Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Replicao do DNA
O DNA a molcula informacional por excelncia. Os genomas de boa parte
dos seres vivos (da totalidade, se no considerarmos os vrus entre os seres vivos)
so formados por duas fitas complementares, numa estrutura circular ou distribudo
em vrias estruturas lineares. A esta estrutura d-se o nome de cromossomo. No
processo de replicao a informao gentica contida nas fitas copiada em duas
novas fitas, que saem pareadas, cada uma, com as fitas antigas, num processo
designado como replicao semiconservativa. O DNA uma molcula
extraordinariamente estvel e de composio qumica muito simples: a estrutura
principal da fita formada por um acar (a desoxirribose) ligada ao seguinte por
uma ponte fosfodister. As bases, que se ligam aos acares e esto voltadas para
dentro da fita dupla, so de apenas 4 tipos: Adenina, Timina, Guanina e Citosina. As
duas fitas se unem por pontes de hidrognio entre as bases de fitas diferentes,
numa regra fixa, conhecida como regra de Chargaff: A pareia com T atravs de duas
pontes de hidrognio, e G pareia com C atravs de trs. Uma vez pareadas as fitas
assumem a conformao de uma dupla hlice, com duas fendas helicoidais. A
replicao da informao gentica tem que ser um processo muito acurado, embora
no desprovido de erro, pois, se por um lado o um excesso de erros levaria morte
da clula filha por mutaes deletrias, por outro lado uma ausncia total de erros
em muitas geraes implicaria uma evoluo lenta ou nula (erros no DNA podem ser
introduzidos por outros mecanismos, alm da replicao).
1.1 Transcrio
O RNA o intermedirio da informao gentica nos organismos em que a
informao gentica primria est armazenada na forma de DNA. Os livros-textos
em geral dividem os RNAs em trs classes: RNAs mensageiros (mRNA), RNAs
transportadores ou de transferncia (tRNA) e RNAs ribossomais (rRNA). A existncia
do tRNA foi primeiramente proposta por Crick ainda na dcada de 50, muito antes de
sua descoberta, a partir de consideraes tericas. Os rRNAs, constituintes dos
ribossomos (lembre-se que a subunidade leve tem um RNA e a subunidade pesada,
dois), j eram conhecidos e os tRNA foram logo descobertos. Os mRNAs de
bactrias tm uma vida mdia muito curta, cerca de 60 segundos, o que faz com que
seu isolamento e caracterizao seja muito difcil. Os dois outros so muito mais
estveis. Os mRNAs eucariotos, contudo, so bastante mais estveis. Ainda assim
preciso extremo cuidado na purificao para que as RNAses presentes nas solues
biolgicas no degradem o mRNA celular que queremos purificar.
A sntese de RNA a partir do DNA feita pela RNA polimerase e se chama
transcrio. Cada base de DNA pode parear corretamente apenas com uma base no
RNA, numa regra semelhante quela proposta por Chargaff: A pareia com U, T com
A, C com G e G com C.
2. Replicao de RNA
Alguns RNAs patognicos, tais como virides, e RNAs satlites, so RNAs
circulares. Eles replicam pelo mecanismo de crculo rolante, produzindo uma longa
fita de RNA. A clivagem desta fita nos vrus individuais feita in vitro sem adio de
qualquer enzima. Uma estrutura secundria do RNA denominada "cabea de
martelo" a responsvel pela auto clivagem do RNA.
Na atual epidemia de dengue importante lembrar que o vrus da dengue
um vrus a RNA que no emprega um intermedirio de DNA para replicar, no
sendo, portanto, um retrovrus, como o HIV.
