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Biologia Molecular - Resumos completos de toda a matéria

Biologia Molecular (Universidade de Aveiro)

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Biologia Molecular – 1º teste

Perspetiva Histórica
1928- Griffith descobriu o princípio transformante (a
transformação é uma maneira de recombinação, troca ou
transferência de informação genética entre organismos);
1938- Weaver utiliza o termo “Biologia Molecular”;
1941-Beadle e Tatum puseram a hipotese de “Um
gene, uma enzima”->
 Defende a ideia de que cada gene codifica uma única
enzima.
 Processo:
1. Esporos expostos a raios X;
2. Foram cruzados com a espécie natural;
3. Estes esporos haploides crescem em meio
completo;
4. Depois são passados para meio minimo
suplementados com diferentes intermediários. E os
que são mutantes não crescem.

1952-Alfred Hershey e Martha Chase confirmaram que o DNA é quem

carrega a informação genética.
Experimento de Hershey-Chase

(O enxofre está presente na constituição das proteínas e o fosfato está

presente no DNA)

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1953- Revista “Nature” publicou uma série de artigos sobre a estrutura

do DNA de Watson e Crick.
1958-Meselson e Stahl demonstraram a replicação semiconservativa
do DNA.
1959- mRNA foi identificado como o intermediário entre DNA e
proteínas.
1961- Tradução de proteínas (Nirenberg e Matthaei)
1965-Holley consegui-o descobrir a estrutura exata de tRNA
1968-Khorana, Nirenberg e Holley ganharam o prémio Nobel pelos
trabalhos realizados na área do código genético.
1969-Khorana e Kleppe propuseram os primeiros princípios do PCR.
Brock consegui-o isolar a DNA polimerase.
1970-Smith identificou a primeira enzima de restrição
1972-Berg identificou o primeiro DNA recombinante in vitro.
1974-Primeira aplicação darecombinação genética feita com sucesso
por Cohen e Boyer.
1976-Primeira empresa de Biotecnologia.
1977- Sanger descobriu o genoma inteiro de um vírus. Também foi
descoberta uma alternativa para o “mRNA splicing”
1982-Insulina é aprovada como sendo o primeiro medicamento
recombinante.
1983-Mullis inventou a reação em cadeira da polimerase. McClintock
descobriu os transposões.
1985- Sequencia do HIV publicada.
1987- Primeira condenação baseada em evidencia de DNA.
1989- Jeffreys utilizou o termo” DNA fingerprinting”.
1990- Começa o projeto do genoma Humano. Terapia genética foi usada
pela primeira vez em humanos.
1994- Primeiros alimentos geneticamente modificados.
1995- Primeiro genoma completa de um organismo vivo.
1996- Clonagem da Dolly

O SÉCULO XXI
-PCR tornou-se uma ferramenta essencial em vários campos ( forense,
alimentar, analise de genes...).

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- Tratamentos com Células estaminais

Estrutura do DNA
Molécula de ácido desoxirribonucleico- constituída por 2 cadeias de
nucleotídeos ligadas por pontes de hidrogênio.
Componentes dos ácidos nucleicos:
Uma pentose;
Um grupo fosfato;
Bases azotadas (T,A,G,C)
C e T e U têm a estrutura com somente um anel – pirimidinas;
A e G têm estrutura de dois anéis –purinas.
A principal diferença entre ribose e desoxirribose é a presença/ausência do
grupo hidroxilo do carbono 2 da pentose.
Formação das cadeias
1. Formação do nucleosídeo (ligação entre a base azotada e a pentose
(C1’);
2. Formação do nucleotídeo (ligação entre um fosfato e a pentose);
3. Formação da cadeia de DNA ou RNA.
Ligações fosfodiéster
-São ligações que ocorrem entre o fosfato e a pentose;
-Também podem ser chamadas 5 '→ 3' ligação
fosfodiéster;
-Grupo fosfato- confere ao DNA/RNA as propriedades
de um ácido;
-São estáveis, mas são facilmente quebradas por
hidrólise enzimática.

-Uma sequência de DNA é representada de 5’ -> 3’

(esquerda para a direita).
-As ligações de hidrogénio entre as cadeias opostas de
DNA são termodinamicamente estáveis;
Emparelhamento de bases complementares

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– adenina (A ) e timina (T) por duas ligações de hidrogénio

– guanina (G) e citosina (C) por três ligações de hidrogénio
Faz com que a estrutura do DNA seja regular e simétrica.

Regras de
Chargaff

-O empilhamento das bases proporciona a conformação da dupla hélice;

-Bases azotadas são apolares e hidrofóbicas;
-Os nucleotídeos são solúveis em água, pois a base azotada ligou-se a
um açúcar;
∑--Uma molécula de DNA de cadeia dupla é composta por bases
azotadas empilhadas (exclui a quantidade máxima de água a partir do
interior da dupla hélice), formando um núcleo hidrofóbico.
∑-Porque os açúcares e fosfatos são hidrossolúveis, ficam orientados
em direção ao exterior da hélice, onde os grupos fosfato polares
podem interagir com o ambiente polar.

Estrutura da cadeia dupla de DNA

Cadeia simples de DNA – fitas alternadas entre açucares e grupos fosfato.
Polaridade de cada uma das cadeias:
5‘- grupo fosfato
3'- grupo hidroxilo
A ligação de hidrogénio só poderia ocorrer se a polaridade das duas
fitas de DNA se apresentarem em direções opostas.
As duas cadeias da dupla hélice de DNA são antiparalelas. 5' → 3' e
3' → 5'
Sulcos na cadeia
O sulco menor- corresponde à depressão entre as duas cadeias
complementares
O sulco maior- equivale à depressão existente entre voltas adjacentes.
O sulco maior tem um papel mais preponderante nas interações DNA-
proteína.
A maioria das proteínas envolvidas na regulação da expressão do
gene ligam-se ao DNA no sulco maior.

