dependem de ATP, SAM ou Mg2+, reconhecem uma sequência particular e cortam o DNA num
ponto não específico dessa sequência;
• Tipo II: são dependentes de Mg2+, cortam de forma específica uma sequência particular de DNA;
• Isosquisómeros: são enzimas de restrição diferentes, que provém de diferentes espécies de estirpes. E
que reconhecem e cortam a mesma sequência de DNA sendo perfeitas ou imperfeitas.

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Quando o número de ex-

tremidades livres é gran-
de ou o número de frag-
mentos que queremos in-
corporar é grande, existe
uma maior probabilidade
de formar o produto 3, daí
que a proporção entre 1 e 2 seja de cerca de 1:10.
Se se utilizarem enzimas de restrição diferentes, os fragmentos vão apresentar extremidades coesivas dife-
rentes, pelo que não conseguem emparelhar. Uma das formas de alterar esta
situação e ligar os dois fragmentos é através de uma modificação por adição
de bases:
As bactérias utilizam as enzimas de restrição como mecanismos de defesa contra, por exemplo, fagos. Mas
como não cortam o seu próprio DNA? Porque têm enzimas de modificação (metilases), as quais metilam o
DNA bacteriano nos locais reconhecidos pela enzima de restrição, o que impede a sua ação.
O corte de DNA em diferentes fragmentos permite a construção de mapas de restrição (arranjo linear dos
locais de DNA cortado), ou seja, identificação dos locais onde se encontram as sequências reconhecidas
pelas enzimas de restrição: após o corte, realiza-se eletroforese em gel de agarose, de modo a separar os
fragmentos. Nunca se consegue obter uma reta de calibração, mas sim uma curva, pois quanto mais aper-
tada a malha de agarose, mais facilmente se separam os fragmentos pequenos, contudo os maiores não são
eficientemente separados; caso se queira separar fragmentos de maiores dimensões, diminui-se a concen-
tração de agarose, mas os mais pequenos não são separados. Para além disso, quando o DNA tem 25 kb ou
mais, a separação torna-se difícil e é preciso um cromóforo (por exemplo, brometo de etídio) para deteção
dos fragmentos (a fluorescência é proporcional à quantidade de cromóforo que se intercala entre bases).

Nota: a [agarose] influencia o processo de migração no gel. Para fragmentos de DNA muito grandes po-
derem ser individualizados, devem usar-se pequenas concentrações.

Após corte do DNA, os diferentes fragmentos podem ser sepa-

rados por eletroforese em gel de agarose (sem necessidade de
adição de SDS como nas proteínas, pois cada nucleótido tem já
carga negativa). Contudo, se quisermos separar fragmentos muito
compridos (mais de 30000pb), só o simples facto de se pipetar a
solução pode cortar o DNA. Assim, usa-se uma técnica denomi-
nada “Pulse field eletrophoresis”, na qual se isolam os núcleos da
célula e se colocam em agarose low melting (a qual é líquida a
30°C); por fim, aplica-se um campo elétrico não linear, a -4°C (aga-
rose está sólida), mudando-se a sua direção de x em x tempo.
Esta técnica permite, por exemplo, a separação de cromossomas
de fungos e bactérias.
10.2. Vetores de clonagem
Os fragmentos obtidos após utilização de enzimas de restrição
podem ser inseridos em vetores, caso tenham sequências complementares (têm de ser cortados com a
mesma enzima) e estejam na presença de uma DNA ligase.
Também se podem ligar extremidades cegas, contudo o processo tem uma eficiência muito inferior.
Uma pergunta relevante seria o porquê de não usar a técnica de PCR para obter muitos clones? Primeiro, o
PCR dá origem a fragmentos diferentes e pequenos. Caso quiséssemos clonar uma sequência comprida, o
processo teria pouca eficiência. Assim, devem-se usar vetores.
Os vetores de clonagem devem apresentar as seguintes características: capacidade de incorporar DNA exó-
geno, replicação autónoma (logo têm de ter uma origem de replicação [ORI]), existência de locais únicos de

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corte por enzimas de restrição, mecanismos de seleção (por exemplo, resistência a um antibiótico) e têm
ser fáceis de purificar.
Tipos de vetores de clonagem:
• Plasmídeos, pBR322;
• Fagos, λ;
• Fasmídeos ou fagemídeos;
• Cosmídeos, pBR com extremidades cos;
• Bacteriófago;
• YACS, BACs e PACs, cromossomas artificiais de levedura, bactéria e de fago, respetivamente.

