S (FBM) 1819LS

Fundamentos de Biologia Molecular
SEBENTA DE FUNDAMENTOS DE
BIOLOGIA MOLECULAR (REVISTA)
LEANDRO SILVA
2018/2019
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ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA)
As bases azotadas das purinas (adenina e guanina) são compostas por 2 anéis,
enquanto que as bases azotadas de pirimidinas (timina e citosina) são compostas por
um anel. O Uracilo é facilmente convertido em citosina. O facto de não existir em DNA
faz com que este se encontre protegido contra mutações que daí possam advir.
A direccionalidade das ligações é uma propriedade importante da molécula de DNA: a
ligação química entre dois nucleótidos é uma ligação fosfodiéster (ligação covalente
entre um grupo fosfato, acoplado ao carbono 5’ de um nucleótido e ao carbono 3’ da
desoxirribose do outro nucleótido. Existem, portanto, duas ligações fosfodiéster (uma
para cada lado do fosfato) e o DNA é uma molécula linear com direção 5’ -> 3’.
Ligação
fosfodiéster
Ponte de
Hidrogénio
O DNA tem estrutura de dupla hélice como forma de proteção contra a degradação ao
nível dos terminais. Cada cadeia emparelha com as bases azotadas complementares
por pontes de hidrogénio, sendo que a guanina emparelha com a citosina através de 3
pontes de hidrogénio, e a timina e a adenina emparelham através de duas pontes de
hidrogénio (mais fácil de quebrar ligações A - T do que C – G).
A cadeia tem uma volta maior (major Groove) e uma volta menor (minor groove),
sendo que a maior permite uma maior interação com proteínas (em número), uma vez
que estas zonas se encontram mais expostas.
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Existem vários modelos para a estrutura de uma molécula de DNA: A, B e Z.
Estrutura B: Descrita por Watson e Crick em 1953. É a forma mais comum, sendo que a
hélice é voltada para a direita e contém 10 resíduos por volta. Emparelha de modo
planar e é perpendicular à ligação fosfodiéster.
Estrutura A: Obtida por desidratação moderada do modelo B, também voltada para a
direita. Possui, contudo, um maior número de nucleótidos por volta (11) e as bases
estão num ângulo de 20º em relação ao eixo helical (ligação fosfodiéster). É mais densa
do que a forma B.
Estrutura Z: Neste modelo, a hélice é
voltada para a esquerda, de modo a
diminuir a tensão existente na hélice.
Contém cerca de 12 nucleótidos por volta,
sendo mais densa do que a A. Não se sabe
se tem função biológica.
TEMPERATURA DE FUSÃO DO DNA: Característica do DNA que o caracteriza em

termos de composição em bases G e C, visto que são estas que estão emparelhadas
com maior número de pontes de hidrogénio (mais energia necessária para as quebrar,
logo, maior ponto de fusão).
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Olhando para a curva, podemos concluir que as cadeias duplas (início da curva)
absorvem muito menos do que as cadeias simples (cimo da curva). A temperatura de
fusão (Tm) depende diretamente de diversos fatores, tais como:
• Percentagem em G + C (relacionado com o grupo em que o organismo está
inserido);
• Sequência de DNA (zonas repetitivas, etc.);
• Incompatibilidade de pares de bases;
• Dimensão da molécula (temos de comparar estruturas com o mesmo tamanho
de fragmentos);
• Concentração de DNA e tampão onde se encontra;
• Força iónica (Na + neutraliza os fosfatos. Portanto, aumentando a concentração
salina, destabilizo o DNA e diminuo a restringência ao realizar hibridizações);
• Agentes desnaturantes (ureia, formamida, etc.)
Tm é o valor de temperatura para o qual 50% dos pares de bases estão desnaturados,
e os restantes 50% ainda estão emparelhados.
Podem surgir vários efeitos no DNA após tratamento com

bases, ácidos ou sais.
Utilizando bases, alteramos o estado tautomérico das
bases azotadas, quebrando as pontes de hidrogénio e
desnaturando a dupla hélice/ estrutura secundária do
ácido nucleico. (Timina e Guanina existem no estado
cetónico (e não enólico) e Adenina e Citosina existem no
estado amino (e não imino), normalmente).
Utilizando ácidos, hidrolisamos os ácidos nucleicos nos
seus componentes essenciais, ou seja, bases azotadas +
açúcares + fosfatos. Soluções ácidas moderadas clivam
ligações glicosídicas, gerando locais apurínicos.
Utilizando sais, as cargas positivas estabilizam os grupos fosfato do DNA (cargas
negativas).
CROMATINA: complexo de DNA e proteínas cromossómicas. Há aproximadamente

duas vezes mais proteínas do que DNA e a estrutura básica da cromatina é formada
por 200pb de DNA ligados a um octâmero de histonas (duas moléculas de cada histona
e uma molécula de histona 1).
EUCROMATINA: regiões nas quais a cromatina se encontra menos compacta.
Nesta zona, os nucleossomas afastam-se uns dos outros, expondo os genes que podem
assim ser transcritos.
HETEROCROMATINA: Parte condensada da cromatina (mais compacta). Os
genes aqui contidos estão inativos.
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PROTEÍNAS:
-NÃO HISTONAS: todas as outras proteínas associadas ao DNA;
-HISTONAS: proteínas positivas (ricas em arginina e lisina), abundantes,
de massa idêntica à do DNA. Regulam a expressão génica abrindo a cromatina e
permitindo acesso ao DNA por fatores de transcrição (proteínas). Estabilizam a carga
do DNA.
Podem ser H1 (ou H5), H2A e H2B (menor peso molecular, ricas em lisinas) e H3 e H4.
O pedaço de DNA que une dois nucleossomas chama-se de linker DNA. As arqueias
também têm histonas iguais às nossas. O DNA dá 1,7 voltas ao octâmero.
EMPACOTAMENTO DE DNA: dá-se em 4 níveis. O nível 1 corresponde à formação do

nucleossoma; o nível 2 inclui “beads on a string” (união de nucleossomas); o nível 3
equivale ao empacotamento de nucleossomas numa fibra cromatínica de 30 nm; o
nível 4 corresponde a alsas de DNA.
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA: dita que a informação está contida no DNA,

passando para RNA e só depois para as proteínas. No entanto, a proteína altera a sua
estrutura, modifica-se e interfere no dogma.
As células passam por vários estados de DNA e de RNA, não podendo estar sempre no
mesmo estado (necessitam de se dividir ou expressar diferentes informações).
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EXPERIÊNCIA DE MESELSON – STAHL:

A premissa imposta pelos cientistas foi que, se duas cadeias polinucleotídicas de DNA
fossem marcadas de algum modo, seria possível prever o funcionamento da replicação
(acerca do destino de cada cadeia no decorrer das gerações posteriores). As previsões
foram as seguintes:
-após uma geração (uma replicação), ambas as moléculas estariam marcadas e
cada uma delas iria conter metade da marcação da “molécula mãe” original;
-após duas replicações, metade das moléculas estaria marcada e a outra
metade não estaria. A metade marcada conteria a mesma marcação do que as
moléculas originais (primeira replicação).
Esta experiência diz-nos que o DNA é replicado de forma semi-conservativa: existe um

molde e uma cadeia nova. No molde, a cadeia tem de abrir para ser possível aceder à
informação contida na sequência de bases.
Para haver novas células, é necessário haver replicação. Este é um processo
extremamente importante para a continuidade da vida: para que esta ocorra, é crucial
a atividade de enzimas específicas como a topoisomerase. Estas enzimas catalisam
quebras em moléculas de DNA de modo a aliviarem nos super-enrolamentos.
-TOPOISOMERASE I: quebra apenas uma das cadeias de DNA e permite que a
cadeia quebrada gire sobre a cadeia intacta. Conserva a energia da quebra da ligação
fosfodiéster, armazenando-a na forma de ligação covalente entre ela e o grupo
fosfato, no ponto da clivagem.
-TOPOISOMERASE II: quebra as duas cadeias de DNA ao mesmo tempo, e pode
introduzir ou retirar super-espiras (supercoil) duas de cada vez, num mecanismo
dependente de ATP. Esta enzima cliva as duas cadeias de DNA e prende-se à
extremidade através de ligações covalentes, passa a dupla cadeia através do corte e
fecha a quebra.
A estrutura fechada e organizada do DNA não é sempre igual na célula. Essa estrutura
condiciona a transcrição e replicação do DNA.
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EPIGENÉTICA: Ciência que estuda, para sequências iguais de DNA, como cofatores
condicionam o fenótipo do organismo (uma vez que estuda a informação do DNA que
não faz parte do código genético, mas que passa de geração em geração).
Ex: metilações, silenciamento de genes (enzimas que acetilam o DNA: diminuem a
carga negativa do DNA e aumentam a repulsão histonas – DNA, permitindo a leitura de
genes pela maquinaria enzimática).
1. REPLICAÇÃO DO DNA
Processo que depende de DNA polimerase para copiar o DNA e verificar (ou não) se
introduziu erros na cópia, voltando atrás na cadeia. É uma exonuclease, removendo
bases no sentido 5’ – 3’. A DNA polimerase não sabe onde parar, copiando enquanto
existir molde. Esta enzima necessita ainda de Mg 2+ para funcionar.
EM PROCARIOTAS (E. coli): A DNA polimerase é utilizada para preencher os espaços

entre os fragmentos de DNA da cadeia atrasada. Esta é também a maior enzima de
polimerização existente na replicação.
A replicação depende da presença de primers. A perda de fosfatos dá a energia
necessária à DNA polimerase para ela funcionar.
Esta enzima pode ter três atividades distintas:
-template (dirigida por DNA, 5’ – 3’);
-Proofreading (volta atrás e confirma o que fez, cortando o que está mal e
tentando colocar uma nova base no sistema: sentido 3’ – 5’);
-Error Correcting (corrige erros no sentido 5’ – 3’).
Em procariotas, temos 3 tipos de DNA polimerases:

-DNA POLIMERASE I: tem como função preencher os gaps da cadeia atrasada. É
a enzima mais importante para preencher gaps na reparação do DNA. Esta enzima
também participa na cópia do DNA e copia constantemente a molécula. É uma
exonuclease e liga primers e fragmentos. É capaz de exonuclease 3’ – 5’ e garante
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uma correta polimerização (proofreading), verificando se os nucleótidos adicionados

são os corretos. Os primers são posteriormente removidos e os fragmentos unem-se.
-DNA POLIMERASE II: Codificada pelo gene PolB, envolvido em respostas de
emergência ao dano de DNA. Envolvida na reparação do ácido desoxirribonucleico.
-DNA POLIMERASE III: Diferente de organismo em organismo, mantendo a sua
função: polimerização do DNA. A sua estrutura tem de envolver o DNA, ancorando
nele e replicando durante muito tempo. Necessita de um primer com um grupo 3’-OH
livre (importante na sequenciação: vamos falar mais à frente).
A holoenzima não é simétrica. Tem subunidades mais catalíticas (Palm: folha β) e é

uma molécula bastante grande (peso molecular de 600 kD). As polimerases são
controladas pelo fator σ no DNA (começa aí a replicação). A replicação é levada a cabo
essencialmente pela DNA Pol III.
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO EM PROCARIOTAS:

-Origem de replicação em E. coli: feito num só ponto. A origem de replicação
relaciona-se com a sequência que se repete nesta origem, reconhecida pela helicase.
As sequências têm direções diferentes e são simétricas umas em relações às outras. Os
cromossomas e plasmídeos em bactérias são geralmente circulares
No fim da replicação, as cadeias estão encaixadas uma na outra (concatâmero). Ass im,
temos o DNA replicado e o DNA não replicado ligados um ao outro, sendo necessário
separá-los com a topoisomerase IV.
EM EUCARIOTAS:
-O DNA tem duas cadeias, sendo que numa, o DNA é copiado de forma livre
(contínua) e apenas necessita de um primer.
A síntese de DNA ocorre no sentido 5’ - 3’ (devido ao crescimento da cadeia se efetuar
através de ligações fosfodiéster entre o oxigénio 3’ da cadeia e o α-fosfato de um
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dNTP). A DNA polimerase requer um primer e adiciona desoxirribonucleótidos ao

grupo -OH na ponta 3’ do primer.
O desenrolamento das cadeias é feito pela HELICASE (específica), que quebra as

pontes de hidrogénio entre bases azotadas complementares. A atividade das helicases
tem início nos pontos denominados de origens de replicação (usualmente ricos em
pares de A – T). Após a helicase separar as cadeias, a PRIMASE forma um primer RNA
complementar à cadeia, que é depois alongado pela DNA POLIMERASE.
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO EM EUCARIOTAS:
À medida que a replicação prossegue, a forquilha em crescimento e as proteínas a ela

associadas movem-se para lá da origem de replicação. O desenrolamento é auxiliado
pela topoisomerase I. A Helicase remove pontes de hidrogénio e desenrola o DNA; a
topoisomerase I remove o supercoil.
PROBLEMA: as cadeias são antiparalelas e a DNA polimerase apenas adiciona

nucleótidos na direção 5’ – 3’. SOLUÇÃO: Ao fim de algumas centenas de bases, um
novo primer é sintetizado na cadeia atrasada e alongado na direção 5’ – 3’. Formam-se
segmentos descontínuos (Fragmentos de Okasaki) que são depois ligados pela DNA
ligase.
Cada primer de RNA é removido e substituído por DNA, através do fragmento
anterior.
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EXEMPLO: FORQUILHA DE REPLICAÇÃO DO VÍRUS SV40 (SEMELHANTE A EUCARIOTAS)
COMPLEXO PRIMASE – POL α: Um complexo de PRIMASE sintetiza os primers em

ambas as cadeias (RNA primers) e a DNA POLIMERASE α prolonga o primer com
desoxirribonucleótidos, formando uma mistura de DNA-RNA primer.
COMPLEXO PCNA – Rfc – POL δ: A prolongação para a cadeia filha de DNA é feita pela
DNA POLIMERASE δ, que tem menos probabilidade de cometer erros na cópia do que
a DNA POLIMERASE α. A POL δ forma o complexo Rfc (fator de replicação C) + PCNA
(proliferating cell nuclear antigen: impede que o complexo PCNA–Rfc–Pol δ se dissocie
da cadeia), que vai translocar o complexo primase-Pol α após a síntese de primers.
Após a separação das cadeias, várias proteínas RPA (replication protein A) ligam-se a
cada cadeia. Estas proteínas mantêm a cadeia na posição/conformação ideal para a
cópia pela polimerase. A Pol α e a Pol δ removem as RPAs após a síntese de cadeias
complementares.
Nos eucariotas, atuam ainda:
-Topoisomerases: associada com o DNA parental, em frente da helicase,
remove o stress contorcional (supercoil). Topoisomerase I, II e IV cortam a dupla hélice
(TOP II é depende de ATP e é crítico a nível do supercoil em cromossomas lineares,
enquanto que a IV é crucial em cromossomas circulares).
-Ribonuclease–H: (com FEN I) remove ribonucleótidos nos terminais 5’ dos
fragmentos de Okasaki. DNA Pol δ substitui por desoxirribonucleótidos, ao mover-se
pelos fragmentos acima.
-DNA Ligase: une fragmentos de Okasaki através de ligações fosfodiéster 5’ – 3’.
-SSBs: proteínas que fazem com que o DNA fique em cada cadeia única, após o
desenrolamento e antes da anexação de primers.
-Proteínas BRACE: têm uma função idêntica às PCNA.
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Nos eucariotas, podemos ter grande número de polimerases:
DNA POLIMERASE FUNÇÃO

DNA POL α Síntese de primers na replicação de DNA
DNA POL β BER (base excision repair); não sai do núcleo
DNA POL δ Síntese da cadeia atrasada; NER e BER
DNA POL ε Síntese da cadeia líder; NER e BER
DNA POL γ Replicação e reparação do DNA mitocondrial
BIDIRECIONALIDADE REPLICACIONAL: No DNA cromossomal eucariótico, origens de

replicação ocorrem de dezenas a dezenas de kilobases. Uma proteína de 6
subunidades – ORC (Origin recognition complex) – liga-se a cada origem de replicação e
associa-se a ouras proteínas necessárias para carregar helicases hexaméricas (6
proteínas homólogas MCM por cada helicase).
Duas helicases MCM separam as cadeias parentais na origem, com proteínas RPA a
ligar-se à cadeia única.
-Com ATP, as helicases movem-se em sentidos opostos;

-Complexos Primase-Polα sintetizam primers;
-Complexos PCNA-Rfc-Polδ substituem o complexo Primase-Polα e prolongam
os primers, gerando as cadeias líder em cada forquilha de replicação;
-Complexos PCNA-Rfc-Polδ estendem os fragmentos de Okasaki da cadeia
atrasada, após o complexo Primase-Polα gerar primers.
A ativação das helicases MCM é regulada por proteínas cinases específicas – as cinases
dependentes de ciclina de fase S.
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Sequências consenso são comuns em todas as E. coli (algumas de 9, outras de 13bp) e

atuam como origens de replicação. São estas sequências que são reconhecidas pela
maquinaria enzimática da replicação.
TELÓMEROS: correspondem ao fim dos cromossomas lineares, e contêm sequências

repetitivas (TTAGGG em humanos) não codificantes. A sua função principal é a de
manter estabilidade estrutural do cromossoma. Cada vez que a célula se divide, os
telómeros são ligeiramente encurtados até que, a certo ponto, a célula perde a sua
capacidade de divisão (este encurtamento também pode eliminar certos genes
importantes).
Estas estruturas também funcionam como protetores, assegurando que a informação
genética relevante seja perfeitamente copiada aquando da divisão celular, além de
impedirem a degradação e recombinação.
TELOMERASE: complexo ribonucleico que contém sequências de RNA, sendo capaz de
polimerizar o DNA (é semelhante
à transcriptase reversa). O
último primer de RNA pode ser
adicionado, mas não
complementado. A telomerase
mantém o tamanho dos
telómeros, restaurando-os para
o terminal 3’, adicionando ao
DNA molde ainda mais molde,
permitindo que o último
fragmento seja extra e possa ser
perdido.
A telomerase perde atividade ao
longo do tempo, não estando
ativa em toda a vida.
A reparação do DNA é de crucial importância ao asseguramento da vida normal.

