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1.

Replicao do DNA
O DNA a molcula informacional por excelncia. Os genomas de boa parte
dos seres vivos (da totalidade, se no considerarmos os vrus entre os seres vivos)
so formados por duas fitas complementares, numa estrutura circular ou distribudo
em vrias estruturas lineares. A esta estrutura d-se o nome de cromossomo. No
processo de replicao a informao gentica contida nas fitas copiada em duas
novas fitas, que saem pareadas, cada uma, com as fitas antigas, num processo
designado como replicao semiconservativa. O DNA uma molcula
extraordinariamente estvel e de composio qumica muito simples: a estrutura
principal da fita formada por um acar (a desoxirribose) ligada ao seguinte por
uma ponte fosfodister. As bases, que se ligam aos acares e esto voltadas para
dentro da fita dupla, so de apenas 4 tipos: Adenina, Timina, Guanina e Citosina. As
duas fitas se unem por pontes de hidrognio entre as bases de fitas diferentes,
numa regra fixa, conhecida como regra de Chargaff: A pareia com T atravs de duas
pontes de hidrognio, e G pareia com C atravs de trs. Uma vez pareadas as fitas
assumem a conformao de uma dupla hlice, com duas fendas helicoidais. A
replicao da informao gentica tem que ser um processo muito acurado, embora
no desprovido de erro, pois, se por um lado o um excesso de erros levaria morte
da clula filha por mutaes deletrias, por outro lado uma ausncia total de erros
em muitas geraes implicaria uma evoluo lenta ou nula (erros no DNA podem ser
introduzidos por outros mecanismos, alm da replicao).

1.1 Transcrio
O RNA o intermedirio da informao gentica nos organismos em que a
informao gentica primria est armazenada na forma de DNA. Os livros-textos
em geral dividem os RNAs em trs classes: RNAs mensageiros (mRNA), RNAs
transportadores ou de transferncia (tRNA) e RNAs ribossomais (rRNA). A existncia
do tRNA foi primeiramente proposta por Crick ainda na dcada de 50, muito antes de
sua descoberta, a partir de consideraes tericas. Os rRNAs, constituintes dos
ribossomos (lembre-se que a subunidade leve tem um RNA e a subunidade pesada,
dois), j eram conhecidos e os tRNA foram logo descobertos. Os mRNAs de
bactrias tm uma vida mdia muito curta, cerca de 60 segundos, o que faz com que
seu isolamento e caracterizao seja muito difcil. Os dois outros so muito mais
estveis. Os mRNAs eucariotos, contudo, so bastante mais estveis. Ainda assim
preciso extremo cuidado na purificao para que as RNAses presentes nas solues
biolgicas no degradem o mRNA celular que queremos purificar.
A sntese de RNA a partir do DNA feita pela RNA polimerase e se chama
transcrio. Cada base de DNA pode parear corretamente apenas com uma base no
RNA, numa regra semelhante quela proposta por Chargaff: A pareia com U, T com
A, C com G e G com C.

1.2 Transcrio reversa


Ainda na dcada de 50 Watson e Crick propuseram que a replicao da
informao gnica fosse realizada apenas no nvel do DNA e que necessariamente
seria transcrita em RNA para finalmente ser traduzida em protena (exceto nos casos
de rRNA e tRNA). Entretanto, de forma independente, Howard Temin e David
Baltimore, no incio dos anos 70, propuseram que certos vrus teriam o genoma na
forma de RNA, e empregariam o DNA como um intermedirio replicativo. Para a
sntese deste DNA estes vrus teriam a informao gentica para a sntese de uma
DNA polimerase RNA dirigida, chamada de forma mais simples transcriptase
reversa. No processo de transcrio reversa o pareamento de RNA e DNA segue a
regra descrita para a transcrio normal.

2. Replicao de RNA
Alguns RNAs patognicos, tais como virides, e RNAs satlites, so RNAs
circulares. Eles replicam pelo mecanismo de crculo rolante, produzindo uma longa
fita de RNA. A clivagem desta fita nos vrus individuais feita in vitro sem adio de
qualquer enzima. Uma estrutura secundria do RNA denominada "cabea de
martelo" a responsvel pela auto clivagem do RNA.
Na atual epidemia de dengue importante lembrar que o vrus da dengue
um vrus a RNA que no emprega um intermedirio de DNA para replicar, no
sendo, portanto, um retrovrus, como o HIV.

2.1 Traduo
O processo de produzir uma sequncia de aminocidos a partir do RNA
chamado traduo e o mais complexo dos processos no fluxo da informao
gentica. Um conjunto vasto de protenas, cofatores e o ribossomo, alm do tRNA e
do mRNA, so necessrios para a sntese proteica. Diferentemente do que ocorre
com os dois outros passos do fluxo da informao gnica, na traduo 3 bases de
RNA formam um cdon, que interpretado pelo sistema de produo de protenas
como um aminocido. Como h 4 bases, pode-se produzir 64 cdons distintos, mas
s h 20 aminocidos usualmente empregados na sntese proteica. Logo, vrios
cdons codificam o mesmo aminocido. Isto faz com que, do ponto de vista
matemtico, a traduo seja uma funo que no admite a sua funo inversa. A
incerteza no processo de produzir RNA a partir de protena o que provavelmente
impediu o desenvolvimento de tal mecanismo pela Natureza.

3. DNA: estrutura e replicao

3.1 A Natureza qumica do gene


At cerca de 50 anos atrs a natureza qumica do gene era um mistrio. De
fato, em preparaes coradas de clulas em diviso era possvel visualizar
cromossomos. Estes cromossomos repartiam-se precisamente entre as clulas
filhas, o que fazia supor que eles teriam correlao com a informao gentica. Ora,
que os cromossomos tinham DNA em sua composio tambm j era sabido, pois
Johann Miescher em 1869 j havia definido a natureza qumica do cido nucleico.
J se sabia mesmo que o DNA era uma molcula muito grande. Porm, e isto no
se encaixava muito com o gosto cientfico prevalecente no mundo ocidental de
ento, o DNA era uma molcula relativamente "montona": era composta apenas de
adenina, guanina, timina e citosina, fosfato e um acar, a desoxirribose. Estes
elementos se repetiam de uma forma aparentemente aleatria e, ao final, todos os
DNAs estudados tinham a mesma porcentagem de adenina e timina, assim como a
mesma porcentagem de citosina e guanina. Alm disso, muitos DNAs isolados de
mamferos, anfbios, peixes, aves e moluscos tinham uma porcentagem quase igual
das quatro bases.

3.2 A estrutura do DNA


A estrutura em hlice dupla para o DNA foi proposta por Watson e Crick.
modelo proposto em 1953 o que chamamos hoje em dia de DNA B. Nesta hlice
as duas cadeias de DNA esto ligadas entre si por pontes de hidrognio, que so
ligaes fracas no covalentes, formadas entre bases opostas nas duas cadeias (ou
fitas). O pareamento muito especfico: a base purnica Adenina pareia somente
com a base pirimidnica Timina, enquanto que a outra base purnica, Guanina, pareia
com a base pirimidnica Citosina. Por isso, o nmero de bases A tem que ser igual
ao de T, enquanto o nmero de bases C ser sempre igual ao de G. O pareamento
AT e GC (regra de Chargaff) se faz por duas e trs pontes de hidrognio,
respectivamente. Assim, a sequncia de bases de uma fita no igual da outra,
porm complementar: dada a sequncia numa fita, a sequncia de bases da outra
estar prontamente determinada. As duas fitas so antiparalelas.
Arthur Kornberg isolou no fim dos anos 50 uma enzima capaz de duplicar o
DNA em tubo de ensaio. Esta enzima, chamada DNA polimerase, adiciona as bases
nitrogenadas de uma fita (usando os precursores desoxi-adenosinatrifosfato, ou
dATP, e as trs outras, dTTP, dCTP e dGTP) a partir da informao contida na outra.
A enzima "l" a fita molde e faz a fita complementar. Mas ela s realiza este trabalho
num sentido quimicamente determinado: como ela faz ligaes fosfodister 3-5, cria
uma nova fita que se estende da extremidade 5-fosfato para a extremidade 3-OH.
Uma anlise da representao plana da dupla fita de DNA, mostrada na figura a
seguir, esclarece esta direcionalidade da sntese de DNA. Como foi dito acima, as
fitas de DNA so antiparalelas: significa dizer que elas "correm" em direes opostas
e so replicadas tambm em direes opostas.

Figura 3: Modelo plano de uma molcula de


DNA, mostrando as fitas duplas antiparalelas. As
extremidades 3, embora representadas aqui com uma hidroxila ligada a elas, esto
na prtica ligadas aos fosfatos do nucleotdeo seguinte, nas cadeias pr-formadas.
Apenas na cadeia nascente h uma hidroxila livre.
Ao se entrelaarem, as duas fitas formam duas fendas, mais ou menos como
um parafuso que tivesse dois fios ao invs de um. atravs destas fendas que a
maior parte das protenas que interagem com o DNA "l" as sequncias de bases
que esto voltadas "para dentro".

Figura4: Modelo da fita dupla de DNA,


de acordo com Watson e Crick, visto de perfil.
NH = azul, O = vermelho, P = amarelo

H pelo menos trs modelos de DNA que so frequentemente citados nos


livros-texto: os modelos A, B e Z. O DNA B de longe o mais frequente, mas o DNA
Z tambm encontrado na clula. Admite-se que o DNA Z "silencioso", isto , no
pode ser transcrito. A transio B-Z seria, assim, um recurso para silenciar grandes
blocos de genes. A forma Z tambm a nica que imunognica, isto , quando um
paciente tem anticorpos contra DNA, contra esta forma que eles so produzidos.
Figura 5: Os trs
modelos mais citados de DNA:
A, B e Z. Nesta figura est bem visvel a fenda maior entre a volta verde de cima e a
vermelha de baixo e a menor, entre a vermelha de baixo e a verde da base, no
modelo B. Tambm fica claro que os dois modelos A e B so hlices dextrogiras,
enquanto o Z levogiro. Tambm d para perceber que o DNA Z no tem duas
fendas ntidas, mas uma escancarada e outra muito discreta.

Por fim, devemos nos lembrar de que o DNA pode assumir a forma circular ou
se organizar em cromossomos lineares.

3.3 A replicao do DNA


A replicao do DNA comea de uma das extremidade. A forquilha de
replicao vai se abrindo medida que, na frente, as duas fitas antigas se
desenovelam, enquanto que, mais embaixo, duas novas fitas vo sendo sintetizadas
e, por sua vez, se enovelam nas fitas antigas; formam-se com isto duas novas
cadeias duplas de DNA, cada uma contendo uma fita nova e uma fita velha. A
replicao dita, por isso, semiconservativas.
A DNA polimerase s sintetiza uma nova fita de DNA no sentido 5-3. Se, de
um lado, a fita nova pode ser feita de forma contnua, de fora para dentro (da
extremidade aberta para o fundo da forquilha), do outro lado a sntese tem que ser
feita de dentro para fora! Por isso a fita feita desta forma chamada fita
descontnua. Ela formada inicialmente por fragmentos de DNA, conhecidos como
fragmentos de Okazaki. Cada vez que um trecho suficientemente longo de DNA fita
simples est disponvel, inicia-se a sntese de um novo fragmento de Okazaki, de
dentro para fora da forquilha. Aps sua sntese uma enzima liga o fragmento recm-
sintetizado ao fragmento sintetizado anteriormente. Desta forma engenhosa a
sntese das novas fitas de DNA sempre feita no sentido 5-3.

A DNA pol. no consegue estender uma nova fita de DNA se no houver um


pequeno trecho de DNA ou RNA pareado na fita molde acima (ou 5) do segmento
que ser sintetizado.

Figura 6: Representao esquemtica do incio da sntese de uma fita nova


de DNA. A DNA polimerase apoia-se no segmento de DNA pareado fita molde e,
adicionando nucleotdeos na direo 5-3, estende a nova fita.

Imaginemos que a replicao comece realmente da extremidade da fita dupla,


como nas figuras usuais que aprendemos na graduao. Para que a sntese das
fitas novas progrida necessria adio de dois primers: um na extremidade da
fita molde que servir para dirigir a sntese da fita contnua, e outro mais para o
interior da forquilha de replicao, pareado com a fita que servir de molde para a
sntese da fita descontnua. Na verdade, para cada fragmento de Okazaki a ser
gerado ser necessria adio de um primer. E, assim como o DNA, o primer
tambm tem um sentido 5-3 bem definido.
Na natureza o primer feito de RNA e adicionado pela enzima primase, que
trabalha junto com a DNA polimerase e com diversas outras enzimas no processo de
replicao do DNA.
Figura 6a: (Parte I) No modelo acima, em que a forquilha de replicao inicia-
se na extremidade do DNA, h inicialmente a adio de um primer na extremidade
da fita molde da esquerda (3). Assim que a forquilha de replicao se abre o
suficiente, pela ao da girase e da helicase e pelo progresso da replicao da fita
contnua, um primer interno colocado e comea a sntese da fita descontnuo, pelo
primeiro fragmento de Okasaki. A fita contnua e os fragmentos de Okasaki so na
Escherichia coli, sintetizadas pela DNA pol. III. Os trechos de fita simples devem ser
protegidos de quebras mecnicas e da ao de DNAses pelas protenas ligadoras
de fita simples (SSB). (Parte II) Quando a forquilha de replicao avana mais, outro
fragmento de DNA adicionado. (Parte III). Terminada a sntese do segundo
fragmento, resta uma ponte fosfodister a ser completada na fita simples recm-
sintetizada, mas que no pode ser feita porque a enzima ligase no une RNA (a
extremidade 5-P do primer do 1o. fragmento de Okazaki) a DNA (extremidade 3-OH
do fragmento de Okazaki novo recm-sintetizado). Para que a ligase possa unir dois
fragmentos de Okasaki consecutivos indispensvel que a DNA pol. I retire o primer
de RNA e ressintetize o espao com DNA.

A consequncia final deste mecanismo de adio de primers antes da


extenso das fitas novas que haver trechos de RNA entre longos segmentos de
DNA na fita descontnua. E mesmo na fita contnua haver pelo menos um primer de
RNA seguido de toda a fita feita com DNA. Hetero hbridos RNA-DNA no so
estveis. Eles tm que ser retirados do DNA maduro. Para isto entra em ao a
atividade corretora da enzima DNA polimerase I (at agora vnhamos falando de
uma DNA pol. sem citar sua denominao completa, que DNA pol. III). A DNA pol. I
reconhece defeitos diversos no DNA, inclusive a presena de RNA, mesmo que
pareado ao DNA (neste caso a base nitrogenada Timina substituda pela Uracila).
Atravs de uma atividade exonucleotdica 5-3, ela retira o primer. Ao mesmo
tempo, empregando a hidroxila livre da extremidade 3 do fragmento de Okazaki j
sintetizado e situado 5 do stio reparado, outra cpia da mesma molcula
ressintetiza o espao deixado, desta vez com DNA. Por fim a enzima ligase
completa a ligao entre os fragmentos de Okazaki.

Figura 7: Representao da
forquilha de replicao, onde
esto mostradas as
principais enzimas e
cofatores que formam o complexo
de replicao (replicossomo): DNA pol. III (duas molculas), RNA primase e
helicase. A helicase uma topoisomerase, responsvel pela abertura da forquilha.
As duas DNA pol. III mostradas trabalham de fato juntas, na mesma direo; para
isto a fita de DNA que replicada descontinuamente forma uma ala e a DNA pol. III
nesta fita periodicamente "larga" a fita e retoma o servio num ponto mais interno.
(figura extrada do livro The Cell: A molecular Approach, de J. Cooper, Sinauer
Assoc. Co., disponvel on-line no Bookshelf do NCBI).

Ora, a primase no adiciona primers no incio dos cromossomos lineares.


Sabemos que cromossomos tm muitas origens de replicao, mas o problema da
ponta sempre persiste. Se no possvel adicionar um primer, ento as pontas dos
cromossomos vo sendo encurtadas, porque no seria possvel replic-las. Isto de
fato acontece: na fita descontnua, sintetizada a partir do molde de DNA fita simples
parental, um primer adicionado um pouco antes do final do molde (pela DNA
primase), aps a sntese do fragmento de Okazaki correspondente, o primer
retirado, sobrando um pequeno trecho a ser recomposto. Se isto no ocorrer, e de
fato no ocorre, a fita simples de DNA ser eliminada e o DNA ficar mais curto um
pouco. Ao longo de mltiplas replicaes a tendncia seria desaparecer o
cromossomo! Os eucariotos (que tm cromossomos lineares) possuem uma enzima,
chamada telomerase, que adiciona uma sequncia de bases definida, repetindo
muitas vezes esta operao, cada vez que detecta um encurtamento significativo da
extremidade de um cromossomo. Neste processo a integridade do cromossomo
garantida. Por isso tambm as extremidades de todos os cromossomos de uma
mesma espcie eucariota so iguais e formadas pelos telmeros.

Figura 8:
Replicao
telomrica: a figura identifica as reaes envolvidas na formao de sequncias
ricas em G, que formam as extremidades dos cromossomas (telmeros). A fita
incompleta sempre a descontnua, recm-sintetizada e iniciada num primer de
RNA, j retirado na figura. Como indicado, a telomerase um complexo RNA-
protena que tm um molde de RNA para a sntese de uma sequncia de DNA rica
em G. Estas repeties tm a sequncia GGGTGG em Tetrahymena (um
protozorio ciliado), GGGTTA em humanos e G 1-3A em Saccharomyces. A
telomerase apenas alonga a fita contnua, pela adio de um nmero variado de
telmeros. A fita descontnua ento parcialmente completada pela DNA
polimerase, que tem a primase como uma de suas subunidades (figura baseada no
livro Molecular Biology of the Cell , Alberts e cols., Garland Publ, tambm disponvel
no Bookshelf do NCBI).
A atividade revisora da DNA polimerase III bacteriana (e das DNAs pol. em
geral, sejam elas eucariotas ou procariotas). Na natureza existem formas
alternativas das quatro bases nitrogenadas que formam o DNA, chamadas formas
tautomricas. A frequncia com que estas bases ocorrem baixa, porm muitas
ordens de grandeza acima da frequncia de erros admissveis no DNA (lembre-se
que a adio de uma base errada na sequncia de um gene uma mutao, que
pode ter consequncias importantes para o portador do gene mutante). Cada vez
que uma dessas bases tautomricas empregada, provoca um erro de pareamento.
Se no for retirada antes da prxima replicao, uma mutao ser introduzida no
DNA. Por isso, as DNA pol. (I,II e III, em Escherichia coli e muitos outros procariotos,
a e b em eucariotos) tm a capacidade de rever, imediatamente aps a adio, se o
pareamento da base adicionada com a base da fita molde foi correto. Qualquer erro
de pareamento refletido pela alterao na estrutura da dupla hlice. Esta alterao
deve fluir por um canal inico da prpria DNA pol. Se a hlice estiver alterada a DNA
pol. para, volta na direo 3-5 despolimerizando a cadeia recm-sintetizada e, aps
algumas dezenas ou at centenas de bases, recomea o trabalho. Parece um
processo pouco econmico, mas lembre-se que a integridade da informao
gentica est em jogo e, portanto, a conservao da espcie.
H ainda na replicao do DNA um grupo de enzimas responsveis pelo
desenovelamento e separao das hlices do DNA, assim como pela separao das
cadeias duplas formadas na replicao do DNA circular. Estas enzimas,
coletivamente chamadas topoisomerases, so vitais para a replicao do DNA na
natureza, mas no tem maior relevncia para a tecnologia baseada na manipulao
in vitro do DNA.
devemos lembrar que nos eucariotos o mecanismo de replicao
essencialmente o mesmo. A fita contnua replicada pela DNA polimerase d (delta)
e a descontnua pela DNA pol. e (psilon). H, ao contrrio dos DNAs procariotos,
vrias origens de replicao no DNA eucarioto, que so ativadas simultaneamente.

4. Fluxo da informao gentica: transcrio e traduo


O DNA o depsito de toda a informao gentica estvel nos procariotos e
eucariotos. Nos genomas dos seres vivos, sejam eles organizados na forma circular
(comum aos procariotos) ou linear (como nos eucariotos, formando cromossomos),
toda a informao gentica necessria ao organismo para enfrentar uma gama
imensa de condies ambientais distintas est estocada no DNA. Se pensarmos nos
metazorios, todo o programa para a formao e desenvolvimento do embrio, com
as complexas relaes espaciais e temporais entre as clulas formadoras de um
indivduo, tudo isto est "escrito" no DNA. Mas, a qualquer momento, uma clula
emprega apenas uma frao consideravelmente reduzida de toda esta informao
gentica.

As molculas de RNA existentes na clulas so todas sintetizadas a partir da


transcrio de trechos do DNA (genmico, mitocondrial ou de cloroplasto) e tm uma
estrutura geral mostrada na figura a seguir. Devemos ter em mente que, mais uma
vez, o pareamento de bases determinante na sntese da nova fita de RNA: a
adenina do DNA pareia com uma uracila no RNA, a timina com a adenina e a
guanina e a citosina com a citosina e a guanina, como na fita dupla de DNA.

Modelo plano da molcula de RNA. H, como no


DNA, a tendncia ao pareamento entre as bases, o que
gera grampos na estrutura do RNA. Assim, na natureza, os RNAs apresentam-se
muito dobrados e com muitos trechos em fita dupla.
Podemos agrupar a maior parte dos RNAs em trs grandes grupos: a) os
RNA mensageiros ou mRNAs, que sero lidos pelos ribossomos e que trazem,
assim a informao gentica para a sntese de protenas; b) os RNA ribossomais ou
rRNA, que, junto com mais de 3 dezenas de diferentes protenas, formam os
ribossomos. Cada ribossomo composto de duas subunidades diferentes. Na
menor h um rRNA e na maior dois. Estas subunidades esto separadas no citosol e
s se unem para a sntese proteica, como veremos mais adiante; c) os RNA
transportadores, ou tRNAs, que so "carregados" com aminocidos de uma forma
extraordinariamente precisa pela enzima aminoacil-tRNA sntese. Os tRNAs tm a
funo de trazer ao ribossomo o aminocido requerido pelo cdon apresentado pelo
mRNA na cavidade A da subunidade maior do ribossomo.

4.1 A transcrio

O processo de transcrio se limita a reproduzir em RNA o que est escrito


em DNA, o que no apresenta maiores dificuldades: as bases A, T, G e C da fita
molde de DNA comandam o pareamento de U, A, C e G na fita recm-sintetizada de
RNA.

A enzima que sintetiza RNA a RNA polimerase. Nos procariotos parece


haver apenas uma RNA pol., mas nos eucariotos elas so distintas, especializadas
na sntese de cada um dos grupos de RNAs. A RNA polimerase precisa iniciar a
sntese de um novo RNA precisamente em um determinado local. A nvel molecular
este processo feito pela identificao pela RNA pol. de uma sequncia de bases
do DNA conhecida como promotor.
A RNA pol. no precisa "abrir" o DNA para ler as sequncias de bases. Ela
procura a sequncia caracterstica do promotor deslizando sobre o DNA e
procurando a sequncia atravs da fenda maior da dupla hlice. Seria como se
procurssemos identificar um grupo de amigos olhando-os pelas costas ou pelo
lado. Afinal, no to difcil, principalmente se pensarmos que s h 4 "amigos": A,
T, G e C.
Como os
pares de
bases no
DNA podem ser reconhecidos pelos seus perfis, sem necessidade de se abrir a
dupla hlice. Na figura esto mostrados 2 pares vistos num sentido ao longo da
molcula de DNA. No outro sentido as imagens so especulares para os pares CG e
TA.

Para o reconhecimento do promotor a RNA polimerase utiliza a subunidade


sigma (s). A enzima formada de 6 subunidades: 2 subunidades a, uma b e uma b,
uma w e a subunidade s. A subunidade s no se liga fortemente s demais, que
formam um ncleo enzimaticamente ativo a2bbw Assim que a RNA pol. se liga ao
promotor, a subunidade s se desliga do ncleo enzimtico, que prossegue na
sntese do RNA at alcanar um terminador.

Como quase tudo na natureza, o promotor no nico. Existe, sim, um


consenso em torno de sua sequncia. Se tomarmos a primeira base transcrita em
RNA como a base +1, a sequncia de consenso de um promotor da bactria
Escherichia coli (o fusquinha da gentica de microrganismos) ser como mostrado
na figura a seguir. A reduo da afinidade e, portanto, da frequncia com que um
promotor ligado e o gene transcrito pela RNA pol., est diretamente associada
homologia com a sequncia de consenso. atravs da variao das sequncias nas
duas caixas (conhecidas como caixa TATA, ou caixa de Pribnow, e caixa -35) que
modulada a transcrio relativa dos genes constitutivos (aqueles que so expressos
o tempo todo durante a vida da clula). Um gene cujo produto deva ser abundante
tem um promotor com sequncia mais prxima ao consenso, enquanto que um gene
cujo produto deva ser raro na clula tem, em geral, um promotor com as sequncias
das duas caixas bastante divergentes do consenso. Alteraes fora das caixas so
menos importantes, desde que no diminuam a distncia entre elas.