2.1 Traduo
O processo de produzir uma sequncia de aminocidos a partir do RNA
chamado traduo e o mais complexo dos processos no fluxo da informao
gentica. Um conjunto vasto de protenas, cofatores e o ribossomo, alm do tRNA e
do mRNA, so necessrios para a sntese proteica. Diferentemente do que ocorre
com os dois outros passos do fluxo da informao gnica, na traduo 3 bases de
RNA formam um cdon, que interpretado pelo sistema de produo de protenas
como um aminocido. Como h 4 bases, pode-se produzir 64 cdons distintos, mas
s h 20 aminocidos usualmente empregados na sntese proteica. Logo, vrios
cdons codificam o mesmo aminocido. Isto faz com que, do ponto de vista
matemtico, a traduo seja uma funo que no admite a sua funo inversa. A
incerteza no processo de produzir RNA a partir de protena o que provavelmente
impediu o desenvolvimento de tal mecanismo pela Natureza.
Por fim, devemos nos lembrar de que o DNA pode assumir a forma circular ou
se organizar em cromossomos lineares.
Figura 7: Representao da
forquilha de replicao, onde
esto mostradas as
principais enzimas e
cofatores que formam o complexo
de replicao (replicossomo): DNA pol. III (duas molculas), RNA primase e
helicase. A helicase uma topoisomerase, responsvel pela abertura da forquilha.
As duas DNA pol. III mostradas trabalham de fato juntas, na mesma direo; para
isto a fita de DNA que replicada descontinuamente forma uma ala e a DNA pol. III
nesta fita periodicamente "larga" a fita e retoma o servio num ponto mais interno.
(figura extrada do livro The Cell: A molecular Approach, de J. Cooper, Sinauer
Assoc. Co., disponvel on-line no Bookshelf do NCBI).
Figura 8:
Replicao
telomrica: a figura identifica as reaes envolvidas na formao de sequncias
ricas em G, que formam as extremidades dos cromossomas (telmeros). A fita
incompleta sempre a descontnua, recm-sintetizada e iniciada num primer de
RNA, j retirado na figura. Como indicado, a telomerase um complexo RNA-
protena que tm um molde de RNA para a sntese de uma sequncia de DNA rica
em G. Estas repeties tm a sequncia GGGTGG em Tetrahymena (um
protozorio ciliado), GGGTTA em humanos e G 1-3A em Saccharomyces. A
telomerase apenas alonga a fita contnua, pela adio de um nmero variado de
telmeros. A fita descontnua ento parcialmente completada pela DNA
polimerase, que tem a primase como uma de suas subunidades (figura baseada no
livro Molecular Biology of the Cell , Alberts e cols., Garland Publ, tambm disponvel
no Bookshelf do NCBI).
A atividade revisora da DNA polimerase III bacteriana (e das DNAs pol. em
geral, sejam elas eucariotas ou procariotas). Na natureza existem formas
alternativas das quatro bases nitrogenadas que formam o DNA, chamadas formas
tautomricas. A frequncia com que estas bases ocorrem baixa, porm muitas
ordens de grandeza acima da frequncia de erros admissveis no DNA (lembre-se
que a adio de uma base errada na sequncia de um gene uma mutao, que
pode ter consequncias importantes para o portador do gene mutante). Cada vez
que uma dessas bases tautomricas empregada, provoca um erro de pareamento.
Se no for retirada antes da prxima replicao, uma mutao ser introduzida no
DNA. Por isso, as DNA pol. (I,II e III, em Escherichia coli e muitos outros procariotos,
a e b em eucariotos) tm a capacidade de rever, imediatamente aps a adio, se o
pareamento da base adicionada com a base da fita molde foi correto. Qualquer erro
de pareamento refletido pela alterao na estrutura da dupla hlice. Esta alterao
deve fluir por um canal inico da prpria DNA pol. Se a hlice estiver alterada a DNA
pol. para, volta na direo 3-5 despolimerizando a cadeia recm-sintetizada e, aps
algumas dezenas ou at centenas de bases, recomea o trabalho. Parece um
processo pouco econmico, mas lembre-se que a integridade da informao
gentica est em jogo e, portanto, a conservao da espcie.
