Biologia Molecular

________________
Resumos TPs __________________

Autor: Hugo Rocha

Licenciatura em Biotecnologia
Ano Letivo 2022/2023

Universidade de Aveiro
 Biologia Molecular – Resumos TPs

Índice
O Gene Interrompido – TP 2 Parte 1 ........................................................................................ 3
Um Gene Interrompido tem Intrões e Exões ........................................................................ 3
A Organização de Genes Interrompidos pode ser conservada ........................................... 4
Variação de sequências de Intrões e Exões: seleção e evolução .......................................... 4
Algumas Sequências de DNA codificam mais que uma Proteína ....................................... 5
Alguns Exões correspondem aos Domínios Funcionais de Proteínas ................................. 7
Membros de uma Família Genética têm uma Organização Comum ................................. 8
Organização do Genoma – TP2 Parte 2 .................................................................................... 9
Replicação está conectada ao Ciclo Celular – TP3 ................................................................. 10
A Replicação de Bactérias está conectada ao Ciclo Celular .............................................. 10
Organização da forma e espacial durante a Segregação de Cromossomas e Divisão
Celular .................................................................................................................................... 12
FtsZ é necessário para a Formação do Septo...................................................................... 13
A Localização do Septo é regulada pelos Genes min e noc/slm ......................................... 13
Replicação em Procariotas – TP4 ............................................................................................ 16
A Partição envolve a separação dos cromossomas ............................................................. 16
Iniciação da Replicação de DNA .......................................................................................... 17
Mecanismo de iniciação da replicação do DNA a partir da origem de replicação de
E.coli ....................................................................................................................................... 18
Metilação das origens de replicação .................................................................................... 19

2
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

O Gene Interrompido – TP 2 Parte 1

As sequências interrompidas são removidas do transcrito primário (ou pré-mRNA)

durante a expressão génica, dando origem a mRNA que inclui uma sequência contínua de bases
correspondentes ao produto polipeptídico determinado pelo código genético.
Exões: são as sequências retidas no produto maduro de RNA. Um transcrito maduro
começa e acaba com exões que correspondem às extremidades 5’ e 3’ do RNA.
Intrões: são as sequências intervenientes que são removidas quando o transcrito
primário de RNA é processado para dar origem a um produto maduro de RNA.
As sequências de exões estão na mesma ordem no gene e no RNA, mas um gene
interrompido é maior que o RNA maduro devido à presença de intrões.

Um Gene Interrompido tem Intrões e Exões

Os intrões são removidos por splicing do RNA, que ocorre em cis em moléculas
individuais de RNA.
As mutações nos exões podem afetar a sequência polipeptídica, enquanto as mutações
nos intrões podem afetar o processamento do RNA e, por isso, influenciar a sequência ou
produção de polipeptídeos.
Durante o splicing (processo de remoção de intrões), os exões são sempre juntados na
mesma ordem que são encontrados no DNA original, para que a correspondência entre gene e
sequência polipeptídica seja mantida.

3
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

A figura mostra que a ordem dos exões num gene se mantém no mRNA processado, mas
as distâncias entre as zonas no gene não correspondem à distância entre as zonas no mRNA
processado. O comprimento de um gene é definido pelo comprimento de um mRNA transcrito
primário, em vez do comprimento do mRNA processado.

A Organização de Genes Interrompidos pode ser conservada

Os intrões podem ser identificados entre sequencias de genes, através da comparação dos
genes com os produtos de RNA da transcrição por sequenciação.
As posições dos intrões são normalmente conservadas quando genes homólogos são
comparados entre diferentes organismos. O comprimento dos intrões correspondentes pode variar
muito. Os intrões normalmente não codificam proteínas.

Variação dos Genes Eucarióticos demonstram variação extensiva:

• Alguns são ininterruptos e as suas sequências são colineares com aquelas dos mRNAs
correspondentes;
• Maior parte dos genes de eucariotas multicelulares são interrompidos, mas os intrões
variam enormemente tanto em tamanho como em número.

Variação de sequências de Intrões e Exões: seleção e evolução

Seleção Negativa
Comparações entre genes em diferentes espécies mostraram que as sequências dos exões
correspondentes são normalmente conservadas, mas as sequências dos intrões são muito menos
parecidas.
Os intrões evoluem muito mais rapidamente que os exões devido à falta de pressão
seletiva para produzir uma proteína com uma sequência útil.