Primeiramente, pode ser efetuada por substituição nucleotídica de dois tipos:
-Transicional: Pirimidina A –> pirimidina B
Purina A –> Purina B
-Transversal: Pirimidina –> Purina (mais frequentes/prováveis)
Por exemplo, uma substituição A –> G provoca a substituição de uma adenina por uma
guanina numa das cadeias de DNA. Esta substituição gera um “mismatch” temporário
no par G – T. Na próxima ronda de replicação, esta mutação transicional torna-se
permanentemente incorporada na sequência de DNA.
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Mutações silenciosas: alteram a sequência de nucleótidos sem alterar a

sequência de aminoácidos. Ex: UAU –> UAC (ambos codificam a tirosina)
Mutações missense: substituição nucleotídica (numa região que codifique uma
proteína) que resulte na alteração dos aminoácidos. Pode alterar as capacidades
biológicas da proteína. Ex: Anemia falciforme: troca de AT por TA gera uma troca de
ácido glutâmico por valina, na β-globina da hemoglobina.
Mutações nonsense: substituição nucleofílica que gera um novo codão STOP,
provocando o término da cadeia polipeptídica e fazendo com que o resto perca (quase
sempre) a funcionalidade. Ex: UAU –> UAA (codão de tirosina passou a codão STOP)
Inserções/Deleções: a fibrose cística resulta da deleção de 3 bases (codão da
fenilalanina).
Expansão de repetições trinucleotídicas: podem adotar conformações de
hélice tripla, destabilizando a transcrição e a replicação do DNA. Podem levar a
doenças neurológicas genéticas, como a doença de Huntington.
O DNA pode ser reparado (ou não) através de numerosos mecanismos, tais como:
Damage Bypass: a enzima polimerase não corrige o erro e permite que este
fique permanentemente incorporado na cadeia de DNA.
Direct Repair: Na maioria dos organismos, a radiação UV forma dímeros de
timina. A enzima DNA fotoliase transfere eletrões para o dímero, dissociando as
timinas por um processo
de fotoreativação. A
enzima metilguanina DNA
metiltransferase remove o
grupo metilo caso ocorra
metilação de resíduos de
guanina.
(NOTA: organismos placentários não possuem uma via de fotoreativação)
Caso o dano necessite de ser removido, existem outros tipos de mecanismos. Excisão
de bases/ nucleótidos, ou modificações de base, são estratégias de reparação que
removem uma parte da cadeia de DNA, substituindo a informação. O primeiro passo
na via de reparação de danos consiste em aceder ao DNA.
Ao detetar erro ou dano no DNA, a cromatina é relaxada através de acetilação das
histonas e remodelação da cromatina. A DNA polimerase acede ao DNA e, no fim do
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processo, PCNA recruta fatores de montagem da cromatina (como o fator 1, CAF-1)

que voltam a meter a cromatina como ela estava inicialmente.
Base Excision Repair (BER): tem início com as enzimas DNA glicosilases, que
vão clivar a ligação N-glicosídica entre a desoxirribose e a base danificada. A base é
removida, formando um local abásico no DNA.
Existem glicosilases com capacidade de reconhecer as bases oxidadas/ reduzidas,
metiladas, deaminadas ou “mismatch”. Por exemplo, a uracilo DNA glicosilase remove
uracilos de pares UA ou UG, enquanto que a enzima hOGG1 promove a excisão de uma
oxoG. Após a remoção da base danificada, a endonuclease remove também parte dos
nucleótidos laterais. A DNA polimerase I e a DNA ligase reparam a cadeia, inserindo os
nucleótidos corretos e unindo-os. Esta polimerização é levada a cabo pela polimerase I
e não III, pois a DNA Pol I tem capacidade de proofreading.
NOTA: em mamíferos, se forem removidos 1 nt (short patch) ou se forem removidos 2-
10 nt (long patch), as endonucleases envolvidas são diferentes.
Nucleotide Excision Repair (NER): utilizada na reparação de distorções
estruturais (dímeros T=T) e capaz de reparar erros de 30 bases de comprimento. Este
mecanismo é utilizado em casos de formação de dímeros pirimidina-pirimidina de
ciclobutano por luz UV, ou de benzo(α) pireno-guanina “adducts” (em fumadores). A
via de excisão envolve proteínas codificadas por genes do mesmo operão (em
procariotas): UVrA, UVrB, UVrC, UVrD.
Mecanismo:
1) Detetar a lesão. As proteínas UVrA e UVrB geram um trímero e detetam a
lesão no DNA;
2) A proteínas UVrC liga-se à proteína UVrB, fazendo com que esta perca as
subunidades UVrA. O dímero UVrB-UVrC ativa a subunidade UVrD, que tem
capacidade de cortar o DNA (endonuclease) e remover a zona deficiente.
UVrD quebra as pontes de hidrogénio e remove o segmento de DNA;
3) A DNA polimerase I e a DNA ligase corrigem o “gap” e reparam a cadeia.
O mecanismo UVr existe em todos os organismos e pode ser ativado em mutações
com metais.
Mismatch Repair (Methyl-Directed: MMR): Todos estes mecanismos de

reparação de dano no DNA estão presentes constantemente na célula. Na presença de
agentes mutagénicos, são transcritos e traduzidos mais intensamente.
1) Acontece uma substituição de base azotada, causando o emparelhamento
incorreto. Podem ser detetados pelo número de anéis da base (se forem 4 ou 2, dá
erro: só podem ser 3). O DNA também pode ser metilado após a replicação; estas
metilações são detetadas, aquando da replicação, quando apenas uma das cadeias
filha está metilada. A proteína MutS liga-se ao local, formando um complexo com a
proteína MutL;
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2) O complexo MutS-MutL interage com a proteína MutH, através de looping

de DNA (alças da molécula);
3) DNA polimerase corrige, após a exonuclease digerir a sequência não
metilada.
REPARAÇÃO DE QUEBRAS: envolve uma perda de informação (parte de DNA). Se a

quebra for de duas cadeias de DNA, é necessário encontrar algures nos cromossomas a
informação que permita preencher a quebra (cromossoma homólogo). Radicais livres
de oxigénio, radiação ionizante e químicos capazes de gerar espécies reativas de
oxigénio, são capazes de provocar quebras no DNA.
RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA: Esta técnica biológica mantém a integridade do
genoma, mediando a segregação de cromossomas durante a meiose (crossing over).
Deficiências hereditárias em reparação de quebras nas duas cadeias podem levar a
maior susceptibilidade para cancro da mama.
Exposição celular a radiação ionizante leva a um aumento significativo da atividade da
ATM cinase (Ataxia Telangiectasia Mutated). Esta cinase é recrutada para o local de
quebra e fosforila algumas proteínas envolvidas na reparação do DNA (BRCA 1) e
controlo do ciclo celular. Enzimas BRCA (ou BRAC) detetam os terminais livres nas
zonas de quebra. Níveis reduzidos de ATM cinase elevam o risco de contrair cancro, a
susceptibilidade a radiação, aumentam o risco de sofrer de imunodeficiências e
doenças neurodegenerativas, bem como o envelhecimento precoce.
Mecanismo RecBCD: o sistema Rec é codificado tanto em procariotas como em
eucariotas, e envolve proteínas A, B, C e D com funções diferentes:
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-Rec B: atividade helicase 3’ – 5’

-Rec D: atividade helicase 5’ – 3’
-Rec C: reconhecimento de locais chi
-Rec A: estabilizadora
Ao chegar a um local chi, aumenta a atividade DNAse 5’ – 3’ (RecD), perdendo
atividade DNAse 3’ – 5’ (RecB). Esta oscilação faz com que se forme uma cadeia única,
estabilizada pela RecA.
JUNÇÕES DE HOLLIDAY:
A migração de cadeias é catalizada pelo

complex RuvAB. O segment em falta é
replicado a partir do cromossoma
homólogo, pelo mecanismo ao lado.
RecA facilita o emparelhamento de

cadeias. A DNA polymerase preenche
os “gaps”, utilizando o cromossoma
homólogo como molde.
Formam-se duas junções de Holliday,

pois os cromossomas são Unidos em
dois pontos.
RuvC cliva o DNA paara separar as

junções de Holliday.
PCR (Polymerase Chain Reaction): técnica de biologia molecular que permite a

replicação in vitro do DNA, de forma extremamente rápida e eficiente. Quantidades
mínimas de DNA podem ser amplificadas milhões de vezes em poucas horas,
permitindo a deteção rápida e fiável de marcadores genéticos de doenças infeciosas,
genéticas ou cancerígenas. Este processo ocorre num termociclador, um equipamento
que automaticamente controla e altera as temperaturas durante períodos
programados de tempo, para o número apropriado de ciclos de PCR (geralmente 30 a
40 ciclos).
Kary Mullis (Nobel da química em 1993) tentou passar o conhecimento de síntese
proteica para a síntese de DNA.
Etapas de um ciclo de PCR:
-Desnaturação (separação das fitas: quebra das pontes de hidrogénio ao
aquecer o DNA a 94-96oC);
-Annealing/ Anelamento (Emparelhamento de bases a 54 - 55oC);
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-Extensão (síntese do DNA: atividade da polimerase a 72 oC).

Como a DNA polimerase é uma enzima como as outras, desnatura facilmente na fase
inicial de desnaturação (96 oC). Para contornar este problema, foi necessário recorrer a
uma DNA polimerase da espécie Thermus aquaticus (Taq).
O meio reacional de PCR requer os seguintes componentes:
-DNA molde
-primers
-dNTPs (desoxirribonucleótidos fosfatados)
-Tampão com MgCl 2 (o Mg 2+ é um cofator imperativo para a atividade da
polimerase)
-Taq polimerase (mantém-se estruturalmente ativa a temperaturas elevadas.
Não tem atividade proofreading, sintetizando apenas no sentido 5’ -3’)
PROTOCOLO GENÉRICO DE PCR:

1) DESNATURAÇÃO (96 oC): a
temperatura elevada quebra as
pontes de hidrogénio que unem
as cadeias, separando-as. As
ligações covalentes mantêm-se.
2) ANELAMENTO (45 oC - 60 oC): O
objetivo do PCR é amplificar
apenas a sequência de interesse
(geralmente de 100 a 600bp),
única no organismo. Os primers
marcam as extremidades da
sequência que pretendemos amplificar, contendo 20 a 30bp, que encaixam sempre no
sentido 5’ – 3’ (são usados pelo menos dois primers, um forward e outro reverse).
3) EXTENSÃO (72 oC): a síntese é iniciada numa zona com cadeia dupla (molde +
primer) e incorpora dNTPs complementares à sequência alvo. Começa a introduzir no
terminal 3’-OH do primer e é definida por dois fatores:
-capacidade da Taq polimerase copiar um maior ou menor número de bases
(antes de se “cansar”);
-tempo de extensão.
No final do primeiro ciclo de PCR, obtemos duas novas cadeias idênticas à primeira.
Como a DNA polimerase não reconhece o fim da sequência, a extremidade 3’ não está
definida (enquanto que a extremidade 5’ tem o primer) e temos segmentos com
diferentes tamanhos.
No segundo ciclo de PCR, é esse segmento que atua como molde, e o primer irá definir
outra extremidade. Após o segmento ter o comprimento correto (definido pelos
primers em cada ponta) – AMPLICONS – alguns ciclos depois, estará presente em
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maior quantidade. É assim que apenas se amplifica a sequência flanqueada pelos

primers.
NESTED PCR: Utilizado quando a quantidade de DNA que temos ao nosso dispor é
muito reduzida, ou quando não temos primers específicos. Para melhorar a
especificidade e a eficiência da reação de polimerização em cadeia, o segmento
genómico é primeiramente amplificado de modo abrangente, copiando até mesmo
sequências localizadas fora dele. Depois de termos uma maior quantidade de DNA com
que podemos trabalhar, segue-se a amplificação real da sequência alvo.
HOT START PCR: variação do PCR. Começa por uma desnaturação do material
genético, a priori da iniciação da reação de PCR. A atividade da Taq polimerase é
inibida neste período, evitando-se assim a amplificação de produtos inespecíficos e
elevando a especificidade e rendimento da reação.
DESENHO DE PRIMERS:
Primers são pequenos oligonucleótidos sintéticos (17-28pb, em PCR normal) utilizados
em muitas técnicas de biologia molecular, desde PCR a sequenciação de DNA. Serve
como ponto de partida para a síntese de DNA e são desenhados de modo a serem
complementares com uma zona alvo do DNA, onde queremos que o primer se encaixe
e que comece a reação de replicação.
A replicação tem início no terminal 3’-OH do primer e copia a cadeia oposta, limitando
a zona de amplificação.
18
O primer que se coloca em cima,

como vai gerar uma replicação da
direita para a esquerda (a replicação
é sempre no sentido 5’ – 3’),
denomina-se primer reverse. Co
primer que está em baixo, como vai
gerar uma replicação 5’ – 3’ da
esquerda para a direita, chama-se
de primer forward.
Isto convencionou-se ser assim.
Um primer com adeninas (A) e timinas (T) no início não é muito bom, pois é fácil de ser
destabilizado (duas pondes de hidrogénio, apenas). É preferível ter um primer com
guaninas (G) e/ou citosinas (C) no terminal 3’-OH do primer que utilizamos.
Os primers são desenhados para fora da zona alvo, e só depois de termos amplificado
essa zona é que utilizamos primers para dentro da zona alvo. Um primer com
sequência igual à 5’ – 3’ vai encaixar-se na sequência complementar nesse sentido. É
necessário um primer que copie também no sentido 3’ – 5’ (primer reverse).
Ao desenhar os primers para PCR, sequenciação ou mutagénese, é frequentemente
necessário fazer previsões acerca da sua temperatura de fusão ou propensão para
formar dímeros consigo mesmo ou com outros primers.
A temperatura de fusão (Tm) calcula-se através da fórmula:
𝑇𝑚 = 4(𝐺 + 𝐶 ) + 2(𝐴 + 𝑇)
A temperatura de emparelhamento (Ta ) calcula-se como sendo: Ta = Tm – 4
A temperatura de fusão depende da sequência e do número de bases (tamanho do
primer), enquanto que a temperatura de emparelhamento depende da especificidade
da amplificação.
O primer não deve ter sequências auto-complementares entre si, ou com o outro
primer (primer forward não pode emparelhar com o primer reverse).
NUCLEASES:
-EXONUCLEASES: enzimas que clivam o DNA na sua extremidade e vão
digerindo pela cadeia fora. Permitem determinar a composição do DNA em bases, de
modo a avaliar a percentagem em guaninas e citosinas.
-ENDONUCLEASES: enzimas produzidas por procariotas que cortam o DNA em
sequências específicas no meio do DNA.
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO (ENDONUCLEASES): podem ser de vários tipos, de acordo com

a sua constituição e funcionamento.
19
-ENDONUCLEASES DE TIPO I: Complexos de grandes dimensões, com múltiplas

subunidades com atividade endonuclease e metilase. Clivam o DNA em locais
aleatórios até 1000 pb da sequência reconhecida. Dependente, para funcionar, de ATP
e de S-adenosilmetionina (SAM). São pouco comuns.
Ex. CfrA I
-ENDONUCLEASES DE TIPO II: Não necessitam de ATP. Clivam o DNA na própria
sequência reconhecida. Tipo mais útil em biologia molecular, por possibilitar a análise
e mapeamento de genes e genomas. Mais comuns.
Ex. EcoR I
-ENDONUCLEASES DE TIPO III: Complexos de grandes dimensões, com múltiplas
subunidades com atividade endonuclease e metilase. Clivam o DNA em locais
aleatórios até 25 pb da sequência reconhecida. Dependente de ATP. Raras.
Ex. Hinf III
-ENDONUCLEASES DE TIPO IV: Clivam apenas DNA metilado. Requerem Mg 2+ para
funcionar. Pouca especificidade em sequências de reconhecimento.
Ex. McrBC
Tipicamente, estas enzimas reconhecem sequências curtas (4-8pb) e palindrómicas e

clivam num determinado local dessa sequência. Quanto menor for a sequência
(usualmente são tetraméricas), mais frequentemente aparecem no DNA e maior a
frequência de corte pela enzima de restrição: aparece maior número de bandas numa
eletroforese.
MAPAS DE RESTRIÇÃO: muito importantes na caracterização do DNA, mapeamento de

genes e de genomas, bem como no diagnóstico de doenças genéticas.
Enzimas de restrição podem apresentar diferentes sensibilidades a padrões de

metilação, como no caso da metilação DAM (Gm6ATC: Grupo metilo na posição N6 da
adenina: N6-metiladenina). Enquanto que algumas enzimas são bloqueadas por este
tipo de metilação (Ex. Cla I), outras não são (Ex. BamH I). A enzima Dpn I apenas cliva a
20
sequência GATC, quando esta se encontra metilada na forma G m6ATC. A enzima Dpn II,
por outro lado, não cliva a sequência se esta se encontrar metilada.
Ao clivar sequências, pode gerar terminais secos ou terminais adesivos. Embora os
terminais secos não tenham importância para a biologia molecular, os terminais
adesivos têm: diferentes moléculas, clivadas pela mesma enzima de restrição, são
complementares (adesivos = “sticky”) e vão unir-se por pontes de hidrogénio. O
estabelecimento de ligações covalentes (fosfodiéster) é feito pela DNA ligase e ATP.
CLONAGEM: técnica que vai ser MUITO falada nesta cadeira.