Os plasmídeos são moléculas de DNA circular que estão separadas do DNA cromossómico. Os mais utiliza-
dos em técnicas de recombinação são aqueles que se replicam na E. coli.
10.2.1. Vetor pBR322
O vetor pBR322 contém sequências
de resistência à tetraciclina (TET), re-
sistência à ampicilina (AMP) e uma
origem de replicação (ORI). Se se uti-
lizar a enzima de restrição BamHI, en-
tão o gene TET vai ficar cortado; se
juntar o fragmento de DNA que
quero clonar e DNA ligase, posso ob-
ter 3 produtos diferentes:
I- Vetor inicial;
II- Fragmento de DNA fecha-se, for-
mando DNA circular;
III-Vetor com o fragmento de DNA.
Se colocar as células num meio com
ampicilina, apenas sobrevivem as
células I e III. Utilizando um pedaço
de veludo e posicionando-o sobre a
placa, obtenho uma cópia das células
que sobreviveram. Coloco então so-
bre uma segunda placa, na mesma
orientação, só que esta placa tem te-
traciclina e, portanto, apenas as cé-
lulas I sobrevivem. Como fiz uma cópia e esta tem um padrão de crescimento igual ao anterior, consigo
localizar as células III, que são as de interesse.
A versatilidade dos plasmídeos de E.coli é aumentada por incorporação de um polylinker ou multiple clo-
ning site (MCS), uma sequência sintética com vários locais diferentes reconhecidos por enzimas de restrição,
que não se encontram em mais nenhum local do plasmídeo. Deste modo, diferentes fragmentos criados
por corte com diferentes enzimas podem ser incorporados no mesmo tipo de plasmídeo.
Para além da resistência a antibióticos, existem também outras formas de selecionar as bactérias que in-
cluíram o DNA recombinante: por exemplo, se o vetor tiver o gene para a β-galactosidase e este for cortado
para inserção do fragmento de DNA, então num meio com lactose, as bactérias β-gal(-) são brancas e as β-
gal(+) formam um produto azul. Como este vetor tinha também resistência para a ampicilina, as bactérias
foram cultivadas também num meio com Amp, logo as que só incorporaram o fragmento não sobreviveram.

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10.2.2. Vetor pBluescript II

O vetor Bluescript é o mais utilizado, pois no
polylinker existem dois tipos de promotores
com orientações diferentes: o promotor T3 é
reconhecido pela RNA polimerase T3 e o T7
pela RNA polimerase T7.
Como o gene está orientado num sentido
específico, vamos obter um mRNA sense e
um antisense. A tradução é feita in vitro e ob-
tém-se proteínas, das quais apenas uma é a
do nosso interesse, logo passamos a saber
qual o sentido do gene incorporado.
A sequência antisense é utilizada para deter-
minação da expressão ou não expressão do
gene num determinado tecido: se se expres-
sar, então o mRNA formado vai hibridar com o antisense.
Esta técnica é análoga ao “chromossome painting”, no entanto, como é realizada num tecido, denomina-se
situ hybridization.
A produção in vitro permite apenas a obtenção de quantidades muito pequenas de proteínas, daí que se
possa utilizar esta técnica em estudos, mas não para produção em grande escala. Para isso, utilizam-se sis-
temas in vivo.

10.2.3. Fago λ
Vetores construídos por bacteriófagos são até mil vezes mais eficientes do que vetores de plasmídeos na
clonagem de um grande número de fragmentos de DNA, pois a infeção de E. coli ocorre com maior frequên-
cia do que a transformação das bactérias e podem-se formar muitos mais fagos do que bactérias numa
única cultura.
Este vírus contém genes para a formação da cápsula e cauda, ocupando cerca de 50 kb do seu genoma.
Mas também têm sequências que não têm interesse na via lítica, pelo que se forem removidas, podem ser
integrados fragmentos de DNA até 25 kb.
A deteção das bactérias infetadas pode ser feita se o DNA vírico tiver uma sequência para a β-galactosi-
dase, pois como referido anteriormente, vão ser formadas colónias brancas e outras azuis.
Para isso, é necessário inserir esse gene: a replicação do DNA fágico é através do rolling circle, pelo que se
obtêm fragmentos com extremidades cos. Por utilização de uma endonuclease específica, corta-se o DNA,
para que se possa inserir o novo fragmento com o gene
da β-galactosidase. No entanto, como tem extremidades
cos, podem-se juntar muitas sequências, como se se es-
tivesse a realizar novamente replicação.
Então, em vez de simplesmente acrescentar um frag-
mento, o que aumenta o número de pares de bases total
do DNA:
1. Remove-se um pedaço (endonuclease + eletro-
forese);
2. Acrescenta-se o fragmento a clonar;
3. Como a cápsula só seleciona entre 35 e 45kb, é
selecionado apenas o DNA com comprimento correto,
aumentando a eficiência do processo.

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10.2.4. Cosmídeos
O problema da utilização de fagos é o facto de o seu DNA ser linear, logo é necessário criar um sistema que
permitisse introduzi-lo como uma molécula linear nos vírus e infetar as bactérias como uma molécula circu-
lar.
Os cosmídeos são moléculas circulares de DNA que contêm uma sequência cos, um ORI, um marcador (por
exemplo, Amp) e locais para introdução de genes. Ao cortar o cosmídeo com enzimas de restrição, é possível
introduzir um gene eucariota, e seguidamente introduzi-lo no fago, através da identificação das zonas cos.
Quando o fago infeta a bactéria, o DNA circulariza nas sequências cos e como tem ORI, replica-se autono-
mamente. Com este método, obtêm-se poucos clones, contudo podem infetar-se muitas bactérias de modo
a aumentar a eficiência do processo. Os cosmídeos podem ser usados na formação de bibliotecas de DNA.