4
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

Seleção Positiva
Sob seleção positiva, um indivíduo com uma mutação vantajosa sobrevive (isto é, é capaz
de produzir uma descendência que é mais fértil) relativamente a outros sem mutação.
Devido a pressões genómicas intrínsecas, tal como aquelas que conservam o potencial de
extrusão de stem-loops do duplex de DNA
A sequência de exões varia enquanto que a de intrões é conservada. Os intrões vão evoluir
mais devagar e conservar sequências reguladoras.

Os genes mostram uma ampla distribuição de tamanhos devido ao tamanho dos intrões e
à variação numérica.
Maior parte dos genes em leveduras são ininterruptos e, em eucariotas multicelulares, são
interrompidos. Os exões são, por norma, curtos (codificam menos de 100 aa) e os intrões são
pequenos em eucariotas em unicelulares/oligocelulares, mas muito maiores em
multicelulares.

Algumas Sequências de DNA codificam mais que uma Proteína

O uso de codões de iniciação ou terminação alternativos produz múltiplos variantes da

cadeia polipeptídica. Diferentes proteínas podem ser produzidas, a partir da mesma sequência de
DNA, quando o mRNA é lido em diferentes pontos de leitura (como dois genes sobrepostos).
Muitos genes estruturais consistem numa sequência que codificam uma única proteína,
embora o gene possa incluir regiões não codificantes em ambas as terminações e intrões na região
codificante. No exemplo da figura seguinte, uma única sequência de DNA pode ter dois codões
alternativos de iniciação no mesmo ponto de leitura.

5
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

Na verdade, um gene sobreposto ocorre quando a mesma sequência de DNA codifica

duas proteínas não homólogas devido a utilizar mais de um ponto de leitura. Normalmente, uma
sequência de DNA codificante é lida num de três potenciais pontos de leitura (Reading frames).
Em alguns genes virais ou mitocondriais, existe alguma sobreposição entre dois genes
adjacentes que são lidos em diferentes pontos de leitura, tal como demonstrado na figura seguinte.
O comprimento de sobreposição é, geralmente, curto para que maior parte da sequência de DNA
codifique uma única sequência de polipeptídeos.

Em alguns genes, os meios alternativos de expressão não afetam a sequência de

polipeptídeos. Por exemplo, alterações que afetam a região 5’ não traduzida – região de um
mRNA que está a montante do codão de iniciação – ou a região 3’ não traduzida, podem trazer
consequências reguladoras, mas o mesmo polipeptídeo é produzido. Noutros casos, um exão é
substituído por outro.
No exemplo da figura seguinte, os polipeptídeos produzidos pelos dois mRNAs contêm
sequências que se sobrepõem extensivamente, mas são diferentes dentro da região
alternativamente processada.

6
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

A próxima figura mostra que o processamento alternativo pode levar à inclusão de um

exão em alguns mRNAs, ao passo que o deixa de fora de outros. Um único transcrito primário
pode ser spliced de duas maneiras. Na primeira, dois intrões são removidos e três exões ligam-se.
Na segunda, o segundo exão é excluído, tal como se um único intrão enorme fosse removido –
este intrão consiste em intrão 1 + exão 2 + intrão 2. Ambas as vias produzem dois polipeptídeos
que são os mesmos no fim, mas um tem uma sequência adicional no seu meio.

Alguns Exões correspondem aos Domínios Funcionais de Proteínas

As proteínas podem consistir em módulos funcionais independentes, cujos limites, em

alguns casos, correspondem aos dos exões.
Os exões de alguns genes aparecem homólogos aos exões de outros, sugerindo um exão
antecessor em comum.

7
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

Membros de uma Família Genética têm uma Organização Comum

Um conjunto de genes homólogos deve partilhar características comuns que precederam

a sua separação evolucionária. Todos os genes de globina têm uma forma comum de organização
com três exões e dois intrões, sugerindo que descenderam de um único gene ancestral.
A posição dos intrões na família de genes da actina é altamente variável, o que sugere que
intrões não separam domínios funcionais.

8
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

Organização do Genoma – TP2 Parte 2

Bp = base pair – um par de bases corresponde aproximadamente a 3.4 Å (0,34 nm) de

comprimento da cadeia.
Kb = kilo-base-pair = 1000 bp

Cromatina – mistura de DNA com proteínas que formam os cromossomas encontrados

nas células dos organismos mais desenvolvidos.
A cromatina existe em duas formas:
Eucromatina: menos condensada e pode ser transcrita.
Heterocromatina: Altamente condensada e, tipicamente, não pode ser transcrita.

Nucleossoma – Refere-se a um octamero central de histonas mais a histona de ligação

(H1) e aproximadamente 180 pares de bases de DNA.
As histonas podem ser removidas por elevadas concentrações salinas e por nucleases que
degradam o DNA.