Vetores de clonagem (transportam o gene que pretendemos clonar):
-PLASMÍDEOS: mais comuns; são elementos de DNA circular não
cromossómicos que podem ter várias características. As bactérias podem ser suicidas
ou unidades replicativas autónomas (plasmídeos f). O pUC é um plasmídeo fácil de
manipular, por ser relativamente pequeno. Contudo, devido ao seu tamanho, a
quantidade de informação que lá inserimos está limitada.
Plasmídeos contêm um gene que lhes confere resistência a um antibiótico (Ampicilina :
AmpR, Tetraciclina: TetR, Kanamicina: KanR etc.) e locais de clonagem agrupados em
MCSs (Multiple cloning sites).
Alguns plasmídeos podem conter o gene lacZ, que contém a informação necessária
para produzir a enzima β-galactosidase.
Esta enzima, além de degradar a lactose e sintetizar allolactose, pode ainda clivar a
ligação do composto X-Gal. Este composto, após clivado, reage com O 2 e produz um
produto (2) que dá uma tonalidade azul ao meio onde se encontra. Assim, é possível
visualmente identificar quais as bactérias que têm o plasmídeo inserido nelas.
Para identificar as bactérias recombinantes (possuem o insert), podemos atender a
genes repórteres, tais como:
-RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICO: colocando as bactérias num meio de crescimento
com tetraciclina, apenas as bactérias que têm o plasmídeo sobrevivem (visto que é o
21
plasmídeo que tem o gene de resistência a esse antibiótico). Se as colocarmos num

meio com ampicilina, contudo, todas elas morrem, visto que nenhuma tem o gene que
lhes garante resistência a esse antibiótico.
-GENE lacZ: clones com DNA nos MCS interrompem a capacidade de bactérias
produzirem a enzima β-galactosidase. Plaqueando as colónias num meio com X-Gal, as
células com a enzima produzem colónias azuis, enquanto que as colónias incolores são
as que têm o plasmídeo com o insert.
-FAGOS: o fago λ é dos bacteriófagos mais estudados (60% do seu genoma é

necessário para a replicação do fago, enquanto que os restantes 40% podem ser
manipulados). Este fago tem cadeia dupla e DNA linear com aproximadamente 50kb. O
DNA incluído na cabeça é transfetado para as bactérias de E. coli.
Os terminais do DNA do fago λ são coesivos, o que permite a circularização no interior
da E. coli.
Uma vez dentro da bactéria, o fago pode seguir duas vias: a via lítica (o seu material
genético é transcrito e traduzido, sintetizando mais fagos) ou a via lisogénica (o DNA
do fago é incorporado no genoma da E. coli, e a célula multiplica-se levando sempre
esse DNA consigo.
-COSMÍDEOS: são uma combinação das propriedades dos fagos e dos
plasmídeos, sendo que isso é uma vantagem da sua utilização. O tamanho do insert
colocado neles vai desde 35 a 45kb. São vetores capazes de transportar grande
quantidade de DNA, permitindo a transferência completa de material genético,
mantendo a estratégia de infeção dos fagos.
É necessário que tenham um local de inserção do DNA, genes de resistência a
antibiótico, terminais coesivos e origem de replicação (tal como em plasmídeos).
O cosmídeo pLFR-5 contém os dois terminais cos do fago λ, bem como várias
sequências de clonagem e origens de replicação, tal como num plasmídeo. Após lá
inserirmos o DNA que queremos, podemos colocar o cosmídeo na cabeça de um fago
λ, in vitro. Dentro da célula, os terminais cos permitem a circulariação do DNA.
Estes elementos possibilitam a construção de bibliotecas genómicas e são largamente
utilizados em metodologias ambientais.
22
-BAC (Bacterial Artificial Chromossome): Baseia-se no plasmídeo f da E. coli e

permite analisar grandes quantidades de genoma. O tamanho do insert pode ir desde
75 a 300Kb.
-YAC (Yeast Artificial Chromossome): utiliza-se para leveduras, também
permitindo a análise de grandes quantidades de genoma (inserts grandes).
-MAC (Mammalian Artificial Chromossome): utiliza-se em eucariotas para
biotecnologia animal e terapia genética.
Os plasmídeos podem ser passados entre células através da pili.

ZONA DE CLONAGEM: tem de estar presente nos vetores pois é neste local que
adicionamos o material genético que nos interessa. Normalmente, esta zona está
dentro de um gene que codifica uma proteína que define características fenotípicas.
Todos os plasmídeos têm ainda uma origem de replicação que lhes garante que sejam
replicados dentro da célula hospedeira. Após tratamento com endonucleases
específicas nas sequências de restrição, o segmento insert é colocado e une-se ao
restante plasmídeo com auxílio da DNA ligase.
A clonagem tem como finalidade a produção de múltiplas cópias, geneticamente

idênticas, de qualquer coisa (desde DNA, proteínas, células até organismos). Uma das
razões de clonar é guardar informação em bibliotecas.
-CLONAGEM DE DNA: produção de várias cópias de uma só molécula de DNA;
-CLONAGEM DE UM GENE: produção de várias cópias de um gene.
-CLONE DE UM GENE: célula contendo moléculas idênticas de DNA
recombinante, contendo o gene de interesse.
A estratégia a utilizar na clonagem depende, em grande medida, do gene e do que se

sabe sobre ele, bem como do nosso propósito. Temos de considerar, como
ferramentas na clonagem, as enzimas de restrição, o vetor, a DNA ligase e a célula
hospedeira.
23
Clonamos genes, não para fazer ovelhas, mas para sequenciar genomas indispensáveis
para muita coisa do nosso dia a dia. Serve para mutação de genes in vivo ou para
expressar uma determinada característica fenotípica.
-Podemos amplificar milhares de vezes apenas um gene;
-Podemos realizar um estudo individual acerca da função de genes;
-Podemos identificar mutações que modificam a função de determinados
genes;
-Podemos entender a ação enzimática de proteínas produzidas pelo gene;
-Podemos verificar com quais outros genes o nosso gene interage;
-Podemos produzir uma proteína em larga escala (como a insulina);
-Podemos produzir organismos transgénicos.
ESTRATÉGIA DE CLONAGEM:
Selecionamos
Clivamos o Colocamos o as células
Unimos os
vetor e o nosso DNA recombinantes
fragmentos
insert com a recombinante por
com aplicação
mesma enzima na célula crescimento
de DNA ligase
de restrição hospedeira em meio com
antibiótico
Existem vários métodos de transformação bacteriana:

1) TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL DE GENES: ocorre naturalmente em bactérias,
permitindo modificar o genoma do parceiro e gerando diversidade. Contudo, muitos
dos plasmídeos promovem stress à célula, ao ficarem resistentes a antibióticos.
2) TRANSFEÇÃO: termo generalista para transferência de material genético;
3) TRANSDUÇÃO: igual à transfeção mas mais específico, por permitir transferência de
material genético em fagos e em bactérias;
4) CONJUGAÇÃO: transferência de genes com objetivo de reprodução, continuando os
dois organismos a existir separadamente;
5) TRANSFORMAÇÃO: aquisição de material genético externo.
Células competentes são células permeáveis ao DNA, capazes de o adquirir do meio

externo (ambiente). Para tornar uma célula competente, podemos submete-la a
temperaturas elevadas ou adicionando CaCl 2 (provoca um choque térmico). Podemos
também bombardear a célula com o DNA, provocando um choque elétrico
(eletroporação) ou utilizar uma “Gene Gun” para introduzir um plasmídeo à força.
24
BIBLIOTECA GENÓMICA: conjunto aleatório de fragmentos de DNA, a partir de um

organismo clonado num vetor, i.e., conjunto de clones que representam a totalidade
do genoma de um determinado organismo. Cada célula contém um fragmento do
“todo”, também podendo ter intrões e outros genes não expressos.
BIBLIOTECA DO cDNA: conjunto de clones representativos de todo o cDNA, derivado
do mRNA, de um conjunto de células num ponto de desenvolvimento.
CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA GENÓMICA FUNCIONAL:

Temos um número N de plasmídeos totais, cada um com um fragmento. Só podemos
estar interessados numa proteína de cada vez (apenas um clone) e utilizamos por isso
uma sonda.
Uma sonda é um oligonucleótido sintético (tal como um primer) que corta a sequência
complementar daquilo que queremos encontrar. É necessário inserir fosfato radioativo
na sonda para esta se tornar detetável. A enzima alcalino fosfatas e remove estes
fosfatos radioativos.
Sabendo qual a proteína que queremos, podemos desenhar a sonda.
Os operões podem englobar mais do que um gene, se estes forem relacionados/
dependentes. As RNAses existem em todo o lado e tornam difícil trabalhar com RNA.
O mRNA existe para ser traduzido e depois disso é eliminado (altamente digerido), não
dando para o preservar durante muito tempo. É necessário ainda eliminar o rRNA e o
tRNA, de modo a isolar apenas o mRNA.
25
Como o mRNA processado tem informação codificante para um polipéptido, tem

interesse passar de mRNA para um cDNA, de modo a guardar na biblioteca. Os genes
eucariotas são grandes devido à presença de muitas zonas não codificantes.
SÍNTESE DE cDNA A PARTIR DE mRNA: o cDNA é a cópia do mRNA em DNA, e é

necessário fazer o cDNA para clonar o RNA mensageiro. O cDNA mede a expressão e
não o potencial. Quando é digerido, após a transcrição, perdemos o mRNA (daí ser
necessário protegê-lo).
Ao nível do terminal 5’, colocamos uma cauda de poli-adeninas que servem para
ancorar primers em que se possa iniciar a síntese. Duplicando essa cadeia com a
transcriptase reversa, podemos fazer PCR.
Antes de tudo isto, os microorganismos são tratados com DNAse e fenol para degradar
o DNA e as proteínas (isolamos o mRNA).
Para plaquear as bibliotecas de plasmídeos (isolamento de clones positivos), utilizamos
meios com antibiótico. As bibliotecas de fagos são incubadas com E. coli e só depois
são plaqueadas em soft agar para o crescimento viral.
Uma vez plaqueada em agár, filtros de nitrocelulose ou membranas de nylon são
colocadas sobre a superfície das placas da biblioteca. As placas/colónias são
“levantadas” juntamente com o filtro ou membrana. As bactérias são depois abertas
para libertarem o seu conteúdo, utilizando detergentes (SDS) e proteases.
As células são aquecidas ou sujeitas a luz UV, e o DNA é desnaturado com base (meio
alcalino) e ligado à membrana por ligações firmes.
ELETROFORESE: consiste na separação de partículas carregadas por ação de um campo

elétrico uniforme. As partículas (fragmentos de DNA) são separadas por carga e por
peso molecular, utilizando geralmente um gel de agarose (preparação horizontal) ou
26
um gel de poliacrilamida (preparação vertical). Este gel apenas permite a separação de

acordo com o peso molecular. Como o DNA tem carga total negativa (grupos fosfato),
tende a dirigir-se para o polo positivo quando é sujeito a um campo elétrico.
Após preparado o gel, carrega-se com a amostra e realiza-se a eletroforese. No final,
utiliza-se uma coloração para as bandas serem visíveis.
Utiliza-se um campo elétrico de 150 volts, apenas para vermos o DNA. No máximo,
utilizamos um campo de 100 volts para separar partículas, em eletroforese.
A coloração das moléculas pode ser feita com:

-Brometo de Etídeo: agente intercalante do DNA que fixa as cadeias (ainda
podemos, no entanto, reutilizar os fragmentos se os tirarmos do gel). É cancerígeno e
fluorescente a luz UV, muito utilizado em gel de agarose.
-Prata: utilizada em gel SDS-PAGE (poliacrilamida). Tem melhor resolução por
ser extremamente sensível. É muito utilizado na coloração de proteínas.
-Coomassie Blue: liga-se a todas as proteínas e, a partir da intensidade de cor
(Absorvância), é possível relacionar com a quantidade de células.
GEL DE AGAROSE: Tem relativamente pouca precisão, sensibilidade e resolução. Não é

um método automático e tem uma curta faixa dinâmica. Os resultados não são
numéricos e o Brometo de Etídio não é muito útil, quantitativamente.
Utilizando uma curva normalizada baseada em quantidades conhecidas de DNA alvo, é
possível medir com exatidão a quantidade de DNA produzido em PCR (varia com o
número de ciclos).
O DNA total de um organismo, ou o RNA, são misturas. As técnicas de Southern Blot
(para o DNA) e de Northern Blot (para o RNA) permitem identificar sequências
específicas na mistura. Blot (de Blotting) refere-se a transferência por capilaridade.
Contudo, é utilizado também um campo elétrico nestas técnicas.
-SOUTHERN BLOTTING: deteta sequências específicas em misturas complexas
de DNA, utilizando uma sonda de DNA. Tandem Repeat é uma sequência com um
determinado número de repetições e é característico de cada organismo. Tem sido
utilizada para detetar RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e VNTR
(Variable Number of Tandem Repeat Polymorphism). São técnicas de tipagem.
VNTR é um indicativo e o filtro deve ter pelo menos um grupo VNTR do pai. Podemos
avaliar diretamente a sequência local da sonda (caso a sonda seja complementar) ou
por sondas radioativas. O DNA é desnaturado inicialmente com uma solução alcalina.
27
Os fragmentos provenientes da eletroforese são desnaturados com solução alcalina e

transferidos para um filtro de nitrocelulose ou para uma membrana de Nylon por
Blotting. O filtro é incubado com uma sonda (32P-probe) que hibridiza com o
fragmento, podendo essa hibridização ser detetada por autoradiografia.
-NORTHERN BLOTTING: tem como objetivo saber o que está a ser expresso
num determinado momento, dentro da célula. É utilizada para detetar fragmentos de
RNA e não DNA. Estes fragmentos de RNA são tratados com formaldeído para lhes
garantir uma conformação linear.
Esta técnica estuda o perfil de expressão do mRNA quando este está presente numa
dada amostra. É uma das formas mais simples de determinar em que altura um
determinado gene está a ser expresso in vivo.
Neste processo, o RNA é separado por eletroforese em gel, transferido para uma
membrana e detetado de modo similar ao DNA numa Southern Blot. A diferença está
na sonda que, neste caso, é de RNA.
28
-WESTERN BLOTTING: rege-se pelo mesmo princípio mas aplica-se a proteínas.

Estas são separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de um
detergente dodecilsulfato de sódio (SDS: remove ligações de dissulfeto e separa os
diferentes polipéptidos). Esta técnica também se chama de immunoblotting e é
utilizada a transferência elétrica e não a capilaridade. Coloca-se o substrato para a
enzima ligado à zona c específica de um anticorpo. As proteínas são marcadas com um
aminoácido 35S-sonda.
SEQUENCIAÇÃO (MÉTODO DE SANGER):

Refere-se à sequenciação de genes através da síntese de DNA in vitro com término por
ddNTPs. Requer:
-DNA molde;
-DNA polimerase;
-tampão e Mg 2+;
-um primer;
-dNTPs e ddNTPs.
ddNTPS (didesoxirribonucleótidos) não possuem um grupo -OH no carbono 3,
indispensável para a ligação do nucleótido seguinte. Após a ligação de um ddNTP, a
polimerização termina e o segmento está pronto (obtemos vários segmentos, de
diferentes tamanhos).
Quanto maior a quantidade relativa de ddNTPs, mais fragmentos haverá, e de menor
tamanho.
Posso ter 4 tipos de ddNTP: ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP (um para cada base de
nucleótido). Se cada um dos tipos de ddNTP tiver um marcador diferente, efetuando
uma eletroforese capilar torna-se possível saber qual o nucleótido terminal de um
fragmento (vendo a cor da sonda). Fazendo isto para cada fragmento e ordenando-os
por tamanho, sei toda a sequência nucleotídica de um gene.
São produzidos vários fragmentos, cujo tamanho é medido por eletroforese. A última
base é conhecida, pois sabemos o ddNTP que foi usado (sondas de cor diferentes).
29
REAL TIME PCR: Baseia-se no uso e deteção de um oligonucleótido fluorescente. A

quantidade de fluorescência é proporcional à quantidade de produto de PCR após cada
ciclo. Esta técnica permite a quantificação em tempo real do material genético, pois
usa corantes que permitem detetar quantas cadeias duplas estão a ser formadas. Esta
quantificação tem a ver com a quantidade de fluorescência da nossa amostra. O
número de cadeias duplas aumenta exponencialmente, sendo que no início não são
possíveis de detetar (há um limite de deteção).
O PCR pode ser visto em tempo real, permitindo a visualização do crescimento da
quantidade do material genético no tubo. Depende da Taq polimeras e e da quantidade
de material genético dentro do tubo. O tipo de Taq utilizada é importante pois tem de
ser capaz de remover a sonda e ter atividade exonuclease no sentido 5’ – 3’.
À medida que copia, introduz uma molécula fluorescente que permite ver o material
genético copiado, em cadeia dupla.
A sonda tem de ter uma molécula dos dois lados:
-Molécula F: fluoresce;
-Molécula Q: interfere com a fluorescência até se separar da molécula F.
À medida que o número de ciclos de PCR aumenta, haverá um aumento da quantidade
de sonda livre. Contudo, a sua deteção só é permitida após algum tempo. Quanto
menos DNA tiver a amostra, maior o número de ciclos necessários para haver deteção.
A fluorescência depende da energia de emissão e da energia de ativação. O composto
irá emitir em diferentes comprimentos de onde e podemos receber a informação a
diferentes comprimentos de onda.
30
RT-PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE PCR): Mede a capacidade de passarmos de RNA

para cDNA. Esta técnica não utiliza o DNA de cadeia dupla como molde, mas sim o RNA
de cadeia simples. A partir deste RNA, a enzima transcriptase reversa sintetiza uma
cadeia de DNA complementar (cDNA) e é ao cDNA que se aplica PCR.
A técnica de RT-PCR é amplamente utilizada para verificar a expressão génica, uma vez
que analisa o RNA responsável pela síntese proteica. Se há uma proteína específica, é
porque há DNA a ser expresso, dando mRNA.
As sondas utilizadas podem ser:

-TaqMan
-TaqMan MGB
-Three Star (ARMS)
-Molecular beacons
-AmpliDet RNA
-Sondas adjacentes/ sondas HYB
-DOL
-Scorpions
-DNA invader
MICROARRAYS: permite uma análise do genoma na sua totalidade, sendo algo caro.
Avalia a expressão de genes em resposta a modificações ambientais (mudanças na
expressão de genes), medindo o estado dinâmico da célula ou organismo.
Identifica os genes que são expressos de modo diferente, sob condições específicas.
É uma técnica recente e muito automatizada, em que recebemos muitos dados e em
que a dificuldade está em conseguir avaliar quais os genes expresso num dado
momento.
Corta-se o genoma e organizam-se os fragmentos, colocando-os no microarray. O
mRNA é complementar ao nosso gene sonda.
31
Componentes:
-matriz com milhares de sequências de ácidos nucleicos arranjados num
pequeno chip;
-uma ou mais sondas marcadas que se hibridizam com a matriz;
-sistema de deteção, que quantifica o sinal de hibridização;
-sonda que selecionamos para hibridizar com o gene.
Os fragmentos, ao serem colocados no array, vão ligar-se a alvos complementares lá

contidos e, ao ligarem-se, são detetados os genes expressos. O mRNA de controlo e o
mRNA experimental são ambos convertidos em cDNA (por ação de transcriptase
reversa), e hibridizados com uma sonda fluorescente:
cDNA de controlo: vermelho fluorescente
cDNA experimental: verde fluorescente
Atendendo à relação da cor verde/ vermelha, um gene estará mais ou menos expresso
na célula experimental do que no controlo.
POLIMORFISMOS: variações na sequência de DNA entre indivíduos da mesma espécie.

