Estrutura e replicação do DNA

VISÃO GERAL

Os ácidos nucleicos são necessários para o armazenamento e a expressão da

informação genética. Existem dois tipos quimicamente distintos de ácidos
nucleicos: o ácido desoxirribonucleico (DNA) e o ácido ribonucleico (RNA, veja o
Capítulo 30). O DNA, o depósito da informação genética, está presente não
somente nos cromossomos dentro do núcleo dos organismos eucarióticos, mas
também nas mitocôndrias, e ainda nos cloroplastos de plantas. As células
procarióticas, que não apresentam núcleo, possuem um único cromossomo, mas
também podem conter DNA não cromossômico, na forma de plasmídeos. A
informação genética encontrada no DNA é copiada e transmitida para as
células-filhas por meio da replicação do DNA. O DNA contido em uma célula-ovo
fertilizada codifica a informação que direciona o desenvolvimento de um organismo. Esse
desenvolvimento pode envolver a produção de bilhões de células.

Cada célula é especializada, expressando somente as funções necessárias para desempenhar

o seu papel na manutenção do organismo. Dessa forma, o DNA deve ser capaz não somente
de replicar-se de forma precisa cada vez que uma célula se divide, mas também de expressar,
de forma seletiva, a informação que contém. A transcrição (síntese de RNA) é o primeiro
estágio na expressão da informação genética (veja o Capítulo 30). A seguir, o código contido
na sequência de nucleotídeos das moléculas de RNA mensageiro é traduzido, completando
assim a expressão gênica.

O fluxo de informação do DNA para o RNA e deste para a proteína é denominado de "dogma
central" da biologia molecular; é representativo para todos os organismos, à exceção de
alguns vírus que possuem o RNA como o repositório de sua informação genética.

Uma fita de DNA ou de RNA é sempre lida da extremidade 5’ para a extremidade 3’. É uma
convenção internacional.

● 5’-ATCCGATGAC-3’
● 3’-TAGGCTACTG-5’
O pareamento específico de bases no DNA leva à Regra de Chargaff: em qualquer amostra
de DNA com fita dupla, a quantidade de adenina é igual à quantidade de timina, a
quantidade de guanina é igual à quantidade de citosina, e a quantidade total de purinas é
igual à quantidade total de pirimidinas.

Formas estruturais da dupla-hélice.

Existem três formas estruturais principais de DNA:

A forma B, descrita por Watson e Crick em 1953, a forma A e a forma Z. A forma B é uma
hélice espiralada para a direita, com dez resíduos em cada volta de 360º da hélice e com os
planos das bases perpendiculares ao eixo helicoidal. Acredita-se que o DNA cromossômico
consista principalmente em B-DNA (a Figura 29. 7 ilustra um modelo de preenchimento do
B-DNA).

A forma A é produzida por uma desidratação moderada da forma B. Ela também é

espiralada para a direita, mas existem 11 pares de bases por volta, e os planos dos
pares de bases estão inclinados 20º em relação à posição perpendicular ao eixo
helicoidal. A conformação encontrada nos híbridos DNA-RNA ou em regiões de fita
dupla de RNA-RNA é, provavelmente, muito semelhante à forma A.

O Z-DNA é uma hélice espiralada para a esquerda, que contém cerca de 12 pares de bases
por volta (veja a Figura 29.7). (Nota: a estrutura do esqueleto de desoxirribose-fosfato é em
"zigue-zague", daí o nome "Z"-DNA.) Porções contendo Z-DNA podem ocorrer
naturalmente em regiões de DNA com sequências alternadas de purinas e
pirimidinas, por exemplo, poli GC. As transições entre as formas helicoidais B
e Z do DNA podem desempenhar funções importantes na regulação da
expressão gênica
Moléculas de DNA lineares e circulares

Cada cromossomo no núcleo de um eucarioto contém uma longa molécula linear de DNA de
fita dupla, ligada a uma mistura complexa de proteínas (histonas e outras, veja a p. 409) para
formar a cromatina. Os eucariotos possuem moléculas de DNA circular nas mitocôndrias,
assim como ocorre nos cloroplastos vegetais. Um organismo procariótico normalmente
contém um único cromossomo circular de fita dupla, supertorcido. Cada cromossomo
procariótico está associado a proteínas semelhantes a histonas que podem condensar o DNA
para formar um nucleoide. Além disso, a maioria das espécies de bactérias também contém
pequenas moléculas de DNA extracromossomais circulares, chamadas de plasmídeos. O
DNA plasmidial carrega informação genética e sofre replicação, que pode ou não estar
sincronizada com a divisão cromossômica.