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-A conformação do DNA depende de vários fatores: a intensidade e

direção do super enrolamento, modificações químicas das bases e meio
envolvente

Estruturas alternativas da dupla hélice

Z-DNA
Foi primeiramente formada sob condições de elevada concentração
de sais ou na presença de álcool.
Também ocorre em metilação das citosinas;

Separação reversível das cadeias de DNA

-Com temperaturas elevadas, as ligações de hidrogénio podem ser
quebradas (separação das cadeias de DNA) – desnaturação ou “melting”
-Com temperaturas elevadas as ligações fosfodiéster permanecem
intactas
-Com arrefecimento da solução, as cadeias complementares tendem a
formar uma nova hélice dupla - "renaturação"
-Replicação, Transcrição e Tradução – as fitas da dupla hélice devem
separar-se de forma transitória e reversível.
Métodos para desnaturar o DNA
-Redução da concentração de sal de uma solução de DNA, promove
desnaturação devido à remoção de catiões que protegem as cargas
negativas da superfície da molécula da hélice
- Solventes orgânicos e valores elevados de pH – promovem a quebra das
pontes de hidrogénio;

-Desnaturação reversível permite a manipulação de DNA in vitro.

-A renaturação permite hibridação - o emparelhamento de bases
complementares de fios de duas fontes diferentes.

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Efeito do teor de GC e concentração de

sal na desnaturação de DNA
quanto maior o teor de GC de uma
determinada molécula de DNA, mais
elevada será a temperatura necessária
para a desnaturar
Baixas concentrações salinas
promovem a desnaturação (remoção
de catiões que revestem as cargas
negativas da molécula de DNA)

Estruturas pouco usuais de DNA

A. Estruturas desalinhadas;
B. DNA cruciforme;
C. DNA hélice tripla;

Estruturas desalinhadas
São encontradas a
montante de
sequências
reguladoras;
Bloqueiam forquilhas
de replicação,
promovendo a
reparação de DNA
(influenciam a replicação e transcrição)
DNA cruciforme
Estruturas cruciformes
resultam de formações “stem-
loop” emparelhadas;
Estão associadas a sequências
palindrómicas;
Podem atuar como elementos
reguladores na replicação de
DNA e a expressão do genes
(procariotas e eucariotas).
DNA hélice tripla
É favorecida pela presença de sequências contendo repetições e
simetria em espelho;

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A cadeia de purinas da dupla cadeia associa-se a uma terceira cadeia

através do sulco maior;
A estrutura do tipo B-DNA inicial é mantida na nova conformação;
Estrutura com alguma relevância, pela relação (ocasional) com
terapias do cancro e doenças genéticas.
Ligações de hidrogénio Hoogsteen
O par AT: a adenina sofre uma rotação de 180° em torno da ligação ao
açúcar.
O par GC: Forma duas pontes de hidrogénio, em vez de três no par GC de
Watson-Crick
Superenrolamento
Uma fita de DNA dá uma volta completa ao eixo da dupla hélice a cada
10,4 pares de bases. adicionar ou subtrair voltas impõe uma tensão!

Superenrolamento positivo – o DNA está torcido na direção da hélice

Superenrolamento negativo - a torção é na direção oposta, resultando
num afrouxamento das bases
-Superenrolamento é menos estável que o estado relaxado de DNA;
-Na natureza, o DNA apresenta superenrolamento negativo resultado da
ação de enzimas específicas - as topoisomerases

Topoisomerases
-Enzimas que adicionam ou removem rotações da dupla hélice de DNA,
quebrando temporariamente
uma ou as duas cadeias da
dupla hélice, promovendo a
rotação de uma cadeia em
volta da outra e ligando-a de
novo.
-Topoisomerases
desempenham papéis
importantes na replicação do
DNA e transcrição de genes.

Topoisomerase I
Não necessitam de energia (ATP);
Clivam a ligação fosfodiéster entre nucleotídeos adjacentes de uma
das cadeias de DNA e passa, a outra através da ligação quebrada.

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Não criam extremidades livres: o terminal 5’ permanece

covalentemente ligado ao resíduo de tirosina e o terminal 3’ ligado a

outra região da enzima.

Genoma

Nucleossoma: complexo de oito proteínas histónicas, duas moléculas de

cada uma das histonas H2A, H2B, H3 e H4 e a dupla cadeia de DNA com
~180 pb.
Compactação do DNA

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-A dupla hélice em torno do nucleossoma é ligeiramente esticada.

Assim:
DNA esticado – 10,5PB/volta
DNA no nucleossoma – 10,17 PB/volta
As histonas podem ser removidas por elevadas concentrações de sais –
sugerindo a natureza eletrostática das interações DNA-histonas nucleares.

Ciclo celular e replicação

-Os cromossomas e o
DNA são copiados
durante a fase S
(síntese).
-Os cromossomas
replicados e separam-se
durante a fase M
(mitótica), com cada
uma das “células filhas”
a receber uma copia de
cada cromossoma
durante a divisão da
célula.
-As fases M e S são
separadas por duas
fases G (G1 e G2), onde há expressão de mRNAs e as proteínas.