10.2.5. Bacterial artificial chromossomes, BACs

Fragmentos de DNA maiores são difíceis de clonar, pelo
que se criaram sistemas artificiais como é o caso dos
BACs: estes vetores têm cerca de 7,5 kb e podem ser in-
seridos fragmentos com cerca de 100 kb. Para introdu-
ção nas bactérias, é necessário fazer eletroporação e vá-
rias tentativas, uma vez que a construção de uma molé-
cula tão comprida é difícil. Para a construção de biblio-
tecas de DNA de organismos mais complexos, como o
humano, estes são os vetores mais utilizados.

10.2.6. Yeaste artificial chromossome vector, YACs

O DNA humano é cortado com enzimas de restrição di-
luídas (para fazerem poucos cortes), ainda dentro do nú-
cleo. Como o cromossoma final não é circular, para além
de que tem telómero e necessita de centrómero, então estes elementos têm de estar presentes no vetor:
a BamHI serve para formar os telómeros e a EcoRI para linearização.

Após digestão com EcoRI,

removem-se os fosfatos
das extremidades para
não ocorrer religação e in-
troduz-se o DNA humano.
A e B são enzimas de sín-
tese de aminoácidos (His
e Met, respetivamente),
as quais servem como
marcadores: num meio
sem esses aa, só as leve-
duras nas quais foi intro-
duzido o DNA recombi-
nante (por eletroporação)
sobrevivem. Uma vez que
as bactérias se dividem
mais rapidamente que as
leveduras, são mais usa-
das que estas últimas.

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10.3. Transformação
O mecanismo pelo qual a bactéria absorve o DNA que pode
ou não ser integrado no seu genoma é denominado transfor-
mação. As células tornam-se competentes por tratamento
com solução de cloreto de cálcio ligeiramente hipotónica a
T=0°C (o sal aumenta a permeabilidade da membrana e as
temperaturas mais baixas são para o crescimento da bacté-
ria), de modo a que o DNA entre de forma passiva. Por fim,
dá-se um choque térmico a 37°C ou 42°C.
Utiliza-se uma relação de cerca de 105 colónias/ μg de DNA,
para que apenas seja incorporado um plasmídeo. A eficiência
da transformação depende também do tamanho do vetor:
quanto maior, menor a eficiência.
A utilização de uma solução de CsCl2 e de brometo de etídio
permite a separação do DNA cromossómico e plasmídeo,
pois altera as densidades. Após este procedimento, removia-
se o DNA referente ao plasmídeo e separava-se do brometo
de etídio por utilização de um solvente orgânico (assim, o
DNA ficava na solução aquosa). Por fim, realizava-se diálise,
de modo a que o cloreto de césio saísse e se obtivesse DNA
ultrapuro.
Para uma eficiência superior de transformação, utiliza-se a
técnica de eletroporação, na qual os plasmídeos se movem
fisicamente e entram nas bactérias, através da aplicação de

um campo elétrico. Este processo é um pouco

aleatório, pois podem entrar fragmentos sem re-
sistência a antibióticos ou mais do que um plas-
mídeo, contudo a eficiência é de cerca de 109 e
podem usar-se fragmentos de 100 kbp.
A eletroporação pode ser usada em tecidos,
contudo, como o DNA inserido é epissomal (não
está ligado aos cromossomas), quando as células
se dividem, ele não é replicado. Este é um dos
maiores problemas das terapias.
Então em vez de um sistema físico, vamos tentar
um sistema biológico.

10.4. Vetores de expressão

Quando se quer expressar uma proteína em grande quantidade, pode-
se utilizar um vetor de expressão, o qual deve: ter um local de origem de
replicação, um promotor facilmente induzível, resistência a um antibió-
tico, um codão de iniciação seguido de polylinker, local de ligação ao
ribossoma e ser fácil de purificar.
Por exemplo, inicialmente utilizava-se o operão da lactose: o promotor
era deixado intacto e colocava-se a nova sequência no meio do gene da
beta-galactosidase, contudo isto produzia proteínas mistas e demasiado
grandes para a bactéria produzir eficientemente. Para além disso, espe-
rava-se que só após a adição da lac se produzisse a enzima, mas esta era
produzida antes da indução.
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Resumo Biologia Molecular_2018/2019 Ana Rita Vieira