Se a variação ocorrer nos locais de restrição, pode gerar RFLP (polimorfismo de
comprimento de fragmentos de restrição). Um exemplo de um caso de RFLP é a
mutação do gene da β-Globina, que provoca a anemia falciforme.
32
PARTE 2: SEGUNDA FREQUÊNCIA
COMPLEXIDADE DO GENOMA:
O genoma é composto por todo o conjunto de genes que compõe um dado indivíduo,
sendo idêntico em todas as células desse indivíduo. O genoma pode, então, ser
formado por:
-DNA (na esmagadora maioria dos casos)
-RNA (em alguns vírus)
O genoma é constituído por vários elementos, tais como cromossomas (lineares e/ou
circulares) e elementos extra-cromossomais (plasmídeos, DNA de organelos, pequenos
cromossomas)
Como são necessários mais genes para dirigir a formação e manutenção de organismos
mais complexos, comparando com procariotas, podemos relacionar o tamanho do
genoma com a complexidade do organismo.
O genoma da E. coli é composto quase
exclusivamente por genes codificantes (1
gene = 1 proteína). Quase todo o seu
genoma codifica proteínas ou RNAs
estruturais (rRNA). Os seus genes não
codificantes servem para a regulação da
transcrição dos restantes genes.
Em eucariotas, por outro lado, a
densidade de genes (número de genes
por Mb de DNA) é menor e tende a
diminuir com o aumento da complexidade do organismo. Este excesso de DNA não
codificante deve-se ao maior tamanho dos genes e das sequências intergénicas
(intrões).
Os intrões são removidos num processo denominado splicing. Cada gene é composto
por intrões e exões, sendo que apenas os exões são codificantes. Os intrões
possibilitam a diversidade que se verifica nos mRNAs, no processamento, visto que a
remoção de certos intrões impede/promove a remoção de outros exões, bem como o
seu reordenamento.
O surgimento de novos genes dá-se devido à duplicação, em que ocorre recombinação
cromossómica e reorganização de exões, e a transferência horizontal de genes.
Duplicação génica: gera homólogos dentro do mesmo genoma, sendo que com o
tempo, os homólogos assumem funções especializadas.
33
Pan genoma: fração do genoma que pode sofrer grande
genoma
variação, em conteúdo, em indivíduos próximos.
Cos genoma: fra çã o do genoma que s e mantém conservada
entre i ndivíduos próximos
O genoma de procariotas e eucariotas inferiores é compacto, o que se reflete numa

estratégia de crescimento rápido, tendo pouca redundância. Como são organismos
pequenos, têm de ser eficientes.
O genoma dos eucariotas superiores é redundante e pouco compacto. As plantas,
especialmente, são altamente redundantes por servirem de nicho ecológico a muitos
microorganismos, ganhando muito material genético por transferência horizontal
(material esse que as plantas não utilizam).
PROPORÇÃO: TAMANHO DO GENOMA VS Nº DE GENES:

Em procariotas e vírus, podemos determinar a complexidade do genoma através da
velocidade de hibridização, obtendo uma curva sigmóide.
MS-2 (vírus): genoma com 4000 bp

T4 (vírus): genoma com 180000 bp
E. coli (bactéria): genoma com 4500000 bp
As arqueias estão relacionadas com nichos
ecológicos primitivos, tendo um genoma
muito reduzido com um número elevado de
genes codificantes.
Em eucariotas, a baixa compactação e o
excesso de DNA não codificante resulta
num aparente paradoxo. A relação
complexidade – tamanho não é co-linear,
não havendo uma relação direta entre os
dois.
Existe um tamanho mínimo que o genoma tem de ter para que o organismo possa
pertencer a um determinado filo.
PARADOXO DO VALOR C:
A técnica para determinar a complexidade de qualquer genoma envolve a
desnaturação e renaturação do DNA. O DNA é desnaturado por aquecimento,
quebrando as pontes de hidrogénio e formando duas cadeias simples. Se o DNA for
arrefecido rapidamente, permanece em cadeias simples.
Se o arrefecimento for lento, contudo, sequências complementares das duas cadeias
encontrar-se-ão e ligam-se. A taxa à qual acontece este reanelamento é uma função da
espécie de onde se retirou o DNA.
34
Uma curva C ot revela a percentagem de DNA que permanece em cadeia simples

(através de uma razão da concentração de DNA em cadeia simples para a
concentração total de DNA), em função do logaritmo do produto da concentração
inicial de DNA, multiplicado pelo tempo que a reação demora.
No ponto C0t 1/2, metade do DNA está renaturado.
A renaturação é uma reação de 2ª ordem que depende da colisão de fitas

complementares, e pode ser descrita por uma equação de cinética de 2º ordem:
𝑑𝐶
= −𝑘𝑐 2
𝑑𝑡
Em que c é a concentração de DNA de cadeia simples num tempo t genérico, e k é a
constante de reassociação das cadeias simples de DNA.
A velocidade de reassociação é uma característica do DNA da espécie. Tem-se que:
C 0: concentração de cadeias únicas, em t=0
C : concentração de cadeias únicas, em t=t
C 0t: determinado pela capacidade de hibridização do genoma
1
𝐶0 𝑡1 =
2 𝑘
Para a E. coli, 𝐶0 𝑡1 = 4.2 x106 pb
2
Em eucariotas superiores, a curva tem um aspeto diferente:
Nos humanos, o genoma não e

linear, sendo que existem 3 ti pos
de sequências que fazem parte
do genoma/ estrutura do DNA
eucariota (3 pontos de
reassociação.
35
1) Sequências curtas, muito repetitivas: taxas de reassociação muito rápidas

(último degrau do gráfico)
2) Sequências intermédias, mediamente repetitivas: permitem processos
evolutivos (degrau do meio)
3) Sequências pouco repetitivas: primeiro degrau.
No processo evolutivo, o número de sequências repetitivas difere de organismo em
organismo.
O paradoxo dos eucariotas superiores resolve-se se considerarmos a existência de

vários componentes. À medida que evoluímos, a quantidade de genes repetidos
aumenta.
Os mycoplasma contêm o genoma mais pequeno dos procariotas.
Certos organismos parasitas perdem parte do seu genoma (desnecessário), diminuindo
a sua complexidade até ao mínimo absoluto para garantir a sua sobrevivência.
O tamanho do genoma de anfíbios deve-se ao facto de habitarem dois ambientes
distintos, tendo uma relação muito próxima com a película microbiana (transferência
de material genético).
A componente repetitiva do genoma pode ser dividida em duas:

-componente de média repetibilidade (rRNA - genes de RNA ribossomal são
mediamente repetitivos no genoma devido à sua importância na tradução; elementos
móveis, transponíveis, retrotransponiveis, ERVs, etc.)
-componente de alta repetibilidade (satélites e microssatélites – são elementos de
extrema variabilidade, associados com a arquitetura cromossomal. Por serem muito
repetidos, confundem a maquinaria de replicação. Estes elementos encontram-se no
meio do genoma)
snRNA genes: controlam a remoção de intrões (moderadamente repetitivos por

codificarem moléculas essenciais ao trabalho celular e com funções genómicas).
36
ELEMENTOS MÓVEIS:
-DNA TRANSPOSÕES
-RETROTRANSPOSÕES
-SEQUÊNCIAS DE INSERÇÃO (curtas, não codificam nada além da transposase)
-PLASMÍDEOS
-BACTERIÓFAGOS
-INTRÕES DO GRUPO I E II
Gene de transposase Gene estrutural
Inverted repeats
Inverted Ins. Sequence
TRANSPOSÕES: não se conhece bem a sua função, mas sabe-se que são importantes.
Codificam a transposase, ladeada por sequências de inserção. Os complexos podem
codificar outras proteínas/ resistências. Ex: dn5 e dn3 (utilizados para mutagénese em
biologia molecular).
RETROTRANSPOSÕES: entram na célula como RNA, passando a DNA com auxílio da
enzima transcriptase reversa e posteriormente incorporados no genoma da célula. Os
vírus em lisogenia possuem elementos Ty mas carecem dos genes env (envelope), o
que não lhes permite formar novos vírus.
O genoma humano contém um importante número de retrovírus endógenos (HERVs:
8%), que são sequências derivadas de infeções retrovirais. Um genoma de retrovírus
impede que sejamos ovíparos, por se ter colocado no meio do gene que nos fazia por
ovos.
Exões são apenas 1% do nosso genoma.
SINTENIA: estudo das posições relativas de cada gene, dentro do genoma. Sequências
repetidas atuam como marcadores genéticos.
As repetições confundem a maquinaria da replicação e acrescentam ainda mais bases

(sem consequência funcional – RFLP).
O que dá tamanho ao genoma é a sua organização.
Famílias multigénicas (ramificação e um gene “pai”) podem ser simples (rRNA: várias
cópias em tandem) ou complexas.
CÓDIGO GENÉTICO:
O mRNA é sintetizado no núcleo, em cadeia simples. Esta cadeia é muito instável e
auto-complementa-se para estabilizar. Os mRNAs são moléculas pequenas.
Crick propôs que os tripletos eram matematicamente consistentes com os 20
aminoácidos que se encontram na natureza, e que não haveria sobreposição nem
espaço entre os codões, sendo que todo o DNA codificava alguma coisa. Haveria ainda
37
uma molécula adaptadora que passava a informação do DNA para proteínas. Caso
ocorresse modificação de um nucleótido no sistema, nada alteraria na sequência de
aminoácidos.
2 nucleótidos: 42=16 (insuficiente)
3 nucleótidos (codão): 43=64 (suficiente)
OPEN READING FRAMES (ORFs): sequências que codificam algum peptídeo, em que
não há um codão STOP ao fim de 50 nucleótidos. Em zonas não codificantes, o codão
STOP repete-se mais vezes (de 20 em 20 codões).
O DNA contém o código em tripletos. Ao ser transcrito, o mRNA é composto por
codões complementares ao tripleto do DNA. O tRNA, por sua vez, contém um
anticodão complementar ao codão.
O código genético é:
-universal (em todos os seres vivos);
-contínuo (sem vírgulas);
-degenerado (vários codões codificam o mesmo aminoácido: AUU, AUC, AUA
codificam a isoleucina)
-não sobreponível, podendo ocorrer modificação com a adição/remoção de
nucleótidos que geram novos codões (exceto no sarcoma de Rous (SRV): oncovírus que
provoca sarcomas, i.e. modificações no tecido conjuntivo, em galinhas);
-não ambíguo (nenhum codão codifica mais do que um aminoácido);
Na codificação, a terceira base é menos rígida, gerando a degeneração do código. São
utilizados codões específicos de iniciação (AUG: metionina) e terminação (UAG, UAA,
UGA) da transcrição. Existem 61 codões codificantes.
NOTA: as diferenças no código genético são sobretudo na terceira base, sendo que
esta pode ser variável. Se o último nucleótido não emparelhar, mantemos a
informação.
As mitocôndrias de diferentes organismo utilizam um código genético muito diferente
de organismo em organismo.
O tripanossoma (protozoário que infeta outros seres vivos) modifica o mRNA ao
introduzir uma base, provocando a malária.
HOMOPOLÍMEROS de mRNA SINTÉTICO:

Em 1957 descobriu-se o polinucleotídeo-fosforilase, que é uma enzima que
cataliza, in vitro, a síntese de RNA sem a necessidade de moldes de DNA ou RNA,
podendo sintetizar RNA com apenas um tipo de nucleótido:
Poli-(A): homopolímero de lisina
Poli-(U): homopolímero de fenilalanina
Poli-(C): homopolímero de prolina
Poli-(G): homopolímero de Glicina
38
ESTRUTURA DO tRNA:
O tRNA é a molécula responsável por transferir a informação do mRNA para uma
proteína. É uma cadeia única com quatro zonas complementares, formando quatro
alças (loops).
A molécula de tRNA possui um terminal 3’ e
um terminal 5’ comum a todos os tRNAs, bem
como outros nucleótidos que estão sempre na
mesma posição, i.e, são conservados para
terem sempre a mesma função.
A estrutura bidimensional em folha não
mostra muito bem a sua forma tridimensional.
A sequência CCA na extremidade 3’ é
universal. A ligação de um aminoácido à
adenina 3’ do tRNA gera um aminoacil-tRNA.
Alguns resíduos de A, C, G e U são modificados na maioria dos tRNAs:

Di-hidrouridina Ribotimidina (T), Pseudouridina
(D), quase quase sempre (ψ), quase
sempre presente presente na alça sempre presente
na alça D TψCG na alça TψCG
Crick propôs a hipótese de Wobble, que representa a diferença entre o número de

codões possíveis e o número de tRNAs que existem. Ele postulou que o nucleótido 5’,
que se liga ao 3’ do mRNA (3ª base), não era espacialmente confinado com as outras
duas bases, podendo haver vários padrões de emparelhamento.
A terceira base não necessita de
emparelhar completamente, podendo
tolerar mais do que uma base. A
guanina tolera o uracilo e a citocina,
por serem ambos piramidinas (um só
anel).
39
INOSINA: vários tRNAs de plantas e animais contêm a

inosina (I) na posição wobble do anticodão, um produto
desaminado da adenina.
Este nucleótido modificado tem capacidade de formar

ligações com várias bases, não sendo específica para uma
só base (A, C e U).
Um tRNA com inosina na posição wobble pode
reconhecer os codões de mRNA com A, C e U na terceira
posição.
O código genético não é universal. Genes mitocondriais
(em humanos) utilizam um código genético diferente:
UGA (terminação) codifica o triptofano; AUA (isoleucina)
codifica a metionina.
Código genético mitocondrial Código genético do resto
40
1. TRANSCRIÇÃO
Síntese de RNA a partir de DNA, realizada por um complexo enzimático cuja enzima chave é a RNA
polimerase. Esta enzima é composta por várias subunidades e realiza a polimerização do RNA a
partir de um molde de DNA.
O processo de transcrição depende de fatores de transcrição e da RNA polimerase.
Diferentes RNAs da célula:

-RNA mensageiro (mRNA): é altamente funcional. Transporta a informação
genética, transcrita a partir do DNA, sob a forma de uma série de sequências de 3
nucleótidos – designados codões – cada uma específica de um aminoácido particular.
Tem poucas estruturas tridimensionais: é de cadeia única, portanto é facilmente
degradado e necessita de ser protegido. É o responsável pela informação transferida
entre o DNA e o RNA. Nos procariotas, essa transferência de informação é feita num
único compartimento, enquanto que nos eucariotas são necessários dois
compartimentos. É sintetizado no núcleo, antes de migrar para o citoplasma.
-RNA de transferência (tRNA): é a chave para decifrar os codões no mRNA,
lendo um mRNA já processado (isento de intrões). Cada tipo de aminoácido tem o seu
próprio subconjunto de tRNAs que se ligam ao aminoácido e o transportam até à
extremidade em crescimento da cadeia polipeptídica (se o codão seguinte assim o
exigir). O tRNA correto ligado ao seu aminoácido é selecionado em cada passo, já que
cada tRNA contém um anticodão específico que pode emparelhar com o codão do
mRNA, por complementaridade.
-RNA ribossómico (rRNA): associa-se a um conjunto de proteínas para formar
estruturas complexas designadas de ribossomas. Estas estruturas, que se movem
fisicamente ao longo do mRNA, catalizam a montagem de cadeias polipeptídicas a
partir de aminoácidos. Também se ligam a tRNAs e a várias proteínas acessórias
necessárias à síntese proteica. Os ribossomas são compostos por uma subunidade
grande e outra pequena, em que cada uma contém as suas moléculas de rRNA.
O mRNA é uma molécula de cadeia única, idêntica à cadeia codificante positiva (+) do
DNA. A cadeia molde do DNA é copiada pela adição direta de nucleótidos.
O mRNA é processado para dar origem a um mRNA maduro (que é posteriormente
traduzido a proteína).
41
RNA POLIMERASE:
Cataliza a síntese do mRNA, no sentido 5’ → 3’. Não tem atividade proofreading
e necessita de uma zona do DNA que a posicione corretamente, de modo a que
“saiba” onde é suposto iniciar o processo de transcrição (promotor), e não de um
primer, sendo que consegue iniciar a transcrição imediatamente. É estruturalmente
diferente em eucariotas e em procariotas.
Tem de incluir o DNA no seu local ativo, de modo a abrir a cadeia para a
transcrever. Pode ser ativada ou suprimida.
O tamanho do RNA define o tamanho do gene. O tamanho da proteína define o

tamanho da região codificante do gene.
RIFAMICINA: antibiótico que inibe a RNA polimerase em

bactérias. Só funciona se o processo de transcrição for diferente
em eucariotas e em procariotas, ao nível da polimerase.
PROMOTORES:
Sequências específicas de DNA importantes para o início da transcrição. Tais
sequências são reconhecidas por alguns fatores de transcrição (proteínas específicas)
que recrutam a RNA polimerase para realizar a montagem do mRNA. Os promotores
determinam:
-a direção da síntese (cadeia codificante vs cadeia molde);
-o local de iniciação, ou seja, o primeiro nucleótido da nova cadeia de mRNA;
-a frequência de transcrição (iniciação pela RNA polimerase).
A sequência do promotor está apenas numa das cadeias do DNA (molde).