Modelos propostos de Replicação

1- Modelo conservativo: DNA original servia de molde para a
formação de uma molécula nova;
2- Modelo dispersivo: cada molécula-filha seria formada por porções
da molécula original e por regiões sintetizadas de novo.
3- Modelo semiconservativo: cada molécula nova de DNA seria
formada por uma cadeia simples da molécula original e uma nova.

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Experiência de Meselson e Stahl

-Durante gerações cultivaram bactérias E.coli num meio com um isótopo de
azoto(N15). Verificaram que ao fim do experimento as bactérias tinham
assimilado o isótopo de nitrogênio e o usado para sintetizar novas
moléculas de DNA.
-Em seguida, meteram as bactérias a crescer em nitrogênio (N14), para ver
se as novas moléculas sintetizadas assimilariam esta forma de nitrogênio.
-Através da centrifugação por gradiente de densidade puderam analisar o
DNA das varias “colheitas” de bactérias.

As conclusões a que chegaram:

-Demonstraram que o DNA replicou-se semiconservativamente, significando
que cada cadeia de DNA serve como um modelo para a síntese de uma
nova cadeia , complementar!

Replicação: princípios básicos

-a replicação de DNA é semidescontínua (uma das cadeias é sintetizada
continuamente e a outra, de forma descontínua).
-a extensão da nova cadeia – incorporação de nucleótidos – assenta no
princípio da complementaridade das bases
-a síntese de DNA é assegurada por DNApolimerases (14 DNA polimerases
eucariotas)

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DNA polimerase adicionam nucleótidos na direção 5’- 3’

-Catalisam a formação de uma ligação fosfodiéster entre o primeiro grupo
5‘-fosfato de um novo dNTP e o grupo 3'-hidroxilo do último nucleótido .
Em eucariotas:
• múltiplas origens de replicação localizadas ao longo do cromossoma.
• origem das bolhas de replicação e forquilhas de replicação.
Permitem a replicação bidirecional do DNA
Processo mais rápido

Replicação bidirecional
REPLICAÇÃO CONTÍNUA
ocorre na cadeia líder
segue a mesma direção da forquilha de replicação
após reconhecimento e ligação ao grupo 3’-OH livre do primer de
RNA, a DNA polimerase inicia a elongação com elevada capacidade
de processamento (parando apenas quando encontra a forquilha ou
quando toda a cadeia é replicada).
REPLICAÇÃO DESCONTÍNUA
ocorre na cadeia atrasada
segue a direção contrária da forquilha
a cadeia atrasada é replicada em pequenos segmentos (100-200
nucleótidos em eucariotas) – fragmentos Okazaki

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este processo de replicação envolve: síntese de primer (primase),

elongação (DNA polimerase), remoção do primer (exonuclease) e
preenchimento da quebra (DNA polimerase) e ligação os fragmentos
Okazaki (ligase).
Etapas da replicação
-Iniciação: Envolve a montagem do “garfo” de replicação como forma de
origem da replicação da sequencia de DNA. O “garfo” é gerado por um
complexo de proteínas chamado “primosome”;
-Elongação: Adição de bases por outro complexo de proteínas chamado
“replissome”. As cadeias parentais desenrolam-se e as cadeias filhas são
sintetizadas.
-Terminação: Nos eucariotas, a replicação continua até um “garfo” se
encontrar outro proveniente de outra replicação adjacente.

Enzimas presentes:
Antigénio Nuclear Celular Proliferante(PCNA) – Coordena a
maturação do fragmento de Okasaki;
Proteínas de manutenção de mini cromossomas (MCM)-
helicases para abrir a cadeia dupla de DNA com o objetivo de iniciar
um novo garfo de replicação de DNA;
Complexo de RNA polimerase e Pol α - sintetiza iniciadores de
RNA e um pequeno fragmento de DNA para iniciar os fragmentos de
Okazaki;
O fator de replicação -C - é o carregador de braçadeira para PCNA
para carregar em DNA de cadeia dupla. (??)
Proteína de replicação - Uma proteína de ligação do DNA de cadeia
simples para proteger o modelo de DNA da clivagem da nucleasse.

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As polimerase de DNA nos eucariotas

A- Replicações de alta fidelidade;

A atividade das exonuclease 3'-5 'da enzima permite a excisão do par de

bases incorreto – revisão(proofreading)

No passo seguinte, a DNA polimerase pode incorporar a base correta

e a replicação pode continuar em frente. Isso preserva a integridade
da cadeia de DNA original que é copiada para as células filhas.
A amplificação de alta fidelidade é essencial para experiências cujo
resultado depende da sequência de DNA correta)

B- Polimerases de baixa fidelidade (propensas a erros) (deficiência

de exonuclease)

-Uma das principais características da replicação do DNA nos eucariotas é a

sua plasticidade:
Um exemplo disse é a extrema rapidez de replicação do genoma de
ovos dos anfíbios;

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Origens da Replicação
-Nos eucariotas, a replicação começa em vários sítios internos dos
cromossomas;
-“Negative Supercolling” – são um dos principais sítios;
-A origem das cadeias de DNA normalmente têm muitas adeninas e timinas.
Por isso diz-se que são ricas em “AT”;

Formação do complexo de pré-replicação

-Uma vez que a cromatina tenha sido esticada, proteínas iniciadoras
especificas reconhecem e ligam as sequencias originais do DNA , formando
o complexo OCR(origin-recognition complex).
-ORC é regulado pelo ATP;
As células eucarióticas separam a seleção de origem da iniciação, através
da formação de um complexo de pré-replicação, o que evita a super-
replicação do genoma.