Atualmente, utiliza-se o vetor pET. Deste plasmídeo, é removido o local T3, pelo
que não consegue produzir a proteína, uma vez que não produz RNA polimerase,
estando, portanto, dependente do genoma bacteriano.
Sem lactose, lac I reprime o operão da lactose tanto do plasmídeo como da se-
quência genómica. Quando há lactose, o gene T3 é transcrito e traduzido, atuando
no plasmídeo.
As proteínas formadas são denominadas de proteínas de fusão. Para a sua purifi-
cação, utiliza-se His6-tag, a qual é introduzida na sequência do plasmídeo.
As histidinas são aminoácidos que se ligam fortemente a metais como o Ni(II),
pelo que ficam na coluna cromatográfica e são depois eluídas utilizando, por exem-
plo, competidor. Caso se utilize competidor, a posterior isolação da proteína em
questão é feita por eletroforese em SDS-PAGE.
A remoção ou manutenção da cauda de histidinas depende da finalidade da pro-
dução da proteína. A sua remoção passa pela anterior inserção da TEV entre a His6-
tag e a origem de replicação. Esta sequência é reconhecida por uma peptidase es-
pecífica, a TEV protease, que é originária dum vírus e cuja sequência é rara nos
humanos.
10.5. Bibliotecas de DNA
A clivagem de um genoma inteiro com uma enzima de
restrição específica e a clonagem de cada fragmento leva à produção de milhões
de fragmentos.
Estes são distribuídos por diferentes bactérias. Se se utilizarem BACs em vez dos
típicos plasmídeos, podem ser inseridos fragmentos maiores e, por isso, são ne-
cessárias menos bactérias transfectadas.
Como a replicação bacteriana induz poucos erros, o DNA não vai ser alterado.
Posteriormente, as bactérias com diferentes plasmídeos vão ser colocadas em
diferentes poços e guardadas a -70°C. O problema deste processo seria o facto
de se puder estar a cortar genes e não se clonarem as junções, logo a determina-
ção da ordem dos fragmentos seria complicada.
Então, para ultrapassar este obstáculo, em vez de se utilizar uma enzima de res-
trição, a qual corta sequências muito específicas, fazem-se cortes físicos através
de sonicação. Porém, não temos extremidades coesivas. A enzima Sam3H reco-
nhece 4 pb em cada 200 pb, pelo que se a diluirmos, de modo a cortar poucas
vezes, então os locais de corte vão ser diferentes em diferentes utilizações. As-
sim, obtêm-se fragmentos com sequências existentes em outros fragmentos,
facilitando a sequenciação.
Para representação do genoma completo, é necessário fazer pelo menos
6 ensaios, de modo a que haja certeza da existência de complementaridade.
Para ordenar, pode-se sequenciar tudo ou utilizar "chromossome wal-
king", técnica na qual se transcreve as sequências sense e antisense (por
exemplo, tendo T3 e T7) e, depois faz-se hibridação com os clones da bibli-
oteca para determinar qual contém o fragmento em estudo.
O problema desta técnica é que as bactérias passam à frente sequências
repetitivas de DNA, pelo que nem todos os fragmentos de DNA conseguem
ser clonados, logo vão existir gaps.

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Resumo Biologia Molecular_2018/2019 Ana Rita Vieira

O DNA pode ser marcado

com dioxigenina, pois
esta constitui um subs-
trato para uma determi-
nada enzima, dando ori-
gem a um produto fluo-
rescente. Por separação
da cadeia de DNA do gene
que se quer estudar e in-
trodução de hexanucleó-
tidos com sequências a-
leatórias, introduzem-se
locais de iniciação da re-
plicação, a qual é feita
com nucleótidos marca-
dos com dioxigenina.
Passando as bactérias da
biblioteca para uma
membrana de nylon, faz-
se hibridação com o DNA
replicado, lava-se para
remover o que não hibridou e, por exposição a raios-X, determinam-se as colónias com as sequências de
interesse. A marcação também pode
ser feita por remoção dos fosfatos não
radioativos do 5', colocando-se por
sua vez fosfatos radioativos.
No fim, como existem gaps, obtendo-
se CONTIGs, isto é, sequências que fo-
ram determinadas, separadas por lo-
cais que não foram clonados. Mas
como saber por que ordem se encon-
tram e quando DNA existe entre eles?
A resposta é "chromossome painting".

10.6. Biblioteca de cDNA

Uma estratégia diferente para iniciar
uma clonagem é a utilização de se-
quências de DNA que presumivel-
mente são transcritas em mRNA,
dando origem a uma proteína.
Isto é conseguido extraindo mRNA de
células (o qual tem poli-A e é separado
dos restantes componentes utilizando
oligo dT e esferas magnéticas) e cons-
truindo a partir dele o cDNA, na pre-
sença da transcriptase reversa.
A cadeia simples de DNA é comple-
mentada, através da utilização da DNA
polimerase.

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Resumo Biologia Molecular_2018/2019 Ana Rita Vieira

As extremidades homopoliméricas são adaptadas pela terminal transferase. Por fim, o cDNA é clonado
utilizando plasmídeos ou vetores fágicos.
As bibliotecas de cDNA dependem da expressão génica: uma determinada célula de um determinado te-
cido expressa diferentemente os genes de acordo com o seu estádio de desenvolvimento, pelo que a repre-
sentatividade de um certo mRNA vai variar.

10.7. Bibliotecas de expressão

Permitem a expressão da proteína codificada pelo DNA clonado num vetor de expressão.
Não são muito usadas. Utiliza-se um vetor de expressão que, por isso, é indutível, formando-se uma pro-
teína de fusão. O operão da lactose mantém-se inativado até que se adicione IPTG. Para fazer um screening
destas bibliotecas é necessário utilizar uma membrana de nitrocelulose por cima da placa com as bactérias,
na qual ficam presas as proteínas, as quais são incubadas com um anticorpo específico, para determinação
do vetor que expressava a proteína de interesse.

10.8. Sequenciação do DNA

10.8.1. Método químico de Maxam e Gilbert
O método de Gilbert, atualmente em desuso, baseia-se na marcação radioativa de um dos extremos do
fragmento de DNA e a sua subsequente degradação parcial através de reações específicas para determinar
bases do DNA. Deste modo, a posição de cada base na cadeia de DNA podia ser determinada medindo a
distância entre o ponto de degradação e a extremidade radioativa visualizada por autoradiografia.

