S (FBM) 1213JP

Licenciatura em Bioquímica
2º Ano
Biologia
Molecular
Jo an a So u s a P er e i r a
2 0 11 1 68 93 5
A n o L e c ti v o: 2 0 12 / 2 0 13
JOANA SOUSA PEREIRA 2012/2013
Ácidos Nucleicos
DNA RNA
Nome Ácido desoxirribonucleico Ácido ribonucleico
Açúcar Desoxirribose Ribose
Bases azotadas A, T, G, C A, U, G, C
Estrutura Dupla cadeia (hélice) Cadeia única
RNA
Existem vários tipos de RNA:
- RNA de interferência: Interfere com o RNA mensageiro.
- RNA mensageiro (mRNA): Envolvido na transferência de informação entre o DNA e a
proteína.
- RNA de transferência (t-RNA): Tem o código genético e o código dos aminoácidos. Só ele
consegue fazer a tradução.
- RNA ribossómico (rRNA): Tem função estrutural.
Nucleótido: Grupo fosfato (liga ao C5 do açúcar) + base azotada (liga ao

C1 do açúcar) + pentose (açúcar).
NOTA: Uma adição nova ao nucleótido liga ao C3 do açúcar.
Nucleosídeo: É o nucleótido sem o grupo fosfato.
Estrutura básica das bases azotadas:
Purinas: Adenina (A) e Guanina (G). Contêm2 anéis.
Pirimidinas: Uracilo (U), Timina (T) e Citosina (C).

Contêm apenas um anel. O Uracilo, geralmente,
substitui a Timina no RNA.
O Uracilo é facilmente convertido em citosina, sendo que o facto de não existir essa base
azotada no DNA faz com que este se encontre protegido contra mutações que daí poderiam
advir.
1 BIOLOGIA MOLECULAR
DNA
Direccionalidade das ligações no DNA:

É uma propriedade importante da molécula. A
ligação química entre 2 nucleótidos adjacentes é
designada por ligação fosfodiéster (os nucleótidos
estão acoplados por ligações fosfodiéster para
formar polinucleótidos).
A ligação fosfodiéster é uma ligação covalente entre
o grupo fosfato, acoplado ao C5’, de um nucleótido e
ao C3’ do açúcar de outro nucleótido.
As ligações no DNA consistem em 2 ligações fosfodiéster, uma no lado 5’ do fosfato e outra no
lado 3’.
Uma cadeia de DNA é um polímero linear com direcção princípio (5’) e fim (3’).
Estrutura do DNA:
Tem a estrutura de uma dupla hélice para se proteger da degradação ao nível dos terminais.
Cada cadeia emparelha com as bases azotadas complementares por pontes de H, sendo que a
guanina emparelha com a citosina por 3 pontes de H, enquanto a timina emparelha com a
adenina por 2 pontes de H.
Tem uma volta maior e uma menor, sendo que a maior permite um maior número de
interacções com proteínas, uma vez que estas zonas estão mais expostas.
O DNA é uma fita com torção:

B- Descrita por Watson e Crick em 1953. É a forma mais comum, sendo que a hélice é voltada
para a direita e contém 10 resíduos por volta, emparelha de forma planar e é perpendicular à
ligação do grupo fosfato ao açúcar.
A- Obtida pela desidratação moderada da forma B, também é voltada para a direita, mas
possui um maior número de nucleótidos por volta (11), e as bases estão num ângulo de 20
graus em relação ao eixo helical, isto é, em relação à ligação do grupo fosfato ao açúcar. É mais
densa que a torção B.
Z - A hélice nesta forma é voltada para a esquerda, de
modo a diminuir a tensão existente na hélice. Contém
cerca de 12 resíduos por volta. É mais densa que a
torção A, e não se sabe se tem função biológica.
Temperatura de fusão do DNA:

Caracteriza o DNA em termos de composição de bases G+C, visto que estas estão
emparelhadas por um maior número de pontes de H.
A partir do gráfico podemos
concluir que as cadeias duplas de
DNA absorvem muito menos que
as cadeias simples.
A temperatura de fusão depende
directamente da concentração de
G e C no meio.
Factores que afectam a desnaturação/renaturação da dupla hélice:

- Percentagem de G/C (está relacionado com o grupo onde o organismo se insere).
- Sequência do DNA (DNA repetitivo).
- Incompatibilidade de pares de base.
- Dimensão da molécula (temos de comparar estruturas sempre com o mesmo tamanho de
fragmentos).
- Concentração do DNA e o tampão onde ele se encontra.
- Força iónica (Na+ neutraliza P-, logo quando a concentração salina é mais baixa, a dupla hélice
fica mais instável, portanto maior a restringência quando se realizam hibridações), sendo que
temos de comparar o DNA para igual [NaCl].
- Agentes desnaturantes (formamida, ureia, etc).
Acção de ácidos, bases e sais sobre a molécula de

DNA:
Bases: Alteram o estado tautomérico das bases,
quebrando as interacções por pontes de H,
desnaturando a dupla hélice, ou estruturas
secundárias dos ácidos nucleicos.
Ácidos: Hidrolisam os ácidos nucleicos nos seus componentes, isto é, bases, açúcares e
fosfatos. Soluções ácidas moderadas clivam ligações glicosídicas gerando locais apurínicos.
Sais: As suas cargas positivas estabilizam os grupos fosfato que contêm carga negativa.
Forças que estabilizam o DNA:

O RNA absorve mais luz, logo o valor de absorção para uma dada amostra com a mesma
concentração de DNA e RNA é maior para o RNA.
DO 260 (DNA) = 1 – 50 µg/ml
DO 260 (RNA) = 1 - 40 µg/ml
Estrutura do cromossoma eucariótico:

Cromatina: É o complexo de DNA e proteínas cromossómicas, há aproximadamente duas vezes
mais proteínas que DNA. A estrutura básica da cromatina é formada por 200 pares de bases de
DNA ligados a um octâmero de histonas, duas moléculas de cada histona e uma molécula de
histona H1.
- Eucromatina: Regiões nas quais a cromatina encontra-se desespiralada na interfase. Nestas

áreas, os nucleossomas afastam-se uns dos outros, expondo os genes que podem, assim, ser
transcritos. É a parte menos compactada (mais relaxada).
- Heterocromatina: É a parte da cromatina condensada (parte mais compactada). Os genes

contidos nesta região estão, portanto, inactivos.
Existem dois principais tipos de proteínas:

- Não-histonas: São todas as outras proteínas associadas ao DNA. Diferem amplamente em
tipo e estrutura das histonas. A sua quantidade varia muito.
- Histonas: Descobertas por Kossel ainda no século XIX (1884). São proteínas ricas em
aminoácidos positivos (básicos), (Lys + Arg)
que se ligam ao DNA. Existem em abundância
no organismo. A sua massa é
aproximadamente igual à do DNA. São
evolutivamente conservadas.
Permitem a regulação da expressão genética
ao abrirem ou fecharem a cromatina,
permitindo o acesso ao DNA por outras
proteínas (factores de transcrição). Estabiliza o DNA em termos de carga.
Têm 5 tipos:
- H1: Também conhecido como H5.
- H2A e H2B: Apresentam um peso molecular consideravelmente inferior ao do H1. São ricas
em lisinas.
- H3 e H4.
Estas subunidades aparecem sempre aos pares, no entanto H1 é a única subunidade que não
tem par.
DNA dupla hélice
Voltas de DNA ao redor das O DNA dá 1,7 voltas no octâmero.

histonas para criar a estrutura do
nucleossoma.
Empacotamento dos
nucleossomas numa fibra de
cromatina.
Formação das cadeias de DNA.
Secção condensada do
cromossoma.
Cromossoma metafásico.
É compreendida hoje a relação das histonas com o DNA. Entretanto há uma série de proteínas
que formam as fibras da cromatina cuja acção não é bem compreendida.
Conclusões:
O DNA das células está empacotado no núcleo. Este empacotamento
dá-se através da associação do DNA (carga negativa) com proteínas
chamadas histonas (carga positiva). O empacotamento do DNA é
hierárquico.
DNA, RNA e a passagem da informação:
Dogma central da biologia: Todo o nosso

pensamento baseia-se que a informação
está no DNA, passando para o RNA e só
depois para as proteínas.
A proteína altera a sua estrutura, provoca
modificações e interfere no dogma.
As células passam por vários estados de DNA e de RNA. Estas não podem estar sempre no
mesmo estado, porque têm de se dividir/expressar diferentes informações.
Experiência de Meselson-Stahl:
Os cientistas imaginaram que, se as duas
cadeias polinucleotídicas de uma molécula
de DNA fossem marcadas, seria possível
fazer uma previsão sobre o destino dessas
cadeias no decorrer das gerações seguintes.
Segundo a previsão:
a) Após uma replicação, ambas as moléculas filhas estariam marcadas e cada uma delas
conteria metade da marcação da molécula mãe original.
b) Após duas replicações, metade das moléculas estaria marcada e a outra metade não. A
metade marcada, conteria a mesma marcação que as moléculas originais (que foram geradas
na primeira replicação).
Esta experiência diz-nos que o DNA replica de uma forma semi-conservativa, isto é, existe um
molde e uma cadeia nova. No molde, a cadeia tem de abrir, pois a informação encontra-se nas
bases.
Para haver novas células é necessário haver replicação. Este é um processo extremamente
importante para a continuação da vida. Para que este ocorra é fundamental a acção de
enzimas, como é o caso da topoisomerase. Estas enzimas catalisam quebras nas moléculas de
DNA, de modo a aliviarem os superenrolamentos.
Existem 2 tipos de topoisomerases:

- Topoisomerase I: Quebra apenas uma cadeia do DNA e permite o giro da cadeia quebrada
sobre a cadeia intacta. Conserva a energia da quebra da ligação fosfodiéster, armazenando-a
na forma de ligação covalente que ocorre entre ela e os grupos fosfato, no ponto de clivagem.
Depois ela utiliza essa energia para restaurar a ligação fosfodiéster e fechar a quebra.
- Topoisomerase II: Quebra as duas cadeias de DNA ao mesmo tempo e pode introduzir ou
retirar superespiras, duas de cada vez, num mecanismo que é dependente de ATP. Ela corta as
duas cadeias de DNA, prende-se às extremidades através de ligações covalentes, passa a dupla
cadeia através do corte e fecha a quebra.
A estrutura fechada e organizada do DNA não é sempre igual na célula. Essa estrutura
condiciona a transcrição e a replicação do DNA.
Epigenética:
É a ciência que estuda, para sequências iguais de DNA, como factores condicionam o fenótipo
do organismo, uma vez que estuda a informação do DNA que é passada de indivíduo em
indivíduo e que não parte do seu código genético.
Replicação do DNA:
A replicação do DNA depende da DNA polimerase. Esta enzima copia o DNA e pode verificar ou
não se introduziu erros, para isso volta a trás. São exonucleases, ou seja, removem a base no
sentido 5’3’. A DNA polimerase não sabe onde parar, onde tem molde ela copia. Esta enzima
depende de magnésio.
Nos Procariotas:
E. coli: A DNA polimerase é utilizada para preencher os espaços entre os fragmentos de DNA
da cadeia atrasada. Esta é também a maior enzima de polimerização existente durante o
processo de replicação.
A DNA polimerase tem 3 actividades diferentes:

- Template: Polimerase dirigida por DNA (5’3’).
- Proofreading: Volta atrás e confirma o que fizeram, cortam o que está mal e tentam colocar
uma nova base no sistema, tem o sentido contrário ao da replicação (3’ 5’).
- Error correcting: Corrige os erros do DNA (5’3’).
Existem três tipos de DNA polimerase:

DNA polimerase I: Tem como função preencher os “bocadinhos”, está envolvida na
recuperação, mas também participa na cópia de DNA, é uma exonuclease ao contrário da III.
Copia durante pouco tempo.
DNA polimerase II: É codificada pelo gene PolB, que se encontra envolvido em respostas de
emergência ao dano do DNA.
DNA polimerase III: É diferente de organismo para organismo, mas têm todas a mesma
função, isto é, são responsáveis pela polimerização do DNA. A sua estrutura tem de estar à
volta do DNA. Tem um local de ancoragem no DNA e copia durante muito tempo.
A replicação do DNA é levada a cabo, principalmente, pela DNA polimerase III, esta contém
várias subunidades, sendo que o seu peso molecular excede os 600KD.
Forquilha de replicação em procariotas:
Na forquilha de replicação, os procariotas têm

a helicase, DNA polimerase III, proteínas SSBs.
Origem de replicação em E. coli:

O início da replicação nos procariotas é feito num só ponto. A origem de replicação tem a ver
com a sequência que se repete nesta origem, sendo que esta sequência é reconhecida pela
helicase. As sequências têm direcções diferentes e são simétricas umas em relação às outras.
Os cromossomas das bactérias são, geralmente, circulares.
- Sistemas circulares: Plasmídeos e cromossomas
No final da replicação, as cadeias estão encaixadas uma

na outra (concatâmero), isto é, temos o DNA replicado e
não replicado todo ligado um ao outro, e temos de
retirar o DNA circular que foi replicado. Para isso precisa
de ser cortado, através do auxílio de topoisomerase IV,
em que estas vão libertar e remover o concatâmero.
Nos eucariotas:
Como é do conhecimento geral, o DNA contém duas cadeias, sendo que numa o DNA é
copiado de forma livre, isto é, de forma contínua, sendo necessário apenas 1 primer  Cadeia
líder.
Enquanto na outra cadeia, o DNA é copiado por fragmentos (fragmentos de Ocasaki), ou seja,
de forma descontínua, sendo que precisa de um primer por cada segmento  Cadeia atrasada.
Aqui a DNA polimerase, neste caso a DNA polimerase III, prolonga o primer de RNA, digere-o e
em seguida substitui-o por DNA, adicionando bases, de modo a completar a sequência.
Ambas as cadeias replicam no sentido 5’3’.
A cadeia atrasada é parcialmente completada pela DNA polimerase α, que tem a primase
como uma das suas subunidades.
DNA ligase: Promove a ligação de todos os fragmentos de Ocasaki da cadeia descontínua.
Neste grupo de seres vivos, esta enzima abrange várias enzimas. A DNA polimerase introduz
um nucleótido trifosfatado, formando uma ligação fosfodiéster, mas para isso necessita de um
primer, isto é, um segmento de RNA com o grupo 3’-OH livre, pois não consegue iniciar o
processo sozinha. Os primers gastam alguma energia.
NOTA:
RNA polimerase (ou primases): Polimeriza o primer.
Primossoma = Primases + proteínas.
Promotor: É a zona do DNA que tem uma sequência
específica que é reconhecida pela RNA polimerase (permite
o encaixe).
Os eucariotas contêm 5 polimerases: α, β, γ, δ e ε. As suas principais funções são:

α: Síntese da cadeia atrasada. Localiza-se no núcleo. Envolvida na replicação do cromossoma
nuclear.
β: Envolvida na reparação de DNA, no reparo de bases e preenchimento de espaços do
cromossoma nuclear. Localiza-se no núcleo. É análoga à polimerase I.
γ: Localiza-se na mitocôndria, sendo que replica e repara o DNA mitocondrial e tem revisão
3'5’.
δ: Síntese da cadeia líder e tem revisão no sentido 3’5’. Precisa de ser ancorado ao DNA para
poder fazer a polimerização.
ε: Envolvida na reparação do DNA.
Essas subunidades não têm capacidade de se ancorar ao DNA, para isso têm proteínas que as
ajudam. As proteínas associadas à DNA polimerase aumentam a actividade desta e estabilizam
a ligação ao DNA molde.
Sliding-clamp protein:
- Proteina β (E. coli);
- PCNA (muito específica nos eucariotas).
Brace protein:
- Complexo γ (E. coli);
- Factor de replicação C ou RFC (eucariotas).
Replicação de cromossomas lineares:

Na cadeia líder, a polimerização é contínua. A primase não adiciona primers no início dos
cromossomas lineares.
Na cadeia atrasada, devido à necessidade de introduzir primers, o último primer ao ser
removido não deixa um terminal 3’ para poder ser preenchido. Essa zona de DNA seria perdida
durante o processo de replicação, pois o terminal de cada um dos cromossomas não é
codificante. Assim sendo, temos longas sequências repetidas (TTAGGG, nos humanos) ao longo
do cromossoma que podem ser perdidas durante a replicação, designadas por telómeros.
Telomerase:
É um complexo ribonucleico muito importante, pois na
sua estrutura contém sequências de RNA, sendo
capazes de polimerizar o DNA. É semelhante à
transcriptase reversa. O último primer de RNA pode
ser adicionado, mas não pode ser complementado. A
telomerase mantém o tamanho dos telómeros,
restaurando telómeros para o terminal 3’, adicionam
ao DNA molde (à cadeia que está a ser replicada) mais molde, o que permite que o último
fragmento seja um fragmento extra que pode ser perdido, pois não tem função biológica, é
estrutural, e a telomerase faz isso tantas vezes quanto necessárias para estabilizar o DNA.
Conhecida em todos os organismos de DNA linear. Não está activa durante toda a vida, sendo
que com o passar do tempo vai perdendo actividade.
Telómeros:
São estruturas constituídas por sequências repetitivas de proteínas e DNA não codificante que
formam as extremidades dos cromossomas. A sua principal função é manter a estabilidade
estrutural do cromossoma. Estão presentes, principalmente, em células eucarióticas, visto que
o DNA das células procarióticas forma cadeias circulares, não tendo, por isso, locais de
terminação, embora existam excepções.
Cada vez que a célula se divide, os telómeros são ligeiramente encurtados. Como estes não se
regeneram chega a um ponto em que não permitem mais a correcta replicação dos
cromossomas e a célula perde completa ou parcialmente a sua capacidade de divisão.
O encurtamento dos telómeros também pode eliminar certos genes que são indispensáveis à
sobrevivência da célula ou silenciar genes próximos.
Funcionam, ainda, como um protector para os cromossomas, assegurando que a informação
genética relevante seja perfeitamente copiada quando a célula se duplica. Também protegem
os cromossomas, de uma forma geral, da degradação e da recombinação.
FISH (Fluorescence in situ hibridization):

É uma técnica citogenética usada para detectar e localizar a presença ou a ausência de
determinadas sequências de DNA em cromossomas. Utiliza sondas fluorescentes que se ligam
somente às partes do cromossoma que apresentam um elevado grau de complementaridade
de sequência. Pode ser usada para detecção e localização de alvos específicos de RNA em
células circulantes, células tumorais ou amostras de tecido. Neste contexto, pode ajudar a
definir os padrões espaço - temporais de expressão génica em células e tecidos.
Exemplo:
Utilizaram esta técnica em células tumorais, em que marcaram por fluorescência os
telómeros. As células novas apresentaram muitas zonas verdes fluorescentes, enquanto nas
células velhas essas zonas eram quase inexistentes. Com isto, chegou-se à conclusão que há
uma diminuição da actividade da telomerase com o aumento do tempo de vida.
Helicase:
É uma classe de enzimas vitais a todos os organismos vivos. São proteínas responsáveis pela
quebra de ligações de H entre as bases, o que faz com que seja possível abrir o DNA, de modo
a expor as cadeias para serem replicadas, ou seja, desenrola o DNA. Para isso utilizam energia
derivada da hidrólise do ATP.
Topoisomerases:
São enzimas que mantêm o número de desenrolamentos da dupla cadeia estáveis. Estas
enzimas cortam e restabelecem as cadeias, de modo a aliviar o superenrolamento, isto é,
promovem quebras reversíveis na molécula de DNA, evitando as torções excessivas.
Tipos de topoisomerase:
- Topoisomerase I: Cliva apenas uma das cadeias. Fazem passar uma cadeia pela outra. Não
requerem energia. Não está envolvida na replicação do DNA.
-Topoisomerase II: Quebrem a dupla cadeia de uma vez e retiram o desenrolamento. A mais
comum é a DNA girase, sendo que sem ela não há replicação do DNA.
Proteínas SSB:
Essas proteínas seguem atrás da helicase e ligam-se à cadeia simples de DNA, estabilizando-a,
de modo a que a DNA polimerase consiga ligar-se eficazmente à cadeia e replique o DNA.
SSB impede que as cadeias simples de DNA emparelhem antes de serem replicadas pela DNA
polimerase. Esta proteína também expõe as ligações cooperativas, onde a ligação a uma SSB
promove a ligação a outra.
Estudos envolvendo a E. coli demonstraram que SSB tem uma maior afinidade por
polinucleótidos que já estejam ligados a SSBs, evidenciando a cooperatividade existente nestas
proteínas.
A interacção da ligação entre SSBs nas cadeias simples de DNA conduz a uma maior força de
estabilização para as cadeias simples e assegura que estas sejam rapidamente revestidas por
SSBs após serem separadas pela helicase.
Mantêm os filamentos da molécula de DNA afastados, formando as forquilhas de replicação.
Proteínas únicas:
Têm como objectivo proteger o DNA que está em cadeia simples. A cadeia simples é muito
susceptível à degradação, por isso é necessário proteger, de modo a que o DNA não seja
digerido. São muito importantes, porque à medida que o DNA vai-se desenrolando, a cadeia
líder vai sendo replicada.
Forquilhas de Replicação em eucariotas:

O início da replicação nos eucariotas é feito em mais do que um ponto, apesar de conter duas
direcções.
Términus da síntese: Remoção dos primers e reconstrução das ligações fosfodiéster nos
fragmentos de Ocasaki.
Origem de replicação em eucariotas:

Os eucariotas têm milhares de origens de replicação, sendo que a estrutura de origem de
replicação repete-se várias vezes ao longo do genoma. As zonas de detecção das origens de
replicação são mais longas do que as dos procariotas, e variam ligeiramente entre os
diferentes eucariotas.
Temos 13 bases, sendo que 9 delas são “repetidas em comboio”, a sequência comum perfaz a
origem de replicação.
Então, primeiro ocorre uma adição de proteínas que vão promover o enrolamento do DNA, ou
seja, vão estabilizar o DNA numa dobra sobre si própria, e a seguir libertam como zona de
ataque para a abertura da cadeia. Estas proteínas (gastam energia) promovem, assim, a
abertura de zonas “Stand” (“repetições em comboio”).
Manipulação genética
Tecnologias de DNA recombinante:
- Baseiam-se em PCR;
- Necessitam de enzimas para manipulação de DNA;
- Clonagem de DNA.
Vector: Onde vamos colocar o DNA que queremos recombinar.
isolamento, sequenciação
Replicação do DNA
vector + fragmento de e manipulação do
DNA recombinante recombinante dentro de
DNA fragmento de DNA
células hospedeiras
purificado
PCR: Reacção de polimerização em cadeia

É uma técnica de Biologia Molecular que permite a replicação in vitro do DNA de forma
extremamente rápida. Com a PCR, quantidades mínimas de material genético podem ser
amplificadas milhões de vezes em poucas horas, permitindo a detecção rápida e fiável dos
marcadores genéticos de doenças infecciosas, cancro ou doenças genéticas.
Este processo ocorre num termociclador, um equipamento que automaticamente controla e
alterna as temperaturas durante períodos programados de tempo para o número apropriado
de ciclos de PCR (geralmente entre 30 e 40 ciclos).
Etapas da PCR:
- Separação das fitas → 96°C
- Emparelhamento de bases → 54°C
- Síntese do DNA → 72ºC
Problema inicial da técnica: Durante a etapa de quebra das

pontes de H e separação das fitas (DNA melting) a 96°C, a
enzima polimerase era desnaturada e precisava de ser acrescentada ciclo a ciclo... Não
permitia automação.
Mistura de reacção:
- DNA molde (100 ng);
- Primers (5 mM);
- dNTPs;
- Tampão com MgCL2;
- Taq polimerase.
Taq polimerase:
A Taq polimerase é uma polimerase de DNA termo estável recombinante do organismo
Thermus aquaticus que, ao contrário de outras polimerases, se mantém activa a temperaturas
elevadas. Esta polimerase não verifica o que faz, vai sempre para a frente, isto é, não tem
actividade proofreading. Sintetiza exclusivamente na direcção 5’3’. Expande os primers de
acordo com a sequência.
Protocolo de amplificação:
- Desnaturação: 96º C
A temperatura elevada separa a dupla cadeia de DNA em duas cadeias. Essas cadeias
são mantidas juntas por ligações de H que, por serem relativamente fracas, quebram-se a altas
temperaturas, ao passo que as ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose, por
serem ligações covalentes mais fortes, permanecem intactas.
- Anelamento: 45-60º C
O objectivo da PCR não é replicar a cadeia inteira de DNA, mas apenas replicar a
sequência de interesse (normalmente com tamanhos entre 100 e 600 pares de bases) que é
única no organismo.
Os primers marcam as extremidades da sequência alvo, estes contêm entre 20 e 30
bases. Numa reacção de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA
que foi produzida durante o passo de desnaturação. Esses primers encaixam sempre no
sentido 5’3’.
- Extensão: 72º C
O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde estão ligados os
primers), incorporando os nucleótidos complementares à sequência alvo e utilizando os dNTPs
em solução. Inicia-se sempre no extremo 3’ do primer, criando uma cadeia dupla a partir de
cada uma das cadeias simples.
É definida por dois factores: capacidade da DNA polimerase copiar um maior ou menor
número de bases, e o tempo de extensão.
No final do primeiro ciclo da PCR, encontramos duas novas cadeias de DNA idênticas à original.
A DNA polimerase não reconhece o final da sequência. Assim, as novas cadeias sintetizadas
têm o seu início definido pelo primer, mas a sua extremidade 3’ não está definida, podendo
haver fragmentos de diferentes tamanhos. No entanto, no ciclo seguinte, esta cadeia vai servir
de molde à síntese de uma nova cadeia, limitando o primer a outra extremidade da cadeia.
A cadeia de DNA, sintetizada a partir deste molde, terá então o comprimento definido, com os
limites definidos pelos primers. Estas cadeias denominam-se Amplicons.
Após alguns ciclos, as cadeias de DNA, que correspondem ao tamanho exacto da sequência
alvo, estão presentes num número muito maior do que as sequências de comprimento
variável. Por outras palavras, a sequência flanqueada pelos primers é a secção do DNA que se
amplifica.
A temperatura de extensão é estável, mas o tempo de extensão é extremamente importante
no processo. No ciclo final da PCR dá-se um tempo extra para que todos os fragmentos sejam
copiados até ao final.
Nested PCR:
É utilizado quando a quantidade de DNA é muito pequena ou quando não temos primers
específicos. De modo a melhorar a especificidade e a eficiência da reacção, o segmento
genómico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo sequências
localizadas fora dela, e utilizando este primeiro produto, segue-se à amplificação da real
sequência-alvo.
Hot start:
É uma variação da PCR. Começa por desnaturar um bocado o material genético antes de iniciar
o PCR. A actividade da Taq DNA polimerase é inibida durante a preparação da reacção,
evitando a amplificação de produtos inespecíficos, aumentando a especificidade e melhorando
o rendimento da reacção.
Desenho de primers:
Primer:
Um iniciador é um pequeno oligonucleótido sintético (deve ter entre 17 e 28 pb) que é
utilizado em muitas técnicas moleculares de PCR para a sequenciação de DNA. Serve como um
ponto de partida para a síntese de DNA. Estes iniciadores foram concebidos para ter uma
sequência que é o complemento inverso de uma região do molde de DNA alvo ao qual se
deseja que o primer emparelhe. A replicação começa na extremidade 3’ do primer, e copia a
cadeia oposta. Limita a zona de
amplificação.
Primers:
1) 5’ GATGCA 3’ (primer forward)
2) 5’ CAGAAA 3’ (primer reverse)
- Um primer com A e T no início não é muito bom, porque é muito fácil de destabilizar. É
preferível ter G ou C no terminal 3’ do que A ou T.
- Os primers são desenhados para fora da zona alvo e depois de termos o produto amplificado
usamos os primers para dentro da zona alvo.
- Um primer com sequência igual à sequência 5’3’ vai se encaixar na sequência

complementar no sentido 5’3’. Temos de ter um primer que copie no sentido 3’5’, para isso
temos de desenhar um primer complementar reverso.
- Ao desenhar iniciadores para PCR, sequenciação ou mutagénese é muitas vezes necessário a

temperatura de fusão (Tm) para fazer previsões sobre estes iniciadores, e a propensão para
formar dímeros consigo próprio, ou outros iniciadores na reacção. Existem programas para
avaliação de primers.
NOTA: A sequência da Taq não pode cortar no meio da sequência que queremos amplificar no
processo de PCR.
Cálculo da temperatura de fusão (Tm):
Usamos a temperatura de fusão como uma temperatura de decisão da temperatura de

emparelhamento. (Ta) = Tm - 4
A temperatura de fusão tem por base o número de bases e a sequência.
A temperatura de emparelhamento depende da especificidade da nossa amplificação.
Problemas no desenho:
Tem a ver com os terminais. O primer não deve ter sequências auto complementares, isto é, o
primer forward e o reverse não se devem complementar.
Nucleases:
Enzimas capazes de quebrar as ligações entre os nucleotídeos (subunidades do ácido nucleico).
Uma das funções das proteínas virais é proteger o genoma (material genético) do vírus contra
nucleases. São extremamente importantes na manipulação do DNA, porque não se pode
trabalhar com fragmentos muito longos de DNA. Corta na ligação fosfodiéster entre os
terminal 3’ e 5’, podendo deixar o fosfato ligado ao terminal 5’ ou 3’.
Podem ser:
- Endonucleases: São proteínas ou enzimas produzidas por procariotas. Cortam no meio do
DNA. Não cortam ao acaso, mas sim em sequências específicas. São enzimas de restrição,
todas de procariotas, tendo como função biológica proteger a célula. Digerem DNA que seja
introduzido no DNA.
- Exonucleases: Corta o DNA na ponta e vai digerindo. Permite determinar a composição do

DNA em bases, de modo a avaliar a percentagem de G + C no DNA.
Classes de endonucleases:
Utilizado em pesquisa
Tipo Abundância Local de reconhecimento
de DNA recombinante
Corta nas duas cadeias

I Menos comum que o tipo II Não é útil
num local não específico
Mais comum (gera fragmentos Corta nas duas cadeias