Podemos ter promotores regulados quando estes se encontram acoplados a proteínas,
em que é necessário modelar essa proteína.
O processo de iniciação e reconhecimento do promotor é comum em
procariotas e em eucariotas, em que ambos possuem zonas de reconhecimento da
RNA polimerase.
Um promotor é tanto mais forte quanto mais se assemelhar às sequências
consenso. A afinidade elevada entre a RNA polimerase e o promotor faz com que se
liguem mesmo sem ocorrer indução (pode provocar a produção descontrolada de
proteínas = desvantagem). Ex: RecA, proteína envolvida na reparação de DNA, é um
promotor forte.
42
PROMOTORES PROCARIÓTICOS: obrigam a RNA polimerase a posicionar-se no local

correto e determinam o número de genes a ser transcritos. Atribuindo o valor +1 ao
primeiro nucleótido a ser transcrito, temos regiões presentes na maioria dos
promotores procarióticos nas posições downstream -35 (-35 Box) e -10 (TATA Box). As
sequências de poliadenina são fáceis de abrir, aparecendo frequentemente em
promotores.
A comparação de milhares de promotores permitiu detetar sequências consenso para

cada box:
Box Sequência Consenso
-10 TATATT
-35 TTGACA
Como já foi referido, desvios das sequências consenso enfraquecem a ligação do

promotor à polimerase, diminuindo a afinidade.
Existe ainda o “elemento up”, localizado nas posições -60 a -40, que estimula a
transcrição até 30 vezes mais (Rico em adeninas e timinas, com sequência consenso:
AAAATTTTTTTTCAAAAGTA).
MAQUINARIA DE TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTAS:

O processo de transcrição dá-se em simultâneo ao de tradução, devido à falta
de compartimentalização do material genético. A RNA polimerase tem várias
subunidades codificadas pelos genes RPO, em que um destes codifica a subunidade
sigma (σ). Esta subunidade é fundamental ao posicionamento da RNA polimerase no
promotor, mas tem de ser removida da polimerase para que esta se consiga deslocar
ao longo da cadeia codificante, ou seja, essa subunidade não está presente no
processo de transcrição.
Na E.coli temos 5 tipos diferentes de subunidades, codificados por 5 genes diferentes:
Gene rpoA – codifica a subunidade α (existem duas subunidades α que se ligam a

sequências reguladoras, participando na iniciação)
Gene rpoB – codifica a subunidade β (participa na iniciação e alongamento; forma
ligações fosfodiéster)
Gene rpoC – codifica a subunidade β’ (liga-se ao molde de DNA)
Gene rpoD – codifica a subunidade σ (reconhece o promotor e inicia a síntese)
Gene rpo? – codifica a subunidade ω (papel desconhecido mas envolvido na
montagem da holoenzima)
43
RNA POLIMERASE II
A RNA polimerase interage com proteínas reguladoras (ativadores e repressores) que

modulam a taxa de expressão génica em diferentes células.
FATOR σ : fator de transcrição (determina a transcrição do gene). A subunidade σ da

RNA polimerase dos procariotas é fundamental para o reconhecimento específico da
região promotora, pois ancora a RNA polimerase ao promotor.
Ela, juntamente com o cerne da enzima, desliza ao longo do DNA à procura do
promotor, não precisando de desenrolar a dupla hélice nem de se ligar e desligar
intermitentemente. Se soubermos, geneticamente, se o fator σ é igual ou diferente em
dois casos, podemos comparar zonas de transcrição. Existem pequenas diferenças nas
sequências do fator σ, por isso elas reagem de modo diferente a estímulos ambientais.
Se mudarmos o fator, o gene deixa de ser transcrito. O fator σ, ao desligar-se,
permite o deslizamento da enzima sobre o DNA e o mRNA é assim produzido, sendo
logo localizado por ribossomas que o traduzem no sentido 5’→ 3’.
TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTAS:
Em eucariotas, o processo é bem mais complexo. A maioria do seu DNA está no
núcleo, sendo que é aí mesmo que ocorre a fase de transcrição. A informação contida
no DNA passa então para o citoplasma na forma de mRNA (molécula de menores
dimensões, mais fácil de passar pelos poros), possibilitando a síntese proteica na fase
de tradução.
A separação temporal e espacial entre os processos de transcrição e tradução,
em eucariotas, permite uma melhor regulação da expressão génica. O transcrito
44
primário de mRNA é amplamente processado, sofrendo uma série de alterações,

escalonadas abaixo:
-aquisição de revestimento (cap) na extremidade 5’ do mRNA;
-introdução de uma cauda de poli-A (poliadenilação) na extremidade 3’ do
mRNA;
-remoção exata de intrões (splicing) para formação de mRNAs maduros com
mensagens contínuas e 100% codificantes.
Dito isto, ocorrem então 3 fases no processo de transcrição:
1. Iniciação: A polimerase, ligada ao promotor, inicia o processo de transcrição ao

adicional os primeiros 9 nucleótidos da sequência de mRNA. As sequências de
nucleótidos são determinadas pela complementaridade no emparelhamento
das bases dos ribonucleótidos com as bases da cadeia de DNA molde. Cada
nucleótido acrescentado à cadeia ribonucleotídica liga-se covalentemente ao
último ribonucleótido da cadeia de mRNA.
2. Elongação: Após a produção e união de aproximadamente 9 nucleótidos, a RNA

polimerase desloca-se pela molécula de DNA, desenrolando a sua hélice e
produzindo uma molécula de mRNA cada vez mais elongada. O DNA já
transcrito volta a ser enrolado, quase imediatamente, recompondo a dupla
hélice. Durante esta fase, o mRNA recém sintetizado emparelha-se
temporariamente com a cadeia molde de DNA, formando um híbrido DNA-
RNA. O grupo hidroxilo 3’ do RNA desta hélice ataca o fosfato de um
ribonucleótido trifosfato, libertando o pirofosfato. Em cada nucleótido
adicionado, o híbrido DNA-RNA gira sobre si mesmo, fazendo com que a ponta
3’-OH do mRNA fique no centro catalítico da RNA polimerase. É importante
notar que o pequeno comprimento do híbrido também tem razão de ser: como
o filamento de mRNA fica bem inclinado para fora da cadeia molde de DNA,
antes de completar uma volta inteira, evita-se o entrelaçamento da ponta 5’ do
RNA com o DNA. A fita de RNA produzida é simples e livre.
45
3. Terminação: Quando a RNA polimerase encontra a sequência de terminação, o

RNA para de ser transcrito. A partir daí, mais nenhum nucleótido é adicionado à
cadeia ribonucleotídica do mRNA. A bolha de transcrição desprende-se,
libertando uma molécula de mRNA e imediatamente esta se enrola
completamente (adquire a estrutura mais estável, por formação de ligações
covalentes ou interações fracas entre bases). O processo de terminus depende
de diferentes enzimas e e da presença do codão de terminação. Nos eucariotas,
envolve a poliadenilação e a clivagem da cadeia (processamento).
NOTA: A diferença no início da transcrição em eucariotas e procariotas encontra-se na

regulação da transcrição. Nos eucariotas, os genes reguladores encontram-se
dispersos pelo genoma.
Podemos ter a remoção/ libertação da RNA polimerase por formação de uma estrutura
tridimensional no mRNA (terminação intrínseca) ou através de enzimas (terminação
dependente da proteína Rho).
a) Formação de Grampos (terminação intrínseca): mecanismo pouco conhecido

em que temos pares A-T precedidos de uma sequência de DNA duplamente
simétrica.
b) Terminus dependente da proteína Rho: (terminações r-dependentes) não
possuem adenilatos na cadeia molde, mas possuem uma sequência curta que é
transcrita, formando um grampo. A RNA polimerase ao passar por essa região
faz uma pausa e, na presença da proteína Rho, dissocia-se. A proteína Rho tem
46
atividade DNA-RNA helicase e é dependente de ATP, o que é capaz de romper o

híbrido.
Tanto na classe r-depende como na classe r-independente, os sinais ativos para
o fim da transcrição estão no RNA recém sintetizado, e não no molde de DNA. In vitro,
os transcritos de RNA são mais longos (ausência de proteína Rho que deveria detetar
sinais adicionais do terminus). Esses sinais não são reconhecidos pela DNA polimerase.
FATORES DE TRANSCRIÇÃO: posicionam-se na zona promotora, onde depois se ligam à

RNA polimerase. Em eucariotas, estes fatores encontram-se em grande número e
funcionam em cascata (o complexo resultante do encaixe de um primeiro fator recruta
o segundo fator, e assim sucessivamente até se ligar a polimerase).
TRANSCRIPTION FACTOR FOR RNA POLYMERASE II (TFII):

TFIIA 3 subunidades Estabiliza a ligação TBP-TFIIB e “chama” a polimerase
TFIIB 1 subunidade Liga-se à TBP (TATA Binding Protein) , reconhece o início
de transcrição e recruta a RNA polimerase II
TFIID 12 subunidades Interage com fatores reguladores e reconhece a TATA
box, no promotor. Limita a taxa de transcrição em alguns
sistemas.
TFIIE 2 subunidades Recruta o TFIIH
TFIIF 2 subunidades Liga-se à RNA polimerase II e à TFIIB
TFIIH 9 subunidades Atividade helicase/ cinase CTD (C-terminal domain)
47
A subunidade do TFIID que reconhece a TATA

box é a TATA Box Binding Protein (TBP), sendo
que o fator TFIID é composto pela TBP e uma
série de TAPs (TBP associated factors). A
afinidade da TBP pela TATA box contribui para a
força do promotor. TBP liga-se a vários outros
polipeptídeos, como a inibidores. A TATA box
sinaliza o início da transcrição e o processo inicia
com a ligação da TFIID à TATA box. O TFIID liga o
TFIIA, o TFIIB e este último liga o TFIIF. Só aqui é
que a RNA polimerase II se vai ligar, e
posteriormente ocorre a ligação do TFIIE, que
recruta o TFIIH.
A ligação de TFIID provoca uma grande distorção

do DNA na zona do promotor que contém a TATA
box (posição -10).
ENHANCERS DE PROMOTORES (en):
Funcionam como acentuadores, ou seja, são sequências de DNA que elevam a
afinidade da maquinaria de transcrição por um certo promotor. Essas sequências
podem estar localizadas acima (upstream), abaixo (downstream) ou dentro do gene a
ser transcrito, e podem também estar distantes deste (até milhares de bp), em
qualquer uma das cadeias do DNA.
Relativamente a Maquinaria de transcrição, podemos ter três tipos de RNA

polimerase, de acordo com a sua estrutura e tipos de RNA que sintetiza. Assim:
RNA polimerase I: transcreve genes de rRNA 5.8S, 18S e 28S;

RNA polimerase II: transcreve genes de mRNAs e alguns genes de snRNAs (small
nuclear RNAs) e ncRNAs;
RNA polimerase III: transcreve genes de tRNAs, rRNA 5S, alguns snRNAs e outros RNAs
pequenos (tRNA, rRNA e ncRNA)
PRECESSAMENTO DO mRNA EUCARIÓTICO (MATURAÇÃO):

O mRNA é processado em eucariotas, sendo que é neste processo que ocorre a
remoção de intrões. Ao terminal 5’ vai ser adicionado um cap, e ao terminal 3’ vai
48
ocorrer uma clivagem seguida de poliadenilação (vai ocorrer a síntese de um

homopolímero de poli-(A)).
Processamento alternativo: não ocorre em todos os mRNAs. Refere-se ao splicing em
que, depois de removidos os intrões, os exões são desordenados ou removidos. É um
processo evolutivamente alternativo, sendo que não acontece ao acaso e gera
diversidade.
CAPPING do mRNA: tem como objetivo a proteção

do mRNA eucariótico e consiste na modificação do
terminal 5’ após transcrição dos primeiros 20-30
nucleótidos. Cap 5’ é uma estrutura típica de mRNA
eucariótico, a qual é gerada pela ligação entre a
extremidade 5’ de uma molécula de mRNA
precursora e um nucleótido alterado – a 7-
metilguanosina – através de uma ponte trifosfato.
A 7-metilguanosina tem a base modificada
(metilada). O processo de Capping consiste na
introdução da 7-metilguanosina no terceiro fosfato
do primeiro nucleótido, através de uma ligação 5’-5’
trifosfato. O Cap 5’:
-permite a regulação da exportação nuclear;
-previne a degradação por exonucleases;
-promove a tradução do mRNA;
-promove a excisão do intrão proximal 5’.
Este processo permite ainda o alinhamento do mRNA com o ribossoma, durante a
tradução, e distinguir o mRNA de outros RNAs da célula.
Também temos uma sequência rica em adeninas que identifica a zona de clivagem do
mRNA por enzimas de restrição: complexo de poliadenilação que reconhece e cliva o
mRNA (CPSF: cleaveage and polyadenylation specificity factor/ fator específico de
clivagem e poliadenilação; PAP: polyadenylate polymerase [sintetiza a cauda])
49
Poliadenilação do mRNA: a introdução de uma cauda

de poli-adeninas protege a molécula de mRNA de
degradação enzimática no citoplasma. A cauda de poli-
(A) auxilia na terminação da transcrição, move o mRNA
para o citoplasma e está ainda envolvida na tradução.
Em humanos, são colocados 200-300 adeninas na
extremidade 3’ do RNA mensageiro. Esta introdução
ocorre antes da libertação da RNA polimerase II.
A clivagem é catalisada pela enzima CPSF (fator
específico de clivagem e poliadenilação) e ocorre entre
10 a 30 nucleótidos a jusante do seu local de ligação. É
neste local que frequentemente encontramos a
sequência AAUAAA (Poli-(A) signal) que vai ser
reconhecida pela endonuclease.
Quando o mRNA é clivado, a poli-adenilação começa
(catalisada pela PAP – poliadenilato polimerase).
Este processo ocorre APENAS em eucariotas, pois é neles que há processamento.
ATIVADORES: proteínas que se ligam aos genes em locais conhecidos com

potenciadores, determinando os genes a ser transcritos e elevando a taxa de
transcrição dos mesmos.
REPRESSORES: proteínas que se ligam a conjuntos de genes em locais conhecidos
como silenciadores, retardando a transcrição ao interferir com os ativadores.
CO-ATIVADORES: moléculas “adaptadoras” que integram sinais ativadores e talvez
repressores, e repassam os sinais resultantes para fatores basais (auxiliam a RNA
polimerase II a aderir ao promotor).
FATORES DE TRANSCRIÇÃO BASAL: em resposta a ações inibitórias de ativadores,
estes fatores posicionam a RNA polimerase II no início da região codificante de um
gene, e enviam a enzima no seu caminho. Ex: Fatores TFII
SPLICING do mRNA: modificação do mRNA após a transcrição, em que os intrões são

removidos da cadeia e os exões são mantidos e unidos.
- Cis-splicing: dentro do mesmo mRNA
-splicing nuclear do pré-mRNA
-splicing de intrões do grupo I
-splicing de intrões do grupo II
- Trans-splicing: entre diferentes mRNAs
- mRNAs de tripanossomatídeos
- alguns mRNAs de nemátodos (animais
cilíndricos e alongados)
50
Intrões de grupo I e de grupo II diferem nos nucle ótidos envolvidos nas reações de ataque
nucleofílico que ocorrem no splicing. Nos intrões do grupo I trata-se de uma Guanina, ao passo que
nos intrões do grupo II se trata se uma Adenina.
REQUISITOS PARA O SPLICING NUCLEAR DO PRÉ-mRNA EUCARIÓTICO:

1. Sequências conservadas nas junções exão-intrão (Regra GT-AG): temos um
terminal 3’GT e um terminal 5’AG, sendo que estes terminais é que indicam que
estamos na presença de um intrão a remover. (terminal 5’GU e terminal 3’AG, e m
mRNA)
2. Sequência de ramificação do intrão (branch site/branch point): existe uma adenina

(intrões do tipo II), chamada de ponto de ramificação, situada 20-50 nucleótidos
antes do corte 3’.
3. Fatores proteicos e ribonucleoproteicos (snRNPs): ribonucleoproteínas são
proteínas ligadas à molécula de snRNA.
4. Spliceossoma: estrutura complexa formada por snRNPs com atividade catalítica,
responsável pela execução do splicing e pela remoção dos intrões.
REAÇÃO DE SPLICING:
Reação de transesterificação que não requer água nem energia, e que vai
ocorrer através de duas reações sequenciais:
a) Primeiro, o grupo 2’-OH do branch site/branch point específico (adenina, no
caso de intrões do tipo II) contido no intrão e definido aquando da
montagem do spliceossoma, realiza um ataque nucleofílico ao primeiro
nucleótido do intrão no terminal 5’ (5’ splice site), formando um
intermediário com alça.
b) Seguidamente, o terminal 3’-OH do exão do lado 5’ libertado desempenha

um ataque nucleofílico ao último nucleótido do intrão do lado 3’ (3’ splice
site), unindo os dois exões e libertando o intrão em alça.
Abaixo temos um exemplo de um mecanismo de remoção de um intrão de tipo II:
51
Além das sequências consenso nas extremidades 5’ e 3’ do intrão (GU e AG: motivos
prolongados com mais nucleótidos no meio), existem também:
- em leveduras, UACUAAC (invariavelmente)
- em eucariotas superiores são variáveis, Py80 N Py80 Py87 Pu75 A Py95
Para haver splicing, ocorre interação entre os
RNAs do complexo de spliceossoma e o mRNA. A
ligação dos snRNPs aos locais de splicing é feita
por emparelhamento de bases (Ex: U1 snRNA e U2
snRNA)
A montagem do spliceossoma ocorre em várias
etapas: os snRNPs entram numa ordem e saem na
ordem inversa. A remoção dos intrões é um processo enzimático complexo que não
garante que um exão 1 seja ligado necessariamente ao exão 2, podendo haver
desorganização/remoção de alguns exões.
MONTAGEM DO SPLICEOSSOMA: demasiado complexo e longo para se lidar ao

pormenor, portanto aqui está um resumo MUITO resumido.
52
A montagem tem início com a ligação do

snRNP U1 ao splice site 5’, seguido da
ligação do snRNP U2 ao branch site
(adenina). Um complexo U4-U6-U5 ligam-
se aos snRNPs U1 e U2, aproximando-os e
dobrando a molécula de mRNA,
aproximando o nucleófilo do eletrófilo e
facilitando o ataque nucleofílico.
Ocorre a saída dos snRNPs U1 e U4, após
o ataque nucleofílico, restando os snRNPs
U2, U5 e U6 na alça intermediária. Dá-se
o segundo ataque nucleofílico, e os
restantes snRNPs saem ligados à alça
intermediária.
Os exões unem-se.
O rearranjo dos exões pode ser direto ou alternativo, gerando mais do que um mRNA
maduro. O rearranjo dos diferentes componentes do spliceossoma tem como principal
função a formação do local ativo catalítico. É o RNA que executa as funções catalíticas ,
e não as proteínas (snRNPs atuam como ribozimas).
A coordenação da transcrição com o mecanismo de splicing é importante para não
ocorrerem erros (embora sejam importantes outras proteínas/fatores de splicing que
não sejam snRNPs nem auxiliem a montagem do spliceossoma ao recrutar snRNPs) e
identificar os locais corretos de splicing da sequência de pré-mRNA.
TRANSPORTE DE mRNA PARA O CITOPLASMA:

Os fatores de proteção protegem o mRNA maduro durante o seu transporte.
Estes são também fatores de iniciação do processo de tradução (Ex: hnRNP,
heterogeneous ribonucleoprotein particles, e mRNP, Messenger ribonuclear protein
complex).
Moléculas de mRNA formam mRNPs ao serem associadas a proteínas. A partir do
momento em que se inicia a transcrição, mRNA começa a ser associado com várias
proteínas: inicialmente com proteínas envolvidas no processo de capping, seguidas de
fatores de splicing e, por último, proteínas mediadoras de poli–(A). Algumas destas
53
proteínas são substituídas ao longo do processamento, mas outras (proteínas SR:

serine-arginine rich splicing regulators) não são. Além disso, outras proteínas também
se juntam ao mRNA, gerando o mRNP. Assim, a molécula de mRNA transporta uma
série de proteínas que o identificam como mRNA maduro e pronto para transporte.
Outros RNAs não têm estas proteínas e têm outras que bloqueiam o seu transporte.
A título de exemplo, os hnRNPs marcam intrões removidos para retenção e destruição
no núcleo. mRNAs maduros também contêm hnRNPs, mas que os marcam para
exportação (diferentes moléculas, mas do mesmo tipo). Outros fatores de exportação,
como a proteína TAP (heterodímero composto por 2 subunidades: NXF1 (grande) e
NXT1 (pequena)) ligam-se ao RNA e a outras proteínas do mRNP, como as proteínas
SR.
A exportação requer energia proveniente da hidrólise de GTP pela proteína GTPase
designada RAN (tem duas conformações, dependendo de ser GTP ou GDP ou de onde
é que ele vem – dentro ou fora do núcleo).
RNA DE INTERFERÊNCIA E SILENCIAMENTO DE mRNA:

O que os ativa (o seu trigger) são os dsRNA. Estes são processados em
pequenos RNAs com dois siRNAs (small interfering RNAs), em que o processo de
clivagem é levado a cabo pela Dicer (RNAse III). Parte do siRNA serve de molde para o
RISC (RNA-induced silencing complex) reconhecer e clivar o mRNA complementar, que
é rapidamente degradado.
Alguns genomas virais possuem dsRNA, o que poderá significar que a
maquinaria de iRNA poderia atuar como mecanismo de defesa anti-viral. RNAi também
bloqueia o movimento de transposões.
54
2. TRADUÇÃO
O mRNA, após traduzido, tem de ser eliminado para não haver formação errónea de
proteínas na célula.
Como já vimos anteriormente, o mRNA é produzido no núcleo e durante a sua
produção ocorre o splicing, o terminal 5’ (cap) é protegido e o terminal 3’ sofre poli-
adenilação. No final do processo de transcrição, existe também a necessidade de
proteger os terminais, que visa o correto transporte do núcleo para o citoplasma
(geração do mRNP) a fim de termos a informação codificante pronta para a tradução.
O mRNA eucariota necessita de ser processado e este processo exige a translocação do
ribossoma. Para que a tradução ocorra, é necessário:
- fator de iniciação;
- tRNA no início (transporta a metionina modificada);
- subunidade menor do ribossoma;
- sequência de reconhecimento entre o tRNA e a subunidade.
RIBOSSOMAS: estruturas
muito abundantes no nosso
organismo (cerca de 10
milhões por célula, 80% do
RNA total) com cerca de 25-
30nm de diâmetro. Tem duas
subunidades independentes,
mas funcionalmente aderentes
(80S), sendo que a pequena
subunidade (40S) é formada
por rRNA 18S e cerca de 30
proteínas diferentes, e a grande subunidade (60S) é composta por rRNA 28S, rRNA
5.8S, rRNA 5S e cerca de 40 proteínas diferentes.
São aderentes a cisteínas do retículo endoplasmático rugoso, e encontram-se na forma
livre pelo citoplasma. São constituídos por 1/3 proteico e 2/3 de rRNA, sendo que a
fração proteica está envolvida em processos catalíticos.
A subunidade mais pequena é a responsável por reconhecer o mRNA.
Em procariotas, os ribossomas estão todos espalhados pelo citoplasma (livres).
Existem vários locais de ligação de RNA ao ribossoma:
- local de ligação do mRNA;
- local P (peptidil -tRNA): recebe a molécula de tRNA que se liga à extremidade
da cadeia polipeptídica em crescimento e localiza-se entre os locais A e E. Lê o codão
de iniciação e é independente de fatores de iniciação. Estes fatores de iniciação vão ser
libertados após o posicionamento do mRNA;
55
- local A (aminoacil-tRNA): recebe a molécula de tRNA que contém o

aminoácido correspondente ao codão do mRNA – dá-se a exposição do codão e
reconhecimento do anticodão;
- local E (exit): local de saída da proteína nascente.
Aminoacil-tRNA sintetases: existem duas classes.

- Classe I: ligação do aminoácido ao 2’-OH do tRNA, sendo geralmente monoméricas.
Ex. Glu, Trp, Leu, Val.
- Classe II: ligação do aminoácido ao 3’-OH do tRNA, sendo geralmente dimétricas ou
tetraméricas.
Ex. Gly, Ala, Pro, Phe.
Bioquimicamente, a reação de carregamento do aminoácido no tRNA dá-se pelo

estabelecimento de uma ligação acil entre o grupo carboxílico do aminoácido e o
grupo 2’-OH ou 3’-OH do nucleótido de adenosina do terminal do tRNA. O
carregamento de tRNAs dá-se em dois passos:
1) Adenililação: o aminoácido reage com ATP para se tornar adenililado, com a
libertação de pirofosfato. O aminoácido liga-se ao ácido adenílico, por ligação
éster (basicamente, ocorre a transferência de AMP).
2) Carregamento de tRNA: o aminoácido adenililado ligado à sintetase reage com
o tRNA. Ocorre a transferência do aminoácido para o terminal 3’ do tRNA, no
grupo 2’ ou 3’-OH, e libertação de AMP.
56
Após termos o tRNA carregado, dá-se o PROCESSO DE SÍNTESE DE PROTEÍNAS, por 5

etapas sequenciais:
1. Ativação do aminoácido e formação do aminoacil-tRNA (já aconteceu);

2. Iniciação: ligação da subunidade pequena e da metionina formilada (fMet ou
então N-formil metionina) no local AUG (codão de iniciação: AUG, GUG ou UUG
[mais comum para mais raro]);
3. Elongação: o polipeptídeo nascente é elongado pela ligação sucessiva de novos
aminoácidos (verdadeiro processo de tradução);
4. Terminação: paragem na síntese dá-se pelo encontro de um codão STOP ou de
terminação (UAA, UAG e UGA). O polipeptídeo desliga-se.
5. Enovelamento e processamento pós-transcricional do polipeptídeo.
A iniciação e a elongação são dependentes de GTP (guanosina trifosfato).

O que faz com que os codões AUG de inserção sejam diferentes daqueles no meio da
sequência?
- Em procariotas: as metioninas
codificadas no meio da sequência são
diferentes das metioninas codificadas
pelo codão inicial (AUG). Estas últimas
são designadas de N-formil Metioninas.
Antes do codão AUG de iniciação, existe
uma sequência consenso denominada de
sequência Shine-Dalgarno (AGGAGGU)
que posiciona o mRNA ao nível do ribossoma, mediado por eIF3 e assistida por eIF1 e
eIF2.
- Em eucariotas, as metioninas são todas iguais. Existem, paralelamente aos

procariotas, sequências consenso denominadas sequências Kosak (AUGG). Aqui, o
AUG é altamente conservado. A partir do momento em que há reconhecimento da
sequência Kosak e posicionamento da subunidade ribossómica (GTP-dependente),
pode ocorrer a deslocação do ribossoma ao longo da cadeia de mRNA.
57
INÍCIO DA TRADUÇÃO EM EUCARIOTAS:

Quando o ribossoma se dissocia, no terminus da tradução, as subunidades 40S
e 60S associam-se a fatores de iniciação de eIF3 E eIF6, formando complexos que
podem iniciar uma nova tradução.
a) Adição sequencial dos componentes indicados ao complexo subunidade 40S-
eIF3, formando o complexo de iniciação.
b) Digitalização do mRNA pelo complexo de iniciação associado, o que conduz ao
posicionamento da subunidade pequena e ligação de Met-tRNAiMet no codão de
iniciação AUG.
c) Após ligação do tRNA ao codão AUG, com gasto de ATP, os fatores eIF 1A, eIF3,
eIF4 (complexo) e EIF2-GDP + Pi saem da subunidade.
d) Associação da subunidade grande (60S), formando um ribossoma 80S pronto
para traduzir o mRNA numa proteína.
Fatores eIF1α-GTP, associados a um aminoacil-tRNA,

transferem o aminoácido para o local A, que se liga ao
aminoácido anterior, no local P, com ajuda de eIF2-
GTP (translocação).
A título de exemplo, a ativação do triptofano: o local
de reconhecimento do aminoácido fá-lo por tamanho,
pois o aminoácido tem de preencher o local ativo
(espaço catalítico).
A ligação fosfato-aminoácido é muito importante. O
que é reconhecido no processo de tradução é o
58
anticodão do tRNA. A ligação aminoácido-tRNA é fulcral para que o processo de

tradução se dê.
Temos o tRNA à volta do ribossoma, que vai ser chamado a entrar no complexo para o
local A. A ativação faz com que haja modificação estrutural do ribossoma 80S e o
primeiro aminoácido liga-se ao fator de iniciação (dependente de GTP), fazendo com
que haja movimentação do ribossoma do local A para o local E (empurra o sistema). O
aminoacil-tRNA permanece no local P à espera de novo anticodão. Ocorre
simultaneamente a movimentação do polipeptídeo nascente do local A, para o local P,
para o local E. O péptido nasce do terminal amínico (NH 3) para o terminal carboxílico
(COOH).
NOTA: Dois fatores de iniciação, eIF2 e eIF5 são proteínas de ligação a GTP, cujo GTP é
hidrolisado durante a iniciação da tradução, para a associação das subunidades 40S e
60S.
Os fatores das células podem regular a síntes e de proteínas por fosforilação de um
resíduo de serina, na eIF2 ligados ao PIC (complexo de pré-iniciação fosforilado não
consegue trocar GDP por GTP e não pode ligar Met-tRNAiMet), e inibindo a síntese
proteica.
Os aminoácidos ligam-se por ligação amida (R’-CO-NH-R’’).
TERMINUS DA TRADUÇÃO EM EUCARIOTAS: Ao atingir um codão STOP (UAA, UGA,

UAG), ocorre a libertação do fator eRF1 e este entra no complexo ribossomal,
provavelmente com o fator eRF3. A hidrólise de GTP é acompanhada por clivagem da
cadeia polipeptídica a partir do tRNA no local P, pela libertação dos tRNAs e das duas
subunidades ribossomais 40S e 60S.
O fator de terminação vai provocar o desacoplamento do ribossoma nas duas
subunidades, com a libertação do polipéptido e dos tRNAs.
59
POLISSOMA: vários ribossomas unidos a uma única cadeia de mRNA (várias traduções
ocorrem em simultâneo).
Em procariotas, o processo de tradução pode ser iniciado ao mesmo tempo que o

processo de transcrição (mRNA policistrónico: existem vários pontos de início de
tradução no mRNA). Depois da tradução, temos um polipéptido não funcional, que
requer modificações poliadicionais para se tornar funcional.
Em eucariotas, o mRNA é traduzido no sentido 5’ → 3’, sendo que a estabilização é
feita por circularização do mRNA com poliadenilação. Têm um mRNA monocistrónico
que interage com proteínas que se ligam à cauda de poli-(A) e com proteínas do
complexo de iniciação.
CONTROLO DA TRADUÇÃO:
1. Todas as polimerases têm processos de controlo de tradução. A RNA
polimerase não faz esse controlo, apenas as aminoacil-tRNA sintetases o fazem.
A afinidade da enzima aminoacil-tRNA sintetase por tRNA, faz com que o tRNA
errado se ligue lentamente e se desligue rapidamente, atuando como um
mecanismo de controlo da tradução a nível do carregamento do tRNA.
2. O aminoácido deve encaixar-se no local sintético da tRNA-aminoacil sintetase,
e não no local de edição (mecanismo de peneira dupla).
3. (des)controlo: Não acontece a verificação do aminoácido na tradução. O
controlo é, portanto, feito apenas no momento da aminoacilação do tRNA. Ex:
transformação de L-Cisteína em L-Alanina, sem alteração do codão de
reconhecimento.
60
MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS: Ocorrem em eucariotas e são muito

importantes, podendo ocorrer logo após a tradução. A regulação da função proteica
pode ser a nível de:
- formação de ligações de dissulfeto (responsáveis pela união de quatro
polipeptídeos num anticorpo funcional);
- clivagem da cadeia polipeptídica;
- fosforilação de serinas, treoninas ou tirosinas;
- glicosilação do N-terminal da cadeia polipeptídica ou de um átomo de
oxigénio num aminoácido de cadeia lateral;
- Metilação/ Acetilação do N-terminal da proteína, estabilizando-a;
- Adição de âncoras lipídicas;
- Lipidação da proteína (adição de lípidos/ ácidos gordos);
- Ubiquitinação (adição de ubiquitina) de resíduos de lisina de uma proteína
alvo, marcando-a para destruição.
CHAPERONAS I: complexo proteico que auxilia na montagem da estrutura

tridimensional de uma proteína, estabilizando-a durante a sua maturação e
assegurando um folding correto do polipeptídeo. Há chaperonas que direcionam as
proteínas para os diferentes organelos, reconhecendo um sinal existente no peptídeo
nascente, característico de cada organelo. Chaperonina é a chaperona mais comum.
As chaperonas ligam-se a regiões interativas da proteína à medida que esta é
sintetizada, impedido a agregação aleatória. Regiões da proteína são liberadas para
interagir de forma ordenada, resultando num folding correto para a função da
proteína. O estado desenovelado da proteína, ao emergir do ribossoma, atrai as
chaperonas.
As proteínas localizadas pós-traducionalmente são libertadas no citosol, após a sua

síntese, por ribossomas livres. Algumas delas possuem sinais de retenção para
organelos. As proteínas localizadas co-traducionalmente associam-se à membrana do
retículo endoplasmático durante a síntese proteica, de modo a que os seus ribossomas
sejam “ligados à membrana”. As proteínas passam para o interior do retículo
endoplasmático, ao longo do complexo de Golgi, e depois através da membrana
plasmática (a menos que possuam sinais de retenção em uma das vias).
61
As proteínas também podem ser direcionadas para endossomas ou lisossomas.