Diagrama representativo de um promotor genrico de E. coli. As caixas -35 e


-10 (tambm chamada caixa de Pribnow ou caixa TATA) so muito conservadas
entre distintos promotores. Pequenas variaes nestas sequncias podem reduzir
drasticamente a afinidade do fator sigma da RNA pol. pelo promotor. A base +1 ,
por conveno, aquela onde se inicia a transcrio. A RNA pol., uma vez acoplada
ao promotor, ocupa cerca de 5 voltas do DNA.

No caso dos promotores bacterianos, a troca de algumas bases nas caixas de


consenso pode enfraquecer o promotor, fazendo com que a afinidade do fator s por
ele seja consideravelmente reduzida. Tambm no caso dos promotores, a troca de
certas bases por outras elimina completamente a funo promotora da estrutura.
Assim, algumas das bases so 100% conservadas, dentro das duas caixas de
consenso.

Embora se tenha mais liberdade em alterar a sequncia da regio promotora


fora das caixas de consenso, no podemos retirar nem acrescentar bases entre as
caixas, porque a distncia entre elas (aproximadamente duas voltas de DNA ou 20
pares de bases) deve ser mantida. Chegamos, ento, a um importante conceito na
biologia molecular: distncia tambm informao. O fator s deve reconhecer as
duas caixas de consenso (primeiro a TATA e depois a -35) e para tal elas devem
estar a uma determinada distncia entre si. Uma reduo desta distncia (ou um
aumento) seria equivalente a um alargamento ou estreitamento de um par de trilhos
de trem: os vages no poderiam mais caminhar sobre eles, porque a distncia
entre as rodas (os stios de reconhecimento das caixas de consenso no fator s)
fixa, determinada pela estrutura do eixo de rodas (ou da molcula, no caso do s).

Este tipo de arranjo particular da estrutura do promotor permite que, com


apenas um par de 6 bases (cada caixa consenso tem em geral uma dzia de bases)
um promotor seja determinado com imensa preciso.

Finalmente, podemos agora claramente perceber que a Natureza


desenvolveu um sistema extremamente preciso para determinar o incio da
transcrio, dando-lhe, contudo, flexibilidade para criar promotores fracos (para
genes cuja expresso no deva ser muito grande) e promotores fortes (para genes
cujo produto seja necessrio em grandes quantidades).
A Natureza tambm usa o recurso de troca de fatores s para orquestrar o
silenciamento e a ativao de grupos de genes. Um exemplo disso a troca do fator
s70, que a subunidade normalmente empregada pela E. coli a 37oC, pelo fator s28,
aps um choque trmico (elevao da temperatura de cultivo para 42 oC ou mais).
Quando a bactria submetida a um choque trmico, a partir de um promotor
reconhecido pelo fator sigma normal (o s70), o mRNA para uma nova protena, o
fator s28 sintetizado. medida que aumenta a concentrao deste novo fator no
citosol bacteriano, ele vai substituindo o velho sigma, pois tem maior afinidade pelo
ncleo enzimtico da RNA polimerase. Em pouco tempo todas as RNA polimerases
tm este novo sigma associado a elas e s reconhecem promotores de choque
trmico, que comandam a sntese de mRNAs para as chamadas HSPs ou protenas
de choque trmico. O promotor de choque trmico tambm tem duas caixas de
consenso, mas as sequncias so um pouco diferentes das de um promotor normal,
e mais distantes entre si.
A substituio por competio do fator s normal por um fator s viral uma das
estratgias adotadas por vrus bacterianos para controlar a maquinaria biossinttica
da clula hospedeira. A substituio sequencial de fatores s por microrganismos que
formam cistos ou esporos tambm uma forma elegante de orquestrar a ativao
sequencial de muitos genes.

Uma vez iniciada a transcrio, o fator sigma se separa das demais


subunidades, que seguem na tarefa de polimerizar o novo RNA, at que alcancem
um trecho no DNA que sinaliza o fim da transcrio. Em princpio somos tentados a
imaginar um sistema semelhante ao do promotor: a polimerase reconheceria uma
regio terminadora e se desacoplaria do DNA. Entretanto, no isto que ocorre: de
fato, h uma regio terminadora, mas a RNA polimerase a transcreve em RNA e
este transcrito que, formando uma estrutura muito especial chamada grampo de
terminao, sinaliza RNA pol. que ela deve parar a sntese de RNA. A anlise de
muitas dezenas de regies terminadoras mostrou que sua sequncia apresenta
caractersticas comuns, que podem ser resumidas da seguinte forma: na fita de DNA
que est servindo de molde para a sntese do RNA surge uma sequncia com cerca
de 8 bases que, aps um espaador de tamanho varivel (4 a 15 bases, em geral),
seguida de outra sequncia complementar a ela, porm em sentido contrrio; logo
aps esta regio simtrica h uma sequncia longa de Timinas (um poli T), na fita 5-
3. Quando a polimerase transcreve esta regio, o RNA formado vai tender a parear
as duas regies homlogas, restando uma cauda poli U. Esta estrutura, conhecida
como grampo de terminao, sinaliza para a polimerase que ela deve terminar a
sntese de RNA.
Sinais de incio e trmino da sntese de RNA pela RNA polimerase bacteriana.
O sinal de incio o promotor, reconhecido pelo fator sigma. O sinal de trmino
reconhecido a posteriori (isto , pela estrutura formada no RNA), e tem, no DNA,
uma simetria didica, seguida de um poli-T.
Atravs destes dois sistemas a bactria determina onde comea e onde
termina a sntese de um RNA, da mesma forma que sabemos onde se inicia e onde
termina um pargrafo num texto qualquer. O que determina qual pargrafo deve ser
lido, e quantas vezes deveremos repetir a leitura assunto do item sobre controle da
expresso gnica.
Nos eucariotos os promotores so muitas vezes bem mais complexos do que
esboado aqui para E. coli. comum que somente a caixa TATA seja identificada.
Sequncias auxiliares, que comandam a expresso, podem estar prximas
posio +1, mas tambm podem estar distantes centenas ou mesmo milhares de
pares de bases. Estas sequncias, conhecidas como "enhancers" ou estimuladores,
so raramente encontrados em procariotos.

O controle da transcrio em eucariotos um assunto ainda em franco


desenvolvimento, mas j est claro que h enormes diferenas nos sistemas de
controle. Mesmo em procariotos pode haver um sistema semelhante ao ativador,
como mostrado na figura abaixo, mas muito menos comum que nos eucariotos.

(A)
Ativao gnica
distncia: NtrC uma protena reguladora de gene bacteriana e atua como um
enhancer. A ativao requer mudana conformacional do DNA e a hidrlise de ATP.
Embora rara em procariotos, esta forma de ativao a regra em eucariotos. (B)
Agrupamento dos fatores de transcrio (TF) gerais necessrios ao incio da
transcrio de um gene eucarioto pela RNA polimerase II.

4.2 A traduo
A vida mdia de um mRNA bacteriano muito curta, raramente ultrapassando
60 segundos. Temos que ter em mente que a vida" de uma E. coli dura meia hora.
Neste intervalo ela passa por profundas transformaes metablicas. Por isso, um
mRNA s necessrio por breves instantes, sendo em seguida descartado. Em
eucariotos, contudo, os mRNA podem ter vida mdia muito mais longa. Os demais
RNAs tambm tem uma vida mdia curta, porm bem maior que a dos mRNA pois
so necessrios de uma forma mais homognea ao longo do ciclo de vida da
bactria. O turn over (substituio de uma molcula por outra mais nova) um
fenmeno geral e est relacionado com a instabilidade termodinmica de qualquer
estrutura a nvel molecular.
No caso dos mRNA de procariotos, a sua degradao controlada por um
processo engenhoso. A transcrio e a traduo esto de tais formas acopladas
que, imediatamente aps a sntese de um pequeno trecho de mRNA, os ribossomos
j se ligam a este RNA nascente, protegendo-o da degradao pelas RNAses
bacterianas. O acoplamento da transcrio com a traduo uma caracterstica dos
procariotos. Nos eucariotos o transcrito primrio do DNA que dar origem a um
mRNA feito no ncleo, enquanto o mRNA e traduzido no citoplasma.
Representao esquemtica do acoplamento entre a transcrio e a traduo
em procariotos.

O processo de traduo se inicia pela ligao da subunidade menor do


ribossomo a um stio (sequncia) especfica no mRNA chamado RBS (ribosome
binding site). Esta ligao mediada, provavelmente, pelo pareamento de uma
sequncia do rRNA 16 S (que faz parte da composio da subunidade leve) com a
sequncia de Shine-Delgarno (ou RBS). subunidade menor acopla-se, ento, o
primeiro tRNA (sempre para formil-metionina, em E. coli), e o conjunto desliza pelo
mRNA at encontrar o cdon AUG (identificado pelo anticdon correspondente no
tRNA). Mais uma vez, necessrio um ajuste preciso da posio de incio da leitura
do mRNA pelo ribossomo. Para cada mRNA existem potencialmente trs diferentes
quadros de leitura (j que as bases so lidas em trincas), porm s um quadro de
leitura correto. Pode parecer estranho que uma subunidade aberta (sem o
acoplamento prvio da outra), junto com um tRNA para formil-metionina, seja
necessria para encontrar o cdon de incio da sntese proteica. Mas, se
ponderarmos sobre a questo, veremos que o tRNA sozinho no poderia se ligar ao
cdon de iniciao, pois ele apenas reconhece um cdon AUG (ou GUG) e desta
forma se ligaria a qualquer uma destas trincas, em qualquer quadro de leitura, ao
longo do mRNA. A subunidade leve, por sua vez, no tem como reconhecer o cdon
AUG, mas "sabe" onde a sequncia RBS e determina, assim, que a primeira trinca
AUG abaixo de seu stio de ligao ser o incio da sntese proteica. Ento, fica claro
que a associao das duas molculas, tRNA e subunidade leve do ribossomo,
imprescindvel.

Ao conjunto subunidade menor/ tRNA, j na posio exata para incio da


sntese proteica, liga-se, ento, a subunidade maior, completando o ribossomo. O
ribossomo tem formado, assim, uma cavidade P ( esquerda, no desenho), onde
est o tRNA com a formil-metionina, e uma cavidade A, ainda vazia, a sua direita,
aguardando a chegada do prximo tRNA transportando o aminocido
correspondente ao cdon apresentado no fundo da cavidade. Quando isto acontece
uma reao qumica (ligao peptdica) ocorre entre o primeiro aminocido e o
segundo, transferindo desta forma o primeiro para se ligar ao segundo, que
permanece pelo seu lado ligado ao seu tRNA. O primeiro tRNA, agora ocupando a
cavidade P do ribossomo, est descarregado. O ribossomo ento se desloca no
mesmo sentido que j vinha fazendo, descartando assim o tRNA vazio
(provisoriamente alojado numa cavidade E, que significa exit), posicionando o
segundo tRNA com os dois aminocidos a ele aderidos na cavidade P e liberando a
cavidade A para receber um novo tRNA carregado. O processo se repete at que um
sinal de terminao seja encontrado. Neste caso o ribossomo espera no um tRNA,
mas uma protena conhecida como fator de terminao, que se liga no stio A ao
cdon de terminao, desestabiliza o ribossomo e interrompe irreversivelmente a
sntese. H vrios fatores proteicos chamados fatores de iniciao e fatores de
alongamento que colaboram neste processo.
Neste modelo
do processo de
traduo h
um stio E (empty = vazio), onde se aloja o tRNA descarregado antes de sair do
ribossomo. Esto representados os diversos fatores que participam do processo de
traduo, alm do ribossomo e dos tRNAs.

Novamente, em eucariotos a complexidade do processo de transcrio/


traduo consideravelmente maior. Isto se d por duas razes: primeiro, os genes
eucariotos costumam ser interrompidos por sequncias que no codificam
aminocidos. Estas sequncias, chamadas ntrons, e as sequncias que sero
empregadas pelo ribossomo (ou para formar tRNA ou rRNA) so transcritas para um
longo RNA, chamado transcrito primrio, ou ainda RNA heterogneo nuclear. Deste
transcrito primrio tm que ser retirados os ntrons, o que feito por um processo
enzimtico chamado splicing (l-se splicin). Alm disso, o pr-mRNA ainda sofre
outras alteraes, como a adio de uma cauda poli A na extremidade 3 e de um
cap" 7-metil-guanosina na extremidade 5 antes de se tornar um mRNA e poder
passar ao citoplasma, onde ser traduzido.
O splicing de RNA
catalisado pelo
spliceossomo, formado pelas snRNP (pequenas ribonucleoprotenas nucleares) U1,
U2, U5 e U4/U6, alm de outros componentes, no representados na figura. Na
primeira etapa do splicing o nucleotdeo ramificado A, prximo ao stio de splicing 3,
ataca o stio 5 de splicing e corta o RNA. A extremidade 5 resultante fica ligada
covalentemente ao A. Na segunda etapa, a extremidade 3 do xon da esquerda,
deixada livre na etapa anterior, ataca o stio de splicing 3 do ntron, clivando o lariat
(lao) e unindo os dois xons.
O mecanismo de splicing mostrado acima essencialmente igual para todos
os mRNAs eucariotos que contenham um intron. A figura a seguir mostra a forma
com que o transcrito primrio do gene para a ovalbumina de galinha processado
para gerar um mRNA maduro;
A figura mostra a
remoo organizada de 7
introns necessrios para a
obteno do mRNA de
ovalbumina maduro, a
partir do transcrito primrio. Os stios de splicing nas posies 5 e 3 esto
representados pelas letras D e A (doador e aceptor, respectivamente).

O splicing de tRNAs e de rRNAs pode ser feito sem a participao do


spliceossomo. De fato, o prprio RNA que se auto processa, numa reao
conhecida como self splicing. Esta atividade enzimtica do RNA contraria a antiga
assertiva da bioqumica que diz toda enzima uma protena.
Devido a estas etapas intermedirias no processamento do RNA, desde
hnRNA (ou transcrito primrio) at mRNA, possvel observar-se em eucariotos
sistemas de controle da expresso gnica muito diversa do que se v em
procariotos.

5. O controle da expresso gnica

5.1 O operon lac


Jacob e Monod criaram um modelo no qual o stio promotor, associado a
outro stio chamado operador, controlava a expresso de todos os genes
imediatamente abaixo, isto , 3, do promotor. A este conjunto chamaram operon.
Como os genes que estudavam eram os responsveis pela sntese das protenas
que degradavam lactose, chamaram a este arranjo de genes operon lac.
Distribuio dos genes e mdulos de controle do operon lac. O gene i, para o
repressor lac, expresso constitutivamente, est situado prximo ao conjunto dos
genes induzveis lacZ, lacY e lacA, responsveis pela sntese das protenas b-
galactosidase, permease e transacetilase. O promotor plac controlado pelo
operador olac, onde se ligam duas molculas do repressor.

O stio operador uma regio do DNA logo abaixo do stio promotor. Na


verdade, os dois stios esto parcialmente imbricados (superpostos), pois o promotor
se estende da base -45 at a base +5, enquanto o stio operador vai da base -8 at
a +12. Desta forma, se tivermos uma protena ligada ao stio operador, ela vai
impedir que este seja ligado pela RNA pol. Uma analogia razovel seria comparar o
promotor com uma bota, em cujo bico est o stio operador. Quando o bico da bota
est ocupado com uma pedra, no se pode calar a bota. Analogamente, quando o
operador est ocupado pelo repressor lac (produto do gene i, que se liga ao
operador na forma de um dmero), a RNA polimerase no pode se ligar ao promotor.
O repressor lac, por sua vez, o produto de um gene que est prximo ao operon,
porm no faz parte integral dele (na verdade, este gene poderia estar muito
distante no genoma de E. coli). Na ausncia de lactose, as poucas molculas de
repressor presentes no citosol da bactria (menos de 10 por clula!) so suficientes
para silenciar a expresso do operon, ligando-se ao stio operador.
Esquema representativo do controle da transcrio dos genes para as
enzimas responsveis pelo uso da lactose em E. coli. O repressor, produto do gene
i, liga-se ao operador (em verdade, duas molculas), impedindo a ligao da RNA
pol. ao stio promotor Plac e bloqueando a transcrio. O repressor est representado
por elipses vermelhas.

Na presena de lactose, contudo, o repressor inativado pela ligao de um


produto do metabolismo da lactose, a alolactose. Inicia-se, ento, a transcrio dos
genes lacZ, lacY e lacA, formando-se um mRNA policistrnico. Este mRNA
imediatamente traduzido para formar trs enzimas da via de degradao da lactose:
a b-galactosidase (b-gal), a permease e a transacetilase. A b-gal degrada a lactose
galactose e glicose e a permease aumenta muitas vezes a permeabilidade da clula
lactose. Com isto a lactose do meio de cultura rapidamente assimilada e utilizada
pela clula. Quando a concentrao de lactose reduz-se muito, at as molculas que
esto ligadas ao repressor acabaro sendo clivadas pela b-gal. A consequncia disto
a ligao dos repressores, agora ativos, ao stio operador, provocando a parada da
transcrio dos genes lacZ, lacY e lacA.

Esquema representativo do controle da transcrio dos genes para as


enzimas responsveis pelo uso da lactose em E. coli. A lactose no citosol bacteriano
(rigorosamente, a alolactose, produto obtido pela transformao da lactose no
interior da bactria) liga-se ao repressor, inativando-o e liberando o promotor para
ser ligado pela RNA pol. O processo de transcrio estar liberado at que a
concentrao citoslica de lactose seja insuficiente para garantir a inativao das
molculas do repressor. Os produtos dos genes lacZ, lacY e lacA, b-galactosidase,
permease transacetilase, respectivamente, esto representados por elipses azuis,
em trs tonalidades. O repressor est representado por elipses vermelhas.

Este o exemplo clssico de um operon que funciona por represso. H


muitos outros semelhantes, que controlam em geral a sntese de enzimas
responsveis pela degradao de um determinado produto nem sempre disponvel
no ambiente. H tambm genes operons que esto sempre ligados e que devem
ser silenciados em determinadas situaes. So em geral os genes para biossntese
de algum produto que a bactria pode obter do ambiente. Somente quando falta este
produto no meio de cultura que a bactria ativa a transcrio dos genes que iro
produzir as enzimas necessrias biossntese do produto em falta.
H sempre um pouco de permease na membrana, porque o operon "vaza",
isto , um pouco dos trs produtos gnicos sempre produzido. E vaza porque os
repressores se desligam por breve momento do operador, j que a ligao de
molculas uma s outras por foras fracas no eterna. No instante em que o
operador estiver livre uma RNA polimerase pode transcrever o operon, o que de fato
acontece. O vazamento observado em todos os genes e operons bacterianos e,
em grau muito menor, na maioria dos genes dos demais organismos. Pode parecer
um gasto de energia desnecessrio, mas o vazamento inevitvel. Por outro lado,
sem ele a maior parte dos operons no funcionaria, porque no teria como ser
disparado.
Alm destes dois sistemas h ainda outros, bastante mais complexos, que
modulam de forma fina a expresso de genes nos procariotos. H mesmo operons
que so controlados por represso e ativao simultaneamente. Vale ressaltar que o
prprio operon lac tem uma particularidade, descoberta muitos anos depois de sua
elucidao por Jacob e Monod: o controle da sua expresso exercido por uma
protena chamada CAP (catabolite gene activator protein), uma protena dimrica
como o repressor lac, com aprox. 45.000 Da. A protena CAP no tem qualquer
influncia na expresso do operon enquanto no estiver ligada ao AMP cclico.
Entretanto, uma vez ligada, ela se associa a um stio acima (5) do promotor, o que
permite uma ligao muito mais rpida e efetiva da RNA pol. ao stio promotor. Na
analogia da bota que fizemos acima, o complexo CAP-cAMP funcionaria como uma
caladeira: na ausncia de pedra na ponta da bota (repressor) a caladeira (CAP-
cAMP) facilitaria muito a entrada do p (RNA pol.) na bota (promotor). Este curioso
mecanismo de controle positivo do operon lac tambm foi observado em diversos
outros operons bacterianos. Qual seu objetivo, afinal? A explicao simples:
quando a bactria no tem glicose para degradar, ela passa por um processo de
fome celular, com consequente aumento dos nveis de cAMP celulares. Este cAMP
se liga protena CAP, permitindo uma expresso aumentada de todos os operons
que so responsveis pela degradao de acares e outros produtos energticos.
Muitos dos vetores de expresso sejam eles fagos ou plasmdeos,
empregados em engenharia gentica, tm o gene clonado sob o controle de um
promotor/operador lac. Este sistema propicia o controle da expresso do gene
clonado atravs da adio de um anlogo da lactose, o IPTG
(isopropiltiogalactosdeo). Este produto muitas vezes mais efetivo que a lactose na
induo da expresso do operon lac, alm de no ser degradado. Veremos mais
adiante como podemos tirar vantagem destas construes artificiais de genes para a
produo de protenas recombinantes.

5.2 O operon triptofano (operon tryp)


A biossntese de aminocidos um processo muito caro em termos
energticos. Por isso, quando h, por exemplo, triptofano disponvel no meio de
cultura, a Escherichia coli imediatamente cessa de produzir as enzimas necessrias
biossntese do aminocido. O processo alcanado pela ativao de um repressor
solvel que, na ausncia de triptofano, inativo. A ativao feita,
compreensivelmente, pelo prprio triptofano que assim, estando presente, bloqueia
sua prpria sntese endgena. A figura abaixo representa este processo. Quando a
concentrao de triptofano diminui muito, o complexo repressor-triptofano se desfaz
e o operon ativado. A figura mostra de forma esquemtica que o operon tem uma
regio que antecede os genes da via biossinttica propriamente ditos, trypE, trypD,
trypC, trypB e trypA. Esta sequncia conhecida como sequncia lder e tem um
papel fundamental no processo que ser discutido mais adiante, chamado
atenuao. Observe que cada gene inicia com um cdon ATG e termina com um
cdon TGA (ou qualquer dos outros dois cdons de parada).

Esquema
representativo
do controle da
transcrio dos genes para as enzimas responsveis pela sntese de triptofano na E.
coli, no nvel de represso do operador. O repressor inativo logo aps sua sntese
e necessita do triptofano para ativar-se. Quando isto ocorre, ele se liga ao operador,
impedindo a ligao da RNA pol. ao stio promotor P tryp e bloqueando a transcrio.
O processo de transcrio de novo liberado quando a concentrao citoslica de
triptofano insuficiente para garantir a ativao das molculas do repressor.

Pela primeira vez ao longo deste texto enfatizamos a presena de uma


sequncia que antecede a regio a ser traduzida, representada na figura pela sigla
SD. a sequncia de Shine-Delgarno, ou stio ligador de ribossomos (RBS) da E.
coli. Os demais procariotos tm estruturas muito semelhantes e os eucariotos no
so muito diferentes neste aspecto. A subunidade leve do ribossomo, ainda antes
de agregar-se subunidade pesada, associa-se ao mRNA atravs desta sequncia
e desliza no sentido 3 at alcanar o primeiro cdon AUG. De acordo com o
conhecimento atual o tRNA para formil-metionina (nos procariotos) tambm se liga
subunidade leve associada ao mRNA, ainda no RBS, e ele que determina a
parada do complexo "subunidade leve-tRNA" no primeiro cdon AUG (que o
anticdon do tRNA para metionina reconhece). frente de todo gene ou regio que
ser traduzida (como a parte da sequncia lder do operon triptofano, da qual
falaremos em breve, que d origem a um peptdeo lder) deve haver fatalmente um
RBS, como mostrado na figura acima e nas demais abaixo, neste subitem, sem o
que no haver sntese proteica. A existncia de um RBS entre genes de um mRNA
policistrnico a forma pela qual a natureza garante a traduo do gene aps a
liberao das duas subunidades do ribossomo quando termina a traduo do gene
anterior.
Uma vez liberado o operador, h a transcrio imediata do DNA. O RNA
produzido inicia-se pelas 4 sequncias representadas em vermelho, que tm uma
particularidade interessante: podem parear duas a duas, 1 com 2, 2 com 3 ou 3 com
4, formando sempre grampos. Apenas o grampo 3-4 um grampo de terminao,
pois seguido de um poli-U. Por outro lado, apenas a primeira sequncia possui
cdons para triptofano (dois seguidos, neste caso). A sequncia-lder frente dos
genes serve para interromper precocemente a sntese de RNA caso ainda haja
algum triptofano no citosol bacteriano, insuficiente para ativar o repressor, mas
suficiente para garantir a produo de protenas. A bactria mede com este sistema
a concentrao de tRNA carregado com triptofano, que exatamente o "precursor"
deste aminocido necessrio cadeia polipeptdica nascente.
A figura a seguir mostra a situao em que a quantidade de triptofano
na clula to reduzida que no h tRNA carregado com triptofano disponvel para
a sntese proteica.
Esquema
representativo do controle da transcrio dos genes para as enzimas responsveis
pela sntese de triptofano na E. coli, no nvel de atenuao. A parada dos
ribossomos sobre a regio 1 (I) permite o pareamento das regies 2 e 3 (II) que,
distantes do poli-U que sucede a regio 4, no configuram um grampo de
terminao. A transcrio progride (III), dando ao final a sntese das 5 enzimas que
formam a via biossinttica do triptofano.