II Muito útil
do mesmo tamanho) num local específico
III Raro Cliva apenas uma cadeia Não é útil
As endonucleases do tipo II têm mais funcionalidade em termos de engenharia biológica, pois

têm mais especificidade.
Todas as sequências de enzimas de restrição são palindrómicas (cortam palíndromos). Cortam
no eixo de simetria da sequência palindrómica, originando terminais secos/cegos (não são
bons para mistura de DNA). Por sua vez, se cortarem em zonas mais longe ou mais perto do
eixo de simetria, originam terminais adesivos (“stick ends”) (cortam na mesma parte da
sequência, são bons para
adicionar sequências).
Modificação do DNA- metilação:

Cada ser procariótico pode produzir várias endonucleases. A endonuclease tem sequências
que reconhece no DNA e dentro das quais corta o DNA. O procariota que produz essas
endonucleases metila o seu próprio DNA nas sequências de ataque das endonucleases.
Exemplo: Metilase de E.corI metila a segunda adenina.
Nomenclatura das enzimas de restrição:
E Escherichia (género)
co coli (espécie)
R RY13 (estirpe)
I Primeira identificada (ordem de identificação da bactéria)
Com as enzimas de restrição podemos tentar recombinar o DNA. Estas enzimas foram a
primeira ferramenta que foi utilizada para tentativa de comparação de genomas através da
geração de mapas de restrição.
Mapas de restrição:
É uma compilação do número, da ordem e da distância entre locais do corte da enzima de
restrição ao longo de um segmento clonado do DNA. As unidades do mapa são expressadas
em pares de bases ou para distâncias mais longas em pares de kilobases.
Existem dois métodos para elaborar um mapa de restrição:
- Mapeamento utilizando digestões múltiplas;
- Mapeamento utilizando digestões parciais.
Elaboração de um mapa de restrição:
Utilização de apenas uma enzima de restrição:

Hind III origina 2 fragmentos, logo cortou uma vez.
A enzima Sal I tem um local de corte diferente da do corte de Hind III, no entanto gera 2
fragmentos, fazendo apenas um corte.
Dupla restrição:
Há o aparecimento de 3 fragmentos: 5.8, 0.8 e 0.4.
A Hind III não corta no meio do 5.8, pois esta corta a 6.2, sendo a Sal I quem corta a 5.8.
O fragmento 0.8 não é cortado no meio pela enzima Sal I. No entanto, os últimos 2 fragmentos
(0.8 + 0.4=1.2) foram cortados pela Hind III, uma vez que origina um fragmento a 0.8
(característico desta enzima). Ao cortarmos com as 2 enzimas nunca originaria um fragmento a
1.2, por isso os últimos fragmentos nunca poderiam ser originados pela Sal I.
NOTA: Hoje em dia, não é necessário fazer os mapas de restrição para sabermos os locais de
restrição, utilizamos a Taq e enzimas de restrição.
Plasmídeo com
sequência Enzimas de restrição Electroforese
desconhecida
Sabemos o
comprimento e a
Origina n fragmentos
sequência nas
pontas de cada um
Ao sabermos que a enzima corta num determinado ponto podemos saber a sequência. O
número de cortes e o número de fragmentos originados por esses depende se a molécula é
circular ou linear.
Se tivermos uma sequência de DNA circular (plasmídeo), ao fazermos 4 cortes originamos 4
fragmentos. Por sua vez, se tivermos uma sequência de DNA linear ao fazermos 4 cortes
originamos 5 fragmentos no gene.
NOTA: Quantos mais cortes fizer mais sei sobre a minha sequência.
Conceitos-chave para a tecnologia do DNA recombinante:

- Vector;
- Sítio múltiplo de clonagem (multiple clonning site);
- Genes repórteres;
- Insert;
- Endonucleases de restrição sítio-específicas;
- Digestão;
- Ligação;
- Clonagem.
Paul Berg:
Reuniu o fago SV40 ao bacteriófago lambda. Ele queria cortar o SV40 e inserir pedaços do fago
no bacteriófago lambda.
Usou enzimas de restrição para cortar os fagos e incubou-os juntos, utilizando DNA ligase.
Criou uma técnica, segundo ele mesmo, para ligar covalentemente moléculas de DNA.
Como o bacteriófago era de E. coli e esta bactéria habita no nosso corpo, ele teve medo de
gerar um novo e letal vírus.
Para manipular o DNA, para além de cortar o DNA temos de ligá-lo.
Vectores:
Os vectores podem ser de transporte ou de transcrição.
Vectores
de clonagem de expressão
quando queremos quando queremos

clonar um gene. expressar uma proteína.
Nos procariotas:
É necessário um promotor, isto é, algo que direccione a RNA polimerase. E locais de ligação a
ribossomas, pois são estas estruturas que lêem a sequência de aminoácidos.
Nos eucariotas:
É necessária uma origem de replicação, de modo a permitir o início da replicação; e
poliadenilação para proteger o mRNA.
Vectores de clonagem:
Em 1970, Stahen Cohen descobriu um método segundo o qual E. coli adquiriria um plasmídeo
conhecido como pSC101. Este plasmídeo contém um gene que confere resistência ao
antibiótico tetraciclina. Estes vectores são importantes para a recombinação de DNA. Os mais
comuns são os de plasmídeos.
Vectores Grupos de vectores:

 Naturais:
Plasmídeos Plasmídeos:
São os mais comuns, sendo que em biologia molecular são vistos como
Fagos vectores. São células de DNA circular não cromossómico, podendo ter várias
características. As bactérias podem ser suicidas ou unidades replicativas
Cosmídeos autónomas, estas últimas são designadas por plasmídeos f.
pUC são relativamente fáceis de manipular. São moléculas relativamente
BAC pequenas, por isso a quantidade de material genético que podemos lá
colocar é pequena, isto é uma limitação, sendo que por isso decidiu-se
YAC
procurar vectores diferentes. Temos de procurar os vectores consoante as
características fenotípicas das células. Se a célula já for resistente a um
MAC
antibiótico temos de utilizar um vector que seja resistente a outro
antibiótico.
O gene Lac Z contém a enzima β-galactosidase.
X-Gal  X + Gal (a β-galactosidase cliva a reacção)
Fagos:
O fago λ é dos bacteriófagos mais estudados. Podem ser usados, porque mais de metade do
seu genoma (60%) é necessário para que o fago se replique, assim podemos utilizar a parte do
genoma que não é necessário (40%) para colocar o DNA que queremos. Têm, assim, a
capacidade de transportar maior quantidade de material genético. Têm cadeia dupla e DNA
linear, aproximadamente, 50Kb. O DNA incluído na cabeça do fago é transfectado para células
de E. coli. Os terminais do DNA do fago têm locais coesivos (cos) que permitem a circularização
no interior de E. coli.
Este irá ter 2 ciclos:
- Ciclo lisogénico: O DNA é incorporado no genoma, a célula multiplica-se e leva sempre o DNA
consigo.
- Ciclo lítico: O RNA transcreve e traduz o seu material genético.
Não queremos que entre em ciclo lítico, por isso temos de encontrar as células que foram
afectadas pelo fago.
Os fagos têm sido modificados para serem vectores de clonagem, alguns locais de restrição são
mutados, deixando apenas um, de modo a sabermos onde o material genético vai ser inserido.
Permite a inserção de genoma do tamanho daquele que removemos, o novo material genético
fica no meio do genoma do fago, pois é essa parte que é removida.
O fago λ também está manipulado de modo a transportar resistência a antibióticos. No

entanto, mesmo modificado continua a ser infeccioso.
Aplicações: Clonagem de DNA genómico, de cDNA e bibliotecas de expressão.
Cosmídeos:
É uma combinação das propriedades de vectores de plasmídeos e de fagos, sendo que isso é
uma vantagem da utilização desses vectores. O tamanho do insert colocado vai desde 35 até
45 Kb. São vectores capazes de transportar elevadas quantidades de DNA, permitindo a
transferência de material genético completa. Mantém a estratégia de infecção do fago.
Temos de ter um local para inserir o DNA, genes de resistência, genes cos e uma origem de
replicação como os plasmídeos.
Exemplo: O cosmídeo pLFR-5 contém os 2 terminais cos do bacteriófago λ e múltiplas
sequências de clonagem e origem de replicação como os plasmídeos.
Aplicações: Construção de bibliotecas genómicas. Os cosmídeos são muito utilizados para
metodologias ambientais.
 Artificiais: Foram criados de maneira a serem células vectores com características de

vectores.
BAC (bacterial artificial chromossome):

Para bactérias, baseiam-se no plasmídeo f da E. coli. O tamanho do insert colocado vai desde
75 até 300 Kb.
Aplicações: Análise de grandes quantidades de genomas.
YAC (yeast artificial chromossome):

Para leveduras.
Aplicações: Análise de grandes quantidades de genoma. Ratinhos transgénicos.
NOTA: As leveduras são diferentes dos fungos, pois as leveduras são fungos unicelulares,
enquanto os fungos são pluricelulares.
MAC (mammalian artificial chromossome):
Para eucariotas.
Aplicações: Utilizado em biotecnologia animal e terapia de genes humanos.
Função evolutiva dos plasmídeos nas células bacterianas

- Transportam genes de resistência a antibióticos:
- Ampicilina (ampR);
- Kanamicina (kanR);
- Tetraciclina (tetR).
- Contém genes para a síntese de antibióticos.
- Plasmídeos são passados de uma célula para outra através de pili.
Zona de
Clonagem Gene de
resistência a
ampr
Zona de clonagem: Tem de estar sempre nos vectores, é o local onde adicionamos o material
genético. Esta zona está normalmente dentro de um gene. Este gene codifica uma proteína
que contém características fenotípicas.
Gene de resistência a ampR que reveste a enzima β-lactamase e confere resistência à

ampicilina
Todos os plasmídeos contêm uma origem de replicação, o que garante que estes sejam
transcritos na célula.
A descoberta da DNA ligase:

É a última enzima que entra no processo de recombinação do DNA. Esta faz a ligação entre o
vector e o material que queremos inserir.
Clonagem:
É a produção de múltiplas cópias geneticamente idênticas (população de células ou
organismos). Uma das razões de clonar é guardar informação, isto é, fazer uma biblioteca.
Clonagem
Para expressão Para armazenar DNA
Gene: É uma região do DNA que codifica para uma proteína (polipeptídeo), responsável por
propriedades físicas e hereditáveis de um organismo que contribuem para o fenótipo/função.
Tipos de clonagem:
- Clonagem de DNA: Produção de múltiplas cópias de uma molécula de DNA.
- Clonagem de um gene: Produção de múltiplas cópias de um gene.
Clone de um gene: Células contendo moléculas idênticas de DNA recombinante com o gene de
interesse.
Objectivos da clonagem:
Um dos mais importantes objectivos da técnica de DNA recombinante é clonar um gene ou um
fragmento de DNA de interesse.
A estratégia a usar para clonar um gene de interesse depende em grande medida:
- Do gene;
- Do que se sabe sobre o gene;
- Objectivo.
Entre as várias ferramentas necessárias para clonar, temos que considerar:

- Enzimas de restrição;
- Vector;
- DNA ligase;
- Célula hospedeira.
Para quê clonar genes?

Clonar genes não serve apenas para originar ovelhas, como a Dolly, a clonagem serve para
muito mais do que isso. Serve para sequenciar genomas, em que depois temos de fazer a
montagem destes e aí é necessária a clonagem. Serve para a mutação de genes in vivo ou para
expressar uma determinada característica fenotípica.
 Podemos amplificar milhares de vezes apenas este gene;
 Realizar um estudo individual da função de genes;
 Identificar mutações que modifiquem a função deles;
 Entender a acção enzimática da proteína produzida;
 Verificar com quais outros genes ele interage;
 Produzir a proteína em larga escala;
 Produzir organismos transgénicos de interesse.
NOTA: A insulina é a clonagem de um gene em procariotas.
Clonagem de fragmentos de DNA:
Fragmento de DNA vector ou veículo de clonagem:

- Plasmídeo;
- Bacteriófago;
- Cosmídeo;
- Cromossoma artificial de bactéria (BAC);
- Cromossoma artificial de levedura (YAC).
Introduzir fragmentos de DNA
não digerimos o DNA alvo, mas amplificamos este

cortamos o material genético com a com a utilização de primers que no lado 5' têm
mesma enzima que cortamos o vector. sequências complementares às sequências de
restrição utilizadas no fragmento.
Juntamos o fragmento de DNA e o vector com a aplicação de uma DNA

ligase
vector recombinado
colocamos o material genético na célula hospedeira
reconhece as células alvo que têm plasmídeo e cujo contém o material

genético que queremos clonar
a célula que reconhece o vector é a célula transformada
Amplificação do clone em bactérias:
Métodos de transformação bacteriana

 Transferência horizontal de genes: Em bactérias é natural. Isto permite modificar o material
genético do parceiro, gerando diversidade. No entanto, muitos dos plasmídeos promovem à
célula momentos de stress, em que ficam resistentes a antibióticos.
 Transfecção: É um termo generalista que serve para transferir material genético.
 Transdução: É igual à transfecção, no entanto é mais específico, sendo que permite a

transferência de material genético em procariotas e fagos. Dependemos das características do
fago que é infeccioso por si só.
 Conjugação: Troca ou transferência de material genético entre duas células, organismos ou

bactérias normalmente com o objectivo da reprodução, continuando os dois organismos a
existir separadamente. Dependemos das características do DNA.
 Transformação: É a aquisição de material genético externo.
Inserção do
Replicação
plasmídeo em
bacteriana
bactérias
Produção em
massa da proteína
recombinante
Células competentes:
São permeáveis a DNA, sendo capazes de adquirir DNA ambiental. Para tornarmos células
normais em células competentes, submetemos estas a temperaturas elevadas e adicionamos
CaCl2, de modo a haver um choque térmico. As células que não são transformadas nesse passo
são bombardeadas com DNA – electroporação - havendo um choque eléctrico. Em último
recurso utilizamos “Gene gun”, em que aqui introduzimos um plasmídeo à força, de modo a
torná-las em células competentes.
NOTA: Plasmídeos pequenos são mais facilmente incorporados pela célula bacteriana
competente.
DNA linear é pobremente incorporado, talvez pelo facto de sofrer degradação pelas
exonucleases presentes no espaço periplasmático.
Importância de marcadores para a selecção dos clones:
Marcadores
célula recebeu o DNA indicam que o DNA é

recombinante
Selecção de clones:
As bactérias são colocadas em meio nutritivo com antibiótico para que cresçam e amplifiquem
o nosso DNA do insert, estas têm de continuar a ser cultiváveis.
Serve para avaliar se o plasmídeo contém ou não o DNA recombinante.
Gene repórter: Reporta se a transformação aconteceu, as bactérias não transformadas não

sobrevivem, é um gene de resistência a algum antibiótico.
Selecção de recombinantes:
Durante a clonagem de fragmentos, a DNA ligase pode fechar o plasmídeo sem que nenhum
insert tenha sido clonado. Para evitar a análise de um vector fechado sem o insert clonado é
preciso um novo teste de gene repórter.
Tem uma selecção negativa (não se aplica directamente) e uma selecção positiva, em que
quem crescer é quem tem o vector.
No mesmo meio de cultura, para além do vector, podemos colocar X-Gal, em que este é
degradado pela β-galactosidase numa substância colorida. Isto permite seleccionar clones que
crescem com resistência a antibióticos. Os clones capazes de não degradar o X-Gal ficam
brancos, enquanto os que degradam ficam azuis.
A seguir tem de se repicar cada uma das colónias, de modo a analisar se têm o insert que
queremos, isto se se começar com o processo de digestão e em seguida o de clonagem. Se
tivermos muitas dúvidas podemos fazer um PCR a seguir, no entanto se este contiver os
mesmos primers vou ter a mesma dúvida inicial.
Por sua vez, se iniciarmos o processo com PCR (este amplifica uma zona específica do DNA),
existe uma enorme probabilidade de aquele ser o fragmento que metemos dentro do
plasmídeo. Ou seja, primeiro temos de confirmar se o vector está no nosso plasmídeo e se tem
DNA recombinante.
Biblioteca genómica vs bibliotecas de cDNA
Função da biblioteca: Permite que mais tarde tenhamos informações do DNA.
Biblioteca genómica:
É um conjunto aleatório de fragmentos de DNA a partir de um organismo clonado num vector,
ou seja é um conjunto de clones que representam a totalidade do genoma de um determinado
organismo. Cada uma das células que isolamos vai conter um fragmento do meu todo. Neste
tipo de biblioteca temos intrões, genes não expressos.
Biblioteca de cDNA:
É um conjunto de clones representativos de todo o cDNA que é derivado do mRNA de um
conjunto de células num ponto do desenvolvimento.
NOTA: Quando avaliamos DNA estamos a estudar o potencial, enquanto que quando avaliamos
RNA estamos a estudar funcionalidade.
Construção da biblioteca genómica funcional:

Temos n plasmídeos totais com um
fragmento cada.
Só podemos estar interessados numa
proteína de cada vez.
Assim, estamos interessados apenas
numa sequência (num clone), porque
não temos possibilidade de estudar toda a biblioteca, para isso utiliza-se uma sonda. Estas
sondas são oligonucleótidos sintéticos que cortam uma sequência complementar daquilo que
queremos encontrar (temos de saber o que queremos). Temos de inserir fosfato radioactivo na
sonda para ser detectável, no entanto com isso, a sonda fica radioactiva. A enzima alcalino
fosfatase remove os fosfatos radioactivos.
NOTA: Em princípio cada clone tem um fragmento de DNA.
Desenho da sonda:
Se soubermos a sequência da proteína sabemos os aminoácidos que ela possui, no entanto
temos de ter em consideração que um aminoácido pode ser codificado por vários nucleótidos
(codões).
Purificação do RNA:
Os operões podem clonar mais do que 1 gene, de modo a ver a dependência deles.
As RNAases existem em todo o lado, por isso é difícil trabalhar com RNA, sendo necessário
este ser tratado antes de ser usado, até mesmo o material tem de ser todo auto-clavado,
porque tudo destrói o RNA.
O mRNA existe para ser traduzido e depois é eliminado do sistema, é altamente digerido,
tendo pouco tempo de vida, não dando para preservá-lo durante muito tempo.
Temos de eliminar o rRNA e o t-RNA (outros tipos de RNA), de modo a ficarmos apenas com o
mRNA.
mRNA é um RNA processado

Sabemos que o mRNA após ser tratado tem
informação para codificar uma proteína. Por
isso é interessante para nós, bioquímicos,
passarmos o mRNA para cDNA, de modo a
sabermos a informação que ele codifica.
Os genes eucariotas são grandes devido ao facto de terem exões e intrões, por isso temos
limitações para metermos informação.
Síntese de cDNA a partir de mRNA:

cDNA é a cópia de RNA em DNA. É
necessário fazer cDNA para
podermos clonar mRNA.
O cDNA mede a expressão e não o
potencial.
O mRNA quando é transcrito em

eucariotas fica susceptível de ser
digerido, por isso tem de ser protegido, para isso ao nível do terminal 5’ e 3’ coloca-se uma
cauda de poli-adeninas. Essas caudas podem ser usadas para ancorar um primer, em que este
vai ser usado para o início da síntese (utiliza-se um primer para as zonas desprotegidas de
RNA). Com isto, duplicamos a cadeia, em que posteriormente conseguimos fazer PCR.
Plaquear a biblioteca:
As bibliotecas genómicas têm milhões de clones diferentes.
Isolamos os clones positivos.
As bibliotecas de plasmídeos são plaqueadas em meio com
antibiótico para isolamento das E. coli.
As bibliotecas de fagos são incubadas com E. coli, depois
plaqueadas em soft agar para permitir o crescimento das
placas de vírus.
Detecção do gene por hibridação em placa:

Uma vez que a biblioteca é plaqueada em agar, os filtros de nitrocelulose ou membranas de
nylon são colocados sobre a superfície das placas. As placas ou colónias são “levantadas”
quando o filtro/membrana são cuidadosamente tirados da placa. O filtro é a replicação da
placa original.
As células bacterianas dentro de colónias são "quebradas" para libertar o seu conteúdo por
imersão da membrana em detergente (SDS) e protease. Em relação aos fagos, as células já
foram lizadas e o DNA é exposto. Em ambos os casos, o DNA é desnaturado devido a ligações
básicas que existem entre o DNA e a membrana por cozedura a uma temperatura elevada ou
através de luz UV para reticular ao filtro.
Electroforese:
É uma das técnicas mais antigas em biologia molecular, sendo ainda
hoje muito utilizada, pois tudo é confirmado através desta técnica.
Consiste na separação de partículas carregadas por acção de um
campo eléctrico uniforme.
Separação
Por peso molecular Por carga
Utiliza-se gel de agarose
cDNA
O gel de agarose apenas permite a separação por peso molecular.

O DNA contém carga negativa, logo tem tendência a se dirigir para o pólo positivo quando
sujeito a um campo eléctrico.
Etapas:
Preparação Aplicação das

Electroforese Coloração
do gel amostras
Usa-se um campo eléctrico de 150 volt só para ver se temos DNA. No máximo, utiliza-se um
campo de 100 volt para separar os componentes da amostra.
Preparação do gel
Horizontal Vertical
usámos mais essa

em poliacrilamida
preparação
em agarose
Coloração das moléculas:

 Brometo de etídio – É um agente intercalante do DNA, isto é, fixa as cadeias de DNA,
mas podemos voltar a usar os fragmentos de DNA se os conseguirmos tirar do gel. É
cancerígeno, é um composto fluorescente à luz UV e é utilizado em gel de agarose.
 Prata – Utilizado em gel SDS-PAGE, gel de poliacrilamida. Tem uma resolução melhor,
pois é extremamente sensível. Utilizada para colorir proteínas.
 Coomassie blue - Este corante irá se ligar a todas as proteínas da célula e, a partir da
intensidade de cor gerada, é possível estabelecer uma relação da intensidade da cor
(absorvância) e quantidade de células.
Desvantagens do gel de agarose:

- Pouca precisão;
- Baixa sensibilidade;
- Baixa resolução;
- É não automático;
- Curta faixa dinâmica;
- Resultados não são expressos em números;
- A coloração com o brometo de etídio não é muito quantitativa, isto é, a quantidade de DNA
em agarose é muito complicada de se obter (ao contrário do que acontece no Real time PCR).
Fases do PCR:
Utilizando uma curva normalizada baseada em quantidades conhecidas do DNA alvo é possível
medir com exactidão a quantidade de DNA produzido. Esta quantidade de DNA varia com o
número de ciclos.
Análise Southern/Northern
O DNA total de um organismo ou RNA são misturas.
São técnicas que foram desenvolvidas para identificar sequências específicas na mistura.
Southern blotting – DNA
Northern blotting – RNA
NOTA: Blot significa transferência por capilaridade, no entanto, neste momento aplicamos
campo eléctrico e as moléculas carregadas passam do gel para a membrana.
 Southern blot:
É uma técnica que detecta sequências específicas de misturas complexas de DNA e utiliza uma
sonda de DNA. Foi descoberta em 1970 por Edward Southern.
Tandem repeat - É uma sequência com uma determinada sequência que se repete. O número
de repetições é característico de um organismo.
Tem sido utilizada para detectar RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e VNTR
(Variable Number of Tandem Repeat Polymorphism). Estas são técnicas de tipagem.
O VNTR é um indicativo, não servindo de prova em tribunal. O filtro deve reflectir pelo menos
um grupo de VNTR do pai.
Podemos avaliar directamente a
sequência local da sonda (se a sonda
for complementar) ou por sondas
radioactivas.
O DNA é desnaturado com uma
solução alcalina.
 Northern blot:
Objectivo: Saber o que está a ser expresso naquele momento.
É utilizado para detectar fragmentos de RNA em vez de fragmentos de DNA. Estes fragmentos
de RNA são tratados com formaldeído, de modo a garantir uma conformação linear.
Estuda o perfil de expressão de mRNA (correspondente à expressão de um determinado gene),

onde e quando está presente numa dada
amostra. É uma das formas mais simples
de determinar em que altura certos
genes estão a ser expressos em sistemas
vivos.
Neste processo, o RNA é separado numa
electroforese em gel, transferido para
uma membrana e detectado de forma
similar ao DNA no Southern blot, sendo
que neste caso é utilizada uma sonda de RNA.
 Western blot:
Utiliza o mesmo princípio do Southern blot e
do Northern blot, mas é aplicado a
proteínas. Estas são separadas por
electroforese em gel de poliacrilamida, na
presença do detergente dodecilo sulfato de
sódio (SDS).
Esta técnica é também chamada de
immunoblotting.
É utilizada a transferência eléctrica e não a capilaridade.
Coloca-se o substrato para a enzima que está ligada à zona c específica do anticorpo.
SDS – Utilizado para remover ligações de dissulfeto, separando os diferentes polipeptídeos da

proteína.
Sequenciação:
Se soubermos a sequência é muito mais fácil sabermos com o que estamos a trabalhar.
Frederick Sanger (1977) foi o primeiro a pensar na técnica de sequenciação como uma
polimerização. O método de Sanger permite a sequenciação de genes, mas não para
metagenómica.
Síntese de DNA in vitro por término didesoxi.
É um mapa físico dos genes e dos cromossomas.
Necessita de:
 1 Molde;
 1 Polimerase;
 Mg2+ para a polimerase;
 1 Primer;
 1 Cadeia;
 dNTPs.
PCR Electroforese Sequenciação
Didesoxinucleótidos:
Ao nível do carbono 3 do açúcar não há grupo OH.
Reacção de polimerização:
Consiste na separação das moléculas.
Dye-termination sequencing:
Faz-se o mapa de electroforese a partir de um fragmento que é transferido por capilaridade. O
processo é altamente automatizado.
Real Time-PCR:
Esta técnica baseia-se no uso e detecção de um oligonucleótido fluorescente. A quantidade de
fluorescência é proporcional à quantidade de produto de PCR após cada ciclo.
Permite a quantificação em tempo real de material genético, porque usa corantes que permite
determinar quantas cadeias duplas estão a ser formadas. Esta quantificação tem a ver com a
quantidade de fluorescência na nossa amostra. O número de cadeias duplas aumenta sempre
exponencialmente, sendo que no início não conseguimos detectar, havendo, por isso, um
limite de detecção (número mínimo de cadeias duplas).
Aqui o PCR pode ser visto em tempo real, isto é, podemos ver crescer a quantidade de material
genético no tubo. Depende da Taq e da qualidade do material genético. O tipo de Taq utilizada
é importante, pois tem de ser capaz de remover a sonda e ter actividade exonuclease no
sentido 5’3’.
À medida que copia introduz uma molécula fluorescente e podemos ver o material genético
copiado. Podemos quantificar ao mesmo tempo que o material está a ser copiado.
A sonda tem de um lado e doutro uma molécula:
- F: Molécula que fluoresce.
- Q: Molécula que interfere com a fluorescência (“quencher”), ou seja, não deixa fluorescer, a
não ser no momento da polimerização em que F separa-se de Q e aí já deixa fluorescer.
Estas duas moléculas anulam-se.
À medida que o número de ciclos vai aumentando haverá um aumento da quantidade de
sonda livre, no entanto a detecção da sonda (de fluorescência) só é permitida a partir de um
certo tempo.
Quanto menos DNA existe na nossa amostra, maior será o número de ciclos necessários para
haver a detecção. Pelo contrário, quanto maior a quantidade de DNA existente, menor o
número de ciclos necessários.
Assim, verificamos que a concentração de DNA está relacionada com o tempo.
Parâmetros de fluorescência
Energia de Activação Energia de Emissão
Emite em diferentes comprimentos de onda e podemos receber a informação a diferentes

comprimentos de onda.
RTPCR (Reverse Transcriptase PCR):

Mede a capacidade de passarmos RNA para cDNA.
Esta técnica não utiliza o DNA de cadeia dupla como molde e sim RNA de cadeia simples. A
partir do RNA a enzima transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA complementar
(chamado agora de cDNA), sendo que ao cDNA aplica-se a técnica de PCR.
É necessária ligação ao RNA e a ligação da transcriptase reversa a uma "cadeia" de poli T, pois
sempre no final da cadeia de mRNA existe uma "cauda" de poli A.
A técnica de RT-PCR é amplamente utilizada para verificar a expressão génica, uma vez que
analisa o RNA responsável pela síntese de proteínas. Se há uma proteína específica, é porque
há DNA sendo expresso, originando mRNA para tal proteína. A expressão para produção de
diferentes proteínas varia conforme a localização da célula dentro do organismo.
Detecção:
Existem duas classes químicas básicas:
- Detecção baseada em sondas:
- TaqMan;
- TaqMan MGB;
- Three Star (ARMS);
- Molecular beacons (faróis moleculares);
- AmpliDet RNA (molecular beacons + NASBA);
- Sondas adjacentes/ sondas HYB (sondas de hibridização);
- DOL (Dye-labeled oligonucleotide ligation);
- Scorpions (primer de amplificação rotulado);
- DNA invader (DNA invasor).
- Detecção baseada em corantes genéricos:

- Brometo de etídio;
- SYBR Green 1 Dye: É um corante como o brometo de etídio, no entanto tem menor
capacidade de se integrar na membrana. É muito tóxico. Usado na quantificação em Real time
PCR, em que se não se encontrar na amostra não fluoresce.
Detecção por TaqMan:
Detecção por SYBR Green:

O corante intercala-se entre as cadeias
duplas. Não fluoresce quando o DNA
está em cadeia simples, mas em cadeias
duplas já fluoresce.
Microarrays:
É uma técnica muito recente. Permite a análise do genoma na sua totalidade, é relativamente
cara. Avalia a expressão de genes em resposta a modificações ambientais, isto é, avalia
mudanças na expressão dos genes, medindo o estado dinâmico da célula ou organismo.
Identifica os genes que são expressos de forma diferente em resposta a condições específicas.
É uma técnica muito automatizada, em que recebemos muitos dados, sendo que a grande
dificuldade é avaliar quem foi e quem não foi expresso.
Aqui corta-se o genoma e organizamos os fragmentos, colocando-os no microarray.
O mRNA é complementar ao nosso gene, sendo usado como uma sonda.
Componentes essenciais dos microarrays:

- A matriz que contém milhares de sequências de ácidos nucleicos ou "alvos" arranjados num
pequeno chip.
- Uma ou mais amostras ou sondas marcadas que são hibridadas com a matriz.
- Um sistema de detecção, que quantifica o sinal de hibridação.
- A sonda (o que seleccionamos para hibridizar) seja uma sequência replicativa do gene.
Resumo:
 Cada um dos pontos corresponde

a uma sequência no genoma, pois não
é preciso avaliar o genoma todo.
Temos o genoma fixado na placa (cada sequência é fixada mais do que uma vez).
Gene a gene foi construído um array.
Tanto os genes control como o experimental contêm o mesmo genoma, no entanto o gene
control apenas expressa o que a célula expressa normalmente para sobreviver, aqui a
quantidade de mRNA é muito pequena, enquanto que o gene experimental, expressa tudo o
que é expresso mais o que se expressa por stress por crómio.
Nos eucariotas, os genes control tem uma expressão básica, enquanto que os genes
experimental são modificados por nós.
Stress por crómio: O cromato é muito tóxico para o DNA, forma aductos. Entram algumas
enzimas de reparação do DNA para separar as bases.
Polimorfismo:
Refere-se à variação na sequência de DNA entre os indivíduos de uma espécie. Se a variação da
sequência ocorrer nos locais de restrição pode resultar um polimorfismo de comprimento de
fragmentos (RFLP).
O exemplo mais conhecido é o RFLP devido à mutação do gene da b-globina.
Complexidade de genomas
É uma área relacionada com biologia molecular, estando mais relacionada com os
evolucionistas.
Genoma
Cos genoma Pan genoma
a maior parte é igual é adquirido e pode ser diferente em

todos os organismos
torna algumas estirpes patogénicas
Genoma:
É o conjunto de genes que compõe um dado indivíduo. É idêntico em todas as células de um
indivíduo.
Pode ser formado por:

DNA: A maior parte dos organismos.
RNA: Vírus.
Cada gene é constituído por intrões e exões, no entanto, só os exões são codificantes. Há
intrões, porque no processo de rearranjo do mRNA é possível gerar diversidade, sendo
possível que a remoção dos intrões impossibilite a remoção de exões. Assim, o surgimento de
novos genes dá-se devido à duplicação, em que há recombinação cromossómica;
reorganização dos exões (genes modernos, pois o comum é a remoção dos intrões); e por
transferência horizontal que resulta da coexistência.
Duplicação génica:
É o principal gerador de novos genes. Geram homólogos dentro de um mesmo genoma, com o
tempo os homólogos assumem funções especializadas.
NOTA: O aumento de complexidade nos metazoários está associado a duplicação génica

acompanhada de novas funções.
Cada linfócito tem só parte do genoma, por isso não podemos usar estes para clonar.
Os nossos antepassados adquiriram certos genomas e estes foram estabilizados, fazendo agora
parte do nosso cos genoma.
Nos eucariotas:
Os organismos passaram de unicelulares para pluricelulares sendo que houve um ganho de
complexidade.
Elementos que compõem o genoma:

- Cromossomas
- Elementos Extra-cromossomais
- Plasmídeos;
- DNA de organelos (DNA mitocondrial, por exemplo);
- Pequenos cromossomas.
O genoma de procariotas e eucariotas inferiores é compacto, o que reflecte uma estratégia de

crescimento rápido, tendo pouca redundância. Estes organismos têm de ser muito eficientes,
porque são pequenos. Por outro lado, o genoma dos eucariotas superiores é redundante e
pouco compacto.
NOTA: As plantas são altamente redundantes, pois como servem de nicho ecológico a muitos
microrganismos de todos os grupos fez com que estes seres ganhassem muito material
genético por transferência horizontal, no entanto não o utilizam.
O tamanho do genoma em bactérias é proporcional ao número de genes:

1 Gene = 1 proteína (enzima)
Nos procariotas, conseguimos determinar a complexidade do genoma através da velocidade
de hibridização. A sua curva de reassociação é sigmoide.
Arqueias: Estão relacionados com nichos ecológicos

primitivos, têm um genoma muito pequeno, no entanto
o número de genes codificante é grande tendo em conta
o tamanho do genoma.
Dependendo do habitat, as bactérias podem ser bem
económicas no número de genes. Estas contêm uma estrutura simples e dependem de um
número definido de genes.
No genoma eucariota, a baixa compactação e o excesso de DNA não codificante resulta em
aparente paradoxo. O tamanho do genoma comparado à complexidade evolutiva das espécies
não resulta numa relação co-linear, ou seja, não há uma relação directa entre a complexidade
do organismo e o tamanho do genoma. Esta relação é conhecida como paradoxo de valor C.
O número de cromossomas não está

relacionado com a quantidade do material
genético.
Não há uma relação linear entre o DNA
codificante e o tamanho do genoma (este
tamanho aparece em picogramas).
Antes de haver conhecimento do nível de codificação e o tamanho pensava-se que quanto
maior o tamanho do genoma mais complexo era o organismo, no entanto, do ponto de vista
histórico isto não se verifica.
Existe um tamanho mínimo de genoma codificante para que o organismo possa pertencer a
um determinado filo.
Determinação de C0t1/2:
Renaturação:
Reacção de segunda ordem que depende da colisão de fitas complementares e pode ser
descrito pela equação de cinética de segunda ordem.
Onde C é a concentração de DNA em cadeia simples num tempo t, e K é a constante de

reassociação.
A velocidade de reassociação é uma característica do DNA.
C0t1/2 é directamente proporcional ao tamanho do genoma. Este indica o tamanho total em

pares de bases (pb) das sequências diferentes. O valor de C0t1/2 é lido como valor de C0t e
reflecte a complexidade daquele genoma. C0t 1/2 de um genoma é a complexidade deste.
Temos mais taxas de reassociação para genomas que têm mais sequências repetitivas.
C0  Concentração inicial de cadeias únicas no tempo t=0.

C  Concentração de cadeias únicas no tempo t=t.
C0t  É determinado pela capacidade de hibridização do genoma.
C0t1/2  Número de bases que se associam (que hibridizem) numa curva de hibridização.
Corresponde a metade da hibridização do genoma (num genoma linear). C0t1/2 =
CURIOSIDADE: C0t1/2 da E. coli é de 4.2 x106pb.
No caso dos eucariotas superiores temos uma curva com o seguinte aspecto:
Nos humanos, o genoma não é linear, sendo que existem 3 tipos diferentes de sequências que
fazem parte da estrutura do DNA eucariota, apresentando por isso a curva de reassociação 3
pontos de reassociação.
- Sequências curtas muito repetitivas: Têm taxas de reassociação muito rápidas. (rosa)
- Sequências intermédias (mediamente repetidas): Permitem processos evolutivos. (azul)
- Sequências pouco repetidas (verde)
No processo evolutivo, o número de sequências repetidas é diferente de organismo para

organismo.
Diversidade genética e elementos repetitivos diferenciam os eucariotas:

O paradoxo dos eucariotas superiores resolve-se considerando a existência de vários
componentes. À medida que evoluímos a quantidade de genes repetidos aumenta.
- Micoplasmas: Contêm o genoma mais pequeno

dos procariotas. Não têm parede celular.
- Certos organismos parasitas perdem parte do seu

genoma (até certo ponto) que não necessitam, ou
seja, tendem a diminuir a sua complexidade até ao
mínimo, isto é, até à sobrevivência do organismo.
- Anfíbios: O tamanho do genoma tem a ver com

facto de viverem em 2 ambientes diferentes, tendo
uma relação muito próxima com a película microbiana, em que esta última transfere material
genético para os anfíbios.
NOTA: Nos eucariotas, o tamanho do genoma não é proporcional à quantidade de material

genético codificante, ao contrário dos procariotas.
A componente repetitiva do genoma pode ser dividida em duas:

- Componente de média repetibilidade:
- Alguns genes repetitivos (rRNA):
Os genes de rRNA são mediamente repetidos no genoma. Sem ribossomas não há tradução,
por isso o número de genes destas estruturas vai ser muito repetido.
- Elementos móveis, transponíveis, retro-transponíveis, ERVs, etc.
- Componente de alta repetibilidade:

- Satélites e micro-satélites.
Principais elementos móveis:
Tipo Características Exemplos
Transposição mediada por DNA
Repartições invertidas de 50 pb.

IS bacterianas IS1, IS10
Codificam transposase.
Gene de resistência a antibiótico
Transposões bacterianos Tn9, Tn10
flanqueado por ISs.
Repetições invertidas com genes
Transposões eucarióticos Elementos P, elementos Ac
internos (com intrões).
Transposição mediada por RNA

Repetições directas de 250-600 pb.
Retrotransposões virais Genoma de retrovírus com genes de Cópia em Drosofila
capsídeo e transcriptase reversa.
De tamanho variável, possuem uma
LINE e SINE elementos em
região rica em A/T na extremidade 3’.
Retrotransposões não virais mamíferos.
Alguns codificam uma transcriptase
Elementos Alu em humanos.
reversa.
 Os próprios elementos repetem-se nos genomas.

 Sequências invertidas e repetidas em cada uma das pontas permite a inserção do DNA.
Sequência de inserção:
É uma estrutura base para todas as outras, é mais pequena. Torna o DNA cinético.
Retrovírus: Em células eucariotas, estes entram na sequência de DNA, fazem uma cópia sobre
si próprio, usam uma enzima que copia RNA em DNA. Muitos destes não saíram do genoma e
foram estabilizados, sendo que agora temos muitas sequências de retrovírus no nosso
genoma.
Retrotransposões virais: Foram introduzidos no DNA e estabilizados no genoma. Eliminaram

alguns genes que deram origem a modificações evolutivas.
Retrotransposões não virais: São grandes ou pequenos e do ponto de vista evolutivo são
muito discutidos. Aparecem muito em mamíferos.
Retro-elementos modelam o genoma:

O genoma humano contém um importante número de retrovírus endógenos (HERVs), que são
sequências derivadas a partir de infecções retrovirais que passam a estar permanentemente
inseridas no DNA, e sequências semelhantes podem ser observadas em praticamente todos os
organismos eucarióticos. Muitos desses HERVs são transcritos e traduzidos em condições
fisiológicas normais, chegando a formar partículas virais completas, e participam em tais
processos complexos como placentação.
Elementos transponíveis e sua propagação:
O transposão pode passar de um gene do genoma para outro, no entanto pode ou não deixar
cópia.
O transposão retrovírus tem as sequências invertidas em cada uma das pontas e no seu
interior tem uma série de genes que codificam para o retrovírus. Tem uma transposase
reversa.
O DNA humano é muito repetitivo:
Grande parte do genoma humano não é

codificante para proteínas, sendo que apenas 1%
é que codifica para proteínas.
Componente altamente repetitivo do DNA:

O DNA repetido e satélite vão estar no meio do genoma (importante na replicação do
cromossoma), estes são elementos de extrema
variabilidade, associados muitas vezes com a
arquitectura cromossomal. Por ser muito
repetido, este tipo de elemento “confunde” a
maquinaria de replicação.
O DNA satélite é muito modificado por erros de
replicação, havendo diferença na sequência de
indivíduo para indivíduo, sendo que estamos
presente o polimorfismo. O PCR permite avaliar
quantas repetições existem num cromossoma.
As sequências satélite fazem parte da estrutura central do cromossoma antes da replicação,
têm função estrutural.
Estes elementos são variáveis mesmo entre indivíduos de uma mesma espécie, sendo muito
utilizado em testes de individualização, como o teste de paternidade e criminalística.
Além da questão da compactação, o número de

genes varia muito entre espécies. O número de
genes codificantes de proteínas é muito variável
em eucariotas.
Os genes codificantes podem ser divididos em categorias funcionais:

Genoma da Drosophila:
Os genes podem ser comuns

ou específicos da espécie.
Partilhamos cerca de 20% dos
nossos genes codificantes com
as leveduras.
O genoma está sempre em evolução:

Os genes aparecem e desaparecem. Estes são estabilizados no genoma, sendo a maior parte
deles não codificantes, contudo são essenciais ao genoma.
Ganhamos genes em termos verticais (de pai para filho) ou em termos horizontais quando
somos infectados. Podemos perder, duplicar genes, porque os transposões podem se copiar,
podemos ainda sofrer mutações e recombinações.
Globulinas e o transporte de oxigénio: É um exemplo de um processo evolutivo. As globulinas

α e β têm origem no mesmo ancestral comum e têm diferentes funções. No nosso genoma,
estas são codificadas por pseudo genes, como os anticorpos. Cada proteína é codificada por
uma soma destes.
Transferência de informação:
Código genético:
DNA: Código em tripleto.
mRNA: Codão (complementar ao código em tripleto do DNA).
tRNA: Anticodão (complementar ao codão, é igual ao DNA).
Estrutura de leitura aberta (open reading frame): A sequência não é sobreponível e é contínua,
o que significa que tem um ponto inicial de modo a sabermos o local inicial de leitura, se não
teríamos uma sequência de leitura diferente (os desvios de leitura dão origem a diferentes
leituras).
Características do código genético:

- É contínuo, não tem vírgulas (os vírus são os únicos que não seguem esta regra).
- Não é sobreponível, sendo que pode ocorrer modificação com a introdução ou remoção de
nucleótidos, pois estas introduções e remoções geram novos codões (excepto no código
genético do Sarcoma de Roux).
- É universal (a um determinado codão corresponde o mesmo aminoácido na maioria dos

organismos).
- Não é ambíguo, isto é, nenhum codão especifica mais de um aminoácido.
- É degenerado, ou seja, um aminoácido pode ser codificado por mais do que um codão.
Existem entre 1 e 6 codões (sinónimos) que codificam para o mesmo aminoácido, sendo que
alguns genomas têm preferência para um dos diferentes codões sinónimos.
- Na codificação, a terceira base é a menos rígida.
- Utiliza codões específicos de iniciação (AUG – codifica a metionina) e de terminação da
transcrição (UAG, UAA, UGA), estes codões, geralmente são universais.
- Contém 61 codões com sentido.
NOTA: Essas diferenças no código genético são sobretudo ao nível da 3ª base, sendo que esta
pode ser variável. Se o último nucleótido não emparelhar mantemos informação.
As mitocôndrias dos diferentes organismos usam um código genético muito diferente de
organismo para organismo.
CURIOSIDADE: O tripanossoma modifica o mRNA introduzindo uma base, provando desta forma
a malária.
Quadro de leitura constituído por

tripletos que representam
aminoácidos que dão origem a
uma proteína.
Como se descobriu o código genético?