10.8.2. Método enzimático de Sanger

Neste método, utilizam-se didesoxinucleótidos (ddNTPs), os quais impedem a extensão da cadeia pela
DNA polimerase.
O primeiro passo é a adição de um primer, visto que a DNA polimerase consegue elongar, mas não come-
çar a replicação (a quantidade de primers é inferior à quantidade de DNA).
Seguidamente, adicionam-se nucleótidos normais juntamente com a enzima DNA polimerase, pelo que
passado algum tempo irão existir em solução moléculas que não elongaram e outras com diferente número
de nucleótidos. Este processo é parado e distribui-se a solução por 4 tubos diferentes, cada um com um
ddNTP diferente e diluído.
Como os primers estão marcados radioativamente, separando as populações de oligonucleótidos por ele-
troforese, pode ser determinada a localização de cada banda por emissão de fluorescência ou após exposi-
ção a um filme de raios-X.
A sequência de 5’ para 3’ pode ser lida do fundo do gel para o topo. Não esquecer de que como ocorre
hibridação, então a sequência da cadeia inicial é a complementar à obtida no gel.

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O método de Sanger permite então a

sequenciação de cadeias até a um má-
ximo de 500-800 pb. É ainda de referir
que embora o DNA esteja em cadeia
simples, não ocorre emparelhamento,
pois utilizam-se 2000V na eletroforese,
o que cria uma resistência enorme.
Contudo, existe um problema: caso
tenhamos uma sequência do género
CCCGGG (sequências de citosinas e
guaninas repetidas uma a seguir à ou-
tra) pode ocorrer emparelhamento e,
como as ligações são muito fortes, a
DNA polimerase vai passar à frente es-
tes nucleótidos.

10.8.3. Sequenciação automática

Mais recentemente, em vez de ser o
primer a estar marcado, são os ddNTPs
que estão marcados, cada um com um
fluorocromo diferente, pelo que basta
uma reação de sequenciação em vez
de 4.

Os produtos obtidos são corridos

em géis existentes no interior de ca-
pilares muito finos (eletroforese ca-
pilar) e visualizados com detetores
laser em aparelhos automáticos.

10.8.4. Random Shotun Cloning

No método enzimático, não é possível distinguir fragmentos com mais de 800 pb, pelo que se quisermos
sequenciar toda uma biblioteca genómica, então a partir dos vetores BAC, o DNA é novamente cortado,
formando fragmentos mais pequenos (3kb) e são colocados num plasmídeo. Depois, um computador vai
analisar milhões dessas sequências e, visto que elas têm sobreposições, consegue determinar os vários
CONTIGs.
Quando estamos a estudar uma determinada proteína ou gene, procura-se inicialmente numa base de
dados a sequência obtida, de modo a perceber se aquela proteína/gene já existe. Caso a sequência não seja
encontrada, então é necessário estudar o gene, a sua expressão, etc.
Como o DNA está em cadeia dupla, o gene pode estar na cadeia simples de cima ou de baixo, pelo que o
computador analisa ambas e determina os ORFs possíveis.

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10.8.5. Next Generation Sequencing

Para se sequenciarem sequências muito compridas, não se clonam os fragmentos:
1. Realiza-se sonicação do DNA, obtendo-se sequências curtas, às quais são adicionadas extremida-
des que são iguais para todas e que funcionam como primers;
2. Os nanobodies têm sequência complementar a A, logo emparelham com os fragmentos (o DNA é
diluído, de modo a que cada nanobody só se ligue um fragmento);
3. Através da técnica de PCR, cada esfera passa a ter várias cópias da sequência que a ela se ligou;
4. Na matriz, cada esfera fica num local diferente das restantes e adiciona-se um agente desnatu-
rante, de modo a ter-se DNA em cadeia simples;
5. Faz-se sequenciação usando didesoxinucleótidos.
Uma variação desta técnica é a solid DNA sequencing, na qual as cadeias simples de DNA estão ligadas a
um suporte sólido. Neste método, coloca-se, por exemplo, ddATP e seguidamente reverte-se isto, por adi-
ção de um grupo hidroxilo; assim continuo a reação, pondo outro ddNTP. Deste modo, ocorre sequenciação
de vários fragmentos de uma vez só, podendo, em 2h, obter-se 200.000 sequências de 50-100 pb. Posteri-
ormente, o computador procura sobreposições e sequencia ambas as cadeias de DNA e é também capaz de
encontrar sequências consenso.
Embora o PCR introduza erros, pois a DNA polimerase utilizada não faz proofreading, como temos fragmen-
tos sobreponíveis, caso apareça a mesma base em todos, exceto num, o pc vai indicar aquele com maior
probabilidade de estar certo. Se, em relação ao DNA standard, ocorrer uma base diferente várias vezes,
então deve ser uma mutação.