H ainda na replicao do DNA um grupo de enzimas responsveis pelo
desenovelamento e separao das hlices do DNA, assim como pela separao das
cadeias duplas formadas na replicao do DNA circular. Estas enzimas,
coletivamente chamadas topoisomerases, so vitais para a replicao do DNA na
natureza, mas no tem maior relevncia para a tecnologia baseada na manipulao
in vitro do DNA.
devemos lembrar que nos eucariotos o mecanismo de replicao
essencialmente o mesmo. A fita contnua replicada pela DNA polimerase d (delta)
e a descontnua pela DNA pol. e (psilon). H, ao contrrio dos DNAs procariotos,
vrias origens de replicao no DNA eucarioto, que so ativadas simultaneamente.
4.1 A transcrio
(A)
Ativao gnica
distncia: NtrC uma protena reguladora de gene bacteriana e atua como um
enhancer. A ativao requer mudana conformacional do DNA e a hidrlise de ATP.
Embora rara em procariotos, esta forma de ativao a regra em eucariotos. (B)
Agrupamento dos fatores de transcrio (TF) gerais necessrios ao incio da
transcrio de um gene eucarioto pela RNA polimerase II.
4.2 A traduo
A vida mdia de um mRNA bacteriano muito curta, raramente ultrapassando
60 segundos. Temos que ter em mente que a vida" de uma E. coli dura meia hora.
Neste intervalo ela passa por profundas transformaes metablicas. Por isso, um
mRNA s necessrio por breves instantes, sendo em seguida descartado. Em
eucariotos, contudo, os mRNA podem ter vida mdia muito mais longa. Os demais
RNAs tambm tem uma vida mdia curta, porm bem maior que a dos mRNA pois
so necessrios de uma forma mais homognea ao longo do ciclo de vida da
bactria. O turn over (substituio de uma molcula por outra mais nova) um
fenmeno geral e est relacionado com a instabilidade termodinmica de qualquer
estrutura a nvel molecular.
No caso dos mRNA de procariotos, a sua degradao controlada por um
processo engenhoso. A transcrio e a traduo esto de tais formas acopladas
que, imediatamente aps a sntese de um pequeno trecho de mRNA, os ribossomos
j se ligam a este RNA nascente, protegendo-o da degradao pelas RNAses
bacterianas. O acoplamento da transcrio com a traduo uma caracterstica dos
procariotos. Nos eucariotos o transcrito primrio do DNA que dar origem a um
mRNA feito no ncleo, enquanto o mRNA e traduzido no citoplasma.
Representao esquemtica do acoplamento entre a transcrio e a traduo
em procariotos.
Esquema
representativo
do controle da
transcrio dos genes para as enzimas responsveis pela sntese de triptofano na E.
coli, no nvel de represso do operador. O repressor inativo logo aps sua sntese
e necessita do triptofano para ativar-se. Quando isto ocorre, ele se liga ao operador,
impedindo a ligao da RNA pol. ao stio promotor P tryp e bloqueando a transcrio.
O processo de transcrio de novo liberado quando a concentrao citoslica de
triptofano insuficiente para garantir a ativao das molculas do repressor.
6. Clonagem de DNA
Uma abordagem mais simples a clonagem de genes de um organismo e a
transfeco destes para outro organismo. A vantagem desta abordagem que se
pode selecionar da espcie doadora apenas as marcas que interessam, evitando a
introduo de genes indesejados. Adicionalmente, ela permite total controle sobre a
construo final, contornando as recombinaes que a Natureza produz durante a
reproduo sexuada (entre indivduos da mesma espcie ou no).
Clonar genes parece simples a princpio, mas as ferramentas para cortar
DNA e "emendar" os fragmentos com um vetor (DNA que se replica e que desta
forma conserva o pedao "emendado" nele, chamado inserto) no eram conhecidas
at o meio da dcada de 70.
Cada bactria possui em geral uma enzima que reconhece uma sequncia de
DNA curta, com 4 a 12 pares de bases. Nas diferentes bactrias estes stios tm em
sua maioria uma caracterstica comum: a de terem a mesma sequncia de bases
quando lidas nas duas fitas complementares. As sequncias abaixo, reconhecidas
pela enzimas de restrio EcoR1 (obtida da Escherichia coli) e HindIII (obtida de
Hemophilus influenzae) exemplificam o que chamado de stio de restrio.