- O complexo liga-se à origem da replicação e, em seguida, recruta as

proteínas Cdc6 (célula da divisão do ciclo 6), Cdt1 (Processo de cromatina e
DNA Replication Factor 1) e Mcm (manutenção do mini cromossoma). Todas
as proteínas essenciais para a iniciação da replicação do DNA!!
- As proteínas acessórias também desempenham um papel na iniciação,
como a proteína de ligação ao DNA de cadeia simples (SSB) em E. coli e a
proteína de replicação A (RPA) em mamíferos.

Formação do Pre-RC
- A remoção de histona na origem da replicação permite o acesso do pré-RC
ao modelo de DNA;
- A hidrólise do ATP no Cdc6 leva ao "carregamento" do complexo MCM e ao
lançamento do Cdt1;
- A dissociação de Cdc6 na origem e a hidrólise de ATP associada à ORC
concluem a montagem do pré-RC

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Licenciamento de replicação
- O sistema de licenciamento da replicação garante uma regulação rigorosa
da formação e ativação de complexos PR pelos níveis de cinases
dependentes de ciclinas (CDKs).
- Their kinase activity phosphorylates selected serines and threonines on
specific proteins - moldando suas funções específicas;

Ciclo Celular
As células da fase G1- monitorizam o ambiente, e quando os sinais
necessários são recebidos, as células sintetizam o RNA e as proteínas para
induzir o crescimento.
Fase S - quando as condições são certas, as células "se comprometem" com
a síntese de DNA e replicam seu DNA cromossómico.
As células da fase G2- continuam a crescer e preparam-se para a mitose;

O anexo de cada “kinetochore” a um micro túbulo do fuso é avaliado no

ponto de verificação M (no final do estágio na metáfase da carocinese).
Moléculas reguladoras do ciclo celular: Regulamento Positivo
- (Cdks) são proteínas quinases que, quando totalmente ativadas, podem
fosforilar e assim ativar outras proteínas que avançam o ciclo celular após
um ponto de controlo;
- Para se ativar completamente, um Cdk deve se ligar a uma proteína ciclina
e depois ser fosforilado por outra quinase.
As cíclinas acumulam-se gradualmente durante a interfase e são
destruídas abruptamente durante a mitose.

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Os processos da
iniciação de replicação
são divididos em dois passos:
Formação pré-RC: montagem sequencial de ORC, Cdc6, Cdt1 e
MCM2-7
Ativação de garfos de replicação: a atividade das CDKs facilita o
carregamento de outras proteínas de replicação essenciais no pré-RC.
MCM2-7 é o complexo de proteína de licenciamento
- Quando a ORC é incapaz de hidrolisar ATP, a montagem do complexo
Mcm2-7 no DNA de origem é inibida;
- Uma vez que o complexo Mcm2-7 é carregado, ele torna-se fortemente
associado ao DNA de origem, e o complexo ORC-Cdc6-Cdt1 não é mais
necessário para manter a ligação ao DNA.
- Somente origens licenciadas contendo Mcm2-7 podem iniciar um par de
garfos de replicação.
- A atividade da helicase do complexo desenrola o DNA antes de cada garfo
de replicação
-Uma vez que os garfos são iniciados, Mcm2-7 é deslocado da origem e
move-se com o garfo de replicação.
Replication licensing events lead to origin activation only once
during the cell cycle

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-
Regulação do sistema de licenciamento de replicação por CDK
- ORC, Cdc6, Cdt1 e Mcm2-7 podem ser regulados de forma independente
como consequência da atividade de CDK.
- Isso significa que nenhum outro Mcm2-7 pode ser” carregado” durante na
fase S, G2 e precocemente durante a mitose, quando a atividade de CDK é
alta!!
- A remoção das proteínas de licenciamento nas origens durante a fase S,
bloqueia a formação de complexos de pré-replicação e garante que as
origens iniciem um par de garfos bidirecionais apenas uma vez por ciclo
celular!
- A atividade de CDK fosforila Mcm2-7. Esta modificação faz com que ele se
associe com RanGTP. Este complexo “sequestra” Mcm2-7 no núcleo e
impede-o de se ligar às origens
da replicação.

Durante as fases S e G2,

quando as CDKs estão ativas, a
formação de um complexo
entre Crm1, Ran-GTP e MCM2-7
pode se formar no núcleo (setas
vermelhas).

Na ausência de atividade de
CDK na mitose tardia e início do
G1, o sistema de licenciamento
está ativo e o MCM27 pode ser
montado no pré-RC (seta
verde).

Vários componentes pré-RC são

de fato excluídos do núcleo durante as fases S e G2:
• Nos metazoários, o grupo solúvel do componente pré-RC Cdc6 é
exportado para fora do núcleo numa fase G1 tardia;
• Em leveduras, outros dois componentes pré-RC, Cdt1 e MCM2-7 são
exportados.