● Plasmídeos podem carregar genes que conferem resistência a antibióticos para a

bactéria hospedeira e podem facilitar a transferência de informação genética de uma
bactéria para outra.

ETAPAS NA SÍNTESE DO DNA PROCARIÓTICO

Quando as duas fitas do DNA de fita dupla são separadas, cada uma pode servir de molde
para a replicação de uma nova fita complementar. Isso produz duas moléculas-filhas, cada
uma com duas fitas de DNA de orientação antiparalela. Esse processo é chamado de
replicação semiconservativa, pois, embora o dúplex parental seja separado em metades (e,
portanto, não seja "conservado" como entidade), cada fita parental individual permanece
intacta nas duas novas duplas-hélices. As enzimas envolvidas no processo de replicação do
DNA são polimerases que atuam segundo moldes preexistentes e que podem sintetizar a
sequência complementar de cada fita com extraordinária fidelidade. As reações aqui
descritas foram, em um primeiro momento, conhecidas a partir de estudos com a bactéria
Escherichia coli, e a descrição a seguir se refere ao processo observado em procariotos. A
síntese de DNA nos organismos superiores não é tão bem compreendida, mas envolve os
mesmos tipos de mecanismos. Nos dois casos, o início da replicação do DNA condiciona a
célula a continuar o processo até que o genoma inteiro tenha sido replicado.

Separação das duas fitas complementares do DNA

Para que as duas fitas parentais de DNA dupla-fita sejam replicadas, elas precisam,
em primeiro lugar, passar por um processo de separação (ou ''fusão"), pelo menos
em uma pequena região, pois a polimerase usa somente fsDNA como molde. Em
organismos procarióticos, a replicação do DNA inicia em uma única e especial
sequência nucleotídica - um sítio chamado origem da replicação. (Nota: essa
sequência é denominada de sequência consenso, pois a ordem dos nucleotídeos é
essencialmente a mesma em cada sítio.) Este sítio inclui uma sequência curta,
composta quase exclusivamente por pares de bases AT, o que facilita a fusão. Nos
eucariotos, a replicação inicia em múltiplos sítios ao longo da hélice de DNA. Possuir
múltiplas origens de replicação fornece um mecanismo para replicar rapidamente
moléculas de DNA eucarióticas de grande tamanho.
Formação da forquilha de replicação

À medida que as duas fitas se desenrolam e se separam, elas formam um "V", onde ocorre a
síntese ativa. Esta região é chamada de forquilha de replicação.

Proteínas necessárias para a separação das fitas de DNA

Essas proteínas são responsáveis por manter a separação das fitas parentais e por desenrolar
a dupla-hélice à frente da forquilha de replicação que avança. Essas proteínas incluem:

Proteína DnaA.

A proteína DnaA liga-se a sequências nucleotídicas específicas na origem da replicação,

induzindo a separação de pequenas regiões arranjadas em tandem (uma após a outra), ricas
em pares de bases AT. Essa separação é dependente de ATP e resulta na separação das fitas,
com formação de regiões localizadas de fsDNA.

DNA·helicases.

Essas enzimas ligam-se ao DNA de fita simples próximo à forquilha de replicação; em seguida,
se movem para a vizinhança, na região de fita dupla, forçando a separação das fitas -
desenrolando, assim, a dupla-hélice. As helicases necessitam da energia fornecida pelo ATP.
(Nota: a DnaB é a principal helicase de replicação da E. coli. A sua ligação ao DNA necessita da
DnaC.)

Proteínas de ligação a DNA de fita simples (SSB, de single-stranded DNA-binding proteins).

Essas proteínas ligam-se ao fsDNA gerado pelas helicases. Elas ligam-se de forma cooperativa
- ou seja, a ligação de uma molécula de proteína SSB facilita que moléculas adicionais da
proteína SSB venham a ligar-se firmemente à fita de DNA. As proteínas SSB não são enzimas,
porém servem para alterar o equilíbrio entre o fdDNA e o fsDNA, induzindo o predomínio das
formas de fita simples. Essas proteínas não somente mantêm as duas fitas de DNA separadas
na área da origem da replicação, fornecendo dessa forma o molde de fita simples necessário
para as polimerases, mas também protegem o DNA das nucleases que clivam o DNA de fita
simples.

Resolvendo o problema das supertorções.

Assim que as duas fitas da dupla-hélice são separadas, surge um problema: o

aparecimento de supertorções positivas (também chamadas de
superenrolamentos) na região de DNA à frente da forquilha de replicação. O
acúmulo de supertorções positivas interfere no desenrolamento adicional da
dupla-hélice.