(Tenho mais que estudar sem ser este powerpoint)

9
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

Replicação está conectada ao Ciclo Celular – TP3

A Replicação de Bactérias está conectada ao Ciclo Celular

A replicação inicia-se quando a célula passa por um tamanho do limite crítico. Existe
apenas uma origem de replicação. A conclusão da replicação produz cromossomas filhos que
podem ser ligados por recombinação ou catenados. Assim, os cromossomas são separados e
movidos para lados opostos do septo antes da bactéria ser dividida em dois.
Então, como sabe a célula bacteriana quando iniciar a replicação? A replicação
ocorre uma vez a cada ciclo celular e ao mesmo tempo em todos os ciclos. E ainda não se sabe
bem como é que este tempo é definido, mas uma proteína iniciadora poderá ser sintetizada
continuamente durante o ciclo celular. A acumulação desta proteína numa concentração crítica
irá desencadear a iniciação.
Outra hipótese é a síntese/ativação de uma proteína inibidora que se torna diluída abaixo
do seu nível de eficiência pelo aumento do volume celular, por exemplo, o caso da síntese da
proteína ativa DnaA (proteína iniciadora bacteriana).
As bactérias são microrganismos que estão presentes praticamente em qualquer ambiente
terrestre e, o que caracteriza estes ambientes, é que tanto são alterados por situações de excesso
de nutrientes como outras situações ambientais onde há privação destes. Então estão alternância
influência a taxa de crescimento da bactéria e regula a taxa de divisão celular.

10
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

A baixas taxas de crescimento (situação clássica), o cromossoma aguarda em G1 antes

do período de replicação em S começar e é possível observar a forquilha de replicação a evoluir
bidimensionalmente.
Porém, a taxas de crescimento mais elevadas, a replicação é contínua e a fase G1
desaparece. Diz-se que nesta situação é uma replicação multiforquilha pois a célula tem duas
origens de replicação e cada uma destas vai iniciar a sua própria bolha de replicação.

As bactérias têm duas ligações entre a replicação e o crescimento celular:

• A frequência da iniciação dos ciclos de replicação é ajustada para adequar a taxa
com a qual a célula está a crescer;
• A conclusão de um ciclo de replicação está conectada com a divisão da célula.

Replicação do cromossoma bacteriano:

• Iniciada numa região oriC única;
• Procede em ambas as direções;
• Termina na região ter.

11
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

Durante o crescimento lento, a replicação é iniciada uma vez por ciclo celular.
Em crescimento rápido sob condições ideais, outra ronda de replicação é iniciada antes
da ronda anterior ter sido completada. Isto resulta na herança, pelas células-filhas, de
cromossomas parcialmente replicados – cromossomas de forquilhas múltiplas.

Organização da forma e espacial durante a Segregação de Cromossomas e

Divisão Celular

Segregação de DNA: o movimento além dos cromossomas recentemente replicados que

acontece simultaneamente com a replicação de DNA.
Forma da célula bacteriana: membrana rígida de peptidoglicanos que rodeia a
membrana interior.
São necessárias três proteínas para manter a forma da bactéria - MreB, PBP2 e RodA –
e mutações em algum dos seus genes pode levar à perda de forma e torná-las redondas.
O fim do ciclo celular numa bactéria é definido pela divisão da célula em duas e esta
divide-se no centro pela formação de um septo, uma estrutura que se forma no centro da célula
como uma invaginação do envelope circundante.
O septo forma uma barreira impenetrável entre as duas partes da célula e fornece o local
no qual as células filhas se vão separar completamente.
Inicialmente, o septo consiste numa dupla camada de peptidoglicanos e na proteína
EnvA, que é necessária para separar as ligações covalentes entre as membranas para que as
células filhas se possam separar.
Então colocam-se aqui duas questões: “O que determina a localização onde se forma o
septo?” e “O que assegura que os cromossomas filhos se encontram em lugares opostos?”.

12
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

FtsZ é necessário para a Formação do Septo

O produto de ftsZ é necessário para a formação do septo. A ftsZ é uma GTPase que se
assemelha a tubulina e polimeriza para formar um anel dentro do envelope bacteriano. É
necessário para recrutar enzimas necessárias para a formação do septo.
Este gene tem um papel central na divisão e mutações nele podem provocar o bloqueio
da formação do septo e gerar filamentos. A superexpressão induz mini-células, causando um
elevado número de eventos de septação por unidade mássica de célula.
A proteína FtsZ recruta uma quantidade de proteínas divisoras de células que são
responsáveis para a síntese de novos septos.
A FtsZ funciona numa fase inicial de formação do septo e está localizada pelo citoplasma
(no ínicio da divisão celular), mas, numa fase mais avançada, já se encontra localizada num anel
à volta da circunferência que se encontra no meio da célula. Esta estrutura chama-se anel-Z, sendo
a sua formação a etapa limitante na formação do septo e a sua montagem define a posição do
septo.