A sntese do mRNA inicia-se assim que o operador liberado. O ribossomo se


liga sequncia de Shine Delargno acima (5) da regio 1 e desliza at encontrar o
primeiro AUG. Ao entrar na regio 1 o ribossomo vai encontrar dois cdons para
triptofano. Na situao prevista nesta figura no h tRNA carregado com triptofano. A
sntese proteica para. A sntese de RNA continua, pois independente destes
fatores, transcrevendo as regies 2 e 3, que pareiam entre si, j que a regio 1 est
protegida contra pareamentos pelos ribossomos que a esto cobrindo. Em seguida a
RNA pol. transcreve a regio 4 e a sequncia poli-A, dando origem a uma sequncia
poli-U. Este poli-U est muito distante do grampo 2-3 formado anteriormente e no
configura um grampo de terminao. A sntese de RNA, portanto, avana pela regio
dos genes da biossntese do triptofano e termina por permitir a sntese das 5
enzimas da via biossinttica. Todo este processo faz sentido nesta situao, pois
no h definitivamente triptofano suficiente para garantir a sntese das protenas
pela bactria.
Ao contrrio, quando a ainda um pouco de triptofano, insuficiente para
ativar o repressor, mas suficiente para garantir a sntese proteica, o pareamento das
sequncias que compes a sequncia-lder muda. A figura seguinte representa esta
nova situao.

Esquema representativo do controle da transcrio dos genes para as


enzimas responsveis pela sntese de triptofano na E. coli, no nvel de atenuao. A
cobertura das regies 1 e 2 pelos ribossomos, na presena de tRNA carregado com
triptofano no citosol bacteriano, permitem o pareamento das regies 3 e 4 que,
prximas do poli-U que sucede a regio 4, configuram agora um grampo de
terminao. A transcrio encerrada precocemente, no dando origem sntese
das 5 enzimas que formam a via biossinttica do triptofano.

Nesta nova situao a quantidade de triptofano muito pequena, porm


suficiente para garantir a presena de tRNAs carregados com triptofano no citosol.
Com isto, os ribossomos no param sobre a regio 1 e progridem para a regio 2,
quando a RNA polimerase est transcrevendo a regio 3. Antes que toda a traduo
da regio 2 seja, feita a RNA pol. j transcreveu a regio 4 e formou o poli-U, o que
d origem ao grampo de terminao mostrado na figura acima. ativado. bom
relembrar que as regies 1 e 2 no podem parear, pois esto recobertas e
protegidas pelos ribossomos engajados na sntese do peptdeo lder. Quando este
fenmeno acontece, a sntese de RNA encerrada antes da transcrio dos genes
da via biossinttica, e nenhuma enzima da via ser produzida. De fato, a atenuao
da transcrio economiza energia da bactria, que no precisa sintetizar enzimas
para a produo de um aminocido que ela ainda dispe, embora em pequena
quantidade.
O mesmo mecanismo descrito para o triptofano empregado em outras vias
biossintticas de aminocidos. A razo parece ser o alto custo energtico destas
vias. A Natureza criou com este sistema uma forma de discriminar entre pouco e
insuficiente, contornando a forma tosca com que o sistema repressor/operador
controla a expresso gnica (lembre-se de que o repressor se desliga
ocasionalmente do operador, dando origem ao vazamento, que importante para a
expresso gnica, particularmente ao disparo de certos operons, como o lac).
possvel que se um sistema de represso simples como o das bactrias fosse
"regulado" para no ser aberto ou fechado seno em circunstncias extremas, ele
jamais funcionaria, ficando sempre fechado ou sempre aberto, conforme o caso.

6. Clonagem de DNA
Uma abordagem mais simples a clonagem de genes de um organismo e a
transfeco destes para outro organismo. A vantagem desta abordagem que se
pode selecionar da espcie doadora apenas as marcas que interessam, evitando a
introduo de genes indesejados. Adicionalmente, ela permite total controle sobre a
construo final, contornando as recombinaes que a Natureza produz durante a
reproduo sexuada (entre indivduos da mesma espcie ou no).
Clonar genes parece simples a princpio, mas as ferramentas para cortar
DNA e "emendar" os fragmentos com um vetor (DNA que se replica e que desta
forma conserva o pedao "emendado" nele, chamado inserto) no eram conhecidas
at o meio da dcada de 70.

6.1 Restrio e Modificao: a ferramenta escondida na bactria


Os bacterifagos, partculas virais que invadem e destroem bactrias,
tiveram um papel central no desenvolvimento da Biologia Molecular. J na dcada
de 40 uma srie de experimentos mostrou como funcionavam os genes de vrios
destes vrus. Uma gerao depois experimentos com fagos levaram a uma
descoberta fundamental - as enzimas de restrio. Estas "tesouras" moleculares,
que a bactria emprega para se defender dos bacterifagos, poderiam ser
aproveitadas para a pesquisa. Elas de fato forneceram a ferramenta h muito
desejado pelos bilogos moleculares para estudar e manipular o DNA e
fundamentaram o caminho para o desenvolvimento da engenharia gentica.
A descoberta das enzimas de restrio aconteceu ao longo de mais de duas
dcadas e demonstrou que as bactrias desenvolveram, durante a evoluo, um
eficiente mecanismo de defesa contra vrus a DNA. Fagos que se desenvolvem bem
numa certa linhagem de bactria, frequentemente produzem uma prognie pequena
quando infectam pela primeira vez outra linhagem da mesma bactria, mas os
poucos fagos sobreviventes prosperam. O fenmeno, conhecido como restrio
controlada pelo hospedeiro, foi descrito pela primeira vez no incio da dcada de 50.
Werner Arber, um microbiologista suo, encontrou uma explicao molecular para o
fenmeno. Ele sugeriu que as bactrias controlam os fagos com um sistema de
reaes geneticamente controladas que ele designou restrio - modificao.
Quando os bacterifagos entram numa bactria da linhagem A, so em sua
maioria mortos no interior da bactria, que corta (cliva) o DNA em um ou mais
pontos. Os poucos fagos que se replicam no interior da bactria, contudo, parecem
"aprender" a evitar o ataque da bactria e, numa segunda infeco, j produzem um
grande nmero de partculas virais novas. Quando estes fagos procuram infectar
uma bactria da mesma espcie, porm de outra linhagem (B), inicialmente produz
uma prognie pequena e apenas na segunda infeco na mesma linhagem
bacteriana que se adapta e produz um grande nmero de partculas virais novas.
Se transportado a um tubo de ensaio com a bactria A original, o fenmeno se
repete, como se o fago tivesse "desaprendido" a infectar a bactria do tipo A. A
situao est mostrada na figura abaixo.
A restrio controlada
pela hospedeira: Fagos que se desenvolvem bem numa certa linhagem de bactria,
frequentemente produzem uma prognie pequena quando infectam pela primeira
vez outra linhagem da mesma bactria, mas os poucos fagos sobreviventes
prosperam.

Afinal, quando um fago entra na bactria, apenas o seu DNA subsiste e se


replica, ficando o capsdeo do lado externo da hospedeira. Ento, todo o processo
de adaptao teria que estar ligado ao DNA.
Hiptese de Arber:
A bactria possui um sistema de proteo de seu DNA contra a sua prpria
enzima de restrio (a "tesoura" molecular), que consiste na modificao,
em geral por metilao, de duas bases numa certa sequncia fita-dupla. Na
figura abaixo a bactria da linhagem A protege desta forma as sequncias
marcadas em amarelo (por exemplo, 5-GAATTC-3), enquanto a da
linhagem B protege outras sequncias, marcadas em azul (por exemplo, 5-
GGCC-3). Esta proteo levada a cabo pela enzima de modificao.
Em seguida vamos admitir que a enzima de restrio que a bactria produz
cliva (corta) o DNA fita dupla exatamente na mesma sequncia que a sua
prpria enzima de modificao protege.
Agora imagine um fago sem qualquer modificao em seu DNA fita dupla
infectando a bactria A. Seu DNA ser clivado (restrito ou cortado)
exatamente na sequncia amarela (e at em mais de uma, se houver).
Entretanto, uns poucos fagos sero replicados antes de serem clivados e
imediatamente modificados pela enzima de modificao da bactria, que
metila as sequncias amarelas independentemente de sua origem,
bacteriana ou viral. Alternativamente, podero sobreviver porque foram
metilados antes mesmo de replicarem.
A bactria decide se uma sequncia deve ser modificada ou restrita atravs
das enzimas de restrio (E.R.), que esto dispersas no citosol bacteriano, mas as
de modificao em geral tm uma proximidade com o aparato de replicao do DNA.
Por isso, um DNA invasor mais provavelmente restrito antes de ser modificado. Ao
contrrio, o DNA bacteriano recm-sintetizado (uma fita nova, j que a outra, velha,
j est modificada) ser provavelmente modificado na fita nova antes de ser restrito.
Alm disso, uma hemi-metilao tambm confere um razovel grau de proteo
contra o ataque de enzimas de restrio, o que faz com que o DNA bacteriano seja
essencialmente imune ao da enzima de restrio da prpria bactria. De forma
equivalente, o DNA viral, que no tem nenhuma metilao, muito mais sensvel ao
corte pela E.R.
Os poucos fagos sobreviventes tero suas duas fitas modificadas
exatamente na sequncia reconhecida pela E.R da bactria hospedeira.
Consequentemente, quando entram na prxima bactria da mesma
linhagem, seus DNAs esto imunes ao ataque da E.R. bacteriana. Todos
os fagos da prognie, igualmente modificados, sobrevivem da por diante
nesta linhagem de hospedeira.
Quando, na segunda parte da figura, os fagos provenientes de A penetram
na hospedeira da linhagem B, eles esto todos modificados na sequncia
amarela. Mas a hospedeira agora corta o fago na sequncia azul (por
exemplo, 5-GGCC-3), de forma que a proteo na sequncia GAATTC de
nada adianta. Quase todos os fagos tero seu DNA clivado, mas os poucos
sobreviventes tero o DNA metilado na posio correta, pela enzima de
modificao da bactria da linhagem B. A modificao na sequncia
amarela vai se diluindo na populao, pois a replicao semiconservativa
e a prognie viral muito grande (mais de 200 fagos por fago infectante).
Apos a segunda infeco na bactria do tipo B todos os fagos estaro
agora modificados e protegidos na sequncia azul, e tero
desaprendidos a sobreviver na bactria do tipo A.
O processo recomea quando o fago tenta infectar uma bactria da
linhagem A outra vez.
Esta explicao molecular foi fundamental para espantar o espectro de
lamarckismo que obviamente ronda um experimento desta natureza.

Interpretao molecular do fenmeno da restrio pela hospedeira, de acordo com


Werner Arber. As crculos vermelhos e verdes representam as modificaes.

Era notvel a especificidade destas reaes e os bioqumicos ficaram


bastante esperanosos de que as enzimas de restrio pudessem ser empregadas
para estudar e clivar o DNA se pudesse ser purificadas. Enquanto Arber trabalhava
com E. coli, outros pesquisadores experimentavam com outras bactrias,
encontrando resultados similares. As esperanas, entretanto, enfraqueceram quando
a primeira das enzimas purificada parecia cortar in vitro o DNA de forma aleatria, e
no numa sequncia de bases especfica (conhecida como stio de restrio).
Passaram muitos anos sem que as enzimas de restrio voltassem a ser
pesquisadas como ferramenta para a engenharia gentica.
As esperanas ressurgiram na dcada de 70, atravs de uma srie de
trabalhos balizadores de Hamilton Smith. Ele purificou a primeira enzima stio-
especfica, a enzima Hind II, da bactria Haemophilus influenzae. Esta descoberta
crucial foi obra do acaso: incubando bactrias e fagos juntos, Smith observou que o
DNA do fago degradava aos poucos. Ele e seus colaboradores conseguiram purificar
a enzima responsvel pela degradao e posteriormente identificaram a sequncia
de seis pares de bases que ela reconhece e cliva, sempre na mesma posio,
sempre da mesma forma! Logo muitas outras enzimas foram descobertas e agora
h mais de 3000 j descritas. Cada enzima cliva o DNA num stio especfico e com
estas enzimas foi possvel manipular o DNA como nunca antes. Um dos trabalhos
mais festejados, que vieram na cola das descobertas de Arber e Smith, foi o de
Daniel Nathans com SV40, que pela primeira vez empregou estas enzimas para
mapear fisicamente o DNA. Seus experimentos levaram em 1972 primeira
tentativa bem sucedida de clonagem de DNA, conseguida por Paul Berg.

6.2 Ainda um pouco sobre as enzimas de restrio

Cada bactria possui em geral uma enzima que reconhece uma sequncia de
DNA curta, com 4 a 12 pares de bases. Nas diferentes bactrias estes stios tm em
sua maioria uma caracterstica comum: a de terem a mesma sequncia de bases
quando lidas nas duas fitas complementares. As sequncias abaixo, reconhecidas
pela enzimas de restrio EcoR1 (obtida da Escherichia coli) e HindIII (obtida de
Hemophilus influenzae) exemplificam o que chamado de stio de restrio.
Observe a sequncia e veja sua simetria. Sequncias de DNA fita dupla com estas
caractersticas so chamadas palndromos.
As setas indicam a ponte fosfodister clivada pelas enzimas EcoRI e HindIII. A
linha pontilhada indica o eixo de simetria do palndromo. A linha laranja mostra o
corte oblquo das duas enzimas, que geram extremidades coesivas.

Quando uma enzima de restrio digere o DNA, ela produz um corte em cada
fita, podendo resultar em extremidades colantes ou adesivas, como as geradas
pelas enzimas acima, ou extremidades cegas, isto , sem bases pareadas. Este o
caso, por exemplo, do stio GGCC, que clivado reto entre o segundo o G e o C nas
duas fitas.

Cada vez que as enzimas de restrio encontram um stio de restrio que


lhes prprio, clivam o stio. Chama-se esta clivagem de digesto do DNA por
enzimas de restrio e chamamos os fragmentos gerados de fragmentos de
restrio. Podemos empregar uma digesto com concentraes reduzidas de
enzima, o que vai gerar uma digesto parcial: nem todos os stios de
reconhecimento da enzima sero clivados, e isto vai permitir obter fragmentos que
contenham um gene inteiro, mesmo que dentro dele haja um ou mais stios de
restrio para a enzima que estamos empregando.
Ao da
enzima de
restrio
EcoR1,
com gerao de extremidades colantes e unio de fragmentos de DNA de origens
distintas.

Os stios de restrio ocorrem ao acaso no DNA e quanto mais frequentes


so mais curtos. A probabilidade de se ter uma sequncia qualquer definida de seis
bases (1/4)6, isto 1: 4096. Uma enzima que reconhea um stio de restrio de
12 bases cortar o DNA com uma frequncia muito baixa. Aps a digesto de um
DNA longo por uma enzima de restrio muitos fragmentos so gerados, quanto
maiores forem, maior ser o stio de restrio.
Embora os stios de restrio apaream ao acaso, h regies do genoma
pobres em stios de restrio: so aquelas ricas em repeties, longas ou curtas.
Suponha, por exemplo, que voc tenha uma regio com 350 repeties de uma
sequncia de 200 bases. Ser um trecho de 70.000 bases. Se, nesta sequncia de
200 bases, no houver o stio de restrio para a enzima que voc est usando (e
as chances de no existir sero grandes, se sua enzima cortar, por exemplo, um
stio com 6 bases, j que voc s acha um stio assim ao acaso a cada 4000 bases),
a regio no poder ser cortada internamente e um enorme fragmento ser gerado,
no sendo possvel clon-lo num plasmdeo. Ao contrrio, se existir o stio, a enzima
vai cortar o segmento em todas as repeties, produzindo uma grande quantidade
de pequenos fragmentos, em geral inteis para a gentica molecular.
Um fago ter um stio de restrio alvo de uma determinada enzima no
apresenta nenhuma vantagem evidentemente, mas como os stios ocorrem ao
acaso, provvel que um fago possa ser restrito por vrias de seus potenciais
hospedeiros. A vantagem para uma bactria em ter uma enzima de restrio que
reconhece stios com 10 pb que provavelmente essas bactrias tem uma gama
bastante restrita de fagos que lhes so infectivos e por isso no precisam estar
prontas para clivar stios frequentes, mas apenas aqueles que existem nos seus
fagos invasores. Como a Natureza estabelece este balano uma questo de
estudos ainda.

6. 3 Clonando DNA num plasmdeo


Finalmente podem ser discutidas as bases da clonagem de DNA. Para
exemplificar o procedimento ser empregado um plasmdeo como vetor de
clonagem e cortando o plasmdeo e o DNA a ser clonado com uma enzima de
restrio que forma extremidades coesivas. preciso ter em mente, contudo, que
existem vrios outros vetores de clonagem e diferentes formas de fragmentar e
clonar o DNA (com enzimas de restrio que deixam extremidades cegas, com ou
sem posterior cauda, com nebulizao, com prensa francesa, etc.).
Um vetor de clonagem deve ter certas caractersticas, que esto sumarizadas
na figura abaixo.

Caractersticas essenciais e adicionais (desejveis) de um vetor de clonagem.


Apesar da maior parte dos vetores serem compostos de fitas duplas de DNA, h
excees, como o fago filamentoso, com DNA fita simples.
O processo se inicia pela extrao do DNA das clulas doadoras e do
plasmdeo (neste exemplo, um plasmdeo pequeno, de aprox. 4,5 kpb, da bactria
E. coli). A extrao de DNA no um processo complexo: resumidamente, as
clulas so lisadas com um detergente, os restos celulares e boa parte das
protenas precipitadas por centrifugao em presena de uma concentrao elevada
de sal (em geral acetato de potssio) e o sobrenadante, transferido para outro tubo,
misturado com isopropanol. O DNA no solvel neste lcool, mesmo diludo com
gua, e tende a precipitar. Para acelerar o processo centrifuga-se o material a
13.000 rpm por alguns minutos e o precipitado ressuspenso em gua ou num
tampo adequado. O DNA que se obtm desta forma no muito limpo, mas serve
para uma boa parte das aplicaes corriqueiras de laboratrio. Atualmente kits
comerciais permitem a extrao rpida de DNA de praticamente qualquer tipo de
clula, em quantidades e grau de pureza que satisfaam ao mais exigente
pesquisador.
A extrao do plasmdeo semelhante descrita acima, mas preciso usar
um estratagema para separar o plasmdeo do DNA bacteriano. O DNA plasmidial
muito menor que os fragmentos de DNA cromossmico bacteriano. O truque ento
consiste em adicionar soluo de lise em certa quantidade de lcali. O pH alto
desnatura o DNA. Logo em seguida adiciona-se cido actico glacial e acetato de
potssio: o cido neutraliza o lcali e os DNAs tendem a renaturar. Porm, a
presena de sal provoca a precipitao de todas as molculas que no forem muito
solveis em gua. O DNA desnaturado pouco solvel em gua e precipita. o
caso dos fragmentos grandes de DNA cromossmico, que no conseguem se
renaturar e precipitam (por centrifugao), junto com as protenas da bactria e
restos celulares. O DNA plasmidial, ao contrrio, renatura-se rapidamente e torna-se
muito solvel em gua, no podendo ser precipitado. Assim, recolhendo o
sobrenadante, teremos essencialmente DNA plasmidial, com uma contaminao
pequena de DNA cromossmico bacteriano.
A figura a seguir mostra um plasmdeo de clonagem clssico, o pBR322,
precursores de muitos plasmdeos modernos de clonagem. Ele foi usado para a
construo de bibliotecas genmicas, pois no permite a expresso do gene
clonado. Nele a clonagem feita em um stio de restrio dentro do gene tet, que
confere bactria hospedeira do plasmdeo a resistncia ao antibitico tetraciclina.
Quando a clonagem feita dentro da ORF deste gene, ele perde sua funo. Outra
marca de resistncia, representada pelo gene bla, confere bactria hospedeira do
plasmdeo a resistncia ampicilina. A figura abaixo mostra o mapa deste
plasmdeo. Observe que o gene tet pode ser cortado, para fins de clonagem, por
vrias enzimas de restrio. As mais comumente usadas so a BamHI (posio 375)
e a SalI (651).

Mapa
do
plasmdeo de
clonagem
pBR322. Observe os dois genes que conferem resistncia a antibiticos (tet
patatetraciclina e bla para ampicilina). Os stios de restrio ao longo da sequncia
de nucleotdeos esto indicados em azul, com o nome da enzima. Observe tambm
que as enzimas BamHI e SalI s ocorrem uma vez ao longo de todo o plasmdeo
(dentro do gene tet) e por isso so prprias para a clonagem.

Uma vez com os dois DNAs disponveis (doador e plasmidial), resta cort-los
com a enzima de restrio escolhida e misturar os dois DNAs. A tendncia ser
parear as extremidades coesivas, formando construes hbridas, ou quimeras. A
adio de ligase completa a cadeia fosfodister em cada uma das fitas de DNA. Este
processo est representado na parte superior da figura abaixo.
Esquema
para a obteno
de
plasmdeos recombinantes, a partir do uso de uma enzima de restrio que cria
extremidades coesivas.

Ao menos 5 produtos distintos podem ser formados a partir desta mistura. O


produto 1 o desejado, no qual um inserto (verde) foi clonado no plasmdeo
(vermelho). Mas, lamentavelmente, outras construes tambm aparecem: o
produto 2 o mais danoso ao processo, pois se trata do plasmdeo vazio, fechado
sem inserto. Ele perfeitamente funcional e no pode ser descartado do processo.
O produto 3 a circularizao de vrios fragmentos de DNA do doador, numa ordem
qualquer. Este "lixo" no problemtico, porque no contm uma origem de
replicao bacteriana. um DNA que ser perdido ao longo do tempo. O produto 4
a unio de dois ou mais plasmdeos e no se replica to rpido quando o plasmdeo
vazio ou carregado com apenas um inserto, de forma que acaba desaparecendo ao
longo do tempo. O ltimo "lixo" o plasmdeo carregado com vrios insertos
catenados, ligados em cadeia ou com um inserto muito grande. uma construo
instvel, tambm, e tende a desaparecer. Assim, excetuando o plasmdeo vazio,
todos as outras quimeras "lixo", uma vez na bactria, tendem a desaparecer e no
um problema para o experimentador.
Uma vez ligado o inserto com o plasmdeo e produzidos os vrios possveis
lixos, tambm, preciso introduzir estas construes na bactria hospedeira. Isto
feito pela entrada passiva de DNA atravs da membrana de bactrias previamente
tratadas com uma soluo de cloreto de clcio, ou ativamente, atravs de choques
eltricos, num processo chamado eletroporao. A eficincia de transformao,
entrada de DNA na bactria, bastante baixa de 10 -3 a 10-8, mas os transformantes
tero o plasmdeo dentro deles, o que lhes deve conferir propriedades novas, que
permitam uma seleo positiva. De fato, os plasmdeos tm uma gene que confere
bactria a resistncia a certo antibitico, por exemplo, ampicilina, de forma que
basta adicionar ampicilina ao meio e eliminar rapidamente todas as bactrias que
no tiverem plasmdeo vazio ou carregado.
O lixo no possvel ser eliminado, pois o plasmdeo vazio confere a mesma
resistncia ao antibitico que o plasmdeo carregado. Entretanto, possvel
averiguar ao menos se, no conjunto de plasmdeos formados, a maior parte est
carregada com inserto ou, ao contrrio, vazia. Para tal os plasmdeos de clonagem
tm uma segunda marca de resistncia a antibiticos em geral, tetraclina, que
perdida quando o plasmdeo aberto e o inserto clonado. Significa dizer que o
stio de clonagem interno ao gene para a resistncia tetraciclina. Significa
tambm dizer que as bactrias que tm plasmdeos vazios so resistentes a
ampicilina e tetraciclina, enquanto as que tm plasmdeos com inserto s mostram
resistncia a ampicilina. O procedimento baseia-se na obteno de uma rplica de
uma placa de Petri contendo colnias crescidas em presena de ampicilina, que
ento carimbada sobre uma nova placa de Petri contendo tetraciclina. As colnias
que crescerem tambm em tetraciclina no interessa, mas podem ser contadas. A
figura abaixo mostra esquematicamente o procedimento, desenvolvido para outros
fins, h quase 50 anos, por Joshua Lederberg.

6.4 Biblioteca genmica: todo o genoma em pedaos...

O conjunto de bactrias albergando plasmdeos quimricos ou


recombinantes construdos a partir de DNA genmico chamado biblioteca
genmica. Em princpio, se cortamos um genoma de um organismo qualquer em
pedaos com uma enzima e construmos uma biblioteca suficientemente grande
(isto , com muitos clones, ou bactrias, diferentes uns dos outros), teremos uma
probabilidade alta de termos qualquer fragmento de DNA desejado em algum dos
clones. Esta meta, contudo, no to simples de ser alcanada. As enzimas de
restrio s cortam nos seus stios especficos e as regies ricas em repeties
muitas vezes no tm nenhum stio de restrio. Como o DNA dos eucariotos
superiores muito rico em regies repetidas, o que ocorre que uma parte
relativamente grande do genoma no pode ser clonada desta forma.

O recurso para obter fragmentos de tamanho razovel (1 a 4 kpb) ao longo de


todo o genoma a fragmentao do DNA por nebulizao ou por outro mtodo
mecnico qualquer e a clonagem dos fragmentos em um vetor aberto com uma
enzima que produz extremidades cegas. Desta forma pode-se obter mais facilmente
uma biblioteca genmica que represente efetivamente todo o genoma.