A localização das proteínas é mediada por pequenos sinais:
- Mitocôndria: hélice anfipática no N-terminal (12-30 aminoácidos)
- Cloroplasto: carregada no N-terminal (>25 aminoácidos)
- Núcleo: região básica, internamente, ou positiva
- Peroxissoma: pequeno péptido no C-terminal (3-4 aminoácidos)
Mitocôndria Núcleo Citoplasma Cloroplastos Peroxissoma
Retículo
Endoplasmático
Complexo de
Golgi
Vesícula
Lisossoma
secretora
Membrana plasmática
Peroxissoma: organelo de armazenamento de enzimas citoplasmáticas.

As proteínas sintetizadas por ribossomas livres, no citosol, são conduzidas a destinos
específicos por pequenos motivos sinalizadores.
O endereçamento de proteínas pode ser de dois tipos, membranar (se possuírem um
sinal KDEL: Lys-Asp-Glu-Leu, são endereçadas para o retículo endoplasmático onde
terminam a tradução) ou não membranar, de acordo com o destino do polipeptídeo:
-transporte co-traducional (vias de secreção):
-retículo endoplasmático;
-complexo de Golgi;
-membrana plasmática;
-meio extracelular/ vesículas secretoras, endossomas ou lisossomas.
-transporte pós-traducional:
-núcleo;
-mitocôndria;
-cloroplasto;
-peroxissomas.
Após a tradução no citosol, as proteínas são transportadas para o organelo correto.
O processo de translocação Retículo endoplasmático –> Complexo de Golgi provoca a
fosforilação/ glicosilação da proteína. No transporte pós -traducional, a estrutura
terciária final é feita no organelo-alvo.
62
DIRECIONAMENTO DE PROTEÍNAS PROCARIÓTICAS: utilizam marcações para enviar

proteínas sintetizadas no citosol para a membrana celular ou para a membrana
externa. São marcadas no N-terminal.
A tradução das proteínas do periplasma em procariotas é feita com uma sequência
sinal de 15-30 aminoácidos no N-terminal, que as marca como sendo do periplasma.
O arsenito é um composto problemático pois se oxida a arsenato (toxicidade). No entanto, a cé l ul a

reduz o arsenato a arsenito e produz uma bomba de arsenito que se assemelha com fosfato,
estruturalmente. Estas bombas têm zonas hidrofóbicas e hidrofílicas (sentem os iões no e xte ri or e
tendem a passa-los para o interior, e vice versa).
INIBIDORES DA SÍNTESE PROTEICA (Antibióticos):

-Tetraciclina: liga ao rRNA 16S, na subunidade 30S, e impede a tradução ao
inibir a ligação do aminoacil-tRNA ao local A do ribossoma.
-Cloranfenicol: liga na subunidade maior do ribossoma (50S) e, tal como a
tetraciclina, inibe a síntese proteica.
Figure 1 Tetraciclina Figure 2 Cloranfenicol
PROTEÍNAS TRANSMEMBRANARES: Possuem domínios hidrofóbicos capazes de invadir

as regiões hidrofóbicas lipídicas da membrana. A orientação dos terminais com
múltiplas transposições pela membrana depende da existência de um número ímpar
ou par de segmentos ou domínios transmembranares. Proteínas com número ímpar de
domínios transmembranares apresentam as regiões N e C em faces opostas da
membrana. Proteínas com número par de domínios transmembranares hidrofóbicos
possuem as regiões terminais C e N na mesma face da membrana.
Em suma:
-A tradução é o processo de síntese proteica;
-A regulação ocorre principalmente na transcrição, mas as modificações pós -
traducionais são importantes para regular a função proteica;
-Diferentes tipos de RNA e proteínas atuam no processo de transcrição e tradução;
-A aminoacil-tRNA sintetase é a responsável pelo código genético.
63
3. REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GENÉTICA:

Tenta dar explicação à questão: “Como é que uma única célula pode dar origem a
tantos tipos celulares distintos?”
Inicialmente, haviam duas explicações:
1. Durante a diferenciação, apenas os genes que codificam proteínas que serão
expressas naquele tipo celular são mantidos;
2. Todos os genes são mantidos, mas só aqueles que codificam proteínas
expressas nesse tipo celular é que são expressos.
TOTIPOTÊNCIA: característica das células desenvolverem estruturas novas e

diferenciadas ou um organismo complexo. Nos
animais, a maioria das células adultas
(diferenciadas) perderam a sua capacidade
totipotente. Entretanto, restaram algumas células
indiferenciadas que ainda mantêm essa
característica de pluripotência (células tronco).
CONTROLO DA EXPRESSÃO DE GENES:

Partindo do princípio que todos temos o mesmo potencial genético, seria
de esperar que todas as células funcionassem de igual modo nos organismos. No
entanto, não é isso que acontece, visto que nem todas as proteínas são expressas do
mesmo modo, no mesmo local e ao mesmo tempo. Podemos ter um controlo
temporal e espacial:
-controlo temporal: quando um determinado gene/proteína só é expresso
num tempo determinado. Ex: proteínas que só são expressas no embrião ou durante
uma determinada fase do ciclo celular.
-controlo espacial: quando a expressão de determinado gene/proteína é
diferente, dependendo do tipo celular. Ex: proteínas que só são expressas em células
nervosas (mielina) ou no tecido muscular (miosina).
Podemos agrupar os genes em duas famílias distintas:

a) GENES CONSTITUTIVOS: presentes em todas as células do organismo,
essenciais para a manutenção da vida. São genes normalmente envolvidos em
processos bioquímicos básicos, como na geração de ATP, replicação e
manutenção do material genético. Também são denominados de Housekeeping
Genes.
b) GENES REGULADOS: são genes que apresentam diferentes níveis de regulação,
sendo que nos procariotas esse processo de regulação é mais simples e melhor
conhecido. São genes expressos em alguns tecidos cuja função está
diretamente relacionada à função do órgão/tecido. Genes regulados são
64
expressos em apenas um tipo de tecido, com uma função altamente

especializada (Ex: β-globina apenas é expressa em eritrócitos). Todas as células
clonais descendentes dessas células também têm o gene expresso.
Ex: maturação de anticorpos em linfócitos B durante a resposta imunitária
tardia.
A concentração em equilíbrio de uma proteína requer vários níveis de controlo. O
controlo translacional pode ser por regulação positiva (indução: uma proteína
ativadora facilita a transcrição de um gene) ou por regulação negativa (uma proteína
repressora inibe a transcrição de um gene).
O operão procariota é composto por um grupo de genes estruturais regulado pelo

mesmo promotor. Como exemplos de operões, temos o operão lac e o operão trp.
OPERÃO lac:
Regulado por diversos fatores, em particular pela disponibilidade de glicose e lactose
no meio extracelular. A lactose é um composto indutor natural do promotor do operão
lac. O operão é desreprimido por ação da lactose, sendo que a molécula efetora é a
allolactose.
Permite aos procariotas uma digestão eficiente da lactose: a célula pode utilizar a
lactose como fonte de energia ao produzir a enzima β-galactosidase, codificada pelo
gene lacZ, que digere lactose em glicose e galactose.
Estruturalmente, consiste em:

-três genes estruturais (lacZ, lacY, lacA)
-promotor de genes estruturais (plac)
-operador (o)
-gene regulador (i)
-promotor do gene regulador (pi)
-terminador
O promotor está sempre reprimido, a menos que haja allolactose no meio.
65
Genes estruturais:
lacZ: codifica a enzima β-galactosidase, uma enzima intracelular que degrada o
dissacarídeo de lactose em monómeros de glicose e galactose;
lacY: codifica a β-galactosidase permease, uma permease da membrana
plasmática que bombeia a lactose para dentro da célular;
lacA: codifica a β-galactosidase transacetilase, que transfere um grupo acetil de
acetil-coA para β-galactosídeos.
Podemos ter dois mecanismos: (a) ausência da lactose; (b) presença de lactose.
Na ausência de lactose (a), a enzima β-galactosidase não é sintetizada, não sendo

produzida a alollactose. Na ausência da allolactose, o repressor lig a-se ao operador e
impede a transcrição dos genes estruturais.
Na presença da lactose (b), a enzima β-galactosidase é sintetizada no meio e a lactos e
é parcialmente convertida em allolactose (indutor: difere da lactose por ter uma
ligação glicosídica do tipo β-[1->6] e não β-[1->4] ). A allolactose liga-se ao repressor,
ativando-o e impedindo que este se ligue ao operador, permitindo a transcrição dos
genes estruturais pela RNA polimerase.
66
OPERÃO trp:
O triptofano (Trp) é um aminoácido essencial nos eucariotas. Porém, pode ser
sintetizado em procariotas se este não estiver disponível no meio. Se adicionarmos
triptofano ao meio, a bactéria rapidamente cessa a sua produção (em cerca de 10
minutos).
Ao contrário do operão lac, o operão trp possui cinco genes estruturais (trpE, trpD,
trpC, trpB e trpA).
Na presença de escasso triptofano, a proteína repressora liga-se a ele (de modo
semelhante ao da allolactose), ficando ativa e ligando o operador do operão trp.
Na ausência de triptofano (a), o repressor produzido pelo gene regulador está inativo.
O operão está livre, a RNA polimerase pode ligar-se ao promotor e a transcrição ocorre
normalmente, sintetizando-se cinco enzimas.
Na presença de triptofano (b), o aminoácido ativa o repressor ao ligar-se a ele. O
repressor ativado liga o operador que inibe a transcrição de genes estruturais.
Pode ainda ocorrer regulação ao nível da tradução, através de atenuação: término

prematuro da transcrição. Na biossíntese de aminoácidos, a atenuação é regulada pela
disponibilidade de um aminoacil-tRNA cognato.
Antes da zona que codifica os genes estruturais, existe uma zona que codifica para
uma pequena sequência que requer triptofano para ser traduzida (não esquecer que,
67
em procariotas, quando estamos a transcrever, a célula está a traduzir ao mesmo

tempo).
Havendo triptofano, o polipéptido é traduzido, fazendo com que haja impedimento do
resto da tradução, havendo desta forma e sucessivamente, uma diminuição do
número de traduções (atenuação).
Quando a transcrição é iniciada no promotor do operão, ela começa antes do primeiro
gene estrutural, e um transcrito líder é feito. Esta região líder contém um sinal de
início e um sinal de STOP da síntese proteica.
Uma vez que a bactéria não tem membrana nuclear, a transcrição e tradução ocorrem
simultaneamente, o que permite a síntese de um pequeno peptídeo enquanto a RNA
polimerase transcreve a região líder. O péptido teste contém alguns resíduos de
triptofano no meio dele.
Havendo quantidade suficiente de triptofanil-tRNA para traduzir o péptido teste, o
péptido inteiro será sintetizado e o ribossoma vai chegar até ao sinal STOP. Por outro
lado, se não há quantidade suficiente de triptofanil-tRNA para traduzir o péptido teste,
o ribossoma não tem ingredientes necessários para a tradução e para aí a síntese,
antes de chegar ao sinal de terminação.
Para entender o mecanismo de atenuação, é importante ainda saber que a sequência
de mRNA líder contém quatro regiões complementares do seguinte modo:
-A região 1 é complementar com a região 2;
-A região 2 é complementar com a região 3;
-A região 3 é complementar com a região 4.
O ribossoma traduzir ou não o péptido teste é afetado pela possibilidade de se
formarem várias estruturas em alça por emparelhamento. Se o ribossoma atinge o
sinal de stop da transcrição, ele cobre a região 2 e esta torna-se incapaz de emparelhar
com a região 3. Assim, a região 3 irá emparelhar com a região 4 e formar-se-á um sinal
de término de transcrição em alça. Havendo bastante triptofanil-tRNA para traduzir o
péptido teste, a atenuação vai ocorrer e os genes estruturais não são transcritos.
68
No fundo, a transcrição só ocorre havendo emparelhamento das regiões 2 e 3, que s ó

ocorre se houver escassez de triptofano no meio. Havendo bastante triptofano no
meio, são as regiões 3 e 4 que emparelham (sinal de atenuação), bloqueando a
transcrição.
Os procariotas:
-necessitam de mecanismos rápidos e eficientes de adaptação ao ambiente;
-produtos genéticos que funcionam em conjunto têm geralmente regulação de
expressão semelhante ou estão organizados em operões;
-a transcrição da maioria dos genes está num estado “bloqueado” pela ligação de
proteínas inibidoras;
-a dissociação dessas proteínas inibidoras depende de um indutor que sinaliza a
mudança ambiental, e que é geralmente uma pequena molécula.
Em eucariotas, os princípios básicos da regulação genética são:

-a iniciação da transcrição é o ponto mais crítico do controlo da expressão genética.
Por isso mesmo, os genes eucariotas possuem um maior número de regiões
regulatórias upstream da “open Reading frame”;
-genes eucariotas não se organizam em operões, mas a regulação conjunta pode ser
obtida pela presença de mais sítios reguladores da iniciação da transcrição;
-acesso às regiões promotoras é restrito pela estrutura da cromatina, e o
remodelamento da mesma é necessário.
Dito isto, o controlo da transcrição pode ser feito a três níveis:
-interferência com o complexo de iniciação da transcrição;
-regulação da estrutura da cromatina;
-modulação dos níveis de atividade dos ativadores e repressores da
transcrição.
REMODELAÇÃO DA CROMATINA:
Um DNA muito compacto não é legível, daí ser necessário modelar o estado de
compactação do DNA, isto é, o grau de compactação do DNA à volta das histonas. Para
isso, são necessários blocos enzimáticos que relaxem os nucleossomas, desenrolando
o DNA à volta das histonas.
A acetilação das histonas (processo enzimático) faz com que haja mais espaço à volta
delas: a acetilação diminui a compactação da cromatina ao diminuir a interação do
core complex com o DNA. Com isto, os locais promotores e reguladores tornam-se
mais acessíveis para a ligação de fatores de transcrição.
69
Isto tudo ocorre devido às cargas que as histonas e o DNA apresentam, permitindo
desta forma a transcrição e, posteriormente, a tradução. Para cada tecido, as zonas
acetiladas são diferentes.
Heterocromatina: regiões supercondensadas e, por isso, transcricionalmente inativas
da cromatina. Tipicamente equivale a 10% da cromatina.
Eucromatina: regiões mais relaxadas da cromatina, transcricionalmente ativas.
A cromatina é modelada por acetilação ou por movimentação dos nucleossomas.
REGULAÇÃO DA QUANTIDADE DE FERRITINA E TRANSFERRINA CELULARES:

(Ferritina: principal proteína plasmática transportadora de Ferro. Transferrina:
proteína responsável pelo transporte de Ferro para os tecidos)
Na ponta 3’ do mRNA do recetor de transferrina, há a estrutura do elemento de
resposta ao ferro (IRE). Esse elemento liga a uma proteína reguladora de ferro (IRP)
quando a célula estiver sem este mineral. A ligação IRE-IRP, na ponta 3’ do mRNA do
recetor de transferrina, protege o mRNA da degradação enzimática e resulta num
aumento do nível do mRNA de recetor de transferrina, que se traduz num aumento do
nível da proteína recetora de transferrina.
A proteína recetora de transferrina transporta a transferrina para o meio intracelular,
detetando-a no meio extracelular e internalizando o complexo transferrina-Ferro por
meio de endocitose mediada por recetor.
Na ponta 5’ da molécula de mRNA de ferritina, há uma estrutura haste-alça que liga
IRP quando os níveis de ferro na célula são reduzidos ou nulos. A ligação da IRP à ponta
5’ do mRNA da ferritina bloqueia a tradução deste mRNA e leva à diminuição dos
níveis de ferritina.
Quando o ferro está presente em grande quantidade, o mRNA de ferritina não liga
mais IRP e traduz ativamente a proteína ferritina. Ao mesmo tempo, a abundância de
ferro evita que a IRP se ligue à ponta 3’ do mRNA recetor de transferrina, levando a
uma degradação enzimática do mRNA e a um declínio dos níveis da proteína recetora
de transferrina.
70
EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS:

Pretendemos expressar uma proteína de um indivíduo A num outro indivíduo B, em
que o vetor que contém o gene codificante da proteína em questão tem de ser
introduzido no outro organismo.
O processo de expressão tem de ocorrer de modo a não interferir com o modo de vida
da célula do indivíduo B. Para isso, temos de garantir que a sequência que vamos
colocar no organismo B (que a vai expressar) seja por ele interpretada do mesmo
modo que no organismo de origem (organismo A).
Podemos provocar uma mutação base a base para mudar codões, ou podemos mudar
o organismo de expressão, caso seja necessário.
Estrutura de proteínas: polímeros de L-α-aminoácidos.