Gradiente RAN

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- Ran controla a atividade dos receptores de transporte nuclear: ele conduz

a montagem e desmontagem de complexos entre receptores de importação
/ exportação nuclear e sua carga.
-O fator de troca de RanGTP está ligado à cromatina, enquanto a proteína
ativadora de RanGTPase (RanGAP) está localizada no citoplasma.
-Isto cria um gradiente
íngreme do Ran, com a
forma ligada ao GTP
predominante no núcleo (ou
próxima dos cromossomas
na mitose) e a forma do
GDP que se encontra
predominante no
citoplasma.
-

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- Comutação de polimerase: é regulada por interações competitivas

proteína-proteína envolvendo DNA polimerases α, δ e ε, proliferação de
antígeno celular-celular (PCNA), fator de replicação C (RFC) e (proteína de
replicação A) RPA
- Na presença do ATP, o RFC (o "carregador de braçadeira") abre o trímero
de PCNA, passa o DNA no anel e depois o coloca novamente.
- DNA pol ε ou pol δ reconhecem este iniciador e começam a liderar ou a
rejeitar a síntese da cadeia, respectivamente

Maturação da cadeia de DNA nascente

- A maturação do DNA recentemente sintetizado envolve:
• remoção de primário de RNA,
• preenchimento de espaço,
• junção de fragmentos de Okazaki (cadeia de atraso)

Juntando fragmentos de Okazaki - A formação de uma ligação

fosfodiéster entre fragmentos de Okazaki adjacentes pela ação da ADN
ligase I em associação com PCNA.
A ADN ligase 1 discrimina os substratos que contêm RNA, evitando assim a
ligação de fragmentos de Okazaki antes que o iniciador de ARN 5 'seja
removido.
Depósito de histona. Os nucleossomas são remontados no DNA nascente
por interação com o fator de montagem de cromatina 1 (CAF-1) e PCNA.
O fator de montagem de cromatina 1 (CAF-1) traz histonas ao garfo de
replicação de DNA via interação direta com PCNA. A deposição de histonas
rápidas dependentes de CAF-1 por trás do garfo de replicação é necessária
para prevenir rupturas da dupla cadeia de DNA espontânea e prisão de fase

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S em células humanas. As histonas H3 e H4 formam um complexo e são

depositadas primeiro, seguidas de dois dímeros histona H2A-H2B.

Replicação de Telomerases
-

Telómeros
 região de sequências de nucleotídeos repetidos em cada extremidade
da cadeia de DNA;
 protege o fim do cromossoma da degradação ou da fusão com os
cromossomas vizinhos - eles fazem uma espécie de capa nos
cromossomas.
 Os telómeros permitem a replicação completa do DNA (extremidades
do DNA), uma vez que são preparadas a partir de saliências;
 Nos vertebrados a sequência de nucleotídeos nos telómeros é
TTAGGG;
A perda de telómeros leva :
 Fusões cromossômicas de ponta-a-ponta!
 Facilitação de recombinação genética;
 Desencadeia a morte celular através da apoptose

-Os telómeros humanos têm aproximadamente 15-20 kb de comprimento!

Manutenção de telómeros pelas telómerases

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-A telomerase está ativa em células-tronco e na maioria das células cancerosas, mas está
normalmente ausente ou em níveis muito baixos na maioria das células somáticas.

-A telomerase posiciona um modelo de RNA para se ligar ao DNA dos telomeros.

Telomerase: ribonucleoproteína (RNP)

-TERT (TElomerase Reverse Transciptase) - fornece ação catalítica;

Transcriptase reversa - uma polimerase que sintetiza DNA usando um modelo de RNA

Elongação da cadeia 3'G e translocação pela telomerase

Mechanism for TRF2-mediated telomere protection – T-loop

-O loop em associação com TRF1 e TRF2 pode auxiliar na prevenção do acesso da telomerase,
uma vez que a telomerase requer um final de 3 'não emparelhado. As proteínas de ligação dos
telomeros funcionam para manter e regular esta estrutura única!

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Regulação da atividade da telomerase

-As proteínas POT1 (proteção de telômeros), TRF1 (TTAGGG repeat binding factor 1) e TRF2
(TTAGGG repeat binding factor 2) podem impedir o acesso de telomerase a telômeros pela
formação de uma estrutura de cromatina dobrada.

A telomerase é ativa em tecidos proliferativos, como em células embrionárias e fetais

precoces, células-tronco, células inflamatórias ... Além disso também está presente na maioria
das células cancerosas humanas

Fatores que afetam o comprimento dos telomeros

-Replicação normal;

-Danos por oxidação do DNA;

-Erros na replicação;

O alongamento alternativo das

Telomerases (ALT) envolve a
replicação de DNA mediada por
recombinação homóloga!

Gene P53

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 Codifica uma proteína que regula o ciclo celular;

 Essa proteína funciona como supressor tumoral por isso também é chamada de
Proteína tumoral;
 Este gene dá estabilidade na medida que previne as mutações que possam ocorrer no
genoma;

O limite Hayflick

é o número de vezes que uma população de células humanas normais irá se dividir até a
divisão celular parar!

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AS EXCEPÇÕES DO LIMITE DE HAYFLICK: algumas células podem continuar a

crescer quase indefinidamente (células de câncer ou células infectadas com vírus)

Pontos principais sobre os telómeros

Ao estender as extremidades 3 'dos cromossomas (telómeros), a enzima telomerase

elimina a perda progressiva das extremidades cromossômicas.
A telomerase é um complexo de ribonucleoproteínas (modelo de RNA de transcriptase
reversa +).
Quando os telómeros se tornam muito longos, as proteínas POT1, TRF1 e TRF2
formam uma estrutura de cromatina protetora chamada inibição de t-loop( além da
atividade da telomerase)
A maioria das células somáticas humanas não expressa suficientes telomerases para
manter um comprimento dos telómeros constante durante os ciclos de replicação do
DNA.
Evidências experimentais sugerem uma relação entre o encurtamento de telômeros e
o envelhecimento.
Na maioria das células cancerígenas, caracterizadas por terem um crescimento
descontrolado, a telomerase foi reativada”

DNA mitocondrial

-mtDNA é geralmente uma molécula circular de ADN de cadeia dupla que não está enrolada
em histonas.

-Em animais têm normalmente entre 16-18 kb!