Observe a sequncia e veja sua simetria. Sequncias de DNA fita dupla com estas
caractersticas so chamadas palndromos.
As setas indicam a ponte fosfodister clivada pelas enzimas EcoRI e HindIII. A
linha pontilhada indica o eixo de simetria do palndromo. A linha laranja mostra o
corte oblquo das duas enzimas, que geram extremidades coesivas.
Quando uma enzima de restrio digere o DNA, ela produz um corte em cada
fita, podendo resultar em extremidades colantes ou adesivas, como as geradas
pelas enzimas acima, ou extremidades cegas, isto , sem bases pareadas. Este o
caso, por exemplo, do stio GGCC, que clivado reto entre o segundo o G e o C nas
duas fitas.
Mapa
do
plasmdeo de
clonagem
pBR322. Observe os dois genes que conferem resistncia a antibiticos (tet
patatetraciclina e bla para ampicilina). Os stios de restrio ao longo da sequncia
de nucleotdeos esto indicados em azul, com o nome da enzima. Observe tambm
que as enzimas BamHI e SalI s ocorrem uma vez ao longo de todo o plasmdeo
(dentro do gene tet) e por isso so prprias para a clonagem.
Uma vez com os dois DNAs disponveis (doador e plasmidial), resta cort-los
com a enzima de restrio escolhida e misturar os dois DNAs. A tendncia ser
parear as extremidades coesivas, formando construes hbridas, ou quimeras. A
adio de ligase completa a cadeia fosfodister em cada uma das fitas de DNA. Este
processo est representado na parte superior da figura abaixo.
Esquema
para a obteno
de
plasmdeos recombinantes, a partir do uso de uma enzima de restrio que cria
extremidades coesivas.
Tamanho do
Designao Descrio
inserto
Plasmdeo 1b-10 kb DNA circular fita dupla
Fago (bacterifago) at 20 kb DNA linear fita dupla
DNA linear fita dupla, que se
Cosmdeo at 40 kb circulariza para converter a forma de
fago em plasmdeo
BAC - cromossomo DNA circular fita dupla (com sinais de
at 250 kb
artificial de bactria cromossomo bacteriano)
DNA linear fita dupla (com sinais de
YAC - cromossomo cromossomo de levedura, como
at 2 Mb
artificial de levedura telmeros, centro organizador de
nuclolo, etc.)
A sonda de
DNA de 250 bases
dirigida contra a
parte final do 3o. xon do gene de 4.500 pb capaz de reconhecer clones com
insertos de fragmentos do gene, desde que contenham alguma parte que hibridize
com a sonda. Na figura, os primeiros 3 fragmentos vo ser identificados pela sonda,
e os dois ltimos no.
Visto isso, pode ser discutida a metodologia geral de identificao dos clones
de interesse dentro de uma biblioteca genmica. A tcnica conhecida como
triagem ou screening e est representada na figura abaixo.
Aps a
produo do transcrito primrio, os spliceossomos aproximam o fim e o incio de
xons adjacentes e formam um lao com o ntron, preparando o conjunto para a
retirada da regio intrnica (1). O RNA gerado aps o splicing dos ntrons (2) ainda
no um mRNA maduro, pois ter ainda retirada uma poro 3 aps o sinal de
poliadenilao, dever receber uma cauda poli-A e a modificao da extremidade
5(cap 7-metil-guanosina) (3). Um procarioto no capaz de realizar o splicing e o
sistema de traduo considerar como mRNA vlido o RNA transcrito primrio (4),
desde que os ribossomos possam se ligar ao RBS da sequncia (nos sistemas de
clonagem com expresso veremos que o RBS faz parte do vetor).
A partir do ATG aps o RBS plasmidial, forma-se ento uma ORF que
termina em geral no cdon de terminao (stop) do gene doador. necessariamente
uma ORF recombinante, que dar consequentemente origem a uma protena
recombinante, ou quimrica. A protena sempre muito menor do que o mRNA
sintetizado a partir do promotor lac do plasmdeo. A "cabea" beta-galactosidase da
protena recombinante (ou quimrica) no enzimaticamente ativa.