6.5 Vetores para pedaos maiores...


Quando h um desejo de clonar fragmentos grandes de DNA e h uma
poro de razes para isto, pode-se optar por outros vetores no-plasmidiais. A
tabela abaixo mostra alguns deles e os tamanhos de inserto que acomodam.

Sinopse dos vetores mais empregados par clonagem de fragmentos de DNA

Tamanho do
Designao Descrio
inserto
Plasmdeo 1b-10 kb DNA circular fita dupla
Fago (bacterifago) at 20 kb DNA linear fita dupla
DNA linear fita dupla, que se
Cosmdeo at 40 kb circulariza para converter a forma de
fago em plasmdeo
BAC - cromossomo DNA circular fita dupla (com sinais de
at 250 kb
artificial de bactria cromossomo bacteriano)
DNA linear fita dupla (com sinais de
YAC - cromossomo cromossomo de levedura, como
at 2 Mb
artificial de levedura telmeros, centro organizador de
nuclolo, etc.)

6.6 Sinopse da triagem de bibliotecas genmicas


A meta da construo da biblioteca genmica a obteno de clones de
nosso interesse. Podem ser, por exemplo, clones com fragmentos de um
determinado gene.
Para encontrar clones que contenham sequncias de DNA que faam parte
do gene procurado em geral tem que se valer da propriedade que uma fita simples
de DNA tem de hibridizar com uma fita que lhe seja complementar. Assim, uma fita
de DNA marcada radiativamente, chamada sonda de DNA, pode funcionar como um
"sistema de busca" de sequncias de DNA que tenham alguma complementaridade
com ela. Esta sonda em geral no muito grande, podendo ter entre 200 e 100
bases. Ela representa, portanto, um trecho do gene no qual estamos interessados.
Portanto, ela vai hibridizar apenas com um trecho do gene. Como exemplo, imagine
a construo de uma sonda de DNA com 250 bases que hibridiza com um trecho do
3o. xon de um gene, cujo comprimento total de 4.500 pb. Qualquer que seja o
tamanho do fragmento do gene clonado, ele ir ser reconhecido pela sonda desde
que contenha um trecho complementar ao menos a um pedao da sonda
(usualmente pelo menos 50%). Como os fragmentos gerados so aleatrios, podem-
se conseguir vrios clones que representam trechos distintos, em geral parcialmente
sobrepostos, do gene de interesse.

A sonda de
DNA de 250 bases
dirigida contra a
parte final do 3o. xon do gene de 4.500 pb capaz de reconhecer clones com
insertos de fragmentos do gene, desde que contenham alguma parte que hibridize
com a sonda. Na figura, os primeiros 3 fragmentos vo ser identificados pela sonda,
e os dois ltimos no.
Visto isso, pode ser discutida a metodologia geral de identificao dos clones
de interesse dentro de uma biblioteca genmica. A tcnica conhecida como
triagem ou screening e est representada na figura abaixo.

a) Tudo comea com o plaqueamento de uma alquota da biblioteca genmica


em placas de Petri. Cada bactria formar uma colnia. Como elas carregam
plasmdeos recombinantes, cada colnia conter, alm do DNA genmico das
bactrias, tambm o DNA plasmidial e, dentro dele, um trecho do DNA do genoma
do organismo em estudo.
b) Quando as colnias estiverem pequeninas ainda, deve-se cobrir a placa de
Petri com uma membrana de nylon ou outro material que tenha tendncia a ligar
DNA, h um produto chamado Hybond, muito usado.
c) Depois de 2 a 4 horas o filtro (membrana) retirado, obtendo-se assim uma
rplica das colnias da placa no filtro. A placa de Petri original, chamada master, vai
para a geladeira, bem selada com plstico adesivo para no secar nem contaminar.
d) A rplica obtida na membrana ainda tem as bactrias ntegras e vivas e o
DNA est dentro delas! Ento, precisa-se inicialmente lisar as bactrias, o que se faz
com vapor de clorofrmio e depois imerso da membrana em uma soluo com SDS
e lisozima. Esta etapa libera os DNAs, que ficam aderidos ao nylon da membrana.
Ela ento colocada num saquinho plstico e incubada com a sonda marcada
radiativamente. Para isso o DNA precisa estar aberto, o que pode ser obtido
aquecendo previamente a membrana a 85 90C ou usando solues
desnaturantes. Aps adio da sonda as condies de hibridizao so restauradas.
e) Depois da incubao com a sonda, o excesso dela lavado e a membrana
e sobreposta a um filme de raio X, indo o conjunto num cassete plstico para o
freezer.
f) Revelao do autoradiograma mostrar a localizao da (s) colnia (s) que
contiver (em) os clones de interesse. Volta-se ento placa master e repicam-se as
colnias selecionadas para tubos de ensaio com o meio de cultura adequado.

g) Ao final, se quiser saber o que cada plasmdeo (clone) est carregando,


ser preciso sequenciar. Por isso, todos os plasmdeos de clonagem j vm
construdos de forma a facilitar o sequenciamento bidirecional dos insertos.
Esquema demonstrativo dos passos necessrios triagem de bibliotecas genmicas
em plasmdeo empregando sondas radiativas.

6.7 Clonagem e expresso: o problema dos ntrons


Um dos principais objetivos da clonagem a expresso do segmento
clonado. Em geral entende-se por expresso do gene a protena que ele codifica.
Assim, se clonar um gene qualquer de um mamfero, deseja-se em geral que ele
possa ser expresso num outro organismo, por exemplo, uma bactria, de forma que
possa obter grandes quantidades da protena do mamfero a partir de uma cultura
bacteriana. o que se imagina quando se ouve falar na produo de insulina
humana por bactrias. Entretanto, expressar genes eucariotos em bactrias no
uma tarefa to fcil quanto a princpio possa parecer.
comum nos eucariotos que o quadro aberto de leitura ou ORF (a regio do
gene que vai deste o primeiro ATG a ser traduzido at o cdon de terminao) seja
interrompido por um ou mais trechos de DNA que no sero posteriormente
traduzidos, pois sero retirados do conjunto, no nvel do RNA, no processo de
maturao do RNA mensageiro. Este mecanismo de retirada de segmentos de DNA
no codificantes, chamados ntrons, conhecido como splicing.
A figura abaixo mostra uma estrutura hipottica, genrica, de um gene
eucarioto, e a gerao de um mRNA eucarioto por splicing e adio de cauda poli-A,
acompanhadas de modificao da extremidade 5(capping). Adicionalmente,
mostramos como seria a organizao de um mRNA com introns, produzido a partir
do mesmo segmento gnico, por um procarioto (por exemplo, a bactria hospedeira
de um plasmdeo recombinante).

Aps a
produo do transcrito primrio, os spliceossomos aproximam o fim e o incio de
xons adjacentes e formam um lao com o ntron, preparando o conjunto para a
retirada da regio intrnica (1). O RNA gerado aps o splicing dos ntrons (2) ainda
no um mRNA maduro, pois ter ainda retirada uma poro 3 aps o sinal de
poliadenilao, dever receber uma cauda poli-A e a modificao da extremidade
5(cap 7-metil-guanosina) (3). Um procarioto no capaz de realizar o splicing e o
sistema de traduo considerar como mRNA vlido o RNA transcrito primrio (4),
desde que os ribossomos possam se ligar ao RBS da sequncia (nos sistemas de
clonagem com expresso veremos que o RBS faz parte do vetor).

fcil, aps a anlise da figura acima, entender que um procarioto no ser


capaz de produzir uma protena igual quela produzida pelo eucarioto, se iniciar o
processo com genes contendo introns. Na verdade, mesmo um outro eucarioto
poder no faz-lo se o sistema de splicing no compreender os sinais de splicing
(sequncias de bases) contidos no incio e no fim dos introns. Por isso, a estratgia
para se clonar e expressar genes eucariotos tem que ser distinta da apresentada na
aula 5.
5.7 Como fazer um DNA eucarioto sem introns?

Precisamos necessariamente partir de genes cujos introns j foram


retirados (salvo algumas excees, quando os genes no contiverem introns, como
o caso de muitos protozorios, por exemplo). Portanto, precisamos partir de RNAs
mensageiros (que no contm introns) e seguir um caminho inverso, inicialmente,
produzindo DNA, para depois, ento, clonar este DNA no vetor e permitir que seja
traduzido de volta num mRNA sem introns.

H vrios procedimentos para se produzir um DNA fita dupla a partir


de um mRNA. Este DNA chamado cDNA, pois a primeira etapa de sua construo
envolve a produo de um DNA complementar (da o C...), como ser visto na
prxima figura. Neste captulo vamos discutir um mtodo que permite criar um DNA
fita dupla com extremidades coesivas diferentes nas pontas 5e 3, de tal forma que,
na hora de se clonar o segmento no vetor, a clonagem ser uni-direcional, isto , o
inserto entrar apenas num sentido.

O processo se inicia pela extrao do mRNA. Este processo , do


ponto de vista bioqumico, semelhante ao processo de extrao de DNA, porm o
RNA muito lbil, sujeito ao das RNAses do prprio organismo e de
praticamente qualquer fluido biolgico, inclusive a gua no autoclavada. Tomadas
as devidas precaues (e empregando kits comerciais, de preferncia) pode-se
obter uma boa quantidade de RNA praticamente a partir de qualquer clula
eucariota. Mas o que queremos mRNA, e no RNA total (uma mistura de RNA
heterogneo nucelar, RNA transportador, RNA ribossomal e pequenos RNAs do
ncleo, alm de mRNA). Por isso, empregamos uma segunda etapa de purificao,
onde o mRNA separado por cromatografia de afinidade dos demais RNAs.
Geralmente se usa um kit, no qual uma pequena seringa cheia de gel de sepharose
ligada a oligonucleotdeos poli-T serve de sistema de captura dos mRNAs (pela
extremidade poli-A, que vai parear com os poli-T do gel). Aps lavar com tampo
tudo o que no ficou aderido, desloca-se o mRNA da coluna com uma soluo de
alta fora inica e, pronto! Temos em trs ou quatro gotas de tampo mRNA
suficiente para obter uma biblioteca de cDNA.
Em seguida vamos discutir o processo de produo do DNA fita dupla
a partir de mRNA. O processo, que todo conduzido em tubo de ensaio, se inicia
pela produo de um DNA complementar fita simples, a partir do mRNA. Como a
transcriptase reversa necessita de um primer para iniciar sua tarefa, empregamos
oligonucleotdeo poli-T. No caso mostrado na figura, detalhe (1), o oligo dT
prolongado, no sentido 5, por um conjunto de bases que contm o stio de restrio
para uma enzima A (neste caso, a enzima XhoI, cujo stio de restrio 5-
CTCGAG - 3). Esta a forma de adicionarmos ao nosso futuro DNA um stio de
restrio conhecido bem na extremidade 3.

Uma vez pareado, o primer vai permitir a sntese da primeira fita de


DNA, que ser estendida com a ajuda da transcriptase reversa e com dNTPs
(desoxirribonucleotdeos tri-fosfato), como na sntese de DNA normal (etapa (2)).
Para proteger a fita de DNA contra a ao de enzimas de restrio (que sero
empregadas mais adiante), o sistema de reao tem, no lugar de desoxicitosina-
trifosfato, um precursor metilado, a 5-metil-citosina-trifosfato, que vai impedir a ao
das duas enzimas de restrio sobre o DNA recm sintetizado, numa etapa posterior
que j iremos comentar. A transcriptase reversa tende a parar seu processo de
sntese de DNA complementar antes de chegar ao incio do mRNA (estamos
produzindo o cDNA de "trs para frente"). Esta parada ocasionada, em parte, por
uma atividade RNsica residual da enzima, que pode degradar o RNA que ela
mesma est prestes a copiar como DNA. Nos kits modernos a transcriptase reversa
recombinante empregada tem uma atividade RNsica muito pequena, mas ainda
assim se observa uma parada da produo do cDNA antes da extremidade do
mRNA, por razes ainda no completamente compreendidas, e que acaba gerando
um cDNA mais curto que o mRNA original. Mais adiante discutiremos a importncia
da perda de informao gentica nesta regio 5 do cDNA.

Para a sntese da segunda fita de DNA a maior parte dos kits


comerciais usa um artifcio, denominado nick translation (traduo por cortes), que
uma denominao muito mal encontrada pelos seus inventores para o processo de
replicao de DNA descrito a seguir. Inicialmente, com o uso da atividade
endonuclesica de uma enzima adequada, inserimos pequenos cortes na cadeia de
fosfatos do RNA (os chamados nicks). Estes cortes criam automaticamente
extremidades 3-OH, que serviro de apoio para que a DNA polimerase (em geral o
chamado fragmento Klenow da DNApol I bacteriana, que polimerisa mas no faz
reviso da sntese). Estes nicks esto mostrados na etapa (3). A partir deles a
DNApol I (ou o fragmento Klenow) sintetiza pequenos trechos de DNA, apoiando-se
nas extremidades 3-OH criadas pelos nicks. Ao trmino desta etapa a DNA pol
produz uma srie de fragmentos e reconstitui, em fita dupla, o stio Xho I na
extremidade 3 do DNA (detalhe (5)).
Figura 5.8 Sntese de cDNA para clonagem uni-direcional em vetor de
expresso. Cada etapa est discutida no texto. Os crculos vermelhos representam
as bases metiladas. A seta na etapa 4 aponta para um nick ou corte.

Em seguida os fragmentos so ligados entre si pela ao da ligase


(etapa (6)) e eventuais salincias (overhangs) da fita so retirados pela ao de uma
exonuclease adicionada ao tubo. Esta ao chamada de trimming (segundo
detalhe (6)). A prxima etapa a adio de adaptadores, que so pequenos
fragmentos de DNA fita dupla contendo um stio de restrio para uma segunda
enzima (no exemplo, o stio GAATTC, da enzima EcoRI). Estes adaptadores so
colados durante algumas horas pela incubao do DNA 'trimado" na presena de
ligase. O resultado o que est mostrado na etapa (7). A adio de vrios
adaptadores em cada extremidade minimizada por um artifcio bioqumico, que
envolve a desfosforilao de uma das extremidades 5 dos adaptadores.

O penltimo passo o corte do fragmento de DNA fita dupla com as


duas enzimas de restrio para as quais adicionamos stios (neste caso, Xho I e Eco
RI), mostrado na etapa (8). As duas enzimas cortam o DNA formando extremidades
coesivas, isto , deixando bases despareadas, numa salincia (overhang) 5. As
duas enzimas no podem cortar o DNA recm sintetizado em algum stio de
restrio interno, pois ele est protegido pela adio das bases metiladas na
primeira etapa de sntese. Os adaptadores e o stio XhoI, contudo, no tm esta
proteo e podem ser clivados. Os fragmentos de DNA gerados por estes cortes so
eliminados de nosso tubo por uma reao de filtrao ou de precipitao e o DNA
fita dupla, pronto para ser clonado unidirecionalmente, fica disponvel finalmente
(etapa (9)).

5.8 Biblioteca de cDNA e caractersticas de um vetor de expresso para


Escherichia coli.

A clonagem dos insertos de cDNA em plasmdeo e a transformao


de bactrias com estes plasmdeos gera uma biblioteca de cDNA. Assim, da mesma
forma que definimos para biblioteca genmica, a biblioteca de cDNA o conjunto de
bactrias, cada qual transportando mltiplas cpias de um plasmdeo carreando um
inserto representando um cDNA qualquer obtido do material biolgico doador de
mRNA. Se o plasmdeo tiver certas caractersticas bsicas que permitam a
expresso do inserto clonado, ser produzida uma protena recombinante. Como
deve ser este plasmdeo?

Inicialmente, devemos ter em mente que os cDNAs gerados pelo


sistema descrito acima nem sempre contm toda a ORF (o quadro aberto de leitura)
do gene. O esquema abaixo mostra as vrias possibilidades, fruto do fato de que a
transcriptase reversa encerra aleatoriamente seu trabalho de sntese da primeira
fita .

Figura 5.9 Vrios cDNAs de tamanhos diferentes so produzidos a partir do


mesmo mRNA. A razo desta variao o abandono da sntese da primeira fita pela
enzima transcriptase reversa em diferentes momentos da sntese, provavelmente
devido clivagem do RNA mensageiro adiante dela pela ao remanescente de
RNAseH que existe naturalmente nesta enzima. O mRNA original (1) em geral
mais longo do que qualquer um dos cDNAs gerados pela ao da trascriptase
reversa. O mais curto (4) no contm sequer um trecho da ORF. UTR =
"untranslated region" ou regio no traduzida.

Como as ORFs costumam ser muito mais longas do que as UTRs


(veja propores no alto da figura 5.10), a maior pare dos cDNAs gerados cai no
caso descrito em 3, isto , contm uma parte da ORF e a regio 3 no traduzida (3
- UTR).

Se clonarmos unidirecionalmente o cDNA com a estrutura mostrada


em (3), Figura 5.10 num vetor de expresso, teremos que disponibilizar no vetor um
promotor esquerda (5) do fragmento clonado. Deveremos tambm adicionar um
operador ao sistema para que a hospedeira no corra o risco de se intoxicar e
morrer com uma quantidade grande de protena recombinante (que, por no ser
normalmente um produto da hospedeira, perturba seu metabolismo, sobretudo
quando est em grandes quantidades, o que geralmente o caso de protenas
recombinantes). Alm disso, pelo fato de que a ORF clonada em geral incompleta
e no contm o ATG inicial, precisamos tambm acrescentar um ATG (e um RBS
antes dele) para garantir a sntese de protena a partir do mensageiro. A figura
abaixo mostra esquematicamente estas propriedades do plasmdeo e a conseqente
protena recombinante gerada pela clonagem.
Figura 5.10 Esquema representativo de um vetor de expresso que emprega
parte do operon lac (muito modificado) para garantir a expresso controlado dos
insertos clonados no stio mltiplo de restrio (MRS). Veja o texto abaixo para
detalhes. A cabea do cavalo a parte aminoterminal da protena (NH2) e cauda da
tartaruga a extremidade carboxi-terminal (COOH).

O exemplo dado na figura bem prximo realidade, isto ,


assemelha-se a plasmdeos comerciais que so frequentemente usados nos
laboratrios de pesquisa e desenvolvimento. A seguir analisamos detalhadamente
cada parte da figura. Entetanto, recomendamos fortemente a visita pgina de
plasmdeos.

Observe que o local onde a clonagem ser feita chamado MRS ou


stio mltiplo de restrio, por conter vrios stios de restrio muito prximos e
nicos em todo o plasmdeo. A vantagem deste arranjo sobre aquele que emprega
uma nica enzima que o experimentador tem muito mais liberdade de escolher a
enzima de restrio que ir empregar para contar o DNA doador. Alm disso, ele
pode cortar o vetor com duas enzimas e obter extremidades diferentes esqueda (5
) e direita (3), o que permitir a clonagem unidirecional dos fragmentos gerados
com a tcnica descrita na figura 5.8.

A clonagem ser feita, neste exemplo, dentro do gene lacZ.


Consequentemente, se a bactria hospedeira for lacZ -, ela se tornar lac+ quando
receber o plasmdeo vazio (sem inserto) e permanecer lac - se receber um
plasmdeo recombinante (carregando um inserto). Mediante o uso de um indutor do
sistema (no caso, um anlogo de latose, o IPTG ou isopropil-tio-galactosdeo) e um
indicador da atividade da b-galactosidase (a X-gal), possvel visualizar como
colnias azuladas aquelas formadas por bactrias com plasmdeos vazios e como
colnias transparentes aquelas formadas por bactrias com plasmdeos
recombinantes. a chamada "seleo por cor".

Aps o gene lacZ indispensvel um sinal de terminao da traduo,


que terminar a sntese do mRNA. Ele est indicado como uma pequena caixa
preta, marcada com um t. O mRNA, por sua vez, termina num grampo, seguido de
um poli-U, representado por uma pequena elipse rosa cortada por 3 Us.

A sntese de mRNA iniciada no promotor e est sob controle do


operador. Assim, a bactria s ir expressar a protena recombinante se houver
indutor no meio, evitando que ela morra intoxicada com a protena recombinante que
est fazendo. Embora o promotor lac seja fraco na Natureza, o que se emprega para
clonagem um promotor mutante forte.

Como no podemos ter certeza de que o primeiro ATG da ORF


original do gene obtido do organismo doador est disponvel (o que implicaria dizer
que a transcriptase reversa teria copiado toda a regio 3no-traduzida mais toda a
ORF antes de parar), convm contar com a presena de um ATG no plasmdeo, que
justamente o ATG do gene lacZ. indispensvel tambm ter um RBS procarioto
antes deste ATG, como indicado pelas caixas azuis na figura, para fazer do RNA
transcrito um verdadeiro mRNA.

Na figura acima o inserto clonado contm parte da ORF do organismo


doador e a extremidade 3 no traduzida (3 UTR). Quando se d a clonagem, o
gene lacZ fica interrompido. A primeira parte do gene servir para codificar os
primeiros aminocidos da protena recombinante (representados pela cabea de
cavalo ao final do esquema). A segunda metade nunca ser expressa porque os
ribossomos terminaro a sntese num cdon de terminao muito anterior ao incio
do trecho restante do lacZ. No caso especfico do exemplo da figura, o inserto
contm parte da ORF (presumivelmente no mesmo quadro de leitura do lacZ, 1a.
parte) e portanto h no fim desta ORF um cdon de terminao do gene do
organismo doador. Se o quadro de leitura estiver errado ou se apenas a extremidade
3 UTR for clonada, existe uma pequena chance de que os ribossomos alcancem a
2a. parte do lacZ, mas provavelmente fora do quadro de leitura (2 chances em 3). De
uma forma geral, podemos afirmar que a segunda parte do lacZ nunca traduzida.

A partir do ATG aps o RBS plasmidial, forma-se ento uma ORF que
termina em geral no cdon de terminao (stop) do gene doador. necessariamente
uma ORF recombinante, que dar consequentemente origem a uma protena
recombinante, ou quimrica. A protena sempre muito menor do que o mRNA
sintetizado a partir do promotor lac do plasmdeo. A "cabea" beta-galactosidase da
protena recombinante (ou quimrica) no enzimaticamente ativa.

Esgotada a discusso da figura, podemos ainda discutir outras


caractersticas do plasmdeo de clonagem e expresso. Como o exemplo de
plasmdeo discutido na construo de bibliotecas genmicas (aula 5), este tambm
deve conferir bactria uma marca seletiva. Em geral, esta marca a resistncia a
um antibitico. Os plasmdeos comerciais em geral empregam a marca de
resistncia ampicilina. Por fim, o plasmdeo deve ter uma origem de replicao
autnoma e relaxada, que permita a gerao de um grande nmero de cpias por
bactria.

Muitos plasmdeos apresentam outras caractersticas interessantes,


mais ou menos comuns a todos. Uma delas a existncia de sequncias de bases
antes e depois do inserto que permitiro a hibridizao de primers para o
sequenciamento do inserto. No captulo seguinte falaremos em maiores detalhes
sobre esta estratgia.

Como saber se a biblioteca de cDNA que construmos tem qualidade,


isto , tm a maior parte dos clones cheia com insertos? No exemplo dado na figura
acima temos um poderoso recurso, a seleo por cor. De fato, basta plaquear no
meio indicador (contendo IPTG e X-gal) a bactria e poderemos em poucas horas
avaliar se a porcentagem de colnias brancas muito maior que a de colnias azuis.
Uma biblioteca razovel deve ter ao menos 90% de colnias brancas.

Outro aspecto importante a representatividade de nossa biblioteca. Assim


que a construmos, podemos calcular quantos clones (uma bactria carregando um
grande nmero de cpias do mesmo plasmdeo recombinante) independentes
geramos no volume total de nosso ensaio. Se a maior parte dos clones estiver com
inserto, podemos assumir que a biblioteca ser representativa se tiver ao menos
500.000 clones. Mas porque um nmero to grande, se no h nenhum organismo
que expresse um nmero to grande de genes? De fato, 100.000 genes quase o
limite para o nmero de genes de um organismo complexo como o homem.
Entretanto, devemos nos lembrar que os genes muito expressos geraro muitos
cDNAs e, conseqentemente, muitos clones, enquanto que os genes pouco
expressos podero gerar apenas um clone na mistura total. Por isso, necessrio
sempre um nmero de clones independentes muito maior do que o total esperado de
genes expressos no material empregado para a construo da biblioteca de cDNA.

5.9 Seleo (triagem ou screening) de clones pela expresso da protena


recombinante.