A estrutura de FtsZ assemelha-se a tubulina, sugerindo que a formação do anel pode

assemelhar-se à formação de microtúbulos nas células eucarióticas.
FtsZ tem atividade de GTPase e a clivagem de GTP é usada como suporte da
oligomerização de monómeros de FtsZ na estrutura do anel. O Anel-Z é uma estrutura dinâmica,
na qual existe uma troca contínua de subunidades com uma região citoplasmática.

A Localização do Septo é regulada pelos Genes min e noc/slm

Conceitos-Chave:
• A localização do septo é controlada por minC, -D e -E e por noc/slmA;
• O número e localização do septo é determinado pela razão entre MinE/MinCD;

13
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

• O movimento dinâmico das proteínas Min na célula estabelece uma patente na

qual a inibição da montagem do anel Z é mais alta nos polos e mais baixa no meio
da célula;
• Proteínas SlmA/Noc previnem a septação de ocorrer no espaço ocupado por
cromossoma bacteriano.
Os produtos de minC e minD formam um inibidor de divisão. MinD é necessária para
ativar MinC, que impede FtsZ de polimerizar no Anel-Z.
A expressão do complexo MinCD na ausência de MinE, ou a elevada expressão na
presença de MinE, causa a inibição generalizada da divisão. A expressão de MinE a níveis
comparados a MinCD confina a inibição das regiões polares. Então, o determinante da septação
a meio da célula é a razão entre MinCD e MinE.
A localização deste sistema de Min é devida a uma dinâmica existente entre MinD e
MinE, que se encontra ilustrada na figura seguinte.

MinD, uma ATPase, oscila de uma extremidade da célula para outra rapidamente. O
complexo MinD-ATP liga-se e acumula-se à membrana lipídica de um dos polos da célula, é
libertado, e depois liga-se ao polo oposto. A proteína MinC, que não se consegue mover por conta
própria, oscila como um passageiro visto que está ligado a MinD.
A proteína MinE forma um anel à volta da célula na borda da zona de MinD e este anel
move-se na direção de MinD nos polos, sendo necessária a hidrólise de ATP e a libertação de
MinD da membrana.

14
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

O Anel MinE disassocia-se e volta-se a formar no limite da zona MinD que se forma no
polo oposto.
As proteínas MinD e MinE são ambas necessárias para as dinâmicas uma da outra. A
consequência deste comportamento dinâmico é que a concentração do inibidor MinC é baixa no
meio da célula e elevada nos polos, o que direciona a montagem de FtsZ no meio da célula e inibe
a sua montagem nos polos.
Depois, temos outras proteínas a ter um papel importante na localização do septo como
as NOC ou as SlmA que evitam a formação do anel-z sobre o cromossoma bacteriano.
É a combinação da oclusão do nucleoide e do sistema Min que promove a formação do
Anel-Z no meio da célula.

15
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

Replicação em Procariotas – TP4

A Partição envolve a separação dos cromossomas

A partição é o processo pela qual dois cromossomas filhos se encontram em cada lado
que o septo forma. Dois tipos de eventos são necessários para uma partição apropriada:
• Os dois cromossomas filhos devem ser libertados um do outro para que possam ser
segregados, seguidos de terminação. Isto requer o desenrolamento de regiões de DNA
que estão enroladas em torno de si nas proximidades do terminal.
• Os dois cromossomas filhos devem se separar durante a partição. Os modelos originais
para a segregação cromossómica sugeriram que o envelope celular cresce pela inserção
de material entre os locais de fixação da membrana dos dois cromossomas, afastando-os
assim.
Mutações nos genes que codificam para topoisomerases (enzimas que têm a habilidade de
passar cadeias de DNA umas pelas outras) evitam que os cromossomas filhos segreguem, com o
resultado que o DNA esteja localizado numa única massa enorme no meio da célula. Ocorre
formação do septo e há libertação de uma célula anucleada e de outra contendo ambos os
cromossomas.
Isto demonstra que as bactérias devem distender os seus cromossomas em ordem, de modo a
estarem a aptas a segregá-los para duas células diferentes.
A segregação é interrompida por mutações na classe muk de genes, o que resulta numa
ddescendência anucleada com muito mais frequência.
O gene mukB codifica para uma larga proteína (180-kD), que tem o mesmo tipo de
organização que os dois grupos de proteínas de manutenção estrutural de cromossomas (SMC)
que estão envolvidas na condensação e na retenção de cromossomas eucarióticos juntos.
Proteínas semelhantes a SMC foram também encontradas em outras bactérias e as
mutações dos seus genes podem aumentar a frequência de células anucleadas.
A proteína MukB orienta e posiciona as regiões de origem do cromossoma durante a
segregação.
A figura seguinte demonstra um modelo para o papel de replicação. O genoma parental
está posicionado centralmente e deve ser descondensado para sofrer replicação. Os cromossomas-
filhos emergem da replicação e são distendidos pelas topoisomerases e, posteriormente, passados
a um estado não condensado MukBEF (um complexo formado entre MukB, MukE e MukF e que
se parece com uma condensina eucariótica), o que faz com que formem massas condensadas nas
posições que vão-se tornar os centros das células filhas.