7.2. RAPD - uma PCR com um primer s...e amplificando qualquer DNA!
Uma limitao sria na PCR convencional a necessidade de se conhecer
previamente a sequncia que se quer amplificar ou, pelo menos, suas extremidades,
para que se possa sintetizar os primers a elas complementares. Se, contudo,
baixarmos a temperatura de hibridizao (pareamento) para menos de 45 oC,
poderemos fazer com que os primers hibridizem com baixa especificidade em muitos
stios do DNA. Em verdade, no precisamos sequer de dois primers, basta um.
Uma PCR feita com um s primer e empregando uma temperatura de
hibridizao (pareamento ou annealing) de 45 oC ou inferior gera, muitas vezes, um
nmero considervel de bandas em muitos diferentes DNAs, atravs do pareamento
com baixa estringncia do primer (em geral ele tambm, pequeno, com 10 a 15
bases, o que facilita os pareamentos). O curioso que, se repetirmos o experimento
nas mesmas condies experimentais, obteremos as mesmas bandas mais uma
vez. As bandas, ento, no so uma amplificao completamente aleatria de
trechos de DNA, mas sim de trechos flanqueados por sequncias que pareiam com
o primer com baixa estringncia, o que muito diferente. Apesar disso, a tcnica de
PCR descrita aqui ganhou o nome de RAPD: de fato rpida, mas o nome -
randomly amplified polymorphic DNA - DNA polimrfico amplificado aleatoriamente -
d margem a certa confuso. Se, por um lado, o pareamento no aleatrio
completamente, por outro a existncia das sequncias com homologia de fato
aleatria, pois no sabemos de antemo se um DNA ter regies com
complementariedade para o primer escolhido.
A figura abaixo mostra esquematicamente o resultado de um RAPD. Observe
que as bandas coloridas podem ser amplificadas de cromossomas diferentes ou do
mesmo cromossoma, mas os primers que as flanqueiam (e a todas as demais
bandas) so sempre os mesmos.
Fig. 7.6a Representao esquemtica do resultado de um RAPD empregando
DNA extrado de indivduos de trs populaes distintas de insetos (a,b,c), (d,e) e
(f,g,h). Os indivduos i e j no tinham origem determinada e poderiam pertencer a
qualquer um dos trs grupos. A semelhana do padro de bandas com o primeiro
grupo sugere a origem. Na parte de baixo da figura uma representao esquemtica
dos stios de pareamento que geram as bandas representadas em vermelho, azul e
amarelo.
7. 7 Um pouco de histria
em construo
A reao em cadeia da polimerase foi desenvolvida a partir de uma idia de
Kary B. Mullis.
K. Mullis nasceu em 1944 em Lenoir, Carolina do Norte, EUA. Obteve o grau
de bacharel em qumica em 1966 no Instituto de Tecnologia da gergia e o PhD em
Bioqumica pela Universidade da Califrnia em Berkeley. Passou ento 7 anos como
ps-doutor em Cardiologia Pediatria e Qumica Farmacutica na Escola de Medicina
da Universidade de Kansas (EUA). Em seguida reebu um convite para trabalhar
como tcncio na Cetur Corporation, em Emeryville, em 1978. Foi l que teve a idia
da PCR.
Segundo ele, foi dirigindo seu carro de San Francisco para sua casa em La
Jolla, California, que ele comeou a imaginar uma maneira simples de determinar
uma sequncia de nucleotdeos a partir de um trecho de DNA. Ele ento, como
querem para si outros cientistas, tece uma inspirao sbita: a soluo no era
apenas para seu problema original, mas tinha um alcance muito maior. Ele imaginou
uma forma de fazer a DNA polimerase iniciar e terminar seu trabalho em pontos pr-
determinados e, consequentemente, pelo uso desta proipriedade, descobriu uma
maneira de amplificar exponencialmente uma sequencia de DNA num tubo de
ensaio.