-As duas cadeias de DNA são diferentes:

 Cadeia pesada- rica em guanina (purina);

 Cadeia leve – rica em citosina (pirimidina);

Nos humanos:

 Cadeia pesada -28 genes;

 Cadeia leve -9 genes;

Região de controlo do DNA mitocondrial contém:

 A origem de replicação da cadeia principal;

 Promotores para a transcrição de ambas as cadeias;

O DNA mitocondrial:

 13 mRNA ;*
 2 RNA ribossomal;
 22 RNA transferência;

-* 13 proteínas essenciais para a oxidação fosforilativa;

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-O DNA mitocondrial é exclusivamente fornecido pela progenitora! (está presente na cauda

dos espermatozoides e por isso não é usado durante a fecundação).

Modelos de Replicação

Modelo de deslocação da cadeia (The strand displacement model (SDM))

 Assíncrono;
 Assimétrico;
 Não emparelhado

-Modelo mais aceite a nível mundial;

-Apenas um garfo de replicação;

-Apenas um primer por cadeia;

A replicação é unidirecional: tanto a cadeia pesada como a cadeia leve podem ser replicadas
continuamente!

Processo:

-Os primers de RNA são sintetizados pela polimerase de RNA mitocondrial;

-Os primers de RNA são clivados pela RNase MPR((multifunction endoribonuclease).

The strand coupled model

-Propoe semidescontinuidade na replicação do DNA;

A replicação é bidirecional e ocorre em um modo semidiscontinuo, envolvendo a síntese de

fragmentos de Okazaki na cadeia retardada.

Modelo RITOLS

-Incorporação de DNA através da cadeia descontínua (3´-5´).

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Diferença entre SDM e RITOLS

A- SDM(modelo 1) propõe que apenas uma cadeia se liga ás proteínas, liga a cadeia H
durante a replicação da cadeia descontinua;
B- RITOLS propõe que uma porção de DNA mitocondrial transcrito liga-se à cadeia H.

Proteínas de replicação do DNA mitocondrial

Danos Vs Mutações

-A DNA polimerase comete erros, mas o seu mecanismo de “proofreding” nem sempre os
corrige na totalidade;

-Os danos no DNA estão associados á exposição a diferentes agentes;

-A replicação de DNA de baixa fidelidade é benéfica para a evolução das espécies e para o
aumento diversidade pois leva a uma maior sobrevivência quando os organismos são sujeitos a
ambiente em mudança!

-Mutações em células-tronco podem levar a distúrbios genéticos hereditários (ou aptidões),

enquanto mutações em células somáticas podem levar a doenças adquiridas, como cancro ou
distúrbios neurodegenerativos!

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Mutação silenciosa: Não altera a sequencia de aminoácidos;

Mutação sem sentido: resulta num codao de

STOP antes do tempo ; provoca formação de
proteínas menores(sem função);

Missense Mutation: Altera o aminoácido

formado;

Frameshift mutation: Adição ou deleção de

um nucleotido faz com que todos os
aminoácidos sejam lidos de forma errada;

Consequências fenotípicas das mutações

A antecipação genética na herança da doença está relacionada à expansão das repetições de

trinucleótidos;

Agentes mutagênicos e danos no DNA

-Agentes mutagênicos: agentes físicos ou químicos demonstraram um aumento na taxa de

mutações no DNA.

-Danos no DNA: consiste em qualquer alteração introduzida no DNA, pois leva á formação de
uma errada cadeia dupla de DNA.

Existem três grandes classes de danos no DNA:

1. Mudanças de bases únicas (desaminação, alquilação e oxidação de bases);

2. Disturção estrutural;
3. “DNA backbone damage”

Desanimação

-A desaminação é o tipo de dano hidrolítico mais frequente e importante e pode ocorrer

espontaneamente pela ação da água ou ser induzida por um mutagênico químico.

Alkylation

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Oxidação

Os potentes agentes oxidantes são gerados por radiação ionizante e por agentes químicos que
geram radicais livres.

OxoG é altamente mutagênico porque pode formar um par de bases Hoogsteen com adenina.

- é o tipo mais comum de mutações que causam cancro humano;

Distorção estrutural

As lesões mais frequentes de DNA induzidas por radiação UV são a indução de dímeros de
pirimidina entre duas bases vizinhas da timina.

Isso interrompe os pares de bases complementares que formam a dupla hélice.

Os dímeros de timina distorcem assim a estrutura da cadeia dupla de DNA.

Reparação do DNA

 O DNA é a única macromolécula biológica capaz de se reparar;

 Mais de 100 genes são necessários para que isso aconteça;
 O Cancro é uma consequência da ineficácia da reparação de DNA.

Mecanismos de reparação de DNA

-“Damage by-pass” – Mecanismo de tolerância;

-Reparação direta – mudanças químicas reversas;

-Reparo por excisão: remove bases incorretas e substitui por bases corretas;

DNA repair by lesion bypass

Lesion Bypass

Polimerases de alta fidelidade

-Copiam zonas de DNA não danificadas, mas são incapazes de fazer atalhos para contornar as
zonas lesionadas do DNA que causam problemas na dupla hélice de DNA.

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Polimerases de baixa-fidelidade – propensa a erros

-A polimerase replicativa, sendo incapaz de contornar uma lesão no DNA, "cai" do DNA ou
simplesmente se transloca a jusante da lesão para continuar a replicação.