Se desejarmos encontrar em nossa biblioteca de cDNA um clone


qualquer, geralmente o que fazemos procurar pelo clone que est expressando a
protena que queremos. Mesmo considerando que a protena quimrica, ela ter
ao menos uma poro (final) da protena de interesse. Para uma triagem voltada
protena, geralmente empregamos como sondas anticorpos, obtidos pela imunizao
de camundongos ou coelhos com uma protena de mesma funo, purificada de
outro organismo, ou mesmo recombinante, mas de outra origem. Como os
anticorpos produzidos so policlonais e dirigidos contra mltiplos epitopos ao longo
da protena, muito provvel que reconheam a parte da protena recombinante que
teve origem no inserto (o corpo de tartaruga da figura acima), mesmo que os
anticorpos tenham sido feitos contra uma protena semelhante de outro organismo.
Todos os passos principais da triagem com anticorpos esto
representados na figura abaixo. Para que os anticorpos possam encontrar as
protenas recombinantes, essencial que as bactrias sejam rompidas e o contedo
protico fixado num substrato adequado. De forma semelhante ao que fazemos na
triagem de bibliotecas genmicas, uma membrana circular (desta vez de
nitrocelulose, que adere protenas; no caso das bibliotecas genmicas a membrana
de nylon, que adere o DNA) colocada sobre uma placa de Petri quando as
colnia de uma pequena alquota da biblioteca ainda esto pequenas. Deixa-se que
as colnias cresam algumas horas em contato com a membrana, que ento
retirada. A placa (master) deve ser mantida na geladeira. As bactrias so lisadas, o
contedo bacteriano sondado pelos anticorpos, que se ligaro s manchas
proticas onde h a protena recombinante que eles reconhecem. O excesso de
anticorpos lavado com tampo e os anticorpos fixados so revelados pelo uso de
um conjugado adequado (anticorpo anti-anticorpo, ligado enzima peroxidase, por
exemplo) e de um substrato que possa ser visualizado facilmente (no caso da
peroxidase, pode ser empregada a tetrametilbenzidina como substrato cromognico
e o perxido de hidrognio como doador de oxignio reativo). As manchas reativas
indicaro na placa de Petri master a posio das colnias de interesse.

evidente que tambm podemos empregar, como fizemos para a


triagem de bibliotecas genmicas, sondas marcadas, mas os clones encontrados
no necessariamente estaro expressando os insertos na forma de protenas
recombinantes, porque os insertos podem estar fora do quadro de leitura inicial do
lacZ.

H muitos detalhes tcnicos na triagem que no discutimos, porm a


base do processo est adequadamente esclarecida.
Figura 5.11 - Esquema representativo da triagem de uma biblioteca de cDNA
em plasmdeo de expresso empregando anticorpos. O princpio da triagem a
descoberta da protena recombinante pelo anticorpo, presente no soro de animais
imunizados ou de animais ou serem humanos infectados com um patgeno.

5.10 Que genes esto representados numa biblioteca de cDNA?

Ao contrrio de uma biblioteca genmica, que contm em princpio


qualquer fragmento de DNA do organismo doador, a biblioteca de cDNA contm
apenas os genes expressos pelas clulas empregadas na extrao de mRNA, e
ainda assim apenas aqueles expressos imediatamente antes do processamento das
clulas no laboratrio. Isto implica dizer que uma biblioteca feita com clulas do
meristema apical de uma planta ter muitos genes diferentes de uma outra biblioteca
feita a partir de estame. Mas tambm ter muitos outros iguais, pois h genes que
so expressos em diferentes tecidos e mesmo outros expressos em qualquer tecido.
5.11 Protenas recombinantes: as quimeras so desejveis?

Ao examinarmos a protena recombinante esquematicamente


representada na figura 5.10 poderamos nos perguntar: para que serve uma protena
hbrida, parte beta-galactosidase bacteriana e parte protena de meu organismo de
estudo? No seria mais sensato ter apenas a parte no bacteriana para ensaiar?

Mesmo uma protena quimrica pode ter aplicao imediata. Apenas


como exemplo discutimos duas aplicaes rotineiras: como antgeno diagnstico e
como vacina.

Se desejamos empregar uma protena recombinante para diagnstico


(suponhamos, uma protena que se inicia com a beta-gal e termina com uma frao
carboxi-terminal da tubulina de Leishmania), podemos fix-la aos micropoos de
uma placa de ELISA. Em seguida, o soro dos pacientes pode ser previamente
misturado com uma soluo contendo extrato de Escherichia coli, de forma a
imunoadsorver na fase lquida todos os eventuais anticorpos do paciente contra
protena bacteriana, em geral, e contra a beta-galactosidase em particular. Por fim,
basta pipetar o soro imunoadsorvido sobre os micropoos. Os anticorpos livres
contra atubulina de Leishmania (presentes no soro dos pacientes com leishmaniose)
vo aderir parte recombinante da tubulina e ficaro presos ao plstico. O
excesso de anticorpos lavado e a presena dos anticorpos fixados tubulina
detectada como descrito acima para a triagem de colnias. Poder-se-a argumentar
que os anticorpos humanos so produzidos contra a tubulina completa, e no
reconheceriam apenas parte dela. Entretanto, com dito acima, a produo de
anticorpos numa imunizao e numa infeco , em geral, policlonal, e dirigida
contra muitos epitopos, que podem estar na parte amino (no presente na nossa
protena recombinante) ou na parte carboxi-terminal (representada pelo corpo de
tartaruga da figura 5.10).

Esta abordagem especialmente interessante quando o antgeno


(uma protena ou uma mistura de componentes do organismo infectante) difcil de
conseguir. o caso da filariose bancroftiana, pois o nico hospedeiro do parasita
Wuchereria bancrofti o ser humano. No tico e vivel obter grandes
quantidades de microfilrias de um paciente para diagnosticar os demais! A
produo de uma biblioteca de cDNA tambm depende de microfilrias ou vermes
adultos de um paciente, mas evento nico e uma vez construda a biblioteca no
ser mais necessrio voltar a obter parasitas do paciente.

No caso de desejarmos fazer uma vacina, a abordagem semelhante:


basta inocularmos a protena recombinante no mamfero que desejamos imunizar,
com ou sem adjuvantes. preciso apenas ter ateno para a imunogenicidade da
parte plasmidial da protena recombinante. A beta-galactosidase pouco
imunognica e pode ser empregada, mas outras construes usam polipeptdeos
mais imunognicos, que devem ser empregados com cautela.

Se, por qualquer razo, no podemos de forma alguma usar uma


protena quimrica, podemos lanar mo de vetores que tm imediatamente antes
do stio de restrio empregado na clonagem uma sequncia de bases que codifica
um pequeno peptdeo reconhecido e cortado por uma enzima adequada. Na figura
5.10 como se a cabea de cavalo estivesse ligada ao corpo da tartaruga por uma
pequena haste de peptdeo, que pode ser cortada por uma enzima. Podemos ento
capturar as protenas recombinantes da lise bacteriana por uma coluna de
cromatografia de afinidade com anticorpos dirigidos contra a parte plasmidial da
protena recombinante (a cabea de cavalo). Uma vez lavada a coluna para retirar o
material no fixado, adiciona-se a ela um pequeno volume de tampo contendo a
enzima que corta a unio entre a cabea e o corpo, e recolhe-se no efluente da
coluna apenas a parte que interessa (protena do organismo doador) da protena
quimrica.

7. PCR - Uma tcnica de mil e uma utilidades


7.1 Primeiros passos
Ainda na dcada de 60 muitos pesquisadores procuraram obter a sntese de
DNA in vitro. evidente que obter DNA em tubo de ensaio o primeiro passo para
um universo de experimentos em gentica molecular. O primeiro a conseguir
caminhar neste sentido foi Arthur Kornberg, de quem j falamos na aula sobre
replicao do DNA. Era natural, j que Kornberg era um profundo conhecedor das
DNA polimerases. A sntese de um DNA viral in vitro foi recebida com entusiasmo
por todos, inclusive a imprensa leiga, que qualificou o feito como a criao da vida
em laboratrio. Esta metfora tem sido usada pela imprensa com insistncia em
vrias ocasies, sempre que se trata de manipular o DNA de um ser vivo, e em geral
provoca mal estar entre os pesquisadores, o que foi o caso de Arthur Kornberg.
Em 1983, Kary Mullis, ento pesquisador empregado na Cetus Corporation,
EUA, imaginou uma forma de fazer com que a DNA polimerase iniciasse e
terminasse seu trabalho em trechos pr-determinados do DNA. Com o sistema seria
possvel amplificar milhes de vezes um pequeno trecho de um longo segmento de
DNA. A idia foi aprimorada na Cetus e apresentada pela primeira vez em 1985,
numa conferncia. Depois disso a tcnica, conhecida como PCR, ganhou quase
instantaneamente uma aceitao mundial e em menos de uma dcada tornou-se o
procedimento bsico de todo laboratrio de gentica molecular no mundo.
Mas, afinal, o que a PCR?
A sigla significa "polymerase chain reaction", que em portugus seria reao
em cadeia da polimerase. Ento, a base da tcnica a ao in vitro da DNA
polimerase. Para compreendermos como funciona a tcnica, que na verdade bem
simples, precisamos recordar que, para iniciar a sntese de uma fita nova, a DNA
polimerase precisa de um primer (de RNA ou de DNA), de um DNA molde e de
precursores de sntese de DNA, coletivamente chamados dNTPs
(desoxinucleotdeos tri-fostato, i.e., dATP, dTTP, dCTP e TGTP).
A idia de Mullis era simples. Adicionava-se ao tubo de ensaio um pouco de
DNA contendo o trecho que queria amplificar, os dNTPs, a DNA pol e dois primers
de DNA feitos em laboratrio, um hibridizando numa fita e "apontando" para o outro,
que hibridizava com a outra fita e "apontava" para o primeiro. A distncia entre os
stios de pareamento dos dois primers no podia ser muito grande, e foram
escolhidos para testes trechos com menos de 1000 pb. Com todos os reagentes no
tubo, a reao era inicialmente aquecida a 94 oC, para que todas as fitas de DNA se
desnaturassem. Em seguida a temperatura era reduzida para permitir o pareamento
dos primers, em geral para 50 oC. Por fim, a temperatura era reduzida ainda mais,
at 37 oC, para que a DNA polimerase de E. coli pudesse trabalhar e estender duas
fitas simples de DNA, uma a partir de cada primer, duplicando, assim, a sequncia
alvo escolhida. Ao se repetir o ciclo os primers encontrariam agora dois alvos cada
um, a partir do primeiro alvo replicado: um no DNA original e outro na cpia recm
sintetizada, gerando, por sua vez, ao fim do novo ciclo, 4 cpias do alvo. claro que
a repetio do processo geraria um nmero de cpias do alvo que se elevaria
exponencialmente, com base 2.
Na verdade, a coisa no foi to fcil assim: a DNA pol era termoinstvel
(como a maioria das protenas dos seres vivos) e se inativava irreversivelmente a 94
o
C. Era preciso adicionar mais DNApol no tubo a cada ciclo de extenso. Alm disso,
a baixa temperatura de funcionamento da DNApol de E. coli propiciava o
aparecimento de pareamentos esprios (sem sentido, errneos) no sistema,
gerando ao final produtos de PCR inesperados.
A soluo foi encontrada logo: a DNA pol de E. coli foi substituda por uma
DNA polimerase de um microrganismo termo-tolerante, o Thermus aquaticus. A
enzima foi batizada de Taq polimerase e permitiu, finalmente, que o PCR se tornasse
uma ferramenta extraordinariamente til na gentica molecular. Que propriedades
tm a Taq polimerase que a fazem to til? Ela termoestvel e sua temperatura
tima de funcionamento 72 oC. Com isto trs problemas ficaram automaticamente
resolvidos:
a) no havia mais necessidade de adicionar enzima no tubo a cada ciclo.
b) a menor temperatura do ciclo era a de hibridizao, que podia ser mantida
acima de 50 oC, evitando hibridizaes esprias.
c) o DNA molde no se renaturava por completo, permitindo uma rpida
desnaturao ao se iniciar um novo ciclo.
Adicionalmente, a manuteno do tubo fechado evitava contaminao do
material do laboratrio e dos estoques de reagentes com os amplicons, nome
genrico dado aos produtos de amplificao da PCR. claro que um amplicon
gerado com um par de primers qualquer serve perfeitamente de molde para uma
nova reao de PCR com os mesmos primers. A contaminao de reagentes e
pipetas com amplicons continua sendo um problema para todos que trabalham com
PCR.
Os eventos ligados s trs temperaturas que mencionamos, 94 oC, 50 oC e 72
o
C, esto esquematizados na figura abaixo. Observe que, a 94 oC, os primers e as
fitas simples de DNA alvo esto misturados, mas no podem parear. Quando a
temperatura reduzida os primers rapidamente alcanam seus stios de
complementariedade, pois so molculas pequenas e, portanto, muito mveis, e
porque esto em concentrao muito mais elevada que o DNA alvo. O DNA molde
tende a renaturar, mas logo a temperatura novamente elevada para 72 oC, que
permite a extenso das novas fitas a partir dos primers, sem desparear os primers
outra vez. Por fim, a temperatura volta a 94 oC, que desnatura todas as fitas,
inclusive as recm sintetizadas, recomeando o processo.
Figura 7.1 Eventos relacionados s trs temperaturas bsicas da PCR:
Desnaturao a 94 oC, pareamento dos primers a 50 oC e extenso de novas fitas a
72 oC, supondo neste caso que a enzima empregada seja a Taq polimerase ou outra
DNA polimerase termo-estvel.

O processo descrito acima gera dois tipos de fitas simples: uma de


comprimento varivel, obtida a partir de um primer que tenha hibridizado com a fita
de DNA original (em geral um longo fragmento de DNA obtido diretamente de um ser
vivo ou de um vrus ou plasmdeo), e outra, de comprimento determinado, que
obtida sempre que um DNA previamente copiado empregado como molde em sua
sntese.
Esta situao est claramente representada na figura abaixo, que mostra os
trs primeiros ciclos de uma PCR. Observe que a fita estendida a partir de um primer
hibridizado com o DNA molde original no tem comprimento fixo, porque o molde
muito longo. Seu comprimento final vai ser determinado pelo instante em que o
primer hibridizar com o stio de complementariedade e pela tempo de extenso total,
temperatura de 72 oC. As duas primeiras fitas estendidas esto indicadas com a
letra e sua direita. J as fitas que so produzidas a partir de primers que
hibridizaram em fitas previamente copiadas tm fatalmente ser comprimento
definido, j que inicia, no primer e terminam ao fim do DNA molde, que exatamente
a e extremidade 5do primer j incorporado na fita molde. As fitas de comprimento
definido aumentam de nmero exponencialmente, formando aos poucos um imenso
nmero d fita duplas de comprimento definido, enquanto as fitas estendidas aumento
linearmente (duas a cada ciclo, por alvo). Uma inspeo da figura a seguir
esclarecer o leitor sobre esta questo.
Figura 7.2 Produo de novas fitas a partir de um DNA alvo pela PCR. Aps
hibridizao dos primers a 56 oC, as fitas novas so sintetizadas a 72 oC, dando
origem a fragmentos estendidos (indicados no primeiro ciclo pela letra e) e
fragmentos amplificados (contornados em amarelo). Os fragmentos amplificados
acumulam exponencialmente na reao.
A visualizao dos produtos de uma reao de PCR costuma ser feita atravs
do uso da eletroforese em gel. Pode-se usar um gel de poliacrilamida, que corre
verticalmente, e corar as bandas de DNA com nitrato de prata ou se pode optar por
correr um gel horizontal de agarose e visualizar as bandas por transiluminao UV,
"corando" previamente o DNA com brometo de etdio (esta substncia se intercala
entre as fitas de DNA e nestas condies absorve o UV e fluoresce com cor
alaranjada). O produto de PCR ser sempre um DNA fita dupla e o que distingue
um do outro, no gel, ser apenas o comprimento relativo. Esta situao est
representada no esquema da figura seguinte.
Figura 7.3 Visualizao de trs reaes de PCR. Em a e b dois produtos so
gerados, a partir de dois pares de primers diferentes. Os dois produtos tm
comprimentos de 400 e 360 pb. A migrao das bandas na eletroforese de cima
para baixo. O fragmento menor migra mais rpido e produz a banda em vermelho. O
maior se desloca mais lentamente no gel e produz a banda em verde. A coluna c
um controle negativo, essencial em qualquer reao de PCR. A coluna d mostra os
marcadores de peso molecular (neste caso, uma escada de DNA - DNA ladder - de
100 pb). Na transiluminao ou na colorao por prata, evidentemente, todas as
bandas tm a mesma cor.
Quando fazemos um PCR, a prtica aconselha a deixar o tubo com os
reagentes por 5 a 10 minutos a 94 oC antes de iniciar o ciclo. Em geral 1 minuto a
cda temperatura suficiente para as etapas do ciclo, que repetido de 35 a 40
vezes. Por fim, ao terminar a ltima extenso muitas vezes os protocolos
experimentais sugerem a manuteno da temperatura de 72 oC por mais 5 a 10
minutos. A opo de esperar 10 minutos antes de comear o ciclo, mantendo o tubo
aquecido, garante que todo o DNA alvo esteja desnaturado antes de se iniciar o
ciclo. Por outro lado, o perodo final a 72 oC garante que todas as fitas tero o
mesmo comprimento pois pode acontecer que, durante o ciclo, algumas fitas
copiadas no tenham atingido o fim do molde. A figura a seguir sintetiza o ciclo da
PCR.
Figura 7.4. Ciclo padro de uma PCR. Antes de iniciar o ciclo o tubo com os
reagentes mantido a 94 oC para garantir a desnaturao inicial de todo DNA alvo.
Da mesma forma, ao terminar o ciclo, a manuteno do tubo a 72 oC garante que
todos as fitas tenham exatamente o mesmo nmero de bases.

Quando PCRs so realizadas, gerando produtos de diferentes comprimentos,


e estes produtos so analisados por transiluminao UV em gel de agarose, o
resultado que se obtm pode ser semelhante ao mostrado abaixo. O menor dos
produtos migra mais rpido e gera a banda mais em baixo no gel. Em geral o gel de
agarose separa bem fragmentos entre 150 pb e 1000 pb. Fora desta faixa pode ser
necessrio usar um gel de poliacrilamida.

Figura 7.5 Imagem obtida de um gel de agarose mostrando bandas


correspondentes a produtos de PCR com diferentes comprimentos (nmero total de
pares de bases) (colunas 2 a 5). Na coluna 1 esto os marcadores de peso
molecular, fragmentos de DNA fita dupla de comprimento conhecido, obtidos por
digesto por enzima de restrio de um DNA conhecido ou sintetizados por
mquinas. A coluna 6 um controle negativo e a pequena banda difusa no fim do gel
apenas a fronteira da eletroforese.
Nos dias de hoje uma PCR feita numa mquina chamada termociclador.
simplesmente um bloco aquecido, controlado por um sistema digital, que eleva e
abaixa a temperatura do material nele inserido (tubos de ensaio pequenos, micro-
placas de 96 poos, etc), de acordo com a programao digitada pelo operador.
Mais de duas dcadas foram necessrias para que estas mquinas pudessem
atingir um grau de preciso e confiabilidade aceitveis, aliado a um preo razovel.
Tambm os reagentes para PCR reduziram de preo consideravelmente na ltima
dcada, tornando o mtodo comercialmente atrativo. Uma reao de PCR pode,
agora, ser feita por US$ 1,00.
Alm do cuidado com a contaminao de amplicons, a PCR exige ateno em
vrios outros detalhes. Um deles diz respeito ao pareamento dos primers: a ltima
base da extremidade 3 do primer tem que estar corretamente pareada com o DNA
alvo, sem o que no ocorrer amplificao. No restante do primer a necessidade de
um pareamento exato no existe e, na extremidade 5podemos at mesmo adicionar
um segmento fita simples que no vai parear com o DNA alvo. Este ressalto
(overhang) no atrapalha em nada a reao e pode adicionar propriedades
importantes ao nosso amplicon final. Vejam um exemplo disso na construo da
biblioteca de cDNA na aula 6!
Outro ponto importante a questo dos erros na sequncia devido
tautomeria de bases. A Taq polimerase no faz reviso (proof reading) in vitro. Se, ao
copiar pela primeira vez o DNA alvo, ela introduzir uma base errada numa das duas
fitas, 25% do produto final estar com sua sequncia diferente nesta base. As
consequncias deste erro podem ser trgicas se estamos procurando fazer um
diagnstico gentico (veja item correspondente). Para evitar isto todos os testes so
feitos em duplicata. A idia que a probabilidade da Taq polimerase "errar" nas duas
reaes sempre na primeira extenso muito reduzida e se um resultado conflitante
surgir, fica claro que num dos tubos a Taq "errou". Se o "erro" for cometido depois
do terceiro ciclo ele j se torna praticamente imperceptvel, pois uma pequena
porcentagem das fitas ter erro e no ser possvel detect-lo facilmente.
Seria ideal que pudssemos disponibilizar em Downloads um relato de Mullis
sobre o PCR a partir da sua apresentao na Academia Nobel. Entretanto, no h
na pgina da Academia Sueca que coordena o Nobel (http://www.nobel.se) as
palestras de Kary Mullis e Michael Smith. Uma apresentao on-line dos trabalhos
dos dois laureados Nobel em Qumica, do ano de 1993 est disponvel: Michael
Smith (pelo aperfeioamento da tecnologia da mutao stio-dirigida) e Kary B.
Mullis (pela inveno da PCR).
http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/illpres/index.html

7.2. RAPD - uma PCR com um primer s...e amplificando qualquer DNA!
Uma limitao sria na PCR convencional a necessidade de se conhecer
previamente a sequncia que se quer amplificar ou, pelo menos, suas extremidades,
para que se possa sintetizar os primers a elas complementares. Se, contudo,
baixarmos a temperatura de hibridizao (pareamento) para menos de 45 oC,
poderemos fazer com que os primers hibridizem com baixa especificidade em muitos
stios do DNA. Em verdade, no precisamos sequer de dois primers, basta um.
Uma PCR feita com um s primer e empregando uma temperatura de
hibridizao (pareamento ou annealing) de 45 oC ou inferior gera, muitas vezes, um
nmero considervel de bandas em muitos diferentes DNAs, atravs do pareamento
com baixa estringncia do primer (em geral ele tambm, pequeno, com 10 a 15
bases, o que facilita os pareamentos). O curioso que, se repetirmos o experimento
nas mesmas condies experimentais, obteremos as mesmas bandas mais uma
vez. As bandas, ento, no so uma amplificao completamente aleatria de
trechos de DNA, mas sim de trechos flanqueados por sequncias que pareiam com
o primer com baixa estringncia, o que muito diferente. Apesar disso, a tcnica de
PCR descrita aqui ganhou o nome de RAPD: de fato rpida, mas o nome -
randomly amplified polymorphic DNA - DNA polimrfico amplificado aleatoriamente -
d margem a certa confuso. Se, por um lado, o pareamento no aleatrio
completamente, por outro a existncia das sequncias com homologia de fato
aleatria, pois no sabemos de antemo se um DNA ter regies com
complementariedade para o primer escolhido.
A figura abaixo mostra esquematicamente o resultado de um RAPD. Observe
que as bandas coloridas podem ser amplificadas de cromossomas diferentes ou do
mesmo cromossoma, mas os primers que as flanqueiam (e a todas as demais
bandas) so sempre os mesmos.
Fig. 7.6a Representao esquemtica do resultado de um RAPD empregando
DNA extrado de indivduos de trs populaes distintas de insetos (a,b,c), (d,e) e
(f,g,h). Os indivduos i e j no tinham origem determinada e poderiam pertencer a
qualquer um dos trs grupos. A semelhana do padro de bandas com o primeiro
grupo sugere a origem. Na parte de baixo da figura uma representao esquemtica
dos stios de pareamento que geram as bandas representadas em vermelho, azul e
amarelo.

Idealmente um RAPD deve gerar um nmero de bandas superior a 4, e estas


bandas devem ser polimrficas (isto , com diferentes migraes) para indivduos
diferentes, ao menos entr grupos distintos. Isto, contudo, nem sempre ocorre. Ainda
assim, o RAPD uma tcnica extremamente poderosa porque os marcadores so
bastante polimrficos e porque se pode testar um grande nmero de primers em
cada situao. Alm disso a tcnica rpida e de baixo custo. A figura a seguir
mostra o resultado de um experimento real do Gentrop/ UFPE, no contexto do
trabalho desenvolvido pelo nosso colega Valdir Balbino. DNA de diferentes
exemplares de Lutzomyia longipalpis, o vetor da leishmaniose visceral nas Amricas,
foi empregado em reaes de RAPD. Os exemplares provieram de uma mesma
localidade. Pode-se observar o acentuado polimorfismo destes marcadores.

Fig7.6b RAPD obtido de exemplares de Lutzomyia longipalpis, inseto vetor


da leishmaniose visceral. Todos os exemplares foram capturados no municpio de
Calumbi, PE, a a amplificao feita com o primer OPP-04 (cortesia Valdir de Queiroz
Balbino). A primeira coluna esquerda a escada de DNA de 100 pb. A terceira
banda mais forte, de cima para baixo, corresponde a 600 pb.
O RAPD permite no apenas discriminar entre populaes diferentes de
organismos, mas inferir sua correlao filogentica. A tcnica tem, contudo, suas
limitaes, sendo a mais grave a dificuldade em reproduzir exatamente os mesmos
resultados de um laboratrio para outro.