Mullis ento levou a idia para seus colegas da Cetus e juntos eles a
colocaram para trabalhar de verdade. Ela foi apresentada pela primeira vez ao
pblico numa conferncia em 1985 e foi pronta e amplamente aceita pela
comunidade cientfica. A popularidade da tcnica, assim como seu conceito, ganhou
crescente popularidade ao longo dos anos seguintes.
Em 1989 a revista Science escolheu a molcula usada na PCR, a Taq
polimerase, como a primeira "Molcula do Ano".
Em 1991 a PCR se tornou extremamente comum em laboratrios pelo mundo
afora e referncias ao uso da tcnica j somavam milhares nas revistas cientficas.
Um ano depois a Cetus, depois de uma reorganizao corporativa, vendeu a patente
da PCR para a Hoffman - La Roche por US$ 300.000.000,00.
Devido ao alcance e popularidade da PCR Kary Mullis foi apontado e recebeu
o prmio Nobel de Qumica em 1995. Esta indicao foi duramente contestada por
muitos que acreditavam que a PCR foi apenas um desenvolvimento de tcnica e que
sua concepo no era suficiente para dar a Mullis o status de nobelista. Mullis
argumentou a seu favor que a unio das tcnicas pr-existentes no formato por ele
criado fazia toda a diferena.
8. Sequenciamento de DNA
At meados da dcada de 70 no era nada simples obter uma sequncia de
DNA, fosse ele fita simples ou dupla. De fato, trabalhar com DNA era muito mais
complicado do que com protenas e o conhecimento sobre os cidos nuclicos
avanava de forma lenta. No incio da dcada de 80 uma tcnica relativamente
rpida de sequenciamento de DNA foi desenvolvida, que empregava a quebra de
uma cadeia de DNA com diferentes produtos qumicos e a visualizao dos
fragmentos gerados por eletroforese. Havia necessidade de fazer-se a marcao
radiativa das molculas porque a quantidade de material produzida era muito
pequena e no podia ser detectada de outra forma. Mesmo com todas estas
dificuldades houve ento um rpido progresso no conhecimento de sequncias de
DNA. Poucos anos depois um novo avano tecnolgico foi alcanado pela
introduo da tcnica de interrupo da sequncia pela incorporao aleatria de
um nucleotdeo modificado (sem a hidroxila na posio 3), que ficou conhecida
como tcnica de didesoxi ou dideoxi. Esta tcnica suplantou imediatamente a
anterior e permitiu o desenvolvimento de sequenciadores automticos de DNA,
sobre os quais versa este captulo. Ainda se faz eventualmente o sequenciamento
manual, mas muito mais trabalhoso, caro e arriscado, pois emprega substncias
radiativas. De uma forma geral quando desejamos saber uma sequncia de bases
de um fragmento qualquer de DNA, purificamos o fragmento e enviamos para
sequenciamento numa empresa prestadora deste servio.
Mas, afinal, como produzir um DNA para sequenciamento e do que se trata a
tcnica de dideoxi?
A primeira parte da pergunta crucial: de fato, se queremos sequenciar um
trecho de DNA, temos que ter uma grande quantidade dele no nosso tubo de ensaio.
Duas formas corriqueiras de se obter grandes quantidades de uma determinada
sequncia de DNA so a clonagem em plasmdeo e a PCR. Se o DNA que
queremos sequenciar for o inserto de um plasmdeo, tudo o que precisamos
crescer 200 microlitros da bactria com o plasmdeo e, empregando as tcnicas j
usuais de extrao de DNA, obter o plasmdeo purificado, que ser empregado na
reao de sequenciamento. Se ainda no tivermos o material clonado, podemos
empregar a PCR e amplificar o trecho a ser sequenciado, purificando a banda do gel
e usando o material assim obtido para iniciar a reao do sequenciamento. Neste
caso, precisamos saber apenas as sequncias das extremidades do trecho a ser
sequenciado.
A segunda parte da pergunta exige uma explicao mais detalhada.