Ao propor o modelo da dupla hélice, Crick propôs também como o DNA seria lido e como a
informação era transferida no modelo.
Assim, Crick propôs que:

- Os tripletos eram matematicamente consistentes com os 20 aminoácidos existentes.
- Não haveria sobreposição.
- Não haveriam espaços entre os codões, isto é, não haveria intervalos de informação, sendo
que todo o DNA codificava alguma coisa (DNA era todo codificante).
- Haveria uma molécula adaptadora que fazia uma adaptação para passar a informação em
proteínas.
- Se houvesse uma substituição de um nucleótido no sistema, não haveria mudança na
sequência de proteínas.
Homopolímeros de mRNAs sintéticos:

Em 1957 descobriu-se a polinucleotídeo fosforilase que é uma enzima que catalisa, in vitro, a
síntese de RNA sem a necessidade da presença de DNA ou RNA como molde, podendo,
inclusive, sintetizar RNA com apenas um tipo de nucleotídeo, tais como poli-U (homopolímero
formado apenas por uracilo) e poli-A (homopolímero constituído apenas por adenina).
Estrutura secundária dos t-RNAs:

O t-RNA é uma molécula responsável pela transferência de informação de DNA para RNA.
É uma cadeia única (ao contrário do DNA). Tem 4 zonas que
são complementares, criando 4 alças. O t-RNA tem um
terminal 5’ e um 3’ comum a todos os t-RNAs.
Na estrutura existe nucleotídeos que estão sempre na mesma
posição, isto é, são conservados para terem sempre a mesma
função.
O anticodão é complementar onde o t-RNA se liga.
A estrutura bidimensional em folha não mostra muito bem a
forma tridimensional.
t-RNA oscilante:
Em 1966, Francis Crick propôs a hipótese do Wobble que representa a diferença entre o
número de codões possíveis e o número de t-RNA.
Ele postulou que o 5' no anticodão que se liga ao 3' do RNA, na 3ª base, não era tão
espacialmente confinado como as outras duas bases, e poderia, portanto, não haver padrão de
emparelhamento de bases.
Experiência do tripleto de ligação:
As enzimas (aminoacil sintetases) são responsáveis pela associação de aminoácidos ao

anticodão, estas permitem a reciclagem.
Inosina:
Embora a adenina seja raramente encontrada na posição de oscilação do
anticodão, alguns t-RNAs em plantas e animais contêm inosina (I). Esta é
um produto desaminado de adenina. Tem capacidade de formar ligações
com várias bases, não sendo específica para uma base.
Um t-RNA com inosina na posição de oscilação pode reconhecer os
codões correspondentes de mRNA com A, C, U na terceira posição
(wobble).
Adição de aa radioactivos em ratos
Passado horas ou dias Passado minutos
fracção contendo pequenas partículas não

todas as subestruturas estão radioactivas proteicas
ribossomas
Transcrição
Consiste na síntese de RNA e é realizada por um complexo enzimático cuja enzima chave é a
RNA polimerase. Esta enzima é composta por várias subunidades e realiza a polimerização do
RNA a partir de um molde de DNA.
O processo de transcrição é dependente de factores de transcrição e da RNA polimerase.
Dogma central da biologia:
DNA RNA Proteína
Os RNAs da célula:
- RNA mensageiro (mRNA):
É altamente funcional. Transporta a informação genética, transcrita a partir do DNA, sob
a forma de uma série de três sequências de nucleótidos,
designado por codões, cada um dos quais especifica um
aminoácido particular.
Tem poucas estruturas tridimensionais. É de cadeia única,
por isso é facilmente degradado, necessitando de ser protegido.
É o responsável pela transferência de informação entre o
DNA e o RNA. Nos procariotas essa transferência é feita num
único compartimento, enquanto nos eucariotas são necessários 2
compartimentos.
É sintetizado no núcleo, onde as proteínas são sintetizadas.
- RNA de transferência (t-RNA):

É a chave para decifrar os codões no mRNA, isto é, o t-RNA lê o mRNA que já não
contém intrões, por isso o DNA é linear.
Cada tipo de aminoácido tem o seu próprio subconjunto de t-RNAs que se ligam a
aminoácidos e transportam-os para o fim, levando ao crescimento de uma cadeia
polipeptídica, se o codão seguinte no mRNA pede.
O t-RNA correcto ligado ao aminoácido é selecionado em cada passo, porque cada
molécula de t-RNA contém uma sequência de três nucleótidos, um anticodão, que pode
emparelhar com as bases do seu codão complementar no mRNA.
É o adaptador que liga o mundo dos ácidos nucleicos ao mundo das proteínas.
Apresenta uma dupla função, ou seja, seleciona e transporta o aminoácido apropriado e
reconhece o codão correspondente ao mRNA. O aminoácido é adicionado no terminal 3’.
- RNA ribossomómico (rRNA):

Associa-se a um conjunto de proteínas, de modo a formar ribossomas. Estas estruturas
complexas, que fisicamente se movem ao longo de uma molécula de mRNA, catalisam a
montagem dos aminoácidos nas cadeias
polipeptídicas.
Também se ligam a t-RNAs e a várias proteínas
acessórias necessárias para a síntese de proteínas.
Os ribossomas são compostos por uma
subunidade maior e outra menor, em que cada uma
das quais contém a sua própria molécula de rRNA ou
moléculas.
O DNA é transcrito para fazer uma cópia em RNA de um gene:

O mRNA é uma molécula de cadeia única (idêntica à cadeia codificante positiva do DNA). A
cadeia molde do DNA é copiada pela adição directa de nucleótidos. O mRNA é processado para
dar origem a um mRNA maduro, sendo este, posteriormente traduzido em proteína.
RNA polimerase:
Esta enzima catalisa a síntese de mRNA, sendo que este é sempre sintetizado no sentido 5’ 3’,
ou seja tem a capacidade de ler DNA e escrever RNA.
Precisa de uma zona no DNA que a posicione, de modo a saber onde se inicia o processo de
transcrição (promotor) e não de um primer, sendo que consegue imediatamente iniciar o
processo de transcrição.
Não tem actividade proofreading.
São estruturalmente diferentes nos eucariotas e procariotas (nos factores de transcrição).
A RNA polimerase tem de incluir no seu centro activo o DNA, de modo a permitir a abertura do
DNA para assim o transcrever.
A RNA polimerase uma vez posicionada o sistema pode ser activado ou suprimido.
NOTA: A transcrição e a replicação implicam a abertura e o fecho contínuo do DNA. São

processos dinâmicos que implicam várias enzimas que desenrolam e enrolam o DNA, este mal
seja transcrito volta à sua estrutura superenrolada.
RNA polimerase bacteriana é inibida por rifamicina:

Rifamicina é um antibiótico, e só funciona se o processo de transcrição for diferente em
procariotas e eucariotas, permitindo estudar o processo de transcrição.
Promotores:
São sequências específicas de DNA importantes para o início da transcrição. Tais sequências
são reconhecidas por algumas proteínas específicas, chamadas de factores de transcrição, que
trazem a RNA polimerase para realizar a montagem dos RNAs. Assim sendo, essas sequências
determinam:
- A direcção da síntese (cadeia codificante vs cadeia molde).
- O local de iniciação, ou seja, o primeiro nucleótido da nova cadeia de mRNA.
- A frequência de transcrição (iniciação pela RNA polimerase).
A sequência do promotor está apenas numa das cadeias do DNA.
Podemos ter promotores regulados quando estes estão acoplados a proteínas, em que aí
temos de modular essas proteínas.
O processo de iniciação e reconhecimento do promotor é comum aos eucariotas e aos
procariotas, isto é, quer sejam procariotas ou eucariotas possuem zonas de reconhecimento
da RNA polimerase. Este reconhecimento leva à abertura da dupla cadeia do DNA e ao
reconhecimento da RNA polimerase.
Sequências consenso:
A base 1 do promotor tem valor +1.
Constituídas +/- por 6
nucleótidos (promotor) -35 e -10 tem a ver com o número de
nucleótidos a que estão distanciados
do +1.
Um promotor é tanto mais forte quanto mais se assemelhar às sequências consenso, no
entanto este tipo de promotor mesmo sem indução, a RNA polimerase vai se ligar devido à
imensa afinidade que existe entre ela e o promotor, e isso constitui uma desvantagem, uma
vez que vamos estar a produzir proteínas de um modo descontrolado.
RecA é uma proteína de reparação do DNA, são promotores fortes.
Promotores procarióticos:
Obrigam a RNA polimerase a posicionar-se e determinam o número de genes.
As regiões -35 e -10 estão presentes na maior parte dos promotores de procariotas.
As sequências de poli-adeninas são fáceis de abrir, facilitando a abertura da dupla cadeia do
DNA. As adeninas (A) e timinas (T) aparecem muitas vezes nas sequências de promotores.
As sequências promotoras variam de gene para gene, sendo que nem sempre estão nas
posições -35 e -10
Exemplos: -35 box e o TATA box
Promotores de genes transcritos pela RNA polimerase II:

Os complexos de transcrição podem ser diferentes em diferentes organismos, ter diferentes
organizações, mas a estratégia é a mesma.
Enhancers dos promotores:

Os enhancers ou acentuadores são sequências de DNA que aumentam a afinidade da
maquinaria de transcrição por um certo promotor.
Essas sequências podem estar localizadas acima (upstream), abaixo (downstream) ou dentro
do gene a ser transcrito, e podem também estar distantes muitos milhares de pares de base
deste, e em qualquer uma das cadeias.
O gene pode ser mais extenso do que a proteína que

codifica:
Os genes contêm vários tipos de informação que não é
transformada em proteínas, pois existem zonas no DNA
que não vão ser transcritas.
Cadeia codificante vs cadeia molde do DNA:

Uma cadeia do DNA é codificante, enquanto outra não. Os genes podem estar numa ou noutra
cadeia. A escolha da cadeia molde depende da localização e orientação do promotor. Numa
dupla cadeia, uma cadeia codifica e a outra transcreve.
Quem é transcrito é a cadeia complementar da codificante (sentido 5’3’).
Numa mesma fita, nos eucariotas, pode existir genes em posições opostas, enquanto nos
procariotas estes estão todos segundo uma mesma orientação. Legalmente, nos procariotas
não existe “tandem repeats” (existe apenas em alguns).
CURIOSIDADE: A E. coli I157 vive connosco e come carne, podendo levar à morte do indivíduo.
Esta estirpe tem um pan genoma muito grande.
Transcrição em procariotas vs eucariotas:
Em Procariotas:
O processo de transcrição é simultâneo ao de tradução,
estes estão muito bem acoplados no espaço.
Têm várias subunidades que são codificadas pelos genes
RPOD, em que estes codificam para a subunidade sigma (σ).
Esta subunidade é necessária para posicionar a RNA polimerase no promotor, mas tem de ser
removida para permitir o deslocamento da RNA polimerase ao longo da cadeia codificante, ou
seja, quando estamos no processo de transcrição não temos esta subunidade presente.
Factor sigma:
É um factor de transcrição, sendo que determina a transcrição do gene.
A subunidade sigma (σ) da RNA polimerase dos procariotas é fundamental para o
reconhecimento específico da região promotora, pois ancora a RNA polimerase ao promotor.
Ela, junto com o cerne da enzima, desliza ao longo do DNA à procura do promotor, não
precisando desenrolar a dupla hélice nem ligar-se e desligar-se a ela repetidamente.
Se soubermos geneticamente se o factor sigma é igual ou diferente podemos comparar zonas
de transcrição. Existem pequenas diferenças nas sequências do factor sigma, por isso estes
reagem de maneira diferente a estímulos ambientais.
Se mudarmos este factor o gene deixa de ser transcrito.
O factor sigma desliga e a RNA polimerase desliza sobre o DNA. O mRNA assim que é
produzido é localizado pelos ribossomas e começa a ser traduzido, no sentido 5’ 3’.
Em Eucariotas:
A transcrição nos eucariotas é bem mais complexa do que nos procariotas. A maioria do DNA
de uma célula eucariota está no núcleo, não passando através da membrana nuclear devido às
suas dimensões, por isso a transcrição ocorre no núcleo, o que irá permitir que a informação
contida no DNA passe para o citoplasma sob a forma de uma molécula de RNA de menores
dimensões, possibilitando a síntese proteica; enquanto a
tradução ocorre no citoplasma. A separação temporal e
espacial desses dois processos permite uma melhor regulação
da expressão génica.
O transcrito primário de mRNA é amplamente processado. O
RNA nascente sofre uma série de alterações:
- Aquisição de revestimento (cap) na sua extremidade 5’;
- Introdução de uma cauda de poli-A na extremidade 3’;
- Remoção exacta de intrões (splicing) para a formação de
mRNAs maduros com mensagens contínuas.
Assim, o processo de transcrição ocorre em três etapas:
- Iniciação: A polimerase ligada à região promotora inicia o processo de transcrição,
adicionando os primeiros 9 nucleotídeos da sequência de RNA. As sequências de nucleótidos
na cadeia de RNA é determinada pela complementaridade no emparelhamento das bases

entre os novos nucleótidos e a cadeia de DNA molde. Cada nucleótido acrescentado à cadeia
ribonucleotídica liga-se covalentemente ao último nucleótido da nova cadeia de RNA.
- Elongação: Após a produção de aproximadamente 9 nucleotídeos, a RNA polimerase passa a

se deslocar pela molécula de DNA, desenrolando a sua hélice e produzindo uma molécula de
RNA cada vez mais alongada. O DNA já transcrito volta a ser enrolado, quase que
imediatamente, recompondo a sua dupla-hélice. Durante essa fase, o RNA recém-sintetizado
emparelha-se temporariamente com a fita molde de DNA, formando um híbrido curto RNA-
DNA. O grupo hidroxilo 3’ do RNA
desta hélice ataca o fosfato de um
ribonucleosídeo trifosfato, libertando
pirofosfato. Em cada nucleotídeo
adicionado, o híbrido RNA-DNA gira,
fazendo com que a ponta 3’-OH do
RNA fique no centro catalítico da RNA
polimerase. É importante notar que o
pequeno comprimento do híbrido
também tem razão de ser. Como o
filamento de RNA fica bem inclinado
para fora do molde de DNA antes de
completar uma volta inteira, evita-se o
entrelaçamento da ponta 5’ do RNA ao
DNA. A fita de RNA produzida é
simples e livre.
- Terminação: Quando a RNA polimerase encontra a sequência de terminação, o RNA pára de

ser transcrito. A partir desse momento, nenhuma outra base nitrogenada é incorporada ao
RNA. Neste momento, a bolha de transcrição desprende-se, libertando uma molécula de RNA
e imediatamente a molécula de DNA se enrola completamente. O processo de terminus
depende de diferentes enzimas e do codão de terminação. Nos eucariotas envolve a
poliadenilação e o corte da cadeia.
NOTA: A diferença no início da transcrição em procariotas e eucariotas é nos processos de

regulação de transcrição. Esses processos de regulação são muito diferentes, porque são mais
dispersos no genoma nos procariotas.
Alongamento da transcrição e terminação:

Terminação da transcrição por formação de grampo é um mecanismo pouco conhecido, em
que temos pares de nucleotídeos A-T precedido por uma sequência de DNA duplamente
simétrica (terminação intrínseca).
Remover/libertar a RNA polimerase pode ser feito por formação de uma estrutura
tridimensional no mRNA, ou através
de enzimas.
Há genes que terminam provocando
um grânulo, sendo que a RNA
polimerase é removida.
No final do gene há 2 sequências que se repetem e são complementares, dando origem a uma
estrutura tridimensional, pois vão tentar minorar energia com a formação da dupla.
Terminação da transcrição dependente da proteína Rho:

As terminações dependentes da proteína Rho (r-dependentes) não possuem adenilatos na
cadeia molde, mas possuem uma sequência curta que é transcrita formando um grampo. A
RNA polimerase ao passar por tal região faz uma pausa e, caso a proteína Rho esteja presente,
dissocia-se. A proteína Rho possui atividade RNA-DNA helicase dependente de ATP, o que
provavelmente rompe o híbrido.
Tanto na classe independente de r como na dependente os sinais activos para o fim da
transcrição estão no RNA recém-sintetizado e não no molde de DNA.
In vitro, os transcritos de RNA sintetizados pela RNA polimerase isolada são mais longos que os
produzidos in vivo. Este facto está associado à ausência da proteína Rho que, em diversas
experiências demonstrou ser um factor importante para a detecção de sinais adicionais do
término da transcrição. Tais sinais, não específicos, não são reconhecidos isoladamente pela
RNA polimerase.
A maquinaria da Transcrição:
Tipos de Polimerases Genes transcritos

RNA polimerase I Genes de rRNA 5.8S, 18S e 28S
RNA polimerase II Genes de mRNAses, alguns genes de snRNAs
RNA polimerase III Genes de tRNAs, rRNA 5S, alguns snRNA, outros RNAs pequenos
A RNA polimerase do tipo I transcreve genes que codifica RNA ribossómico.