Essas enzimas cortam de maneira reversível uma única fita na dupla-hélice. Elas apresentam
as atividades de nuclease (corte das fitas) e de ligase (ligação das fitas). Essas enzimas não
necessitam de ATP e parecem estocar a energia das ligações fosfodiéster que clivam,
aparentemente reutilizando a energia para ligar novamente a fita. Cada vez que um "corte"
transitório é criado em uma fita de DNA, a fita intacta de DNA é passada através da quebra
antes da fita clivada ser ligada novamente, aliviando assim ("relaxando") as supertorções
acumuladas. As topoisomerases tipo I relaxam supertorções negativas (ou seja, aquelas com
menor número de voltas na hélice em comparação ao DNA relaxado) na E. coli, e ambas as
supertorções negativas e positivas (ou seja, aquelas com menor ou maior número de voltas
da hélice que o DNA relaxado) nas células eucarióticas.

DNA-topoisomerases tipo II.

Essas enzimas ligam-se fortemente à dupla-hélice do DNA e fazem cortes transitórios em

ambas as fitas. A enzima induz, a seguir, um segundo estiramento da dupla-hélice do DNA
para passá-la através da quebra e, por fim, refaz a ligação. Como resultado, ambas as
supertorções, negativas e positivas, podem ser aliviadas por este processo dependente de
ATP. As topoisomerases tipo lI são também necessárias, tanto em procariotos como em
eucariotos, para a separação das moléculas de DNA encadeadas após a replicação
cromossômica. A DNA-girase, uma topoisomerase tipo lI encontrada em bactérias e plantas,
possui a propriedade incomum de ser capaz de introduzir supertorções negativas no DNA
circular relaxado, usando energia da hidrólise do ATP. Isso facilita a replicação futura
do DNA, pois as supertorções negativas neutralizam as supertorções positivas
introduzidas durante a abertura da dupla-hélice. Esse mecanismo também auxilia na
separação transitória das fitas, necessária durante a transcrição.

● Agentes anticâncer, como o etoposide atuam sobre a topoisomerase tipo II

humana. A DNA-girase bacteriana é um alvo singular para um grupo de
agentes antimicrobianos chamado quinolonas, como, por exemplo, a
ciprofloxacin.

Primer (iniciador):

É um sequência de aproximadamente 10 bases de RNA.

5’-AUGCGCUCG-3’

Direção da replicação do DNA

As DNA-polimerases responsáveis pela cópia dos moldes de DNA são capazes de "ler" as
sequências nucleotídicas parentais apenas no sentido 3' - 5', enquanto sintetizam as novas
fitas de DNA no sentido 5' - 3' (antiparalelo). Portanto, começando com uma dupla-hélice
parental, as duas regiões recém-sintetizadas de cadeias nucleotídicas devem crescer em
sentidos opostos - uma na direção 5' - 3', rumo à forquilha de replicação, e a outra na direção
5'-3', oposta à forquilha de replicação (Figura 29.14). Esse feito é conseguido por um
mecanismo que difere um pouco em cada fita.

1. Fita contínua. A fita que está sendo copiada no mesmo sentido do avanço da forquilha de
replicação chama-se fita contínua e é sintetizada ininterruptamente.

2. Fita descontínua. A fita que está sendo copiada no sentido oposto ao do avanço da
forquilha de replicação é sintetizada com interrupções, com pequenos fragmentos de DNA
copiados próximos da forquilha de replicação. Essas pequenas regiões de DNA descontínuo,
denominadas fragmentos de Okazaki, por fim são unidas para tornarem-se uma fita única e
contínua. A nova fita de DNA produzida por esse mecanismo é denominada fita descontínua.

Iniciador de RNA

As DNA-polimerases não conseguem iniciar a síntese de uma

fita complementar de DNA a partir de um molde completamente
de fita simples. Em vez disso, essas enzimas necessitam de
um iniciador de RNA - ou seja, uma pequena região de fita
dupla que consiste em RNA pareado com o molde de DNA, com
um grupo hidroxila livre na extremidade 3' da fita de RNA.

Iniciador de RNA

As DNA-polimerases não conseguem iniciar a síntese de uma

fita complementar de DNA a partir de um molde completamente
de fita simples. Em vez disso, essas enzimas necessitam de
um iniciador de RNA - ou seja, uma pequena região de fita
dupla que consiste em RNA pareado com o molde de DNA, com um grupo hidroxila livre na
extremidade 3' da fita de RNA.

Primossomo.

A adição da primase converte o complexo pré-iniciador necessário para a separação das fitas
do DNA (veja a p. 399) em um primossomo. O
primossomo produz o iniciador de RNA necessário
para a síntese da fita contínua e inicia a formação
dos fragmentos de Okazaki na síntese da fita
descontínua. Assim como na síntese de DNA, a
direção da síntese do iniciador é 5‘ - 3'.