Inicialmente, temos que recordar o que seja um didesoxinucleotdeo
trifosfasto, ou ddNTP. O precursor normal da sntese de DNA o dNTP, ou
desoxiribonucleotdeo trifosfato, que apresenta uma hidroxila na posio 3. a
partir desta hidroxila que a fita nascente estendida. Um ddNTP, entretanto, no tem
esta hidroxila. Logo, se for incorporado a uma fita de DNA, interrompe a
incorporao de outros nucleotdeos a partir dele. Se o ddNTP for marcado
associado radiao ou fluorescncia, a fita interrompida ficar radiativa ou
fluorescente e poder ser detectada mais facilmente. Para fins desta aula vamos
admitir que cada didesoxibase est marcada com uma florescncia diferente.
Portanto, as fitas terminadas em A, T, G ou C vo emitir cores diferentes quando
excitadas com luz de um determinado comprimento (em geral, de um feixe laser).
Em seguida temos que entender como a reao de sequenciamento pode
comear sempre exatamente da mesma base, a partir do DNA molde que
adicionamos reao. Para tal, basta recordarmos que uma nova fita simples s
sintetizada se tivermos um DNA molde, uma DNA polimerase, dNTPs (e neste caso,
um pouco de ddNTPs fluorescentes) e, finalmente, um primer! neste primer que
reside o segredo do incio exato da reao de extenso: o primer sempre pareia
exatamente na posio esperada, jamais uma base antes ou uma depois, por
exemplo. Por isso, todas as fitas estendidas a partir deste primer iniciam
rigorosamente na mesma base, a partir do primer e copiando a fita molde.
Por fim, basta recordarmos que as fitas assim produzidas devem ser muito
numerosas para poderem ser detectadas. Por isso, temos que comear a reao de
sequenciamento com muito mais DNA do que uma reao de PCR. As fitas
produzidas podem ser separadas pelo tamanho em eletroforese de poliacrilamida, e
a base final da sequncia da fita identificada pela fluorescncia emitida quando a
banda eletrofortica correspondente fita cruza o ponto do gel que iluminado por
um feixe de laser. Neste sistema de deteco a eletroforese no pra, as bandas
passando no fim (em baixo) do gel que so detectadas em movimento. Com isto,
podemos identificar com preciso 600 a 700 bases a partir do primer.
Na figura abaixo exemplificamos como surgem as fitas simples estendidas a
partir de um primer (seta preta pequena) que pareia com uma sequncia especfica
(em vermelho) do plasmdeo (trechos em amarelo), no qual foi clonado um inserto
(azul) entre os stios de restrio EcoRI e XhoI. Observe que o inserto pode ter um
comprimento muito varivel, tipicamente entre 500 e 3000 pb. No exemplo estamos
admitindo que, numa determinada posio na sequncia do inserto, uma parte dele
tem uma base A e outra uma base G. o que ocorre se clonarmos um trecho de
DNA de um alelo para o qual o doador heterozigoto. Observe tambm que, do
lado direito do inserto, h uma sequncia (em verde) na qual pode parear um outro
primer, que ser empregado no sequenciamento quando quisermos vir da direita
para a esquerda sobre o inserto. Jamais, contudo, os dois primers so empregados
simultaneamente, e por isto a reao de sequenciamento NO UMA PCR!!! Por
isso, no temos tanta preocupao com contaminao como nas reao de PCR:
podemos fazer mltiplas reaes de sequenciamento, lado a lado, numa placa de 96
micropoos e mesmo reutilizar boa parte do material plstico empregado no preparo
do DNA ou na reao de sequenciamento, em si, bastando para isto lavar bem o
material.