A RNA polimerase do tipo III transcreve RNAs de interferência e ribossómico.
A RNA polimerase interage com proteínas activadoras e repressoras que modulam a taxa de
expressão génica nas células.
Grande e complexa, a holoenzima RNA polimerase de E. coli possui 5 tipos de subunidades.
Subunidade Gene Número Massa (kb) Papel

Participa da iniciação, liga-se a
a rpoA 2 36,5
sequências reguladoras
Participa da iniciação e alongamento,
b rpoB 1 151
forma ligações fosfodiéster
b' rpoC 1 155 Liga-se a molde de DNA
Reconhece promotor, inicia síntese
s rpoD 1 70
(dissociando-se logo após)
w - 1 11 Desconhecido
Organização do gene em procariotas e eucariotas:

As sequências ao nível do gene e do mRNA são sequências informativas acerca do número de
aminoácidos.
Eucariotas: Têm estruturas em operão. No operão existem vários codões de iniciação e de

terminação, sendo que é possível codificar várias proteínas com o mesmo mRNA.
Dentro do próprio gene temos zonas codificantes e não codificantes (exões e intrões). O
tamanho das proteínas não tem a ver com as zonas não codificantes do DNA. O número de
intrões e exões não é proporcional ao tamanho do gene. A zona dos exões pode ser
modificada.
A regulação da transcrição pode ser feita muito longe da zona de posicionamento da RNA
polimerase.
Existem algumas sequências de DNA que não são transcritas em mRNA, estas são as que se
encontram antes do codão de iniciação, e por isso têm sinal negativo (-).
Este codão de iniciação é reconhecido por todas as polimerases.
Factores de activação:
Vão activar o processo de transcrição e encontram-se longe da zona de ligação da RNA
polimerase.
Factores de transcrição:
São factores que se posicionam na zona promotora, onde depois se ligam à RNA polimerase.
Nos eucariotas, estes encontram-se num elevado número e funcionam em cascata, isto é, o
encaixe de um factor de transcrição recruta outro, sendo que só assim haverá ligação da RNA
polimerase.
Nome Nº de subunidades Função
Estabiliza a ligação TBP/TFIIB
TFIIA 3
Chama a RNA polimerase
Liga-se ao TBP, reconhece o início e recruta a
TFIIB 1
Pol II
TFIID
Interage com factores reguladores
- TBP (TATA box 12
Reconhece TATA box
protein)
TFIIE 2 Recruta TFIIH
TFIIF 2 Liga-se à Pol II e TFIIB
TFIIH 9 Helicase/cinase CTD
TATA box protein:

A TATA box sinaliza o início da transcrição.
O processo começa com a ligação de TFIID ao TATA box ou sequência
TATA (sequência de DNA dupla hélice composta por T e A).
A subunidade de TFIID que reconhece a sequência TATA no promotor
é denominada TBP, sendo que é esta subunidade que vai ligar a TFIIA,
em que esta por sua vez vai ligar a TFIIB e esta liga TFIIF e só aqui é
que a RNA polimerase se vai ligar, e posteriormente liga-se a TFIIE,
recrutando esta a TFIIH. A ligação de TFIID provoca uma grande
distorção no DNA da TATA box.
Outras sequências promotoras:

A sequência TATA box não é a única que sinaliza o início da transcrição, contudo é a mais
importante e ubíqua.
Elemento Sequência consenso Factor geral da transcrição

BRE G/CG/CG/ACGCC TFIIB
TATA TATAA/TAA/T TBP
INR C/TC/TANT/AC/TC/T TFIID

DPE A/GGA/TCGTG TFIID
Processamento do mRNA eucariota para mRNA maturo (Maturação):

O mRNA é processado nos eucariotas, sendo que
neste processo vai ocorrer a remoção dos intrões; ao
terminal 5’ vai ser adicionado um cap; e o terminal 3’
vai sofrer uma clivagem onde vai ser adicionado uma
cauda de poli-adeninas.
Processamento alternativo:
É um exemplo de um processo que não ocorre em todos os mRNAs. É o processo de splicing
onde os intrões são removidos e os exões são unidos por uma ordem diferente, isto é, a ordem
dos exões no DNA é diferente da ordem dos exões no mRNA. Este é um processo
evolutivamente alternativo, sendo que não ocorre ao acaso.
Complexo de iniciação da transcrição:

A regulação da transcrição não
é feita em cima do promotor,
mas sim através de moléculas
reguladoras, isto no caso de
estarmos presente eucariotas.
Essas moléculas reguladoras
regulam os factores de
activação, RNA polimerase.
Nos procariotas, essa regulação é feita em cima do promotor.
 Activadores:
São proteínas que se ligam a genes em locais conhecidos como potenciadores. Ajudam a
determinar quais os genes que se irão ligar, e aceleram a taxa de transcrição.
 Repressores:
São proteínas que se ligam a conjuntos selecionados de genes em locais conhecidos como
silenciadores. Interferem com o funcionamento dos activadores, retardando, assim, a
transcrição.
 Co-activadores:
São moléculas “adaptadoras” que integram sinais activadores e talvez repressores e repassam
os resultados aos factores basais.
 Fatores de transcrição basal

Em resposta a acções inibitórias de activadores, estes factores posicionam a RNA polimerase
no início da região de codificação da proteína de um gene e enviam a enzima no seu caminho.
Processo de edição do mRNA Capping:

É um processo de protecção de mRNA em eucariotas.
A modificação do terminal 5’ cap ocorre após transcrição dos
primeiros 20-30 nucleótidos.
Cap 5' é uma estrutura típica de mRNA eucariótico, a qual é gerada
pela ligação entre a extremidade 5' de uma molécula de mRNA
precursora e um nucleotídeo alterado, metilguanosina fosfato,
(GMP metilado).
7-metilguanosina é uma base modificada (foi metilada). Assim, o
capping é a introdução da base modificada no 3º fosfato da 1ª base,
protegendo o DNA da degradação.
O Cap 5’ permite a regulação da exportação nuclear, a prevenção da
degradação por exonucleases, a promoção da tradução e a
promoção da excisão do intrão na posição proximal 5’.
Este processo permite o alinhamento do mRNA com o ribossoma
durante a tradução, e distinguir o mRNA de outros RNAs das células.
Temos uma sequência rica em adeninas que identifica a zona do corte do mRNA, esta
sequência é reconhecida por uma série de enzimas.
Existe um complexo de poliadenilação que vai
reconhecer as sequências e cortar o mRNA.
Função da Cap 3’:

A introdução da cauda de poli-adeninas protege a
molécula de mRNA da degradação enzimática no citoplasma. Auxilia na terminação da

transcrição, passa o mRNA do núcleo para o citoplasma, e é importante na tradução.
Poliadenilação e factores de poliadenilação:

Em humanos, são colocadas 200-300 pb de adeninas na extremidade 3’. Esta introdução
(protecção) ocorre antes da libertação da RNA polimerase.
A clivagem é catalisada pela enzima CPS (factor específico de clivagem e poliadenilação) e
ocorre entre 10-30 nucleótidos a jusante
do seu local de ligação. Neste local,
frequentemente, encontramos a
sequência AAUAAA (de RNA) que vai ser
reconhecida pela endonuclease.
Quando o RNA é clivado a poliadenilação
começa, sendo catalizada pela PAP
(poliadenilato polimerase).
NOTA: As 2 sequências que contêm adeninas e guaninas são reconhecidas pela enzima
poliadenilase, esta precisa de clivar o mRNA. O pequeno fragmento que é clivado é deitado
fora.
Splicing:
É a modificação do mRNA após a transcrição, em que os intrões são removidos e os exões são
mantidos.
Cis-splicing (dentro do mesmo mRNA):

- Splicing nuclear do pré-mRNA;
- Splicing de intrões do grupo I;
- Splicing de intrões do grupo II.
Trans-Splicing (entre 2 mRNAs diferentes):

- mRNAs de tripanossomatídeos;
- Alguns mRNAs de nematodos.
 Splicing nuclear do pré-mRNA:
Principais requerimentos para o splicing nuclear do pré-mRNA:

- Sequência conservada nas junções exão-intrão (regra GT-AG):
Temos um terminal 3’ (GT) e um 5’ (AG), sendo que são estes terminais que nos vão dizer que
estamos perante um intrão.
- Sequência de ramificação no intrão (“branch-site”):

Existe uma adenina chamada de ponto de ramificação situada entre 20 e 50 nucleotídeos
antes do ponto de corte 3’.
- Factores proteicos e ribonucleproteícos (snRNP’s):

Ribonucleoproteínas: São proteínas ligadas à molécula de RNA do tipo snRNA (pequeno RNA
nuclear).
- Spliceosoma:
É uma estrutura com actividade catalítica responsável pela execução do splicing, e pela
remoção dos intrões. É formado por ribonucleoproteínas.
Reação de Splicing:
É uma reacção de trans esterificação que não
necessita de água nem de energia, e vai
ocorrer através de duas reações sequenciais.
Primeiro, o grupo 2'OH do “branch-point”
específico de nucleótidos dentro do intrão que
é definido durante a montagem spliceossoma
realiza um ataque nucleofílico no primeiro
nucleótido do intrão na extremidade 5’ do
local de junção, formando um laço intermediário com libertação de um OH. Em segundo lugar,
o 3'OH libertado executa um ataque nucleofílico no último nucleótido do intrão no local 3' de
união unindo, assim, os exões e libertando o laço de intrão.
Sequências consenso nas vizinhanças exão-intrão:
Os ribonucleótidos são estruturas de

RNA linear, estas têm de se ligar ao
mRNA, por isso dentro da sua
estrutura contêm uma sequência que
reconhece as sequências
complementares de mRNA.
Mecanismo de splicing no pré-mRNA:
A montagem do spliceossoma ocorre em várias etapas.

Os ribonucleótidos entram numa ordem e saem na ordem inversa.
A remoção dos intrões é um processo enzimático complexo, e não
garante que o exão 1 seja ligado ao exão 2, sendo que pode gerar
modificação, sendo que o rearranjo dos exões é determinado pela
remoção dos intrões.
Rearranjo dos exões
Directo Alternativo
Pode gerar mais do que uma forma de

mRNA maduro
Resumo da função do spliceossoma e rearranjo de mRNA:

O rearranjo nos diferentes componentes do spliceossoma tem como principal função a
formação do local catalítico activo.
Uma das características mais importantes do spliceossoma é o facto de ser o RNA quem
executa as funções catalíticas (e não as proteínas): snRNA actuam como ribozimas.
A coordenação da transcrição com o mecanismo de splicing é importante para não ocorrerem

erros (importância das outras proteínas), factores de splicing que não snRNP e cuja função é
auxiliar à formação do spliceossoma (recrutamento de snRNP) e identificar os locais correctos
de splicing na sequência de pré-mRNA.
NOTA: Na clivagem das proteínas temos de nos basear no RNA e não nos genes.
Transporte selectivo de mRNAs:

Os factores de protecção protegem o mRNA durante o seu transporte. Estes são também
factores de iniciação do processo de tradução.
As proteínas nucleares não passam
para o citoplasma. Estes factores
protegem no processo de
ciclização do mRNA.
Tradução
O RNA após ser traduzido tem de ser eliminado para não haver formação errónea de
proteínas.
O mRNA é produzido no núcleo e durante a sua produção o terminal 5’ (CAP) é protegido. No
final do processo de transcrição existe também a necessidade de protecção dos terminais, de
modo a que o mRNA (com a informação transcrita) possa passar do núcleo para o citoplasma,
a fim de termos a informação para codificar proteínas.
O mRNA eucariota precisa de ser processado. Este processo exige a translocação do
ribossoma.
Para que o processo de tradução ocorra é necessário:

- Factor de iniciação;
- t-RNA no início (que transporta a metionina modificada);
- Subunidade mais pequena do ribossoma;
- Sequência de reconhecimento entre o t-RNA e a subunidade.
Ribossomas:
São estruturas muito abundantes no nosso organismo (10 milhões de ribossomas por célula
(80% de RNA total)). Tem entre 25 e 30 nm de tamanho.
Têm 2 subunidades independentes, mas funcionalmente aderentes (80S), sendo que a

pequena subunidade (40S) é rRNA 18S + 30 proteínas diferentes, enquanto a grande (60S) é
rRNA 28S + molécula rRNA 5.8S + rRNA 5S + 50 proteínas diferentes.
Pode ou não estar no citoplasma. Quando não se encontram no processo de tradução estes
estão desacoplados.
São aderentes às cisternas do retículo endoplasmático rugoso. São constituídos por 2/3 de
RNA e 1/3 de proteína, sendo que a parte proteica está envolvida em processos catalíticos.
A subunidade mais pequena é a que reconhece o mRNA.
Nos procariotas, os ribossomas estão todos espalhados pelo citoplasma.
Existem diferentes locais de ligação do RNA ao ribossoma:

Local P (peptidil-t-RNA): Recebe a molécula de t-RNA que se liga à extremidade da cadeia
polipeptídica em crescimento e localiza-se entre o local A e E. Lê o codão de iniciação, sendo
dependente de factores de iniciação. Estes factores de iniciação vão ser libertados após o
posicionamento do mRNA.
Local A (aminoacil-t-RNA): Recebe a molécula de t-RNA que

contém o aminoácido correspondente ao codão do mRNA, há a
exposição do codão e reconhecimento do anticodão.
Local E (Exit): Local de saída da proteína nascente.
Transpeptidação: É o movimento dos peptídeos. Quando ocorre a adição do peptídeo

nascente ao novo aminoácido, isto é, PA.
Translocação: É o movimento da subunidade menor do ribossoma, havendo, desta forma a

leitura do mRNA. Passa o peptídeo do local A para o local P.
Tanto a transpeptidação como a translocação são processos citoplásticos para os procariotas e

eucariotas.
Processo de síntese de proteínas:

A síntese de proteínas ocorre em 5 etapas:
1. Activação do aminoácido, havendo formação do aminoacil-t-RNA.
2. Iniciação: Ligação da subunidade pequena e da etionina-acil t-RNA no sítio AUG.
3. Elongação: O polipeptídeo nascente é elongado pela ligação de novos aminoácidos (este é o
verdadeiro processo de tradução).
4. Terminação: A paragem na síntese dá-se pelo encontro de um codão de terminação e o

polipeptídeo desliga-se (no codão de terminação é inserido um factor stop que faz com que o
aminoácido se desligue).
5. Enovelamento e processamento pós-transcricional do polipeptídeo.
A iniciação e a elongação são dependentes de GTP.
Como os AUG de iniciação são diferentes daqueles no meio da sequência?