7.3. PCR na investigao de Paternidade


Uma das aplicaes mais conhecidas da PCR a investigao de
paternidade. Tcnicas bioqumicas ou moleculares (voltadas ao DNA) j existiam
muito antes da descoberta da PCR, mas foi com o desenvolvimento de sistemas
diagnsticos baseados em PCR que a investigao de paternidade alcanou o
mercado com mais abrangncia, pela reduo dos custos do exame e
democratizao dos reagentes (pode-se realizar o teste sem pagar royalties).
Para se compreender como funciona a tcnica precisamos recordar um pouco
a organizao do genoma humano ( e de muitos outros organismos complexos).
Apenas 3% do nosso genoma composto de genes. H, ao contrrio, uma enorme
parte dele composta de repeties mais ou menos longas, conforme o caso. No
sabemos ainda porque isto ocorre, mas estas repeties podem ser usadas
vantajosamente como marcadores moleculares em muitos casos. Como no so
genes, no esto sob uma presso seletiva to grande e mostram muito mais
variao do que as sequncias de genes propriamente ditas.
Dentre as regies repetidas a investigao de paternidade por PCR costuma
empregar uma classe de repeties conhecidas como STR - small tandem repeats
ou pequenas repeties em tandem. So pequenas regies de DNA com um nmero
varivel de repeties de 3 ou 4 nucleotdeos cada, flanqueadas por regies
conservadas. Um esquema simplificado de um STR est mostrado na figura abaixo.
Como os seres humanos e os demais mamferos so diplides, cada regio de um
cromossomo (exceto nos machos o par XY) est presente no outro. Elas no
precisam, contudo, ser exatamente iguais. Na representao da figura abaixo
chamamos alelos as duas rgies homlogas nos dois cromossomos, por analogia ao
que fazemos com genes, embora os STRs no sejam genes. Observe que as
regies repetidas esto flanqueadas por regies conservadas que se estendem
esquerda (5) e direita (3) das repeties. Para qualquer ser humano estas
regies conservadas so as mesmas, mas cada um de ns pode ter um nmero
diferente de repeties em cada alelo. Quanto maior o conjunto de diferentes
repeties maior ser a informao colhida pela realizao da anlise da regio.
Assim, se o nmero de repeties para o caso estudado (cada caso chamado
sistema e em geral empregam-se 8 a 16 sistemas, cada um lanando mo de um
STR de um cromossoma diferente) varia, digamos, de 3 a 15, haveria 12
possibilidades em cada alelo. Apenas como exerccio, se a probabilidade na
natureza fosse a mesma para qualquer uma das repeties (i.e., a frequncia allica
fosse a mesma), a probabilidade de um indivduo qualquer ter o arranjo de 4 e 9
repeties mostrado abaixo seria 1/12 x 1/12 = 1/ 144.

Fig 7.7 Representao esquemtica de um STR e sua amplificao por PCR,


atravs de primers dirigidos s regies flanqueadoras conservadas. Os dois
produtos gerados tem comprimentos diferentes pois a parte interna da sequncia
difere de um alelo para o outro.
Quando o sistema acima analisado em gel de agarose, duas bandas sero
visveis se o indivduo for heterozigoto para aquele STR. No caso de investigao de
paternidade, o filho de um casal deve herdar um cromossoma do pai e outro da me.
Isto que dizer que, para um sistema qualquer, o filho ter um STR (e uma banda)
materno e outro paterno. A figura abaixo retrata a situao onde um casal avalia a
paternidade de dois meninos. O primeiro (Fo.1) tem claramente uma banda de
origem materna e a segunda banda est na mesma altura da banda paterna.
Portanto, o marido no pode ser excludo de ser o pai. No segundo caso, contudo, a
criana tem uma banda materna mas nenhuma que corresponda a alguma banda
paterna. Esta situao exclui o marido de ser pai do segundo filho (Fo. 2).
Fig. 7.8 Representao esquemtica de um gel representando o resultado de
um sistema de STR para investigao de paternidade. A primeira coluna tem
marcadores allicos padro, equivalentes aos marcadores de peso molecular. As
colunas 2, 3, 4 e 5 mostram o resultado da amplificao de um sistema para o
suposto pai, a me e dois filhos. A banda materna de cada filho est indicada e a
banda paterna de um deles est contornada com uma elipse. O teste exclui o
suposto pai da paternidade do segundo filho.
A incluso obrigatria da me em testes de paternidade evita que uma
eventual troca de recm-nascido na maternidade possa confundir os resultados. O
mesmo processo descrito acima pode ser empregado em qualquer animal que tenha
reproduo sexuada. preciso apenas identificar os STRs candidatos e avaliar
criteriosamente a distribuio dos alelos na populao em estudo. Para os seres
humanos os alelos esto distribudos igualmente em todas as populaes do globo,
mas em bovinos, por exemplo, devido ao cruzamento controlado pelo produtor, os
STRs esto distribudos de forma muito diferente de uma raa para outra. Ainda
assim, a avaliao de pedigree em animais de raa um campo crescente de
aplicao desta tecnologia.
Apenas como lembrete: os STRs no so os nicos alvos possveis para
investigao de paternidade via DNA. Alm disso, a investigao bioqumica e
gentica de paternidade j era um mtodo bem estabelecido muito antes da
inveno do PCR. Sugerimos que o leitor mais interessado procure informaes na
internet para complementar esta questo.

7.4. PCR na investigao de crimes


Outro campo frtil para o uso da PCR a criminalstica. A possibilidade de
amplificar um pequeno trecho de DNA milhes de vezes permite, em muitos casos,
amplificar de uma pequena amostra biolgica (mancha de sangue, bulbo de cabelo,
fragmentos de pele), mesmo em um estado de conservao, suficiente DNA para
uma anlise de STRs como a descrita acima. Um caso clssico a investigao da
procedncia de uma mancha de sangue no casaco da vtima (ou resto de pele sob
as unhas da vtima). Supondo, para fins deste exemplo, que o material no
contivesse restos de clulas da prpria vtima, o procedimento para anlise do caso
estaria em conformidade com o mostrado na figura abaixo.
Observe que, neste caso, cada suspeito aparece, para cada sistema com
duas bandas (aparecer apenas uma se o indivduo for "homozigoto" para aquele
STR). Na amostra as duas bandas do suspeito 2 esto claramente visveis. O
suspeito um tem apenas uma banda, a outra portanto o exclui de ser a fonte da
amostra. O teste exclui dois indivduos, mas no prova, como na paternidade, que o
outro o "dono" da amostra. A incluso do resultado de 5 a 8 sistemas eleva a
probabilbidade de no excluso (como no caso de paternidade) para
99,99999999%. Isto quer dizer que no podemos excluir o suspeito dois com uma
margem de acerto de 99,99999999%.

Fig. 7.9 Representao esquemtica de um gel representando o resultado de


um sistema de STR para investigao criminal. Trs suspeitos esto sendo
investigados e uma amostra de sangue est disponvel. A primeira coluna tem
marcadores allicos padro, equivalentes aos marcadores de peso molecular. As
colunas 2, 3 e 4 mostram o resultado da amplificao de um sistema para os
possveis criminosos. A coluna 5 mostra o resultado do mesmo sistema para a
amostra. O padro de duas bandas idntico ao do suspeito 2 e exclui os demais.
Os casos de estupro, em geral, trazem uma complicao adicional: o material
colhido na vtima (por exemplo, esperma do criminoso) est misturado com o DNA
da vtima (e com muito DNA contaminante no humano, da flora vaginal). Nestes
casos o DNA dos suspeitos sempre misturado com o DNA das vtimas antes da
amplificao dos STRs. O resultado feito por comparao do padro de 4 bandas
das misturas de DNA, uma a uma, de suspeito + vtima, com o padro obtido da
amostra colhida da vtima no corpo de delito. A figura abaixo ilustra este caso.

Fig. 7.10 Representao esquemtica de um gel representando o resultado


de um sistema de STR para investigao criminal. Trs suspeitos esto sendo
investigados num caso de estupor e uma amostra de sangue est disponvel. A
primeira coluna tem marcadores allicos padro, equivalentes aos marcadores de
peso molecular. As colunas 2, 3 e 4 mostram o resultado da amplificao de um
sistema para os possveis criminosos, sempre em mistura com o DNA da vtima.. A
coluna 5 mostra o resultado do mesmo sistema para a amostra colhida no corpo de
delito que, supostamente contendo DNA da vtima e do criminoso. A ltima coluna da
direita a amplificao apenas do DNA da vtima. O padro de quatro bandas da
amostra idntico ao do suspeito 3 e exclui os demais.
As aplicaes forenses (na justia) da PCR so ilimitadas, mas no h
espao aqui para maior detalhamento.

7.5. PCR no diagnstico de enfermidades genticas e na identificao de


portadores sos de alelos mutantes.
Doenas genticas podem, algumas vezes, ser difceis de diagnosticar.
Adicionalmente, no aconselhamento gentico de casais importante determinar
inequivocamente se um indivduo portador de um alelo mutante (portador so). A
identificao de mutaes em genes pode ser feita tambm por PCR, em geral com
a manipulao posterior do produto de amplificao. A seguir exemplificamos duas
destas aplicaes. Numa delas o nucleotdeo mutado faz parte de um stio de
restrio (se voc lembrar que so mais de 600 as enzimas de restrio, cada uma
com seu prprio stio, no ser muito difcil encontrar uma que corte um stio
incluindo o nucleotdeo em estudo). Na outra um artifcio permite detectar qualquer
nucleotdeo mutado, faa ele parte de um stio de restrio ou no.
A figura abaixo ilustra o caso em que o stio de restrio para EcoRI,
GAATTC, inclui um nucleotdeo que est frequentemente mutado no caso da doena
gentica em estudo. No alelo normal o stio de restrio est preservado e no alelo
mutante ele foi perdido, pela troca de um par AT por um GC. Se o contrrio tivesse
acontecido, a tcnica tambm poderia ser aplicada da mesma forma, apenas com a
mudana equivalente na interpretao dos resultados. Quando o trecho de DNA em
estudo amplificado por dois primers anelando nas regies acima e abaixo da
mutao (em princpio todo o restante do gene conservado), os produtos gnicos
tero o mesmo tamanho, sejam provenientes do alelo normal (wt - wild type)ou do
mutante. Ento, ser preciso uma interveno nos produtos para que uma distino
entre eles possa aparecer. Isto feito pela ao da enzima de restrio escolhida
(no caso, a EcoRI). O produto de PCR produzido a partir do alelo normal pode ser
clivado pela enzima de restrio, dando origem a duas bandas. O produto originado
da amplificao do alelo mutante no tem mais o stio para EcoRI e no pode ser
clivado, permanecendo do tamanho original. Assim, num indivduo heterozigoto
(portador so de uma mutao recessiva) o sistema produzir trs bandas: a maior,
correspondente ao produto de PCR do alelo mutante, que no pde ser clivado pela
EcoRI, e duas menores, fruto da clivagem do produto de PCR do alelo normal.
Fig. 7.11 Princpio da identificao de mutaes pontuais atravs da
eliminao/criao de stios de restrio e gerao de fragmentos de digesto com
polimorfismo de comprimento a partir de produtos de PCR (PCR/RFLP). A figura
representa o caso de um indivduo heterozigoto para a marca estudada. A mutao
elimina um stio EcoRI existente no alelo selvagem (wt). A amplificao dos dois
alelos produz fragmentos de mesmo comprimento. Entretanto, a digesto destes
fragmentos com a enzima EcoRI gera um polimorfismo de comprimentos, com o
alelo mutante permanecendo no cortado, enquanto o alelo selvagem clivado em
dois pedaos de tamanho distinto.
Na avaliao do resultado da PCR/RFLP discutida acima, o gel deve mostrar
uma banda nica apenas para o indivduo afetado (homozigoto mutante, com clnica
da doena), j que os produtos de PCR dos dois alelos no podem ser clivados pois
perderam o stio de restrio para EcoRI. J o homozigoto normal ter seus os
produtos de PCR de dois alelos clivados e no gel apenas duas bandas estaro
visveis. Apenas no caso j discutido (portador so, heterozigoto wt/) sero visveis
trs bandas. A figura abaixo representa de forma esquemtica o resultado de uma
anlise PCR/RFLP.

Fig. 7.12 Resultado da investigao da presena de mutao no stio EcoRI


por PCR (PCR/RFLP). A figura representa o caso de um indivduo heterozigoto para
a marca estudada (coluna b), um indivduo afetado e um normal homozigoto. A
mutao elimina um stio EcoRI existente no alelo selvagem (wt). A amplificao dos
dois alelos produz fragmentos de mesmo comprimento. Entretanto, a digesto
destes fragmentos com a enzima gera um polimorfismo de comprimentos, com o
alelo mutante permanecendo no cortado, enquanto o alelo selvagem clivado em
dois pedaos de tamanho distinto.

Em muitos casos de mutaes pontuais a tcnica de PCR/RFLP no pode ser


aplicada, seja porque no h stio de restrio conhecido para o entorno da
mutao, seja porque mltiplas mutaes so possveis no gene de interesse,
tornando a abordagem acima impraticvel. Uma alternativa o mis-match PCR, ou
PCR com pareamento errneo. O princpio desta tcnica, descrito pela primeira vez
por Cotton et al., em 1988, e tambm conhecido com CMC - chemical mismatch
cleavage - baseia-se na clivagem de DNA em locais com pareamento errneo pela
piperidina, e est representada na figura abaixo. Um indivduo heterozigoto tem uma
mutao pontual numa regio qualquer do gene. Podemos amplificar esta regio
com primers dirigidos a suas extremidades, como fizemos na PCR/RFLP. Em
seguida aquecemos o produto do PCR e deixamos esfriar rapidamente para induzir
a formao de heteroduplexes (uma fita simples de um alelo e a complementar do
outro) alm dos homoduplexes (as dus fitas pareadas de volta, de um mesmo alelo).
Nas regio no pareadas ou com pareamento errneo com bases C e T liga-se o
produto hidroxilamina ou o tetrxido de smio, respectivamente. Uma vez ligados,
estes produtos permitem a clivagem do DNA neste local pela piperidina. Assim, 50%
dos produtos de PCR sero cortados por este sistema em todo lugar onde houver
uma mutao. Em geral os fragmentos gerados pro este sistema so pequenos e
devem ser visualizados em gel de poliacrilamida. A figura abaixo mostra como
funciona este sistema.
Fig. 7.13 Resultado da investigao da presena de mutao em uma base
desconhecida pela tcnica de PCR-mismatch. A figura representa o caso de um
indivduo heterozigoto para a marca estudada: o alelo selvagem tem o par TA e o
mutante o par GC. A amplificao por PCR do trecho onde a mutao est usa
primers que esto a alguma distncia direita e esquerda da provvel mutao.
Quando o produto do PCR aquecido os dois tipos de fita (TA e GC) se separam,
dando origem a 4 fitas simples. Quando a mistura rapidamente aquecida, as fitas
simples se reassociam ao acaso de 4 formas distintas, pois a diferena de uma
nica base no impede o pareamento das fitas quase complementares. Aps o uso
de um sistema qumico adequado, os pares de base errneos so clivados e as fitas
com mis-match geram dois fragmentos no gel, ao contrrio das fitas com
pareamento perfeito. O heretozigoto aparece, no gel, com trs bandas (veja figura
abaixo).
O resultado do experimento descrito acima est esquematicamente
representado na figura seguinte. O portador so, heterozigoto, tem uma mutao na
posio descrita na figura anterior. O primeiro afetado tem esta mutao nos dois
alelos. J o segundo afetado tem um alelo com a mutao da figura anterior e outro
alelo com uma mutao mais a direita, como representado na barra vertical ao lado
do gel.

Fig. 7.14 Resultado da investigao da presena de mutao pela tcnica de


mismatch PCR. A figura representa o caso de um indivduo heterozigoto para a
marca estudada (coluna b), dois indivduo afetados e um normal homozigoto. A
amplificao dos dois alelos produz fragmentos de mesmo comprimento. Entretanto,
a clivagem destes fragmentos pela piperidina gera um polimorfismo de
comprimentos, com o alelo mutante permanecendo no cortado, enquanto o alelo
selvagem clivado em dois pedaos de tamanho distinto. No caso do primeiro
afetado (homozigoto) no h mismatch interno porque os dois alelos so idnticos.
Nocaso do afetado heterozigoto cada alelo diferente do outro em dois pontos
distintos, o que gera trs fragmentos pela piperidina, mais o produto no clivado do
homoduplex.
No se deve esquecer, contudo, que a presena de um mismatch no
significa diretamente uma mutao, pois h na natureza diferenas individuais entre
qualquer ser vivo. Estad diferenas, que no significam doena mas diferenas
simples entre indivduos so chamadas SNPs. O teste final para o reconhecimento
de presena de uma mutao , de fato, o sequenciamento direto do produto de
PCR. Se houver diferena entre os alelos, no lugar correspondente eletroferograma
haver duas bases possveis (p.ex. T ou A). (veja aula sobre sequenciamento, a
seguir). A consulta num banco de dados pblico de SNPs ser essencial, tambm
(ver aula de Introduo Bioinformtica, mais adiante).

7.6. PCR em tempo real - o sistema Taqman


Recentemente foi desenvolvido um sistema pela empresa Applied Biosystems
(fundida com a Celera na atual Applera), para detectar o produto do PCR medida
em que esta vai sendo sintetizado na reao. O engenhoso sistema baseado no
uso de uma sonda, dirigida contra uma regio interna da sequncia que se deseja
amplificar, e que tem dois fluorocromos, um em cada extremidade da sonda (um
DNA fita simples). Na extremidade 5 h um fluorocromo que s fluoresce se estiver
distante fisicamente do fluorocromo na posio 3. Este segundo fluorocromo
funciona como capturador de energia (quencher) e no deixa com que a energia
luminosa usada para excitar a sonda chegue em quantidade suficiente para excitar o
primeiro fluorocromo. Estes dois fluorocromos esto representados como R e Q
(para quencher). Quando o primer hibridiza na regio 5, a sonda tambm o faz no
meio da sequncia. medida em que a Taq polimerase avana sintetizando a fita
nova, ela vai degradando a sonda sua frente, liberando o fluorocromo R da sonda
e permitindo que absorva energia e emita luz. A energia para a excitao dos
fluorocromos provem de um feixe de laser que atravessa a amostra e o equipamento
que faz isto chama-se PCR em tempo real (real time PCR) ou Taqman. A figura
abaixo esclarece este princpio.

Fig. 7.15 Princpio de funcionamento do Taqman, ou PCR em tempo real.


Uma sonda fita simples com dois florocromos adicionada reao de PCR. O
fluorocromo Q atua com atenuador da fluorescncia de R, sendo protanto um
quencher. Para isto preciso que esteja prximo a R. A TAq polimerase separa os
dois fluorcromos medida em que degrada a sonda quando sintetiza a fita nova. O
fluorocromo R recm liberado da sonda emite ento luz num comprimento de onda
caracterstico, diferente de Q. A excitao dos fluorocromos feita com laser que
atravesse o tubo de reao.
A medio da radiao feita pelo aparelho, que taa um grfico com a
absoro obtida aps cada ciclo de PCR. O ciclo em que o patamar (limite) de
negatividade ultrapassado est diretamente relacionado quantidade de DNA
molde na mistura. Com isto, a quantificao de DNA molde passou a ser no apenas
possvel, mais rpida. O sistema ainda bastante dispendioso mas tender a se
tornar mais barato medida em que novos sistemas entrarem no mercado e um
maior nmero de mquinas for disponvel.
Fig. 7.16 Grfico obtido com o Taqman. A seta indica o ciclo em que a
reao ultrapassa o limite da reao negativa. Quanto menor a quantidade de DNA
molde no tubo de reao maior o nmero de ciclos necessrios para ultrapassar o
limite da negatividade. A reao de PCR no Taqman emprega em geral apenas duas
temperaturas (94 oC para desnaturao e 60 oC, para hibridizao e extenso) e o
resultado da PCR pode ser dado em menos de 30 minutos.

7. 7 Um pouco de histria
em construo
A reao em cadeia da polimerase foi desenvolvida a partir de uma idia de
Kary B. Mullis.
K. Mullis nasceu em 1944 em Lenoir, Carolina do Norte, EUA. Obteve o grau
de bacharel em qumica em 1966 no Instituto de Tecnologia da gergia e o PhD em
Bioqumica pela Universidade da Califrnia em Berkeley. Passou ento 7 anos como
ps-doutor em Cardiologia Pediatria e Qumica Farmacutica na Escola de Medicina
da Universidade de Kansas (EUA). Em seguida reebu um convite para trabalhar
como tcncio na Cetur Corporation, em Emeryville, em 1978. Foi l que teve a idia
da PCR.
Segundo ele, foi dirigindo seu carro de San Francisco para sua casa em La
Jolla, California, que ele comeou a imaginar uma maneira simples de determinar
uma sequncia de nucleotdeos a partir de um trecho de DNA. Ele ento, como
querem para si outros cientistas, tece uma inspirao sbita: a soluo no era
apenas para seu problema original, mas tinha um alcance muito maior. Ele imaginou
uma forma de fazer a DNA polimerase iniciar e terminar seu trabalho em pontos pr-
determinados e, consequentemente, pelo uso desta proipriedade, descobriu uma
maneira de amplificar exponencialmente uma sequencia de DNA num tubo de
ensaio.
Mullis ento levou a idia para seus colegas da Cetus e juntos eles a
colocaram para trabalhar de verdade. Ela foi apresentada pela primeira vez ao
pblico numa conferncia em 1985 e foi pronta e amplamente aceita pela
comunidade cientfica. A popularidade da tcnica, assim como seu conceito, ganhou
crescente popularidade ao longo dos anos seguintes.
Em 1989 a revista Science escolheu a molcula usada na PCR, a Taq
polimerase, como a primeira "Molcula do Ano".
Em 1991 a PCR se tornou extremamente comum em laboratrios pelo mundo
afora e referncias ao uso da tcnica j somavam milhares nas revistas cientficas.
Um ano depois a Cetus, depois de uma reorganizao corporativa, vendeu a patente
da PCR para a Hoffman - La Roche por US$ 300.000.000,00.
Devido ao alcance e popularidade da PCR Kary Mullis foi apontado e recebeu
o prmio Nobel de Qumica em 1995. Esta indicao foi duramente contestada por
muitos que acreditavam que a PCR foi apenas um desenvolvimento de tcnica e que
sua concepo no era suficiente para dar a Mullis o status de nobelista. Mullis
argumentou a seu favor que a unio das tcnicas pr-existentes no formato por ele
criado fazia toda a diferena.
8. Sequenciamento de DNA
At meados da dcada de 70 no era nada simples obter uma sequncia de
DNA, fosse ele fita simples ou dupla. De fato, trabalhar com DNA era muito mais
complicado do que com protenas e o conhecimento sobre os cidos nuclicos
avanava de forma lenta. No incio da dcada de 80 uma tcnica relativamente
rpida de sequenciamento de DNA foi desenvolvida, que empregava a quebra de
uma cadeia de DNA com diferentes produtos qumicos e a visualizao dos
fragmentos gerados por eletroforese. Havia necessidade de fazer-se a marcao
radiativa das molculas porque a quantidade de material produzida era muito
pequena e no podia ser detectada de outra forma. Mesmo com todas estas
dificuldades houve ento um rpido progresso no conhecimento de sequncias de
DNA. Poucos anos depois um novo avano tecnolgico foi alcanado pela
introduo da tcnica de interrupo da sequncia pela incorporao aleatria de
um nucleotdeo modificado (sem a hidroxila na posio 3), que ficou conhecida
como tcnica de didesoxi ou dideoxi. Esta tcnica suplantou imediatamente a
anterior e permitiu o desenvolvimento de sequenciadores automticos de DNA,
sobre os quais versa este captulo. Ainda se faz eventualmente o sequenciamento
manual, mas muito mais trabalhoso, caro e arriscado, pois emprega substncias
radiativas. De uma forma geral quando desejamos saber uma sequncia de bases
de um fragmento qualquer de DNA, purificamos o fragmento e enviamos para
sequenciamento numa empresa prestadora deste servio.
Mas, afinal, como produzir um DNA para sequenciamento e do que se trata a
tcnica de dideoxi?
A primeira parte da pergunta crucial: de fato, se queremos sequenciar um
trecho de DNA, temos que ter uma grande quantidade dele no nosso tubo de ensaio.
Duas formas corriqueiras de se obter grandes quantidades de uma determinada
sequncia de DNA so a clonagem em plasmdeo e a PCR. Se o DNA que
queremos sequenciar for o inserto de um plasmdeo, tudo o que precisamos
crescer 200 microlitros da bactria com o plasmdeo e, empregando as tcnicas j
usuais de extrao de DNA, obter o plasmdeo purificado, que ser empregado na
reao de sequenciamento. Se ainda no tivermos o material clonado, podemos
empregar a PCR e amplificar o trecho a ser sequenciado, purificando a banda do gel
e usando o material assim obtido para iniciar a reao do sequenciamento. Neste
caso, precisamos saber apenas as sequncias das extremidades do trecho a ser
sequenciado.
A segunda parte da pergunta exige uma explicao mais detalhada.
Inicialmente, temos que recordar o que seja um didesoxinucleotdeo
trifosfasto, ou ddNTP. O precursor normal da sntese de DNA o dNTP, ou
desoxiribonucleotdeo trifosfato, que apresenta uma hidroxila na posio 3. a
partir desta hidroxila que a fita nascente estendida. Um ddNTP, entretanto, no tem
esta hidroxila. Logo, se for incorporado a uma fita de DNA, interrompe a
incorporao de outros nucleotdeos a partir dele. Se o ddNTP for marcado
associado radiao ou fluorescncia, a fita interrompida ficar radiativa ou
fluorescente e poder ser detectada mais facilmente. Para fins desta aula vamos
admitir que cada didesoxibase est marcada com uma florescncia diferente.
Portanto, as fitas terminadas em A, T, G ou C vo emitir cores diferentes quando
excitadas com luz de um determinado comprimento (em geral, de um feixe laser).
Em seguida temos que entender como a reao de sequenciamento pode
comear sempre exatamente da mesma base, a partir do DNA molde que
adicionamos reao. Para tal, basta recordarmos que uma nova fita simples s
sintetizada se tivermos um DNA molde, uma DNA polimerase, dNTPs (e neste caso,
um pouco de ddNTPs fluorescentes) e, finalmente, um primer! neste primer que
reside o segredo do incio exato da reao de extenso: o primer sempre pareia
exatamente na posio esperada, jamais uma base antes ou uma depois, por
exemplo. Por isso, todas as fitas estendidas a partir deste primer iniciam
rigorosamente na mesma base, a partir do primer e copiando a fita molde.
Por fim, basta recordarmos que as fitas assim produzidas devem ser muito
numerosas para poderem ser detectadas. Por isso, temos que comear a reao de
sequenciamento com muito mais DNA do que uma reao de PCR. As fitas
produzidas podem ser separadas pelo tamanho em eletroforese de poliacrilamida, e
a base final da sequncia da fita identificada pela fluorescncia emitida quando a
banda eletrofortica correspondente fita cruza o ponto do gel que iluminado por
um feixe de laser. Neste sistema de deteco a eletroforese no pra, as bandas
passando no fim (em baixo) do gel que so detectadas em movimento. Com isto,
podemos identificar com preciso 600 a 700 bases a partir do primer.
Na figura abaixo exemplificamos como surgem as fitas simples estendidas a
partir de um primer (seta preta pequena) que pareia com uma sequncia especfica
(em vermelho) do plasmdeo (trechos em amarelo), no qual foi clonado um inserto
(azul) entre os stios de restrio EcoRI e XhoI. Observe que o inserto pode ter um
comprimento muito varivel, tipicamente entre 500 e 3000 pb. No exemplo estamos
admitindo que, numa determinada posio na sequncia do inserto, uma parte dele
tem uma base A e outra uma base G. o que ocorre se clonarmos um trecho de
DNA de um alelo para o qual o doador heterozigoto. Observe tambm que, do
lado direito do inserto, h uma sequncia (em verde) na qual pode parear um outro
primer, que ser empregado no sequenciamento quando quisermos vir da direita
para a esquerda sobre o inserto. Jamais, contudo, os dois primers so empregados
simultaneamente, e por isto a reao de sequenciamento NO UMA PCR!!! Por
isso, no temos tanta preocupao com contaminao como nas reao de PCR:
podemos fazer mltiplas reaes de sequenciamento, lado a lado, numa placa de 96
micropoos e mesmo reutilizar boa parte do material plstico empregado no preparo
do DNA ou na reao de sequenciamento, em si, bastando para isto lavar bem o
material.
Ainda na figura, podemos ver que fragmentos de diferentes tamanhos so
gerados, porm nunca (exceto no caso onde houver moldes de DNA com
polimorfismo de base, como no caso A/G mostrado) dois fragmentos de igual
tamanho terminaro em bases diferentes. Na parte de baixo da figura todos os
fragmentos representados na parte de cima esto organizados por ordem de
tamanho. Observe que:
a) podem existir muitos fragmentos (fitas simples estendidas a partir do
primer) do mesmo tamanho, mas fatalmente terminaro na mesma base (exceto no
caso do polimorfismo do DNA molde);
b) podem existir fitas terminado na mesma base (afinal, s temos 4 opes,
A,T,G ou C!), com comprimentos diferentes. No h qualquer restrio para isto.
c) h espaos mostrados na sequncia, onde no havia nenhum fragmento
gerado do tamanho esperado. Isto s acontece quando a reao gera poucos
fragmentos, mas uma reao deste tipo gera centenas de milhares de fragmentos de
cada tamanho e muito pouco provvel que existam sequncias no representadas
de um comprimento qualquer.
d) apenas onde h polimorfismo de base do DNA molde h fragmentos do
mesmo tamanho terminando em bases diferentes ( o caso A/G).
Examine, por favor, atentamente a figura 8.1 abaixo antes de continuar a
leitura desta aula.
Figura 8.1: Fragmentos de diferentes comprimentos gerados a partir do
primer, interrompidos quando um didesoxinucleotdeo incorporado na fita. Os
didesoxinucleotdeos so marcados com substncias fluorescentes diferentes,
conforme a base (A,T,G ou C).