16
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

Iniciação da Replicação de DNA

DnaA: a concentração de DnaA ativa a iniciação da replicação do DNA em bactérias (a

sua acumulação é que desencadeia esta iniciação).
O DnaA promove o desenrolamento do DNA em oriC:

• A ligação de DnaA ativa as repetições de 9-mer (9 pares de bases) a montante de

oriC (caixas de DNA);
• A ligação auxilia na preparação da fusão do DNA aberta pela ação da helicase
DnaB.
Os 13-mers e as caixas de DNA (9-mers) são regiões ricas em AT:

• Fundem a temperaturas baixas comparativamente ao DNA que contém pares GC;

• Estas regiões são postuladas para ajudar a fundir a cadeia dupla de DNA na região
oriC para a iniciação da replicação de DNA

17
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

Mecanismo de iniciação da replicação do DNA a partir da origem de

replicação de E.coli

Elementos de uma sequência em oriC: caixas de DnaA (setas vermelhas), 13-mer

(triângulos verdes) na região rica em AT, e zonas de ligação para IHF e FIS (proteínas associadas
ao nucleoide).
Em primeiro lugar, a proteína DnaA liga-se às caixas de DnaA sequencialmente (ver
números). Complexada com ATP, abre a região rica em AT (contendo sequências de 13-mer)
para formar o complexo aberto.
Posteriormente, dá-se a entrada da proteína hexamérica DnaB (elipse azul) do complexo
DnaB-DnaC e segue para formar o complexo de pré-priming. A DnaB inicialmente liga-se à
proteína DnaA que se encontra conectada a oriC.
Depois, há libertação da DnaC (círculo vermelho), hidrolisando ATP, do complexo
DnaB-DnaC.
Por último, a DnaB, que se encontra ligada a cada cadeia parental de DNA, move-se na
direção 5’-3’ e interage periodicamente com a primase (que sintetiza primers de RNA necessários
tanto para a síntese da leading e da lagging strand).

18
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

Metilação das origens de replicação

A metilação do DNA em procariotas é conhecida desde 1950, mas a sua função ainda é
elusiva.
Diversas DNA metiltransferases existem em bactérias que não pertencem aos sistemas
R-M, como por exemplo a Adenina Metilase (DAM).
DAM: adiciona um grupo metil à adenina da sequência 5’ – GATC – 3’ no novo DNA.
É uma metiltransferases órfã que não faz parte do sistema de restrição-modificação e regula
a expressão génica.
Metilação do DAM:
• Regulação da expressão do gene dnaA;
• E regulação da ligação a oriC.
• Ambos depende de SeqA.

A perda de função de mutantes de Dam em E. coli mostra aumento na taxa de mutações

e uma taxa anormal de iniciação da replicação.
SeqA: existe em bactérias e archaea. Tem uma função importante na replicação de DNA.
Ao ligar-se a sequências GATC hemimetiladas, regula negativamente a iniciação da
replicação do DNA na origem de replicação (oriC).
Os tetrâmeros de SeqA são capazes de agregar ou multimerizar de uma maneira reversível
e dependente da concentração.

19
Rocha. H
 Biologia Molecular – Resumos TPs

Em G1, oriC e o promotor de DnaA são completamente metilados e, no início da

replicação, as proteínas DnaA ligam-se às zonas oriC iniciando a replicação.
Após a replicação:
• Dois novos oriCs replicados são hemimetilados (metilação parcial ou
incompleta);
• SeqA substitui o DnaA em oriC e bloqueia a transcrição de dnaA.
• DAM metilase volta a metilar todas as zonas, bloqueando uma reiniciação
precoce da replicação do DNA até que um novo ciclo seja possível.

20
Rocha. H