-Isso permite o carregamento mediado por PCNA de outra DNA polimerase capaz de replicar a
lesão

Bypass of DNA damage

-As polimerases de DNA especializadas de baixa fidelidade, propensas a erros substituem

transitoriamente as polimerases replicativas e copiam o DNA danificado passado em um
processo chamado síntese de translesão (TLS).

1. A máquina de replicação pára em um dímero de timina no modelo para a síntese de

cadeia principal.
2. DNA pol “e” é substituído por uma das polimerases especializadas.
3. Após a síntese de transleção, ocorre outro interruptor de polimerase. DNA pol ι (iota)
é liberado e substituído por DNA pol “e”. A replicação de DNA de alta fidelidade
continua.

Lesion Bypass produces:

-mutantes de substituição de nucleótidos: a maioria das lesões altera completamente as

propriedades de emparelhamento das bases preexistentes;

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Reversão do dano de DNA

-Reparação do DNA por fotoreativação:

A radiação UV provoca formação de dímero TT

A enzima absorve perto de UV para a luz visível e quebra os anéis formados pelos dímeros de
pirimidina para restaurar os dois resíduos de timina.

-Reparação do DNA por remoção do grupo metil

A metiltransferase catalisa a transferência do grupo metilo em O6-metilguanina para o grupo

sulfidrilo (SH) de um resíduo de cisteína na enzima. Isso restaura a Guanina normal na
sequência de DNA e inativa a enzima.

Reparo do DNA pela remoção do DNA danificado

Mecanismo de reparação por excisão

- repara muitos tipos de mutações_ substituições, pequenas deleções.. Está dependente de

haver cadeias corretas de DNA.

Mecanismo de reparação por múltipla por excisão

-Reparo por excisão de bases- apenas corrige uma base;

-Reparo por excisão de nucleotídeos;

Processo:

- é iniciado pela DNA glicosilase. Esta vai clivar a ligação N-glicosídica.

-formação de um local abásico no DNA.

-Diferentes DNA glicosilases reconhecem diferentes mudanças de bases únicas:

 Oxidação/redução de bases;
 Metilação de bases;
 Deaminação de bases;
 Emparelhamento incorreto de bases

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- O uracilo é removido pela glicosilase DNA-uracil de forma a criar um local abásico.

Short Patch repair:

1. Um 3 'nick por beta-liasa associada a glicosilase cliva a ligação fosfodiéster adjacente

ao local abasico.
2. O único nucleótido danificado é excisado por APE1 (AP endonuclease 1).
3. A síntese de reparo é mediada pela DNA polimerase β para reparos de caminhos
curtos.
4. A lacuna no esqueleto do DNA é ligada pela ADN ligase 3-XRCC1

Long patch repair:

1. Um 5 'nick por APE1 em associação com PCNA, cliva a ligação fosfodiéster adjacente
ao local abasic.
2. FEN-1 excisa 2–10 nt;
3. A síntese de reparo é mediada pela DNA polymerase δ ou ε.
4. A lacuna no esqueleto do DNA é ligada pela DNA ligase 1

Proteínas envolvidas na reparação por excisão de bases

DNA Glicosilase: responsável por reconhecimento de regiões danificadas. Eles tiram as regiões
danificadas fora da cadeia dupla de DNA e em seguida clivam a ligação N-glicosidica das bases
afetadas, deixando um local AP.

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AP endonucleases: Clivam um local AP para suportar (...?)

Nucleotide excision repair (NER)

O reparo de excisão de nucleotídeos (NER) e a transcrição são acoplados e o processo de

reparo prossegue mais rapidamente através de uma cadeia transcrita de genes:

- Genomico global (GG-NER): reconhecendo lesões em todo o genoma

-NER acoplado a transcrição (TC-NER): identifica lesões na cadeia transcrita de genes ativos

A via de reparação de excisão de nucleotídeos é usada para reparar a distorção estrutural, por
exemplo, protuberâncias de dímeros TT induzidos por irradiação UV.

In Global Genomic-NER:

1. O dano do DNA é reconhecido pela

XPC. XPC aparentemente recruta XPA,
RPA e TFIIH.
2. O desenrolamento do DNA duplex é
promovido pela ação de helicases XPB
e XPD que são subunidades do
complexo TFIIH.
3. XPC é liberado e a endonuclease XPG
junta-se ao complexo de reparo. XPG
faz uma incisão 3 'e a endonuclease
XPF-ERCC1 faz um corte de 5'.
4. A cadeia danificada (24-32nt) é
libertada.
5. A síntese de reparo é mediada por ADN
pol δ ou ε em associação com PCNA,
RFC e RPA.
6. A ligação do espaço restante é
mediada pela ADN ligase 1.

In Transcription-Coupled NER:

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TC-NER é muito semelhante ao GGNER, exceto que a RNA polimerase desempenha o papel de
XPC na detecção de dano e na fusão inicial do DNA

DNA repair II

Mismatch repair pathway(mmr)

-uma grande região de DNA, incluindo o desfasamento, é excisada: transferindo o DNA

danificado de um complexo com atividade de nuclease para um complexo com atividade de
polimerase

Processo:

 Reconhecimento do DNA danificado;

 MutLα introduz nicks aleatórios em locais distais na cadeia.

 O carregamento de EXO1 no lado 5 'da incompatibilidade ativará a atividade da

exonuclease 5' a 3 'até que o desajuste seja removido. (?)

 Síntese de reparação: 5 '→ 3' síntese de reparo é mediada por DNA pol δ e fatores
associados

 Ligação: A ligação do espaço restante é catalisada pela ADN ligase 1.