10.8.6. Southern, Northen e Western blot

• Western blot (immunoblotting): deteta proteínas específicas com anticorpos radioativos ou fluores-
centes. Se a mesma proteína aparece com pesos moleculares diferentes ao longo do desenvolvimento
de um organismo, o mais provável é que seja devido ao splicing alternativo.
• Northen blot: deteta moléculas específicas de RNA. Avalia a presença, quantidade e tamanho de um
mRNA particular e compara mRNAs específicos de diferentes organismos.
Uma amostra de RNA é desnaturada por tratamento com um agente como formaldeído, de modo a que se
tenha a certeza de que não ocorrem estruturas secundárias. Os diferentes RNAs são separados de acordo
com o seu peso molecular e são transferidos para uma membrana de nitrocelulose, sendo incubada com
cDNA complementar ao gene de interesse. Por fim, a membrana é sujeita a autoradiografia.
• Southern blot: nesta técnica, detetam-se sequências particulares de DNA com sondas específicas. Nu-
ma mistura de vários fragmentos cortados com uma enzima de restrição, alguns segmentos vão ter o
mesmo comprimento e, portanto, migram juntos numa eletroforese. Contudo, se se desnaturarem os
fragmentos em condições alcalinas e se transferirem para uma membrana de nitrocelulose, por poste-
rior incubação com uma sonda marcada radioativamente, é possível revelar o segmento de interesse.
Ao contrário das duas técnicas anteriores, onde a questão mais relevante era a existência ou ausência de
uma proteína ou RNA, aqui a pergunta pode prender-se com a existência de mais de uma cópia de um certo
gene.

Nota: no Southern blot há deteção de polimorfismos genéticos, designados por restriction fragment len-
ght polymorsphim (RFLP), caraterizados pela presença ou ausência de locais de restrição particulares no
DNA. Permite a deteção de fragmentos únicos numa pulação, avalia a presença de mutações em diferen-
tes alelos.

10.8.7. DNA micro arrays

A monitorização da expressão de milhares de genes simultaneamente pode ser atingida através da técnica
de DNA micro array, na qual fragmentos de cerca de 1 kb são amplificados por PCR e aplicados à superfície

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Resumo Biologia Molecular_2018/2019 Ana Rita Vieira

de um microscopic slide de vidro, o qual é depois processado quimi-

camente, de modo a desnaturar e prender o DNA. Outra forma é a
síntese de oligonucleótidos de um determinado gene, os quais estão
covalentemente ligados à placa de vidro (DNA chips).
São também preparados cDNAs ou mRNAs correspondentes ao
gene em estudo, os quais vão hibridizar com as sequências comple-
mentares e podem ser detetados num scanning laser microscope.
Se forem utilizadas células, por exemplo, em diferentes meios de
cultura, por extração dos seus mRNAs e marcação com diferentes
fluorocromos, é possível detetar em que situações os genes são ex-
pressos.
Conclusões firmes sobre se, por exemplo, genes que exibem mu-
danças similares na expressão são co regulados e, portanto, relacio-
nados funcionalmente, raramente podem ser elaboradas por aná-
lise de apenas uma experiência de micro array. A solução é combinar informações de várias experiências,
sob diferentes condições e ao longo do tempo- cluster analysis.
Nesta técnica, a quantificação de mRNA é indireta, uma vez que depende da hibridização (a intensidade
da cor é proporcional ao nº de mRNA que hibridizaram). Uma forma de quantificar diretamente é através da
sequenciação de mRNA, pois nº sequências=nº mRNAs.
A utilização de bar codes permite sequenciar diferentes amostras ao mesmo tempo, pois o computador
separa-as de acordo com a sequência particular que lhes foi adicionada.

10.8.8. Polimerase Chain Reaction, PCR

A reação de polimerase em cadeia é um método rápido que permite a amplificação in vitro de um seg-
mento específico de DNA ou RNA. Cada ciclo da reação envolve:
1. Desnaturação do DNA de cadeia dupla (por aquecimento);
2. Hibridação dos primers às sequências complementares;
3. Extensão dos primers com a DNA polimerase.

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Após uma série de hibridações de primers, extensões e dissociações dos produtos formados, o compri-
mento das cadeias de DNA amplificadas será fixo. A optimização do PCR tem muitas variáveis, sendo a mais
importante o correto desenho dos primers.
A DNA polimerase utilizada neste método é termorresistente, contudo não faz proofreading, pelo que in-
troduz erros, daí que se façam pelo menos 3 reações de PCR independentes.
Também pode ser utilizado mRNA: neste caso, é adicionado apenas um primer e a transcriptase reversa,
para formar DNA. Após separação das cadeias, adiciona-se um primer diferente, de modo a formar DNA em
cadeia dupla. A partir deste passo,
os ciclos são idênticos ao PCR com
DNA.
A interação entre proteínas e DNA
ocorre em sequências específicas.
Como determiná-las? Primeiro te-
mos de saber mais ou menos a loca-
lização da proteína (no promotor) e
seguidamente realizam-se cortes
com uma enzima de restrição, de
modo a obter vários fragmentos. A
esses fragmentos é adicionada a
proteína em questão e, em cada
poço de um gel de eletroforese co-
loca-se um fragmento diferente (os
fragmentos antes da adição de pro-
teína já tinham sido separados por
eletroforese, daí poderem ser sepa-
rados após adição do fator). O DNA
está marcado, mas as proteínas não,
pelo que aquelas que não se ligaram
não são detetadas.
O fragmento de DNA específico pa-
ra a proteína vai ser retardado, pois
apresenta um maior peso molecu-
lar; assim, fica definido o local de li-
gação.
Por adição de competidor, deixa de
haver uma banda retardada.
Outra forma é através do DNA footprint, ou seja, marca-se o DNA e corta-se com DNAase, a qual é inespe-
cífica. Como a proteína protege o ácido nucleico, então no gel de eletroforese vai aparecer uma zona que
sem bandas relativamente à experiência sem proteína.
Na técnica de Chromatin Immunoprecipitation, o DNA com a proteína ligada é sonicado, formando frag-
mentos, os quais são imunoprecipitados com anticorpos específicos para essas proteínas. Depois, tanto a
proteína como o anticorpo são separados do DNA e este é sequenciado.