Quando os fragmentos gerados numa reao de sequenciamento so


separados por eletroforese, os fragmentos menores vo frente, seguidos dos
demais, sendo a distncia entre as bandas aproximadamente igual, pois representa
sempre a diferena de uma base a mais ou a menos. A figura 8.2 mostra
esquematicamente como esta separao acontece e como a fluorescncia nas
bandas identificada, medida em que elas atravessam um trecho do gel que
iluminado por um feixe laser (representado pela barra verde na parte de baixo do
gel). Observe que a distncia entre as bandas regular. Um gel pode permitir o
sequenciamento de 600-700 bases para cada reao, e podemos correr at 96
reaes por gel. H no mercado tambm sequenciadores de DNA de ltima gerao
nos quais o gel foi substitudo por um feixe de capilares, que so automaticamente
preenchidos por um polmero, ao invs de gel. Cada reao de sequenciamento
separada no seu capilar e a fluorescncia detectada individualmente. o que evita
uma eventual confuso entre sequncias causada pelos desalinhamentos das
corridas eletroforticas, comum nos gis. H mquinas com feixes de 1 a 384
capilares. As maiores so capazes de produzir mais de 2 mil sequncias em 24
horas.
Examine, por favor, atentamente a figura 8.2 abaixo antes de continuar a
leitura desta aula.

Figura 8.2: Os fragmentos de diferentes comprimentos migram no gel, os


menores na frente. So iluminados por um feixe de laser e fluorescem quando
atravessam a janela do feixe. Um gel pode resolver 96 sequncias simultaneamente.
Os gis tm sido substitudos por capilares preenchidos de polmero nas mquinas
mais modernas. As bandas pretas indicam ausncia de material e so apenas um
recurso grfico usado aqui para indicar o espao aumentado entre bandas que
aconteceria neste caso. Entretanto, isto no ocorre na reao de sequenciamento
finalizada, porque o nmero de fragmentos gerados muito grande e a
probabilidade de uma classe de tamanho no ser representada na reao
praticamente nula.

A fluorescncia emitida pela passagem de uma banda pela janela de medio


registrada por um sistema de microcmaras sensoras, que por sua vez transforma
o sinal num grfico, conhecido como eletroferograma. Os picos representam as
bandas, e quanto mais altos e agudos mais qualidade tm, isto , maior ser a
probabilidade de que a base registrada seja correta. O valor de qualidade medido
por um programa chamado Phred, que leva em conta vrios parmetros
(espaamento entre bandas, largura e altura do pico, intensidade absoluta do sinal,
rudo de fundo, etc). Geralmente emprega-se como padro aceitvel de qualidade o
valor Phred 20, que corresponde a aprox. 99% de certeza da base indicada. A figura
8.3 abaixo mostra um eletroferograma obtido no sequenciamento de um inserto de
cDNA do parasita Leishmania chagasi. Observe que, neste trecho, a qualidade do
sequenciamento muito alta, com espaamento regular dos picos (que indica
espaamento regular das bandas) e picos agudos. No h nenhum polimorfismo de
bases, nem poderia haver, pois esta sequncia foi obtida a partir de um clone de
cDNA.
Figura 8.3: Eletroferograma parcial de uma sequncia de DNA obtida no
sequenciador automtico ABI3100 Prism, da Applied Biosystems, na Unidade de
Genmica do Laboratrio de Gentica Molecular do Departamento de Gentica da
UFPE. Observe que os picos so agudos e regularmente separados, o que indica
alta qualidade do sequenciamento neste trecho
Esperamos que este texto tenha esclarecido a maior parte das questes
bsicas pertinentes ao sequenciamento de DNA. Entretanto, julgamos que uma
visita nossa sub-pgina de animaes essencial, pois a animao sobre
sequenciamento muito ilustrativa do que foi dito aqui.
Em edies futuras desta aula outras questes sero abordadas e discutidas:
a) a qualidade da sequncia e o aspecto do eletroferograma
b) a identificao de polimorfismos
c) a contaminao de primers e de clones
d) as limitaes do sequenciamento automtico de DNA

e) os avanos na tcnica a partir de 2000.


1. Extrao de DNA
Durante toda a primeira parte do sculo XX as protenas tiveram muito mais
ateno da cincia do que os cidos nuclicos. Como censequncia, os mtodos de
extrao, purificao e anlise de protenas avanaram muito mais do que os
equivalentes para DNA. A partir da dcada de 60 esta situao foi lentamente se
modificando at que, ao final do sculo, ficou muito mais fcil extrair, purificar e
analisar DNA do que protena. Parecia um caminho sem volta, mas a protemica aos
poucos vai igualando este placar outra vez, Esta, entretanto, outra histria, que
vamos contar em outras aulas.
A extrao clssica de DNA envolve os passos descritos no livro: lise,
desproteinizao e concentrao do DNA. Devemos manter em mente que o DNA
extremamente solvel em gua, muito mais do que a maioria das protenas e
mesmo de muitos acares. Mas mesmo antes que se possa proceder primeira
destas etapas, preciso considerar o material que nos vai doar as clulas ou, ao
menos, o DNA (j fora delas),
1.1 Tipos de material fonte e manipulaes prvias extrao
H uma ampla gama de material do qual poderemos ter interesse em extrair o
DNA, como mostrado na tabela abaixo. Uns so duros, outros moles ou lquidos, uns
abundantes, outros escassos, uns fceis de extrair o DNA e outros positivamente
dificlimos.
Tabela I. Alguns exemplos de fontes de DNA. Podem ser duras ou friveis e
mesmo lquidas.

material mole ou
material duro
fluido
osso ascite
tumor slido aspirado de medula
tecidos moles em
coral
geral
esponjas marinhas sangue
gua de
coprlitos reservatrios naturais ou
artificiais

O material duro geralmente fragmentado antes da extrao por macerao,


o que pode ser feito de muitas formas distintas: com um pistilo e uma cuba, com um
ralador, com alicate, etc. Em geral o material a ser macerado e os instrumentos so
todos congelados ou pelo menos mantidos em gelo durante o trabalho, embora o
DNA seja muito resistente s temperaturas usuais, O problema que a macerao
gera um calor local surpreendente, que no se percebe facilmente.

Tecidos moles e tumores devem ser congelados em nitrognio lquido ou gelo


seco e macerados como o material duro. Sangue, ascite, gua e qualquer outro
material que contenha o DNA em suspenso celular devem ser centrifugados para a
coleta das clulas e fragmentos de tecidos. O precipitado (ou pellet) deve ser
ressuspenso num tampo adequado e passado por um homogeneizador Potter, que
consiste de um tubo onde passa muito justo um mbolo de vidro sinterizado ligado a
uma haste. O material lquido obrigado, pelo movimento do mbolo, a subir e
descer pelo tudo, entre a parede do tubo e a do mbolo. Nesta passagem as clulas
so rompidas. Dependendo do ajuste entre o mbolo e o tubo, at mesmo as
organelas sero rompidas. A figurinha ao lado mostra trs tubos Potter e seus
mbolos. Em geral o material que vai ser homogeneizado num Potter mantido
gelado e o prprio Potter fica imerso num banho de gelo. Este procedimento
especialmente importante na extrao do RNA. A figura abaixo mostra um Potter
num banho de gelo.

Figura 1. Homogeneizador Potter num banho de gelo. A suspenso de clulas


obrigada a subir e descer pelo mbolo quando este gentilmente movimentado ao
longo do tubo.

Simplificaes so possveis na etapa de preparao prvia do material,


como passar a suspenso de clulas repetidas vezes por uma agulha fina,
empurrando a suspenso com uma seringa. Ainda mais simples, pode-se ferver o
material e usar o sobrenadante como fonte de DNA.

1.2 Lise qumica

Esta etapa est bem detalhada no texto do livro. Lembramos apenas alguns
pontos suplementares:
algumas clulas tm uma parede celular rgida (como os vegetais) ou esto
de alguma forma protegidas pro material duro (como no caso das esponjas). Em
alguns casos podemos empregar uma enzima especfica para estas paredes rgidas
(lisozimas, quitinases, proteinases, etc.), em outros casos temos que empregar o
Potter ou mesmo a prensa francesa. Outra forma muito eficiente de lise e a quebra
por ultra-som.

Se a lise feita num tubo de ensaio (um micro-tubo tipo eppendorf, por
exemplo), o DNA liberado da clula vai para o sobrenadante. A manipulao d
soluo com as ponteiras usuais das micropipetas tendem a quebrar o DMA em
grandes fragmentos, de 100 mil a 500 mil bases. Estes grandes fragmentos so
teis para quase todas as tcnicas de anlise de DMA. Apenas para a anlise de
tamanhos de cromossomos temos que ser muito cuidadosos na extrao, mas isto
no ser tema de nossa disciplina.

O aquecimento do material a ser lisado ajuda na lise, mas se for acima de 65


o
C vai levar desnaturao do DNA cromossmicos (que est em grandes
fragmentos, como dito acima). O DNA desnaturado pouco solvel e tender a
precipitar na etapa de desproteinizao, o que vai forar a perda de material para
anlise. O aquecimento, contudo, usado quando queremos extrair DNA plasmidial
de uma clula, e nos ver livres do DNA cromossmico.

1.3 Desproteinizao

Classicamente a retirada de protenas feita com o uso do fenol. Este


solvente orgnico tem um coeficiente de partio muito elevado para protenas, isto
, quando misturado numa soluo aquosa contendo protenas, o feno sequestra as
protenas em sua fase e, medida em que vai se separando da gua, leva as
protenas consigo. A gua fica no sobrenadante e as protenas ficam retidas no
fenol, no fundo do tubo. Mas normalmente a etapa de extrao com fenol
precedida de uma outra, mais simples, em que as protenas menos solveis so
retiradas pela adio de sal suspenso. Este o clssico "salting out" da
bioqumica, que tambm o princpio da conservao de carnes por salmouras, etc.
Aps a adio do sal (em geral acetato de amnia) a suspenso centrifugada e o
pellet descartado. No sobrenadante h, agora menos protena e j se pode extrair o
que ficou com fenol.

A desproteinizao est bem descrita no livro e no vamos dar maior nfase a


ela aqui.

1.4 Concentrao do DNA

Uma vez que nos vimos livres das protenas (e com elas outras molculas,
que vo embora no salting out), sobra no sobrenadante o DNA. Para concentrar o
DNA geralmente precipitamos o dito com lcool. Para isso adicionamos lcool 100%
gelado ao mesmo volume de soluo de DNA e centrifugamos o tubo a 13.000 por 5
minutos. Aps o descarte do lcool pode-se lavar gentilmente o pellet com lcool a
70% e deixar secar o material. Uma vez seco, o DNA pode ser re-dissolvido num
volume adequado de gua ou de tampo (em geral Tris-EDTA). H outros detalhes e
comentrios importantes no texto do livro.

1.5 Alternativas ao fenol

Hoje em dia h um grande nmero de kits comerciais que empregam resinas


e outros produtos para a purificao rpida de DNA. Em nossas mos o DNAzol
um dos mais eficientes: a quantidade de DNA obtida por mg de tecido no muito
grande, mas a pureza satisfatria para a maioria das aplicaes. H tambm uma
variante do DNAzol para extrao de DNA do sangue, o BloodDNAzol, e outra para
extrao de RNA (o RNAzol). Estes kits so baseados nas propriedades caotrpicas
da tioguanidina na concentrao de 6M ou maior: neste produto os componentes
celulares se desagregam, as enzimas pram de atuar e o material se torna estvel
por longo tempo temperatura ambiente. a forma ideal de transportar amostras
para extrao e anlise posterior

2. Observaes sobre o PCR


A tcnica de PCR j foi discutida nas aulas anteriores (veja Aulas de Gentica
Molecular no site www.biolmol.cjb.net) e vamos aqui apenas enfatizar certos pontos.
2.1 Tubos, placas e evaporao
Os termocicladores de hoje, tambm chamados mquinas de PCR ou
simplemente PCRs, trabalham com tubos diminutos de plstico (para volumes de, no
mximo, 200l, mas usualmente levam reaes com 10 a 50 l) ou com
microplacas com 96 poos, cada um para at 200 l. claro que uma reao feita
com 10 ou 50 microlitros, se aquecida repetidamente como pede uma reao de
PCR, vai evaporar completamente. Para evitar isso pode-se colocar uma pequena
gota de leo mineral sobre a reao, em cada tubo, ou selar a placa com um filme
plstico muito aderente. Ultimamente a indstria vende tubos com uma tampa
especial que evita a evaporao e tambm um selo plstico formado por 96
pequenas tampas que pode ser colocado sobre a placa e mantido apertado contra
ela pela tampa do termociclador, o que tambm evita a evaporao.

2.2 Falta de energia

Um problema crtico no PCR que ele no deve ser interrompido e retomado


algum tempo depois. Assim, falta de energia sempre uma dor de cabea para o
experimentador. idealmente, a mquina de PCR deve estar conectada a um no-
break, como um computador.

2.3 Rampas de aquecimento e resfriamento

Quanto mais rpida seja a mudana de temperatura entre os pontos


escolhidos para uma reao de PCR (usualmente 96, 56 e 72 oC). melhor ser o
resultado do PCR: menos bandas esprias, mais nitidez da banda esperada, etc.
Entretanto, aquecer rapidamente no pe to simples, e esfriar rapidamente ainda
mais complicado. As rampas de esfriamento e aquecimento mais ngremes so as
melhores. O sistema Peltier, pelo qual a passagem de corrente eltrica num bi-
mental aquece ou esfria uma placa, muito simples e confivel, mas no d rampas
muito ngremes. Os melhores termocicladores no usam este princpio, mas so
muito caros. Ento, o comprador deve estar atento ao resultado que quer atingir e
aos custos que deve tolerar.
A figura ao lado mostra
duas rampas de inclinao
diferente para um termociclador
hipottico.

Outro ponto importante: os


termocicladores no servem s
para fazer PCR, mas podem ser
usados para um grande nmero
de outras aplicaes no
laboratrio.

2.4 Hot start

Quando se comea um PCR, a enzima Taq polimerase vai atuar ainda


durante a rampa de aquecimento, antes que os DNAs estejam devidamente
desnaturados a 96 oC. Isto pode dar umas bandas extras no PCR e borres feios no
gel. Para evitar isso pode-se pipetar a Taq no tubo quando a mistura j alcanou a
temperatura de desnaturao. H hoje em dia resinas especiais que se
desmancham quando a temperatura adequada e liberam a Taq. Comear a ao
da Taq quando a temperatura alta conhecido como hot start.

2.5 PCR touch down

No livro h um item sobre o uso desta tcnica para determinar a melhor


temperatura de pareamento (anelamento ou annealing). Mas hoje em dia muito
mais corriqueiro o uso de termocicladores com gradiente de temperatura. Pode-se
regular a placa aquecedora para ter sua esquerda uma temperatura e direita
outra, vrios graus maior ou menor. O resultado que todas as temperaturas
intermedirias estaro distribudas nos poos ao longo da placa. Esta forma muito
mais eficiente para determinar a melhor temperatura de pareamento, ou de
extenso.

2.6 PCR em tempo real


Muitas vezes as pessoas confundem a nomenclatura RT-PCR, porque de
fato ela tem dois significados. Um que est no livro, reverse-transcriptase-PCR, um
PCR que comea pela ao da transcriptase reversa, para transformar um RNA num
cDNA. Depois a reao continua como um PCR convencional. O outro significado
real time PCR, um sistema moderno de PCR, quantitativo, em que a reao no
visualisada num gel e sim medida pela fluorescncia emitida no sistema. esta
tcnica est breveente descrita e comentada no final da aula de PCR na pgina de
aulas de gentica molecular deste site.

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Aula 2: Desenho de primers

Alm da apresentao do Prof. Kido, h tambm aqui d o site do programa


que foi empregado na aula parta desenho de primers (software on-lineprimer3).
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

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Aula 3: Outras tcnicas moleculares e aplicaes no mencionadas na aula 1


O PCR foi inventado no meio da dcada e 80 e s veio encontrar uma ampla
aplicao, inclusive comercial, na dcada de 90. Antes disso, outras tcnicas
moleculares dominavam o mercado. Como eram todas menos sensveis que o PCR,
suas aplicaes eram, de certa forma, mais limitadas. Duas delas se destacavam e
se complementavam: o uso de sondas de DNA e o uso de enzimas de restrio. A
unio das duas tcnicas ficou conhecida como RFLP (restriction fragment lenght
polymorphism, polimorfismo dos comprimentos de fragmentos de restrio). As
sondas e o RFLP continuam tendo grande aplicao, inclusive no diagnstico
laboratorial, apesar do PCR. A seguir comentaremos brevemente o desenvolvimento
de sondas e suas aplicaes e o RFLP.
1. Sondas de DNA e hibridizao com DNA ou RNA
Uma sonda de DNA um DNA fita simples, de tamanho pequeno (em geral
ente 50 e 300 bases), que est marcado com uma susbtncia radiativa ou conjugado
a um produto qualquer que permita sua visualizao nuam etapa final do ensaio de
hibridizao. Assim, o objetivo de uma sonda encontrar (hibridizar com) um trecho
de um DNA para o qual ela seja pelo menos parcialmente complementar, e permitir a
posterior localizao de sua presena num ensaio qualquer: num Southern blot
(como uma banda), num dot assay (como um ponto), num ELISA (como susbtrato
colorido), etc. Veremos inicialmente, de forma muito breve, como possvel produzir
uma sonda com uma sequncia conhecida, e de tamanho determinado.
H vrias formas de se produzir uma sonda e as que vamos descrever so
apenas duas delas, talvez as mais frequentemente empregadas. Para uma reviso
mais completa deste assunto, favor consultar o site
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.section.458 , que mostra o
captulo de um dos nossos livros da bibliografia (neste caso, em ingls), o Gentica
Molecular Humana, de Strachan e Reed.
1.1 Preparao de sondas de DNA
As sondas de DNA vo servir, em geral, para vrios tipos de testes de
hibridizao. Estes testes tm, em comum, o objetivo de identificar visualmente uma
sequencia de cido nucleico (em geral DNA, mas tambm am alguns casos RNA)
que est em mistura com muitas outras. As sondas de DNA podem ser feitas como
fitas duplas ou fitas simples, mas para funcionarem nos ensaios de hibridizao, elas
devem ser desnaturadas, numa primeira etapa, se forem feitas como fitas duplas.
As sondas convencionais so feitas de DNA clonado num plasmdeo. A partir
deste plasmdeo possvel produzir fitas simples de DNA copiadas do trecho
clonado, como primeiro passo para a produo de sondas fitas simples. Pode-se
tambm amplificar o DNA clonado por PCR (empregando primers que hibridizam
com as regies flanqueadores do inserto no plasmdeo). Estas duas formas bsicas
de iniciar a produo de sondas fita simples ou fita dupla esto mostradas na figura
1 abaixo: Um pedao de DNA fita dupla (em segmento de um gene, uma regio com
repeties, uma regio telomrica, etc.) pode ser clonado num plasmdeo e a partir
desta construo pode-se produzir uma fita simples (por extenso de um primer,
esquerda, como na parte A da figura 1) ou por PCR, direita. Pode-se, neste
processo, incorporar, por exemplo, um precursor radioativo de uma das bases
nitrogenadas, e a fita simples ou dupla j ser produzida marcada e ser, portanto,
uma sonda. Por outro lado, pode-se marcar o DNA fita simples ou fita dupla recm
produzido pela conjugao com uma enzima ou biotina (parte B da figura 1 ) ou se
pode ainda empregar um primer previamente "marcado" com material radioativo ou
fluorescente (parte C da figura 1 ). H vrias outras possibilidades de se marcar uma
sonda, mas remetemos o leitor ao link j comentado anteriormente ou a manuais
especficos de laboratrio. Quanto ao tamanho da sonda, ela pode ter umas poucas
centenas de bases, mas pode, em alguns casos, ser muito longa, com mais de
10.000 bases. Tudo depender do que queremos identificar na nossa posterior
hibridao.