(A deficiência hereditária no reparo de incompatibilidade causa uma taxa aumentada de

mutações genéticas e susceptibilidade a certos tipos de cancro)

Proteínas envolvidas no MMR

-MutSα/β (MSH2–MSH3/6) recruits MutLα (MLH1–PMS1/2 heterodimer): ativa a maquinaria

de reparação do DNA.

-The exonuclease EXO1: uma ruptura de uma única cadeia pela exonuclease EXO1 inicia os
reparos em associação com PCNA, em seguida, remove progressivamente a porção da corda
entre o nick e a falta de correspondência.

- DNA polymerase δ

- The replication clamp PCNA

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-The clamp-loader RFC (replication factor C)

-The single-strand DNA-binding protein RPA (replication protein A)

DNA double strand break repair (DSB)

DNA double strand break repair (DSB)

-Recombinação homóloga: repara rupturas de duas

vertentes recuperando informações genéticas de um
cromossoma homólogo não danificado. No caso em que os
dois cromossomas não são exatamente homólogos, a
conversão de genes pode ocorrer.

-Junção final não homogénea: reúne rupturas de duas

vertentes através da ligação direta das extremidades do
DNA. Nas células de mamíferos, as rupturas de duas
vertentes no DNA são principalmente reparadas através de
união final não-homogénea.

-A recombinação homologa é baseada na abilidade da cadeia de DNA encontrar regiões que

tenham homologia quase perfeita em qualquer parte do genoma.

ATM(ataxia telangiectasia mutated) é uma transdutor de sinal chave.

-ATM é recrutado para o local de quebra e fosforila algumas das proteínas envolvidas no
reparo do DNA e no controle do ciclo celular. Um alvo importante do ATM é a proteína
supressora de tumor p53.

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Recombinacao homologa:

Non-homologous end-joining(NHEJ):

Passos-chave enzimaticos:

- Ação dos nucleotidos;

- Polimerização;
- Ligação;

Mutações nos sistemas de reparo de DNA podem causar doenças no ser humano:

BRCA1 and BRCA2

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- Proteínas supressoras de tumores;

-Têm um papel de vital importância na reparação do DNA.

Ku70/Ku80 heterodimer

-O heterodímero Ku70 / Ku80 é necessário para o NHEJ e atua como um repressor da FC, por
meio da inibição da ressecção final do DNA.

Reparo DSB dependente

do NHEJ: a fidelidade é
baixa e, na maioria das
vezes, associada a
deleções de
nucleotídeos nas
junções de reparação.

Os componentes
principais do C-NHEJ são o heterodímero Ku70 / Ku80 que se liga com alta afinidade às
extremidades do DNA e protege-os da degradação, e DNA Ligase IV, que catalisa a ligação final

Antirecombinases

-Iniciação HR é limitada por antirecombinases;

-O primeiro passo para os mecanismos dependentes de HR são a formação de ssDNA que é

então revestido pela proteína de replicação A (RPA)

A invasão de Strand e a formação de D-loop são passos comuns de mecanismos de dissolução

de junção de Cadeia Holliday (HJ) e mecanismos de junção da cadeia dependentes de síntese
(SDSA).

Controlling dHJ Metabolism

-Ocorreram estruturas duplas HJ (dHJ) se as moléculas das articulações não forem processadas
por:

 SDSA (antirrecombinases and D-loop disruption)

Como são processadas?

A ligação direta das cadeias extensas às extremidades 5 'expostas do DSB (círculos azuis) leva à
formação dHJ.

 I. DHJ clivagem: clivagem endonucleolítica (triângulos pretos) por HJ resolvases (SLX4-

SLX1 e GEN1) pode resultar em resultados cruzados ou não transversais, dependendo
da orientação da clivagem.

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 II. Dissolução: dHJ dissolução por BLMTOPOIIIα * forma produtos não-cruzados.

 III. D clivagem de loop: resolução com cruzamento por processamento nucleolítico
(triângulos pretos) e ligadura (setas pretas encaracoladas) do D-loop pelo MUS81-
EME1 resolvase.

Microhomology-mediated end joining (MMEJ):

-
um

mecanismo de reparo propenso a erros que envolve o alinhamento de seqüências micro-

homólogas internas às extremidades quebradas antes da união - Única rotura de notas (SSA).

-um mecanismo de reparação de DSB mutagênico que usa 1-16 nt de homologia flanqueando
o DSB iniciador para alinhar as extremidades para reparo (C-NHEJ não envolve homologia ou
apenas 1-4 nt de homologia nos usos de junção).

MMEJ mechanism

PARP1: Poly-ADP ribose polymerase PARP1 é ativado por DSBs e é capaz de competir com Ku
para ligação de extremidade de DNA. A maior afinidade de Ku para fins em comparação com
PARP1 poderia explicar a predominância de C-NHEJ.

CtIP: pode modular as funções atribuídas ao BRCA1. A radiação ionizante induz a sua
hiperfosforilação e dissociação do BRCA1 de forma dependente do ATM.

Modelo para a atividade da polimerase θ (Polθ)

O loop de inserção2 é necessário para o bypass da lesão de DNA e a junção final mediada por
microhomologia (MMEJ).

Polθ emprega potencialmente seus diferentes domínios para promover a formação e / ou a

estabilização do intermediário recozido:

• sua dimerização irá amarrar o DNA juntas (I, II);

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• o domínio ATPase poderia potencialmente deslocar proteínas de ligação a ssDNA (III) • Polθ
poderia estender as
extremidades
ressecadas, gerando
MH (IV) adicional.

• A atividade Polθ é
necessária para a
síntese de
preenchimento (v),
um passo crucial
durante o MMEJ

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