10.8.9. RNA de interferência

Constitui um mecanismo natural de regulação da expressão génica, através de micro RNAs (transcritos
pela RNA polimerase II).
O dicer corta o microRNA (miRNA) em siRNA (silecing RNA). O microRNA encontra-se em cadeia dupla,
pois apesar de ser transcrito como uma sequência linear, tem sequências complementares seguidas, as quais
emparelham. Quando o siRNA se liga ao argonaute, uma das cadeias é clivada, pelo que passa a ser de

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Resumo Biologia Molecular_2018/2019 Ana Rita Vieira

cadeia simples. A ligação do complexo ao mRNA, vai

levar à degradação do mRNA, pelo que este processo
influência a tradução e o tempo de semivida do
mRNA.
Os miRNAs regulam quase todos os aspetos da ex-
pressão génica de um mamífero. Muitos deles têm
vários targets, pelo que um mesmo miRNA pode apa-
recer expresso em muitos locais diferentes do orga-
nismo e podem aparecer diferentes microRNAs de
acordo com o desenvolvimento celular.
Na técnica de micro arrays, podem utilizar-se miR-
NAs, os quais iriam emparelhar com certos mRNAs.
Ao colocar mRNA de células tumorais e células nor-
mais, marcados de diferentes cores, obtinha padrões
diferentes.
Os siRNA são utilizados no estudo dos genes, pois se
é necessário descobrir qual a sua função, podemos si-
lenciar o gene e, portanto, descobrir quais as conse-
quências deste ato. Se, por exemplo, utilizar T3 e T7,
obtenho sequências complementares, as quais se jun-
tam formando um RNA de cadeia dupla. Por adição a
uma determinada célula, ocorre silenciamento. Desta
forma, já não é necessário induzir mutações no gene
que se quer estudar.
Os siRNAs podem ser sintetizados in vitro, com a aplicação do dicer, sintetizados industrialmente ou através
de vetores. Neste último caso, poderia aplicar-se um plasmídeo no núcleo de uma célula eucariota, o qual
teria um promotor HSE para a sequência de miRNA. Por aumento da temperatura, formavam-se os siRNAs.
Esta técnica já foi utilizada num sistema in vivo (na
mosca Drosophila). O GAL4 não existe nestas moscas,
por isso, quando se cruza uma mosca que foi transfec-
tada com um plasmídeo com a sequência para a GAL4
com outra mosca normal, então vai ser induzida a for-
mação de siRNAs, os quais degradam o mRNA for-
mado.
A transfecção é transiente, uma vez que o plasmídeo
desaparece à medida que a célula eucariótica se divide.
Então, como tornar esta alteração permanente? A res-
posta está na inserção do DNA no cromossoma eucari-
ota.
Para inserção do DNA num cromossoma (o que obvi-
amente vai ser aleatório), então utiliza-se um plasmí-
deo com o gene da transposase e outro com um mar-
cador w+ (dá cor vermelha aos olhos da mosca) e ele-
mentos do transposão (sequências repetidas). A inser-
ção ocorre por recombinação e é feita num oócito.
Após algumas descendências, se existir uma mosca
com olhos vermelhos, então é porque ocorreu inser-
ção do fragmento do genoma da mosca. Esta será ho-
mozigótica recessiva.

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Resumo Biologia Molecular_2018/2019 Ana Rita Vieira

Esta transformação tem uma eficiência de cerca de 10%, logo utilizam-se muitas moscas para aumentar a
probabilidade de ocorrer transformação.
Muitos dos métodos utilizados para silenciamento de genes em fungos podem ser adaptados a genes de
eucariotas superiores. Estes genes podem ser introduzidos na linha germinal por recombinação homóloga,
dando origem a animais “knockout”. Ratinhos com um gene knockout permitem o estudo do desenvolvi-
mento, comportamento e fisiologia dos mamíferos, tal como os humanos.
Para se introduzir um gene num cromossoma do ratinho, formando um organismo transgénico, é neces-
sário que este contenha um marcador, para determinar se a recombinação homóloga teve sucesso (a re-
combinação em locais não homólogos é muito mais frequente). Esse marcador pode ser o da neomicina, o
qual é um antibiótico, o qual é colocado no local do gene X, causando a sua rutura. As sequências que flan-
queiam o gene da neomicina são iguais às do DNA do cromossoma onde se quer silenciar o gene X.
Existem 2 estratégias para formar transgénicos:

1. O DNA é inserido no núcleo que adveio do macho, num oócito já fertilizado e o oócito é induzido a
maturar por indução de progesterona, para depois ser novamente colocado na fêmea, cujo corpo tinha de
ser induzido a funcionar como se estivesse prenha. Este é um método muito complicado.
2. Num novo método, a transfecção dá-se por eletroporação em células estaminais. Estas são cultivadas
num meio com neomicina, de modo a serem selecionadas apenas aquelas cujo DNA foi inserido. Estas célu-
las são então inseridas num blastocisto (como pode dar origem a várias linhas celulares, as células modifi-
cadas aparecem em vários locais).
As células utilizadas foram de um ratinho castanho (recessivo) e inseridas num ratinho branco para deter-
minar se as células estaminais sobreviveram e proliferaram.

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Posteriormente, o ratinho com manchas castanhas acasala com um ratinho castanho normal, dando origem
a 3 possíveis ratinhos: B/b e X+/X+, B/b e X-/X+, b/b e X+/X+, portanto, é necessário procurar os heterozigóticos
com X- e acasalar dois desses ratos, para obter um homozigótico X -/X-, que pode ou não ter cor castanha.

Contudo, se o gene X fosse um gene essencial, o ratinho não conseguiria sobreviver. Para solucionar este
problema, existe uma técnica que permite inativar genes específicos de células somáticas num período es-
pecífico do desenvolvimento. Nesta, colocam-se locais de recombinação lox P e enzimas CRE que catalisam
a recombinação entre esses locais. A expressão da enzima é controlada por um promotor específico, logo a
inativação do gene X só ocorre nas células cujo promotor é ativo.
Por acasalamento do ratinho com
este DNA recombinante e de um
ratinho com a enzima CRE, ob-
tém-se uma descendência que vai
ter o gene de interesse silenci-
ado, uma vez que, por recombina-
ção local, remove-se as sequên-
cias entre os lox P. Como a CRE só
vai existir em tecidos específicos,
então podem ocorrer problemas
advindos da deleção do gene, mas
não em todo o organismo, logo a
taxa de sobrevivência do ratinho é
maior.
Para determinar se a descendên-
cia é homo ou heterozigótica, re-
tira-se a ponta da cauda do rati-
nho e faz-se PCR para se obterem clones que depois são analisados. O organismo homozigótico recessivo é
o de interesse.

10.8.10. CRISP-CAR9
Existe uma nova técnica de
editing específico, que permite
a mudança de apenas uma se-
quência para um aminoácido,
para que não seja necessário in-
troduzir longas sequências não
naturais como nos casos anteri-
ores.
A CRISP-CAR9 baseia-se num
mecanismo de defesa bacteri-
ano contra invasões víricas:
CAS corta DNA do fago em pe-
daços muito pequenos e insere-
os no CRISP array, este é trans-
crito e novamente cortado,
sendo incluído num complexo,
para reconhecimento do DNA
fágico (RNA de interferência).

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Por utilização não do complexo, mas apenas da CASIII, o DNA não é completamente degradado, mas apenas
cortado num único local, de modo a poder ser inserido apenas um aminoácido. Num mamífero, como não
tem a endonuclease CAS9, então insere-se um plasmídeo com a sequência para essa enzima numa célula
estaminal e o crRNA (depois tem de se obter descendência cujo DNA foi inserido no genoma) ou, um plas-
mídeo com ambas as sequências. Este mecanismo abre caminhos para tratamento de doenças em que só
existe uma mutação de um aminoácido numa proteína.

11. Vírus e indução de tumores

11.1. Vírus
Os vírus são um vasto con-
junto de entidades biológi-
cas que vivem de forma pa-
rasitária dentro de outras
células.
Possuem material genético,
DNA ou RNA, tanto em ca-
deia dupla como em cadeia
simples. Devido a possuí-
rem diferentes tipos de ge-
noma, a sua replicação tam-
bém é variável.
A replicação ocorre no nú-
cleo, à exceção do polioví-
rus, que se replica no cito-
plasma. Requer a formação
de um primer, dado que as polimerase não têm a capacidade de fazer iniciação. Quanto à replicação, existem
diversas classes de vírus.
• Classe I: núcleo, polimerases celulares. O DNA codifica a sua RNA polimerase e outras proteínas essências
para a replicação capside e regulação.
• Classe II: genes pequenos, que só codificam para proteínas de capside.
• Classe III: codificam para a transcriptase
e a polimerase. O seu genoma está seg-
mentado.
• Classe IV: tradução de um poli RNA, que
possui 3 intermediários replicativos
(vpg, replicase e protease).
• Classe V: transcriptase vírica.
• Classe VI: transcriptase reversa.
• Classe VII: DNA anti sense completo e
DNA sense incompleto. Os 2 tipos de
RNA são completos.
O exemplo mais significativo ocorre para a
replicação dos retrovírus, que se associa à
maquinaria celular dos hospedeiros.
Têm a capacidade de se inserirem nas célu-
las e possuem proteínas que vão desenca-
dear a replicação do DNA.
Após a infeção do conteúdo da cápsula
dentro do hospedeiro, que é essencialmen-

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