Figura 1: A - Um segmento de DNA (em vermelho) pode ser clonado num


plasmdeo (em amarelo) e a partir de posies especficas no plasmdeo pode-se
estender uma fita simples (com o auxlio de uma DNA polimerase) ou produzir uma
fita dupla (por PCR). Se precursores de bases (dNTPs) marados forem empregados
neste processo, a fita simples ou dupla j sai marcada, sendo, poranto, uma sonda.
B - uma fita previamente produzida pode ser "marcada" pela conjugao de algumas
bases com uma enzima ou outra molcula apropriada (biotina, por exemplo). Estas
molculas auxiliaro na visualizao posterior da sonda, no ensaio de hibridizao.
C - A marcao da sonda pode ser feita pelo uso de um primer previamente
marcado.
Uma alternativa para a produo de sondas de pequeno tamanho a sntese
de oligonucleotdeos, isto , pequenas sequncias de DNA fita simples, neste caso,
marcadas com radiatividade ou outro tipo qualquer de marcao. Os
oligonucleotdeos tm em geral menos de 50 bases e a hibridizao deve ser feita
em condies especiais para que estas sondas possam ficar aderidas ao DNA alvo
ao fim do ensaio de hibridizao.
Os marcadores de sondas podem ser, como dito anteriormente, de origem
radioativa ou no. Tradicionalmente, a marcao radioativa feita pela incorporao
de nucleotdeos contendo radioistopos ( 32P, 33P, 35S ou 3H), que pode ser detectada
de vrias formas, sendo a mais usual a auto-radiografia (exposio do material - gel,
membrana de blot, etc - a um filme de raio X).
As marcaes no radioativas, pela conjugao de uma molcula especfica a
vrias bases da cadeia de DNA, so em geral de trs tipos:
incorporao de um fluorforo (ou fluorocromo), isto , uma molcula
que emitir florescncia quando devidamente excitada (Figura 2, abaixo)
incorporao de uma enzima, que dever quebrar um substrato
cromognico adicionado posteriormente, que ir gerar uma cor sobre o ponto em
que ocorreu a reao ou dentro do recipiente onde a sonda est presente.
incorporao de uma molcula reprter, que ser ligada numa segunda
etapa a uma segunda molcula com a misso de identificar a primeira, por reao
cromognica ou por outro sistema qualquer. Atualmente a molcula reprter biotina
tem sido bastante utilizada: ela fortemente reconhecida pela avidina (ou
estreptoavidina), sendo a segunda molcula conjugada com uma molcula
adequada para a gerao do sinal (cor, fluorescncia, etc) no ensaio. Outra molcula
bastante empregada a digoxigenina (um esteride de planta), que atua como
reprter. Um anticorpo especfico anti-digoxigenina, conjugado com uma enzima (a
peroxidase, por exemplo) empregado para revelar a posio da digoxigenina no
ensaio.
Figura 2: A - A conjugao de um fluorocromo (fluorescena, que brilha verde
no microscpio) ou rodamina (que tem uma cor avermelhada) feita atravs de um
brao espaador ao nucleotdeo de uma cadeia ou diretamente oa precursor de
bases trifosfatado (como na figura). B - A amostra cujo DNA foi reconhecido com a
sonda marcada com fluorescena observada ao microscpio de fluorescncia por
epi-iluminao. O comprimento de luz adequado para a excitao do fluorocromo
selecionado pelo filtro de excitao, a luz reflete no espelho dicrico e desce pela
objetiva at a amostra. O flouorocromo excitado emite a radiao verde
caracterstica que direcionada pela objetiva de volta ao espelho, mas desta vez a
luz o atravessa e vai, atravs da ocular, ao olho do observador. Fonte da imagem:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.figgrp.476
1.2 Princpios de hibridizao de cidos nuclicos
A hibridizao de cidos nuclicos pressupe a mistura de fitas simples de
DNA de fontes distintas. A sonda usualmente composta de um conjunto de
molculas idnticas de DNA, marcadas como discutido acima. O DNA alvo pode ser
composto de fragmentos de genoma, DNA previamente submetido a digesto por
enzimas de restrio, RNA mensageiro e ainda muitas outras fontes de cidos
nuclicos. A fonte de DNA alvo tem, em geral, uma natureza heterognea, isto ,
muitas diferentes sequncias de bases estaro presentes nos fragmentos de DNA
oferecidos anlise.
Se o DNA alvo ou a sonda (ou ambos) so DNA fita dupla, preciso separar
as duas fitas antes de iniciar a hibridizao, o que geralmente obtido por
aquecimento ou por tratamento com tampo muito alcalino. Quando se restauram as
condies adequadas para o pareamento de bases, as fitas voltam a parear. A
sonda pode ento parear com sua regio de complementariedade no DNA alvo.
claro que, se a sonda era originalmente fita dupla, ela tender a formar de novo a fita
dupla, assim como o DNA alvo voltar a formar uma dupla fita, se originalmente ele
estava nesta forma no ensaio. Mas o que interessa para o ensaio a hibridizao da
sonda com o DNA alvo. Em geral o DNA alvo est aderido a um suporte, enquanto a
sonda est na fase lquida, o que permite, por simples lavagem, retirar toda a sonda
que no pareou com o DNA alvo ao final do ensaio, e revelar o resultado.
A temperatura de desnaturao dos cidos nuclicos depende da composio
de bases do DNA: quanto maior o contedo CG maior a temperatura necessria
para a desnaturao. A temperatura em que 50% das molculas de DNA se
desnaturam (chamada Tm), para o genoma humano (que tem perto de 40% de C+C)
de 87 oC. Ento, quando a desnaturao feita pelo aumento de temperatura,
classicamente empregamos 94 oC. Mas a temperatura de desnaturao tambm
determina a melhor temperatura de pareamento (ou anelamento, como designado
o processo no nosso livro-texto de Rossetti e cols.). Geralmente ela 25 oC menor
que a de desnaturao. Ento, temperaturas de hibridizao entre 56 e 64 oC so
comuns. Se descermos demais a temperatura de hibridizao (pareamento ou
anelamento) h sempre o risco, como no PCR, de provocarmos pareamentos sem
sentido, ruins, que vo atrapalhar nossa anlise dos resultados, posteriormente.
Depois que o pareamento feito, preciso lavar o excesso de sonda, que
no pareou com o DNA alvo. Isso pode ser feito com o tampo de lavagem a uma
temperatura mais alta do que a ambiente. Esta temperatura mais alta (em geral 37 a
45 oC) cria uma condio de estringncia (de rigor) mais forte, e lava embora o que
no estiver muito bem preso no suporte onde est preso o DNA alvo.
Um dos fatores que vai determinar se a sonda fica bem aderida ao DNA alvo
o seu tamanho. Outro fator a porcentagem de identidade (complementariedade)
entre a sonda e o DNA alvo. Com a prtica (e a leitura de manuais especficos) o
experimentador vai se familiarizando com estas variveis do ensaio de hibridizao.
Vrios outros fatores influenciam na reao de hibridizao e no cabe aqui uma
discusso mais completa.

1.3 Ensaios de hibridizao de cidos nuclicos


A imobilizao do DNA alvo num suporte qualquer, em geral uma membrana
de nylon ou uma lmina de vidro, foi a forma encontrada para, ao mesmo tempo,
aumentar muito a concentrao de DNA alvo no ensaio e facilitar as etapas de
lavagem da sonda no aderida ao DNA alvo. Praticamente todos os ensaios de
hibridizao so, assim heterogneos, isto , uma parte dos reagentes fica na fase
slida (a membrana) e outra na fase lquida (o tampo). Nos ltimos anos a
inverso dos elementos do suporte passou a ser adotada em ensaios de alto
desempenho (high throughput). A tabela abaixo mostra os vrios ensaios mais
comumente empregados em laboratrios de pesquisa e de servios no mundo todo.

Tabela I - Ensaios padro e ensaios reversos mais adotados em laboratrios


de pesquisa e servios no mundo. Baseado em
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.table.499

Ensaios padro Sonda marcada em soluo DNA alvo no ma


Populaes comp
Qualquer DNA ou RNA
prvio fracionamento
Dot-blot marcados, mas usualmente um
diretamente sobre a m
oligonucleotdeo
pontos (dots)
Geralmente DNA
ser clones individuais de
Southern blot Qualquer
restrio, fracionado po
transferido para membran
Northern blot Qualquer Populao compl
total ou mRNA), fraciona
e transferida para uma m

Hibridizao in situ de Geralmente um clone genmico DNA nos cromoss


cromossomo marcado clulas lisadas numa lm
Geralmente uma ribo-sonda
Hibridizao in situ deanti-sense (isto , complementar fita RNA dentro de c
tecido de RNA do tecido) ou ainda umfixadas numa lmina de m
oligonucleotdeo
Colnias de bac
Blot de colnia Qualquer plaqueamento em ga
membrana
Plaques de lise
Blot de plaque viral (ou
Qualquer formado em placa de
fgica)
membrana.
Clones de bactria
Ensaio de hibridizao
Qualquer geometricamente ordena
de grid de colnias
manualmente, em escala
DNA alvo marcado em
Ensaios reversos Sondas no mar
soluo
Oligonucleotideos
Dot-blot reverso DNA complexo
membrane
Clones de DNA a
DNA microarray DNA complexo
uma membrana com aux
Microarray de Oligonucleotideos
DNA complexo
oligonucleotdeos lmina de vidro, e, micro-

Muitas das tcnicas acima podem encontrar aplicao imediata em


diagnstico.
No Dot blot podemos pipetar numa membrana os DNAs extrados de tecidos
de pacientes com uma suposta infeco por um fungo, por exemplo, e em seguida
hibridizarmos o material com uma sonda representando uma regio gnica exclusiva
(caracterstica) deste fungo. Muitos pacientes podem ser investigados, assim, ao
mesmo tempo. A limitao a quantidade de DNA do fungo presente no ensaio, que
no deve ser to pequena que, frente ao enorme excesso de DNA do prprio
paciente, no possa ser localizada pela sonda.
A hibridizao de cromossomos, tambm chamada FISH, pode ser aplicada
identificao de alteraes de sequncias nos cromossomos que no levam a
mudanas conformacionais detectveis pelas tcnicas de bandeamento
convencionais. , assim, uma aliada do diangstico gentico humano ou de animais,
alm de ter inmeras aplicaes em pesquisa.
A hibridizao in situ de tecidos se assemelha ao FISH, mas o alvo em geral
o RNA das clulas, e no um cromossomo individualizado na metfase. Ela pode ser
aplicada ao estudo da expresso de certos genes que podem estar ligados, por
exemplo, ao cncer. Mas tambm pode ser aplicada deteco de RNA viral ou de
um agente infeccioso qualquer no tecido de um paciente.
O Southern blot (que ganhou este nome por ter sido inventado por um
pesquisador de nome Southern) tambm encontrou muitas aplicaes no
diagnstico. Estranhamente, no uma tcnica trivial, mas foi de tal forma
aprimorada e padronizada pelas vrias empress fornecedoras de insumos que
alcanou considervel uso na rea diagnstico, com especial aplicao na deteco
de doenas genticas e no diagnstico de paternidade. Vamos focalizar um pouco
mais a ateno sobre este ensaio e deixaremos os demais para outra disciplina, que
ser oferecida em breve no CCB (UFPE) pelo Gentrop (Departamento de Gentica).
Para uma leitura on-line (em ingls) deste assunto, recomendamos o livro texto de
Gentica Molecular Humana - Strachan e Reed, pelo link
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.
A figura abaixo sumariza os principais passos do Southern blot aplicado a um
DNA pr-digerido com enzimas de restrio. Esta associao tcnica conhecid
como RFLP e envolve a purificao do DNA alvo (de um paciente, por exemplo), sua
digesto com enzimas de restrio, a separao dos fragmentos gerados e a
transferncia destes fragmentos para uma membrana de nylon ou material anlogo.
Esta membrana ser ento incubada com a sonda de DNA marcada, que dever ser
dirigida contra o segmento de DNA que se tem interesse em estudar. Vo aparecer
bandas correspondentes a fagmentos de restrio do DNA original que tm
sequncias total ou parcialmente complementares sonda.
Figura 3: Esquema representativo da tcnica conhecida como RAPD, que
de fato a aplicao do Souther blot a um conjunto de amostras de DNA pr-digeridas
com enzima de restrio. A figura auto-explicativa. Ressaltamos apenas o
resultado da eletroforese, que d um nmero muito grande de bandas com
diferentes pesos moleculares e que no podem ser resolvidas no gel, que mostra
apenas um rastro (smear) no lugar das bandas. As bandas s surgiro pela
identificao destas pela sonda.
Se a sonda tiver um nmero razovel de bases (suponhamos, 1000 b), ela
poder ser capaz de identificar alteraes ocorridas no padro de fragmentao do
DNA pelas enzimas de restrio, toda vez que um stio de restrio dentro da regio
de reconhecimento da sonda o prximo a ela for criado ou desaparecer, devido a
uma mutao. Isto vai provocar o aparecimento ou desaparecimento de uma banda
no resultado final mostrado na figura abaixo, indicando que houve alterao na
sequncia de DNA.
Figura 4: - A digesto de um DNA genmico com enzimas de restrio gera
um nmero muito elevado de bandas. Mas com o uso de uma sonda dirigida a uma
nica regio do genoma (um gene ou regio intergnica de interesse) possvel
estudar apenas um pequeno trecho. A figura mostra esquerda e direita dois
segmentos de DNA idnticos exceto pela presena de uma mutao que elimina um
stio de restrio para a enzima BamH1 (GGATCC) do segmento em estudo; Os
stios de restrio que ainda permanecem no DNA mutado geram um segmento de 9
kpb, que ser identificado pela sonda no Southern blot, enquanto no DNA selvagem
(no mutante) o mesmo fregmanto ser cortado em dois pela enzima de restrio,
gerando dois fragmentos de 4 e 5 kpb. Apenas um deles (o de 4 kpb) ser
reconhecido, j que o outro no contm regio de homologia com a sonda.

Quando o RFPL aplicado ao estudo de diferenas entre fragmentos de


restrio contendo regies repetidas, que no fazem parte de genes, ele pode se
tornar uma ferramenta para identificar indivduos e apontar relaes de cruzamento
entre casais. Isto se deve ao fato de que estar regies ricas em repeties, no
sendo genes, divergem muito entre indivduos. Estas repeties, chamadas VNTR,
poderiam, em princpio, ter um nmero muito variado de repeties, mas na prtica o
termo guardado para arranjos de tamanho moderado, contendo repeties de 5 a
64 pb. estas repeties so conhecidas como DNA mini-satlite hipervarivel, ao
contrrio das repeties de um a 4 nucleotdeos, que so chamadas micro-satlites.
Cada um de ns carrega, em princpio, dois alelos para quaisquer destas
repeties, uma trazida do genoma de nossas mes e outra de nossos pais. Quando
transmitimos prognie estas "marcas", uma delas apenas passar F1, que
receber a outra do outro parceiro (ou parceira) do cruzamento. Ento, estudando
estas regies, que so polimrficas em tamanho, poderemos inferir hereditariedade
e individualidade. A figura abaixo, adaptada de um excelente portal sobre biologia
molecular (http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/), mostra como poderiam
aparecer estes fragmentos de restrio reconhecidos por uma sonda, numa anlise
de relao de parentesco.

Figura 5: - O RFLP para paternidade gera um nmero de bandas grande


(simplificado na figura), fruto da digesto do DNA genmico do indivduo com
enzimas de restrio e do reconhecimento de mltiplos fragmentos pela sonda
dirigida contra a regio repetida de interesse. Neste esquema as cores das bandas
maternas e paternas correspondem s cores de seus ovcito e espermatozide. D1,
filha do casal, tem 2 bandas maternas, sendo as restantes necessariamente
paternas. D2, filha de um primeiro casamento da me, tem 3 bandas maternas mas
as bandas paternas (em vermelho) no coincidem todas elas com as esperadas no
atual marido (uma pequena diferena de migrao suficiente para diferenciar duas
bandas). S1, filho do casal, tem duas bandas maternas e as 3 esperadas bandas
paternas. S2, filho adotivo, tem bandas que no correspondem nem me nem ao
pai (embora possa haver algumas coincidncias). Na prtica, o RFLP no tem cores
distintas para as bandas materna e paterna, o que faz com que a distino seja
baseada exclusivamente na posio da banda no gel (migrao).
Fonte: http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/DNAfingerprint/
Como as bandas que aparecem na digesto do DNA de um indivduo so
numerosas, relativamente comum que dois indivduos quaisquer, quando
comparados, mostrem ao menos uma banda diferente entre si. Mas a variedade de
padres de banda no infinita e numa composio de bandas, no caso de
paternidade, como a descrita acima (Fig. 5), pode haver coincidncia entre as
bandas do suposto pai e do filho, sem que este seja, de fato, gerado por aquele.
preciso lanar mo de testes estatsticos, que avaliam a probabilidade de que cada
banda observada esteja presente uma vez num ensaio qualquer. As frequncias
destas bandas correspondem s frequncias allicas que aprendemos, quando
estudamos genes. H tabelas sobre a frequncia de cada banda e uma estatstica
rebuscada para analisar os resultados, e recomendamos aos interessados que
procurem o livro-texto de Strachan e Reed e consultem o site mencionado na
legenda da figura.
Na prtica, o RFLP no tem cores distintas para as bandas materna e
paterna, o que faz com que a distino seja baseada exclusivamente na posio da
banda no gel (migrao). Um RFLP precisa, assim como outras tcnicas onde
muitas bandas so geradas numa eletroforese, de uma regularidade grande da
corrida eletrofortica, e d para ver que isso nem sempre alcanado (Figura ao
lado)

Figura 6: - RFLP real. Veja a


distoro das faixas (lanes) de
eletroforese, tornando difcil identificar com
preciso a posio relativa de uma banda
e outra entre colunas no adjacentes.

O mesmo princpio descrito acima pode ser aplicado para os testes de


individualidade empregados nos casos de criminalstica e gentica forense (em geral
a identificao de paternidade tambm um tema da gentica forense).
Uma variante mais moderna deste ensaio, e que no usa a etapa de Southern
blot e sim a amplificao inicial de um trecho do genoma (com as repeties a serem
estudadas), tem sido oferecida como kit e empregada em laboratrios. Neste caso,
um trecho do genoma amplificado por PCR. O produto do PCR aplicado ao gel.
O resultado est ilustrado na figura abaixo, para a identificao de um suspeito de
um crime.

Figura 7: Resultado de uma


investigao de um crime (estupro).
O DNA da vtima, dos suspeitos, do
namorado e do material colhido na
vagina (evidncia ou corpo de delito)
foi obtido. Um DNA controle tambm
empregado no ensaio. As bandas
obtidas do suspeito 1 coincidem com
as obtidas do esperma do corpo de
delito. As bandas obtidas do DNA das
clulas da mulher, obtidas em mistura
com o esperma, coincidem com as
bandas da vtima (de fato, o DNA
da vtima).

Pela inspeo simples da imagem acima fica evidente que o padro de


bandas com esta variante da tcnica (que est mais detalhadamente descrita na
pgina da aula 7 para Gentica Molecular - C. Biolgicas) bem mais simples do
que o do RAPD. Geralmente s so discernidas duas bandas, correspondentes aos
dois alelos com repeties nos cromossomos homlogos do indivduo.
iblioteca: Conjunto de clones (aqui compreendidos como um hospedeiro
albergando mltiplas cpias idnticas de um determinado vetor recombinante, ou
ainda o prprio vetor, quando armazenado sem o hospedeiro, como no caso de
bacterifagos) gerados a partir de uma fonte de informao gentica (DNA ou
mRNA). As bibliotecas feitas a partir de DNA do organismo so ditas genmicas e
aquelas feitas a partir de mRNA so ditas de cDNA (e representam apenas os genes
expressos do tecido empregado para extrair o mRNA)
Northern blot: Transferncia de RNAs bandeados por eletroforese para
uma membrana adequada, em geral de nylon. O processo pode ser feito por campo
eltrico (os RNAs so negativos e migram para o plo positivo) ou arraste
hidrodinmico. As membranas de Northern blot podem ser hibridizadas com sondas
de DNA ou RNA. O nome northern uma aluso ao nome Southern, do inventor da
transferncia anloga de DNA.
Clone: Nome empregado em vrias acepes distintas. Pode significar uma
molcula de DNA recombinante contendo um gene ou sequncia de DNA de
interesse. A palavra empregada para designar tambm o hospedeiro carreando o
clone (no vetor) ou ainda qualquer organismo obtido por propagao vegetativa de
outro (esta acepo est foram do contexto da gentica molecular)

Oligonucleotdeo: Um filamento curto de cido nuclico, em geral fita simples,


que pode variar desde poucas bases at algumas dezenas. Em geral so sintticos.
So chamados abreviadamente de oligos (p. ex., oligodT, oligos para
sequenciamento, etc.)

cDNA: Rigorosamente, DNA complementar. O nome empregado para


designar a fita simples de DNA obtida pela transcrio reversa (geralmente parcial)
de um mRNA, a partir de sua extremidade 3' (cauda poli A). A designao
estendida para o DNA fita dupla obtida pela sntese de uma segunda fita de DNA
complementar primeira por alguma DNA polimerase.

PCR: Sigla de polymerase chain reaction, ou reao em cadeia da


polimerase. Reao de extenso de DNA que emprega dois primers que hibridizam
prximos um ao outro na fita de DNA molde (ou alvo), e permitem a produo de
milhes de cpias do fragmento de DNA situado entre os dois primers

dNTPs/ ddNTPs: Desoxinucleotdeos trifosfatados/ didesoxinucleotdeos


trifosfatados. Precursores da sntese de DNA, so empregados para a extenso de
fitas simples in vitro pela ao de uma DNA polimerase, a partir de primers e DNA
moldes adicionados ao sistema. Os dideoxinucleotdeos, quando adicionados a uma
cadeia crescente, interrompem a extenso da fita, pois no oferecem a hidroxila na
posio 3', indispensvel para a ligao fosfodister com o nucleotdeo seguinte.
Podem ser dATP. dGTP. dTTP ou dCTP, ou seus anlogos dideoxi.
Primers: iniciadores da sntese de DNA, so pequenos oligonucleotdeos
sintticos fita simples (de DNA). O primer vai hibridizar (ou parear) com uma fita do
DNA alvo dupla fita. Para o PCR emprega-se em geral dois primers. Para o
sequenciamento de DNA sempre um primer empregado de cada vez. Tanto para
PCR como para sequenciamento os primers costumam ter entre 10 e 25 bases.

Enzima de restrio: Enzimas que reconhecem stios especficos no DNA fita


dupla (em geral palndromos) e cortam a dupla fita, formando extremidades abruptas
(cegas) ou desencontradas (ou coesivas). Os stios reconhecidos por estas enzimas
so designados stios de restrio e os fragmentos de DNA gerados pela digesto
de um DNA com estas enzimas so conhecidos como fragmentos de restrio.
Sonda: Uma molcula de DNA ou RNA marcada com fsforo radioativo u
conjugada com algum tipo de marcao que possa ser identificada posteriormente
por um ensaio bioqumico (florescena, biotina, digozigenina, etc.). A molcula pode
ser fita simples ou fita dupla. As sondas devem ser produzidas em milhares de
cpias e por isto em geral so segmentos clonados em plasmdeo ou produtos de
PCR. Entretanto, em alguns casos, todos os fragmentos de um determinado genoma
podem ser marcados e usados como sondas para hibridizar com outro genoma.

Hibridizao: O pareamento de duas molculas de DNA fita simples atravs


da complementariedade de bases, seguindo a regra de Chargaff (A-T, G-C). Aplica-
se a mesma designao para o pareamento RNA-DNA ou RNA-RNA.

Southern blot: Transferncia de DNAs bandeados por eletroforese para uma


membrana adequada, em geral de nylon. O processo pode ser feito por campo
eltrico (os DNAs so negativos e migram para o plo positivo) ou arraste
hidrodinmico. As membranas de Southern blot podem ser hibridizadas com sondas
de DNA ou RNA. O nome uma homenagem ao inventor da transferncia.

Hospedeiro: O organismo usado para isolar e propagar uma molcula de DNA


clonada (em geral num vetor qualquer). Para clones inseridos em plasmdeos, em
geral emprega-se a Escherichia coli como hospedeiro. Da mesma forma se
bacterifagos so usados. Clulas de mamferos, de leveduras e de insetos so
tambm muito empregadas.
Vetor: Qualquer unidade autoreplicativa de DNA (fita dupla ou simples) que
possa servir para carregar um inserto de DNA exgeno de um hospedeiro para outro
(da mesma espcie ou de espcies distintas, quando o vetor ganha o nome de vetor
de transferncia ou shuttle vector). Exemplos: plasmdeos (bacterianos ou
eucriotos), bacterifagos, vrus, cosmdeos, fagemdeos, BACs (cromossomos
artificiais de bactrias) e YACs (cromossomos artificiais de leveduras).

Insero/ Inserto: Ato de inserir um DNA doador num DNA receptor/ Diz-se
inserto ao DNA inserido (em geral num vetor, mas algumas vezes diretamente no
genoma da clula transformada ou transfectada) Western blot:
Transferncia de protenas bandeadas por eletroforese para uma membrana
adequada, em geral de nitrocelulose. O processo s pode ser feito por campo
eltrico (os RNAs so negativos e migram para o plo positivo). As membranas de
western blot podem ser hibridizadas com sondas de anticorpos. O nome western,
como o nome northern tambm, uma aluso ao nome Southern, do inventor da
transferncia anloga de DNA. O western blot frequentemente chamado
imunoblot.
Ligao: A unio de dois segmentos de DNA fita simples pela ao da ligase.
A enzima reconstitui a ligao fosfodister 3'5' entre dois nucleotdeos adjacentes.