Alongamento da cadeia

As DNA-polimerases procarióticas e eucarióticas alongam uma fita nova de DNA pela adição
de desoxirribonucleotídeos, um de cada vez, na extremidade 3' da cadeia em crescimento
(veja a Figura 29.16).

DNA-polimerase III. O alongamento da cadeia de DNA é catalisado pela DNA-polimerase III.

Utilizando o grupo hidroxila 3' do iniciador de RNA como aceptor do primeiro
desoxirribonucleotídeo, a DNA-polimerase III começa a adicionar nucleotídeos ao longo do
molde de fita simples que especifica a sequência de bases na cadeia recém-sintetizada. A
DNA-polimerase III é uma enzima com alta processividade ou seja, permanece ligada à
fita-molde enquanto se move ao longo dela, e não precisa se desligar e ligar novamente ao
adicionar cada novo nucleotídeo. Essa característica da DNA-polimerase III resulta de um anel
formado por sua subunidade beta, que circunda e se move ao longo da fita-molde do DNA,
servindo assim como um grampo deslizante no DNA. A nova fita cresce na direção 5' - 3',
antiparalela à fita parental (veja a Figura 29.16). Os substratos nucleotídicos utilizados são os
desoxirribonucleosídeos-5'-trifosfato. Um pirofosfato (PPi) é liberado a cada novo
desoxinucleosídeo monofosfato adicionado à cadeia em crescimento (veja a Figura 29.15). A
hidrólise de PPi em 2Pi significa que um total de duas ligações de alta energia é usado para
impulsionar a adição de cada desoxinucleotídeo.

● Todos os quatro desoxirribonucleosídeos trifosfato (dATP, dTTP, dCTP e dGTP)

devem estar presentes para ocorrer o alongamento do DNA. Se um dos quatro
estiver em quantidade reduzida, a síntese de DNA será interrompida quando aquele
nucleotídeo esgotar-se.
É extremamente importante para a sobrevivência de um organismo que a sequência do DNA
seja replicada com o menor número possível de erros.

A excisão dos iniciadores de RNA e sua substituição por DNA

A DNA-polimerase III continua a sintetizar DNA na fita descontínua até ser bloqueada pela
proximidade de um iniciador de RNA. Quando isso ocorre, o RNA é retirado e a lacuna é
preenchida pela DNA-polimerase I.

Atividade exonucleásica 5‘- 3'.

Além de possuir a atividade de polimerase 5‘- 3', que sintetiza DNA, e a atividade de
exonuclease 3‘-5', que corrige erros na cadeia de DNA recém-sintetizada, assim como a
DNA-polimerase III, a DNA-polimerase I também possui atividade de exonuclease 5‘- 3',
capaz de remover hidroliticamente o iniciador de RNA. (Nota: Essas atividades são de
exonucleases porque removem um nucleotídeo de cada vez a partir da extremidade da
cadeia de DNA, em vez de clivá-lo internamente, como fazem as endonucleases. Inicialmente,
a DNA-polimerase I localiza o espaço ("corte") entre a extremidade 3' do DNA
recém-sintetizado pela DNA-polimerase III e a extremidade 5' do iniciador de RNA adjacente.
A seguir, a DNA-polimerase I remove hidroliticamente os nucleotídeos de RNA "à sua frente",
movendo-se no sentido 5‘- 3' (atividade exonucleásica 5‘-3). Enquanto remove o RNA, a
DNA-polimerase I o substitui com desoxirribonucleotídeos, sintetizando DNA no sentido 5‘-
3' (atividade polimerásica 5‘- 3). Enquanto sintetiza o DNA, ela também "revisa" a nova
cadeia, usando a atividade exonucleásica 3‘- 5'. Esse processo de remoção/síntese/revisão
continua, um nucleotídeo de cada vez, até que o iniciador de RNA seja totalmente degradado
e a lacuna seja preenchida com DNA.
DNA-ligase

A ligação fosfodiéster final entre o grupo 5'-fosfato na cadeia de DNA sintetizada pela
DNA-polimerase III e o grupo 3'-hidroxila na cadeia produzida pela DNA-polimerase I é
catalisada pela DNA-Ligase. A junção dessas duas regiões de DNA necessita de energia,
fornecida, na maioria dos organismos, pela clivagem de ATP em AMP+ PPi.

REPLICAÇÃO DO DNA EUCARIÓTICO

O processo de replicação do DNA eucariótico segue de maneira muito semelhante à síntese

de DNA procariótico. Algumas diferenças já foram discutidas, como as múltiplas origens de
replicação nas células eucarióticas em comparação às origens de replicação únicas em
procariotos.