Ainda na figura, podemos ver que fragmentos de diferentes tamanhos so
gerados, porm nunca (exceto no caso onde houver moldes de DNA com
polimorfismo de base, como no caso A/G mostrado) dois fragmentos de igual
tamanho terminaro em bases diferentes. Na parte de baixo da figura todos os
fragmentos representados na parte de cima esto organizados por ordem de
tamanho. Observe que:
a) podem existir muitos fragmentos (fitas simples estendidas a partir do
primer) do mesmo tamanho, mas fatalmente terminaro na mesma base (exceto no
caso do polimorfismo do DNA molde);
b) podem existir fitas terminado na mesma base (afinal, s temos 4 opes,
A,T,G ou C!), com comprimentos diferentes. No h qualquer restrio para isto.
c) h espaos mostrados na sequncia, onde no havia nenhum fragmento
gerado do tamanho esperado. Isto s acontece quando a reao gera poucos
fragmentos, mas uma reao deste tipo gera centenas de milhares de fragmentos de
cada tamanho e muito pouco provvel que existam sequncias no representadas
de um comprimento qualquer.
d) apenas onde h polimorfismo de base do DNA molde h fragmentos do
mesmo tamanho terminando em bases diferentes ( o caso A/G).
Examine, por favor, atentamente a figura 8.1 abaixo antes de continuar a
leitura desta aula.
Figura 8.1: Fragmentos de diferentes comprimentos gerados a partir do
primer, interrompidos quando um didesoxinucleotdeo incorporado na fita. Os
didesoxinucleotdeos so marcados com substncias fluorescentes diferentes,
conforme a base (A,T,G ou C).
material mole ou
material duro
fluido
osso ascite
tumor slido aspirado de medula
tecidos moles em
coral
geral
esponjas marinhas sangue
gua de
coprlitos reservatrios naturais ou
artificiais
Esta etapa est bem detalhada no texto do livro. Lembramos apenas alguns
pontos suplementares:
algumas clulas tm uma parede celular rgida (como os vegetais) ou esto
de alguma forma protegidas pro material duro (como no caso das esponjas). Em
alguns casos podemos empregar uma enzima especfica para estas paredes rgidas
(lisozimas, quitinases, proteinases, etc.), em outros casos temos que empregar o
Potter ou mesmo a prensa francesa. Outra forma muito eficiente de lise e a quebra
por ultra-som.
Se a lise feita num tubo de ensaio (um micro-tubo tipo eppendorf, por
exemplo), o DNA liberado da clula vai para o sobrenadante. A manipulao d
soluo com as ponteiras usuais das micropipetas tendem a quebrar o DMA em
grandes fragmentos, de 100 mil a 500 mil bases. Estes grandes fragmentos so
teis para quase todas as tcnicas de anlise de DMA. Apenas para a anlise de
tamanhos de cromossomos temos que ser muito cuidadosos na extrao, mas isto
no ser tema de nossa disciplina.
1.3 Desproteinizao
Uma vez que nos vimos livres das protenas (e com elas outras molculas,
que vo embora no salting out), sobra no sobrenadante o DNA. Para concentrar o
DNA geralmente precipitamos o dito com lcool. Para isso adicionamos lcool 100%
gelado ao mesmo volume de soluo de DNA e centrifugamos o tubo a 13.000 por 5
minutos. Aps o descarte do lcool pode-se lavar gentilmente o pellet com lcool a
70% e deixar secar o material. Uma vez seco, o DNA pode ser re-dissolvido num
volume adequado de gua ou de tampo (em geral Tris-EDTA). H outros detalhes e
comentrios importantes no texto do livro.
***************************************************
***************************************************
Insero/ Inserto: Ato de inserir um DNA doador num DNA receptor/ Diz-se
inserto ao DNA inserido (em geral num vetor, mas algumas vezes diretamente no
genoma da clula transformada ou transfectada) Western blot:
Transferncia de protenas bandeadas por eletroforese para uma membrana
adequada, em geral de nitrocelulose. O processo s pode ser feito por campo
eltrico (os RNAs so negativos e migram para o plo positivo). As membranas de
western blot podem ser hibridizadas com sondas de anticorpos. O nome western,
como o nome northern tambm, uma aluso ao nome Southern, do inventor da
transferncia anloga de DNA. O western blot frequentemente chamado
imunoblot.
Ligao: A unio de dois segmentos de DNA fita simples pela ao da ligase.
A enzima reconstitui a ligao fosfodister 3'5' entre dois nucleotdeos adjacentes.