As cadeias laterais de
aminoácidos podem ser polares
(se contiverem aminoácidos
neutros como a serina), apolares
(se contiverem aminoácidos
aromáticos como a fenilalanina)
ou carregadas positivamente
(aminoácidos básicos como a
histidina) e negativamente
(aminoácidos ácidos como o
aspartato ou o glutamato). De
acordo com as propriedades dos
aminoácidos constituintes, uma
proteína terá uma determinada
estrutura tridimensional, fruto
das interações entre cada um
dos aminoácidos e pela
estabilização dessas interações
ao formarem-se as estruturas
secundárias típicas tais como as
folhas β e as hélices α.
71
Níveis de estrutura proteica:

-primária: estrutura covalente das ligações amida;
-secundária: arranjos repetitivos locais (hélices α, folhas β, voltas β, etc.);
-terciária: enovelamento tridimensional;
-quaternária: oligomerização.
APLICAÇÕES DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES:

a) Terapia génica: possibilidade de introdução de um gene que codifica uma
proteína que auxiliará no processo de tratamento de doenças genéticas ou
outras, do hospedeiro.
b) Melhoramento animal e vegetal: obtenção de plantas mais resistentes e de
animais mais férteis e com carne de melhor qualidade para consumo.
c) Criação de modelos animais: ideais para o estudo da estrutura, função e
regulação de um gene. São amplamente usados durante o estudo de doenças
humanas, sem que haja perigo para o Homem.
ENGENHARIA GENÉTICA:
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE: conjunto de técnicas que permite
a combinação de segmentos de DNA, com origem diferente, de modo a originar uma
nova molécula de DNA. É uma técnica usada na clonagem de genes, na modificação
genética de organismos e na biologia molecular, de um modo geral.
CLONAGEM GENÉTICA: obtenção de um grande número de cópias de um
gene com interesse.
Genes repórter são genes que produzem proteínas que podem ser detetadas e
quantificadas utilizando simples testes. São exemplos de genes repórteres o gene de
GFP (green fluorescente protein), o lacZ (ONPG é clivado pela enzima β-galactosidase,
adquirindo a cor amarela indicativa da presença da enzima codificada pelo gene lacZ) e
o gene de LUC (luciferase, uma enzima oxidativa produtora de bioluminescência).
Haverá baixa expressão proteica se o DNA clonado tiver codões pouco utilizados no
organismo hospedeiro (em E. coli, por exemplo). A solução é uma mutagénese sítio-
específica, que consiste na alteração de nucleótidos sem alteração do aminoácido
codificado.
72
VETOR DE CLONAGEM: elemento genético com capacidade de replicação autónoma,

usualmente um vírus ou um plasmídeo, que não possui promotor. Um vetor de
clonagem contém:
-origem de replicação;
-gene de resistência a antibióticos;
-zonas de sequência conhecida e que permite a sua clivagem para inserção
do fragmento que pretendemos clonar (Polycloning site);
-tag.
O tag é uma curta sequência de nucleótidos que codifica um péptido com poucos aminoácidos.
Pode ser adicionado à extremidade N ou C do produto do gene clonado e permite a deteção e
purificação de proteínas.
Péptidos de fusão específicos conferem vantagens à proteína alvo durante a expressão, tais
como o aumento da solubilidade, proteção de proteólise e melhoramento da sua conformação
e produção. São exemplos de tags:
-6 His (poli-histidina)
-GST (Glutationa-S-transferase)
-MBP (proteína de ligação a maltose)
-GFP (proteína verde fluorescente)
-Epítopos (determinantes antigénicos)
A proteína de fusão pode estar no N-terminal ou no C-terminal, sendo que é mais comum
encontrar-se no N-terminal.
Anterior à proteína de fusão, existe a sequência de reconhecimento dos ribossomas
(sequências de Shine-Dalgarno, em procariotas).
VETOR DE EXPRESSÃO: vetor de clonagem que

também dirige a expressão do gene clonado,
visando obter uma grande quantidade de uma
proteína específica. Estes vetores possuem um
promotor específico para a expressão na célula
hospedeira, pois pretendemos que a DNA
polimerase e a RNA polimerase atuem nesse
promotor.
As características do promotor vão fazer com que
aquilo que pretendemos clonar seja mais ou me nos
73
expresso (um promotor pode ser forte ou fraco e é isso que determina a sua afinidade pelas
maquinarias de transcrição e tradução).
Este vetor requer que a RNA polimerase leia o gene que clonamos (o gene é clonado com o
material que queremos expressar), mas não queremos que a RNA polimerase transcreva todo
o gene: apenas a parte que nos interessa. Os vetores de expressão controlada dão resposta à
necessidade de superproduzir, de modo controlado, o produto de expressão de um gene (uma
proteína recombinante ou r-proteína).
Assim, para que a informação possa ser traduzida num vetor de expressão, é necessário:
-promotor para a RNA polimerase;
-sequências de terminação para a RNA polimerase;
-terminador de transcrição a jusante da sequência codificante para evitar a
formação de mRNA demasiado longo;
-codões STOP para os ribossomas (término da tradução);
-sequência indicadora da ancoragem ao ribossoma, designada por sequência de
Shine-Dalgarno, que garante uma ligação efetiva do mRNA ao ribossoma onde se dá a
tradução, garantindo que o processo se dê eficientemente e que a expressão do gene clonado
não fique limitada ao nível da tradução;
-codão de iniciação ATG que inicia a tradução da maioria dos genes procariotas.
Estes vetores têm uma origem de replicação e marcas genética de seleção (genes de
resistência a antibióticos, como a tetraciclina e a ampicilina)
No caso do vetor de expressão controlada para a expressão numa célula bacteriana ( E. coli), o
vetor deverá apresentar uma região promotora reconhecida no hospedeiro e que permita uma
transcrição eficiente do gene clonado a usar para a superprodução da r-proteína. É
conveniente que este promotor seja regulável de modo a que possa ser “ligado” e “desligado”
(daí o nome de vetores de expressão controlada).
O terminador da transcrição, a jusante da sequência clonada, impede a transcrição atravé s de
outro promotor, que pode inibir a sua função (fenómeno conhecido como oclusão do
promotor). Além disso, o terminador aumenta ainda a estabilidade do mRNA.
O IPTG é um análogo da lactose, mas não metaboli zável,

mantendo-se com uma concentração constante durante o
crescimento celular que ocorre na sua presença. Este remove a
proteína repressora, LacI, do operador. O IPTG é o indutor da
maior parte dos promotores dos vetores de expressão.
Os locais comuns a ambos os vetores de clonagem e de

expressão são os locais de clonagem (multiple cloning site), as
origens de replicação e os genes de resistência a antibióticos.
Os vetores de expressão podem ser vetores de fusão transcricional ou vetores de fusão

traducional:
VETORES DE FUSÃO TRANSCRICIONAL: fornecem apenas o promotor, não tendo
todas as informações necessárias para o processo de transcrição;
74
VETORES DE FUSÃO TRADUCIONAL: fornecem o promotor e os sinais de tradução

como o RBS (ribosome binding site) e o codão de iniciação. Têm toda a informação necessári a
para a tradução.
Aquilo que clonamos tem de conter toda a informação necessária à transcrição e à tradução.
Nos vetores de fusão transcricional, o promotor e o gene constituem uma unidade
transcricional, ou seja, a transcrição iniciada a partir do promotor continua através do gene
clonado. O vetor fornece o promotor, e o inserto contém os sinais de tradução (RBS e codão
de iniciação de tradução). É produzida uma proteína nativa.
Nos vetores de fusão traducional, também se forma uma unidade transcricional. O vetor
fornece o promotor e os sinais de tradução, e é produzida uma proteína de fusão/híbri da e m
que parte do produto da tradução é derivado do insert e parte, do vetor.
As modificações pós-traducionais são necessárias para a atividade biológica da proteína.
Para a fusão traducional, é necessário conhecer a sequência de nucleótidos do insert e aval i ar
o resultado da clonagem num determinado local. O insert deve estar na mesma grelha de
leitura do ATG do vetor (codão de iniciação).
Pode ser necessário mudar de vetor ou modificar o vetor ou o insert, utilizando linkers ou
adaptadores. Alternativamente, o insert pode ser produzido por PCR.
Em suma, um vetor de expressão é caracterizado por:

-promotor forte e eficiente para produzir elevadas
quantidades da proteína desejada e de baixo nível
basal, para evitar toxicidade;
-terminador para evitar transcrição indesejada;
-sequência de Shine-Dalgarno para o início da tradução
(em procariotas);
-Tags e proteínas de fusão para permitir a purificação
de proteínas de interesse e para adicionar
características vantajosas;
-Protease cleaveage site para remoção de tags;
-Repressor para evitar a produção de proteína em
quantidades tóxicas para a célula;
-Sequência codificante de um péptido sinal para uma
secreção correta da proteína.
Um promotor pode ser regulável (dependendo das condições

ambientais/genéticas, promove a síntese do mRNA, ou “desli ga” a
sua síntese, levando-o a níveis basais; O indutor ativa o promotor)
ou artificial (tacI e tacII, fusão das regiões -35 do promotor do
operão trp com a -10 do promotor do operão lac da E. coli, são
mais eficazes a promover a transcrição de genes).
75
O enovelamento proteico, dentro da célula, difere em eucariotas e em procariotas. Em

procariotas, o ambiente redutor não permite a formação de pontes de dissulfeto no citosol,
apenas no espaço periplasmático. As proteínas não sofrem modificações pós-traducionais e
dá-se a secreção para o periplasma. Em procariontes, os peptídeos são retidos em corpos de
inclusão e pode ocorrer degradação proteolítica.
Em eucariotas, contudo, pode ocorrer a formação de pontes de dissulfeto e glicosilação.
Ocorrem modificações pós-tradicionais diversas e dá-se a secreção para o meio extracelular.
SISTEMAS DE EXPRESSÃO HETERÓLOGA:

Vantagens de utilizar cada um dos sistemas.
PROCARIOTAS: E. coli
-profunda caracterização fisiológica e genética;
-curto tempo de geração;
-fácil manipulação e baixo custo;
-pode acumular proteínas heterólogas em mais de 20% do seu conteúdo proteico;
-maior capacidade secretora:
B. subtilis (menor número de protéases periplasmáticas)
B. megaterium (menor número de protéases periplasmáticas)
Staphilococcus carnosus
Streptomyces lividans
EUCARIOTAS:
A. LEVEDURAS (S. cerevisiae, P. pastoris, K. lactis)
-baixo custo e cultivo em altas densidades;
-bons secretores;
-sofrem modificações pós-traducionais;
-não são patogénicas nem apirogénicas;
B. FUNGOS FILAMENTOSOS (A. Nidulans, A. Awamori, A. Niger, Penicillium

chrysogenum, A. Sydowii, Acremonium chrysogenum)
-aparato sofisticado de modificações pós-traducionais;
-capazes de padrões de glicosilação semelhante a humanos;
-baixa caracterização genética e fisiológica;
-baixos rendimentos;
C. PLANTAS (Nicotiana tabacum)

-baixo custo de produção;
-síntese de proteínas funcionais;
-fácil recuperação e purificação proteica;
-direcionamento da proteína recombinante (frutas, tubérculos, folhas ou em sementes).
D. CULTURAS DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS E INSETOS

-sofrem modificações pós-traducionais;
-utilizam-se vetores baculovírus ou trichoplusia, células ovário de hamster chinês (CHO),
células de hibridoma HEK293 e células de rim de bebé de hamster (BHK);
76
-alto custo e difícil manipulação, por requererem um meio nutritivo dispendioso e te re m um

lento crescimento.
CASO PRÁTICO: DIABETES E PRODUÇÃO DE INSULINA.

DIABETES DE TIPO I: incontrolável, já que é provocada pelo término da produção de insulina
pelas células pancreáticas;
DIABETES DE TIPO II: relacionado com o modo de vida do indivíduo, tal como obesidade, e com
a perda de sensibilidade à insulina pelas células pancreáticas.
Na tentativa de encontrar meios de produção de insulina humana, começou-se pela produção

desta proteína por animais compatíveis (inicialmente bovinos, até se perceber que
provocavam alterações no organismo humano). De seguida, chegou-se à conclusão de que,
imunologicamente, o animal mais próximo do Homem é o porco, sendo que o nosso si ste ma
imunitário reconhece e não rejeita a insulina do porco.
A insulina suína possui apenas uma troca de
aminoácido de treonina para alanina, que é
interpretada pelo nosso organismo como
uma mutação insignificante, insuficiente
para a rejeitar. A insulina humana não é
modificada pós-traducionalmente.
A insulina é produzida inicialmente como
pré-pró-insulina (inativa), que possui um
polipéptido que une as duas cadeias. Depoi s
da sua ativação, esse polipéptido é removido
e as duas cadeias unem-se por pontes de
dissulfeto.
Para a produção in frame da insulina (vetor e insert utilizam o mesmo open Reading frame),
temos de contar o número de bases entre o promotor e o codão ATG, para que a sequência
seja lida de acordo com os codões que lá estão.
FIM DO PROGRAMA
77

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Fundamentos de Biologia Molecular

ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA)

Existem vários modelos para a estrutura de uma molécula de DNA: A, B e Z.

TEMPERATURA DE FUSÃO DO DNA: Característica do DNA que o caracteriza em

Podem surgir vários efeitos no DNA após tratamento com

CROMATINA: complexo de DNA e proteínas cromossómicas. Há aproximadamente

EMPACOTAMENTO DE DNA: dá-se em 4 níveis. O nível 1 corresponde à formação do

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA: dita que a informação está contida no DNA,

EXPERIÊNCIA DE MESELSON – STAHL:

Esta experiência diz-nos que o DNA é replicado de forma semi-conservativa: existe um

EM PROCARIOTAS (E. coli): A DNA polimerase é utilizada para preencher os espaços

Em procariotas, temos 3 tipos de DNA polimerases:

uma correta polimerização (proofreading), verificando se os nucleótidos adicionados

A holoenzima não é simétrica. Tem subunidades mais catalíticas (Palm: folha β) e é

FORQUILHA DE REPLICAÇÃO EM PROCARIOTAS:

dNTP). A DNA polimerase requer um primer e adiciona desoxirribonucleótidos ao

O desenrolamento das cadeias é feito pela HELICASE (específica), que quebra as

FORQUILHA DE REPLICAÇÃO EM EUCARIOTAS:

À medida que a replicação prossegue, a forquilha em crescimento e as proteínas a ela

PROBLEMA: as cadeias são antiparalelas e a DNA polimerase apenas adiciona

EXEMPLO: FORQUILHA DE REPLICAÇÃO DO VÍRUS SV40 (SEMELHANTE A EUCARIOTAS)

COMPLEXO PRIMASE – POL α: Um complexo de PRIMASE sintetiza os primers em

Nos eucariotas, podemos ter grande número de polimerases:

DNA POLIMERASE FUNÇÃO

BIDIRECIONALIDADE REPLICACIONAL: No DNA cromossomal eucariótico, origens de

-Com ATP, as helicases movem-se em sentidos opostos;

Sequências consenso são comuns em todas as E. coli (algumas de 9, outras de 13bp) e

TELÓMEROS: correspondem ao fim dos cromossomas lineares, e contêm sequências

A reparação do DNA é de crucial importância ao asseguramento da vida normal.

Mutações silenciosas: alteram a sequência de nucleótidos sem alterar a

processo, PCNA recruta fatores de montagem da cromatina (como o fator 1, CAF-1)

Mismatch Repair (Methyl-Directed: MMR): Todos estes mecanismos de

2) O complexo MutS-MutL interage com a proteína MutH, através de looping

REPARAÇÃO DE QUEBRAS: envolve uma perda de informação (parte de DNA). Se a

-Rec B: atividade helicase 3’ – 5’

A migração de cadeias é catalizada pelo

RecA facilita o emparelhamento de

Formam-se duas junções de Holliday,

RuvC cliva o DNA paara separar as

PCR (Polymerase Chain Reaction): técnica de biologia molecular que permite a

-Extensão (síntese do DNA: atividade da polimerase a 72 oC).

PROTOCOLO GENÉRICO DE PCR:

maior quantidade. É assim que apenas se amplifica a sequência flanqueada pelos

O primer que se coloca em cima,

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO (ENDONUCLEASES): podem ser de vários tipos, de acordo com

-ENDONUCLEASES DE TIPO I: Complexos de grandes dimensões, com múltiplas

Tipicamente, estas enzimas reconhecem sequências curtas (4-8pb) e palindrómicas e

MAPAS DE RESTRIÇÃO: muito importantes na caracterização do DNA, mapeamento de

Enzimas de restrição podem apresentar diferentes sensibilidades a padrões de

CLONAGEM: técnica que vai ser MUITO falada nesta cadeira.

plasmídeo que tem o gene de resistência a esse antibiótico). Se as colocarmos num

-FAGOS: o fago λ é dos bacteriófagos mais estudados (60% do seu genoma é

-BAC (Bacterial Artificial Chromossome): Baseia-se no plasmídeo f da E. coli e

Os plasmídeos podem ser passados entre células através da pili.

A clonagem tem como finalidade a produção de múltiplas cópias, geneticamente

A estratégia a utilizar na clonagem depende, em grande medida, do gene e do que se

Existem vários métodos de transformação bacteriana:

Células competentes são células permeáveis ao DNA, capazes de o adquirir do meio

BIBLIOTECA GENÓMICA: conjunto aleatório de fragmentos de DNA, a partir de um

CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA GENÓMICA FUNCIONAL:

Como o mRNA processado tem informação codificante para um polipéptido, tem

SÍNTESE DE cDNA A PARTIR DE mRNA: o cDNA é a cópia do mRNA em DNA, e é

ELETROFORESE: consiste na separação de partículas carregadas por ação de um campo