Nos procariotas: As metioninas codificadas no meio da sequência são diferentes das
metioninas codificadas pelo codão inicial (AUG), estas últimas são designadas por formil-
metionina.
Têm a sequência Shine-Dalgarno: AGGAGGU. Estas sequências estão antes da zona de início,
posicionando o mRNA ao nível do ribossoma.
Nos eucariotas: As metioninas são todas iguais.

Têm as sequências de Kozac: AUGG. Aqui o AUG é altamente conservado.
A partir do momento em que há reconhecimento da sequência de Kozac e posicionamento da
subunidade ribossómica (dependente de GTP) pode ocorrer a deslocação do ribossoma ao
longo do mRNA.
Início da tradução em eucariotas:

Inserção: Quando um ribossoma se dissocia no término da tradução, as subunidades 40S e 60S
associam-se a factores de iniciação eIF3 e eIF6, formando complexos que podem iniciar uma
nova tradução.
O primeiro passo é o de adição sequencial dos componentes
indicados para o complexo formado pela subunidade 40S e
eIF3, formando o complexo de iniciação.
A seguir ocorre a digitalização do mRNA pelo complexo de
iniciação associado, o que conduz ao posicionamento da
subunidade pequena e liga Met-t-RNAi Met no codão de
iniciação.
No passo seguinte ocorre a associação da subunidade grande
(60S), formando um ribossoma 80S pronto para traduzir o
mRNA.
Dois factores de iniciação, eIF2 (passo 1) e eIF5 (passo 4) são proteínas de ligação ao GTP, cujo
GTP é hidrolisado durante a iniciação da tradução.
Os factores das células podem regular a síntese de proteínas por

fosforilação de um resíduo de serina na eIF2 ligados ao PIB, o complexo
fosforilado é incapaz de trocar GDP por GTP e não pode ligar Met-t-RNAi
Met, inibindo assim a síntese de proteínas.
Como o aminoácido correcto é ligado ao t-RNA?

t-RNA-amino-acil sintetases fazem todo o processo de controlo (esse
controlo não existe depois da tradução). Há uma amino-acil sintetase
para um grupo de aminoácidos e outra para outro grupo de aminoácidos, sendo,
cataliticamente 2 classes. O processo de activação é semelhante em eucariotas e procariotas.
Ligam o t-RNA e o aminoácido. Reconhecem o anticodão e carregam o aminoácido correcto.
Aminoácidos activados:
Activação do triptofano: O local de reconhecimento do aminoácido é feito por tamanho, pois
espacialmente os aminoácidos têm de ocupar o espaço e preencher o espaço catalítico.
A ligação fosfato-aminoácido é muito importante, porque temos de libertar 2 aminoácidos
para o polipeptídeo nascente. O que é reconhecido no processo de tradução é o anticodão. A
ligação aminoácido-t-RNA é fulcral para que o processo se dê.
Temos o t-RNA à volta do ribossoma que vai ser chamado a entrar no local A. A activação faz
com que haja modificação no ribossoma e o primeiro aminoácido liga-
se ao factor de iniciação (dependente de GTP), fazendo com que haja
movimentação do ribossoma do local A para o
local E (empurra o sistema). O t-RNA amino-acil
fica no local P à espera de um novo anticodão. Há
movimentação do polipeptídeo nascente do local
P para o A.
Terminus da tradução em eucariotas:

Quando a movimentação do ribossoma numa cadeia de proteína nascente atinge um codão de
terminação (UAA, UGA, UAG), ocorre a libertação do factor eRF1 e este entra no complexo
ribossomal, provavelmente em conjunto ou próximo a um local com eRF3.
A hidrólise do GTP é acompanhada por clivagem da cadeia peptídica a partir do t-RNA no local
P, pela libertação dos t-RNAs e das duas subunidades ribossomais.
O factor de terminação vai energeticamente fazer com que haja desacoplamento do
ribossoma, libertação do peptídeo, e libertação do t-RNA.
NOTA: Um único mRNA pode ser traduzido por muitos ribossomas ao mesmo tempo:
Polissoma.
Prokarya X Eukarya:
Procariotas:
O processo de tradução pode ser iniciado ao mesmo tempo que a transcrição (policistrónico).
Existem pontos de início no mRNA. Depois da tradução temos um peptídeo, mas este pode
não ser funcional, ocorrendo modificações poliadicionais.
Eucariotas:
O mRNA é traduzido no sentido 5’3’, sendo que a sua
estabilização é feita por circularização do mRNA com a adição de
caudas de adeninas (poliadenilação).
Têm um RNA monocistrónico, havendo interação entre proteínas
que se ligam à cauda de poli-adeninas e proteínas do complexo de iniciação.
Ordem de ligação dos aminoácidos:

O peptídeo nasce sempre do terminal amínico (NH3) para o terminal carboxílico (COOH).
Controlo da tradução I:
Todas as polimerases têm processos de controlo de tradução. A RNA
polimerase não faz esse controlo, apenas as aminoacil sintetases o
fazem.
A afinidade da enzima aminoacil sintetase pelo t-RNA disposto no
código faz com que o t-RNA errado ligue-se lentamente e desligue-se
rapidamente.
Controlo de tradução II:

O aminoácido deve-se encaixar no sítio sintético da t-RNA-
aminoacil sintetase e não no sítio de edição.
Mecanismo de peneira dupla.
(Des) Controlo da tradução III:

Não acontece a verificação do aminoácido na
tradução. O controlo é, portanto, feito apenas no
momento da aminoacilação do t-RNA. Isso não é assim
tao importante, porque podemos rapidamente repor o
processo de tradução.
Alongamento da tradução:
Nota: O complexo de iniciação é colocado na subunidade menor do ribossoma, sendo que só

depois coloca-se a subunidade maior.
Tempo de execução do processo:

Nos eucariotas, o processo de transcrição é mais rápido do que o processo de tradução. O
tempo existente entre a transcrição e a tradução é maior nos eucariotas, uma vez que estes
processos ocorrem num tempo e espaço diferentes, enquanto nos procariotas este tempo é
quase inexistente, visto que os processos ocorrem simultaneamente.
Possíveis erros no processo:

Se houver um erro na tradução, a proteína será incorretamente traduzida. A estrutura
secundária das proteínas depende muito das sequências primárias, no entanto estas últimas
são vulgarmente modificadas.
Modificações pós-traducionais:
Estas modificações só ocorrem em eucariotas e são muito importantes, podem ou não ocorrer
imediatamente após a tradução.
Regulação da função proteica: (ocorre após a tradução)

- Formação de ligações dissulfeto/dobramento (sem ligações dissulfídicas temos 4
polipeptídeos em vez de um anticorpo funcional): É a ligação covalente entre 2 resíduos de
cisteína;
- Clivagem da cadeia;
- Fosforilação: Adiciona um fosfato à serina, treonina ou tirosina;
- Glicosilação: Atribui um açúcar, geralmente ao N-terminal ou ao átomo de oxigénio num
aminoácido da cadeia lateral;
- Metilação/Acetilação: Adição de um grupo acetil ao N-terminal da proteína, de modo a
aumentar a sua estabilidade;
- Adição de âncoras lipídicas.
- Lipidação: Atribui um lípido (ácido gordo) à cadeia de uma proteína;
- Ubiquitinação: Adição de ubiquitina a um resíduo de lisina de uma proteína alvo marcando-a
para destruição.
Modificações pós-translacionais:
A forma fosforilada é diferente da desfosforilada, sendo que pode ou não estar activa. É uma
forma de regular a actividade proteica.
Chaperonas I:
Complexo proteico que auxilia na montagem da estrutura tridimensional de uma proteína.
Estabilizam a proteína durante a sua formação e permitem o
seu folding correcto.
Há chaperonas que direcionam as proteínas para os diferentes
organelos. Estas estruturas reconhecem um sinal existente no
peptídeo nascente.
Chaperonina é a mais comum.
Proteína pronta:
As proteínas localizadas pós-traducionalmente são libertadas no citosol após a sua síntese, por
ribossomas livres.
Algumas possuem sinais de direcionamento para organelos, tais como para o núcleo ou
mitocôndrias.
As proteínas localizadas co-traducionalmente
associam-se à membrana do retículo
endoplasmático (RE) durante a síntese, de modo
a que os seus ribossomas sejam ligados à
membrana.
As proteínas passam para o interior do RE, ao
longo do complexo de Golgi e em seguida
através da membrana plasmática, a menos que
possuam sinais que determinem a sua retenção
numa das etapas desta via. O endereçamento
ocorre ao nível do RE.
Só depois da tradução total das proteínas é que
estas vão ser endereçadas para onde são
necessárias. A mitocôndria tem a sua própria função genética, enquanto os cloroplastos
necessitam de recrutar proteínas do genoma. Essas proteínas também podem ser direcionadas
para outros organelos, tais como os endossomas ou lisossomas.
Núcleo Citoplasma Peroxissoma
Mitocôndria
Cloroplastos
s
RE
Lisossoma Complexo de Vesícula

secretora
Golgi
Endossoma
Membrana Plasmática
Endereçamento de proteínas:
Endereçamento
membranar não membranar
são endereçadas para o RE onde acabem

a sua tradução
I: Co-traducional (vias de secreção):

- RE;
- Complexo de Golgi;
- Membrana plasmática;
- Meio extracelular;
- Núcleo;
- Mitocôndria;
- Cloroplasto;
- Lisossomas/peroxissomas.
É aqui que as proteínas membranares são traduzidas. O RE passa as proteínas para o complexo
de Golgi, sendo que esse processo de translocação provoca fosforilação, glicolisação.
II: Pós-traducional: A estrutura terciária final é apenas feita ao nível da mitocôndria. Existe um
factor de translocação que se liga à proteína e só no núcleo é que esta é traduzida.
Sinais de endereçamento na proteína:

1 - Sequência sinal (16-30 aminoácidos no N-terminal);
2 - Sinal de endereçamento nuclear (4-8 aminoácidos com carga positiva, exemplo: PKKKRLV);
3 - Sinal de retenção no RE (KDEL).
NOTA: Comparando duas proteínas com a mesma funcionalidade, devemos ter em conta a
sequência de aminoácidos, pois um aminoácido pode ser codificado por vários codões.
Direcionamento de proteínas procarióticas:

O endereçamento de proteínas não é um evento recente de evolução, mesmo as bactérias
mais primitivas utilizam as marcações para evitar proteínas sintetizadas no citosol para a
membrana celular, para a membrana externa. São marcadas no N-terminal.
Tradução de proteínas do periplasma em procariotas:

A leitura é sempre no sentido 5’3’. As proteínas do periplasma são sintetizadas com uma
sequência sinal (15-30 aminoácidos no terminal amínico).
NOTA: O arsenito existe em todos os ambientes primitivos, este composto é um problema,

porque oxida-se a arsenato. No entanto a célula reduz o arsenato a arsenito e produz uma
bomba de arsenito parecido com fosfato. Estas bombas têm zonas hidrofóbicas e zonas
hidrofílicas. Elas sentem os iões lá fora e tendem a passá-los para dentro e vice-versa.
Inibidores de síntese proteica:
Antibióticos inibem a síntese de proteínas bacteriana:

- Tetraciclina:
Liga no RNA 16S, usando a subunidade mais pequena do ribossoma (30S) e impede a tradução,
pois inibe a ligação do aminoacil ao t-RNA no local A.
Apenas é administrada a animais, a fim de terem menos micróbios e crescerem mais depressa.
- Cloranfenicol:
Liga na subunidade maior do ribossoma, e tal como a tetraciclina, também impede a síntese
proteica.
Proteínas Transmembranares:
Domínios hidrofóbicos são capazes de invadir as regiões lipídicas (também hidrofóbicas) da
membrana plasmática.
A orientação dos terminais de proteínas com múltiplas

transposições pela membrana depende da existência de um
número ímpar ou par de segmentos transmembranares.
Proteínas com número ímpar de domínios transmembrânicos
apresentam as regiões N- e C-terminais em faces opostas,
enquanto proteínas com número par de domínios
transmembrânicos apresentam essas regiões na mesma face.
CONCLUSÕES:
- A tradução é o processo de produção de proteínas.
- A regulação ocorre principalmente na transcrição: Modificações pós-traducionais são
importantes para regular a função proteica.
- Diferentes tipos de RNA e proteínas actuam no processo de transcrição e tradução.
- A t-RNA sintetase é a responsável pelo código genético.
Regulação da expressão genética
Como uma única célula pode dar origem a tipos celulares tão distintos?
Hipótese 1: Durante a diferenciação, apenas os genes que codificam as proteínas que serão
expressas naquele tipo celular são mantidos.
Hipótese 2: Todos os genes são mantidos, mas somente as proteínas específicas ao tipo celular
são expressas.
Totipotência:
É uma característica das células desenvolverem estruturas novas e diferenciadas ou um
organismo complexo.
Células pluripotentes:
Nos animais, a maioria das células adultas (diferenciadas) perderam a
sua capacidade totipotente, entretanto restaram algumas células
indiferenciadas, que ainda mantêm essa característica de
“pluripotência”, designadas de células-tronco.
Controlo da expressão dos genes:

Partindo do princípio que todos temos o mesmo potencial genético, seria de esperar que todas
as células funcionassem de igual modo nos organismos, no entanto isso não acontece, pois
nem todas as proteínas são expressas da mesma maneira, no mesmo local e ao mesmo tempo.
 Temporal:
Quando um determinado gene/proteína só é expresso num “tempo” determinado.
Exemplo: Proteínas que só são expressas no embrião, ou durante uma determinada fase do
ciclo celular.
 Espacial:
Quando a expressão de determinado gene/proteína é diferente dependendo do tipo celular.
Exemplo: Proteínas que só são expressas em células nervosas, como a mielina, ou no tecido
muscular, como a miosina.
NOTA: É preciso que haja uma regulação cuidadosa de expressão dos genes.
Existem duas famílias de genes distintos:

- Genes Constitutivos:
Em todas as células do organismo existem proteínas essenciais para a manutenção da vida,
normalmente envolvidas em processos básicos como geração de energia, replicação e
manutenção do material genético.
Estes genes não são regulados, são sempre expressos.
São chamados de house keeping genes.
- Genes Regulados:
Estes genes têm níveis de regulação diferente, sendo que nos procariotas este processo é mais
simples, pelo que se sabe mais a cerca destes, enquanto nos eucariotas é mais complexo.
São expressos em alguns tecidos, cuja função está directamente relacionada com a função do
órgão/tecido.
São genes expressos em somente um tecido de função altamente especializada, como, por
exemplo, a β-globina é expressa somente em eritrócitos.
São genes expressos em somente uma célula e todas as células clonais são descendentes dessa
progenitora, como, por exemplo, a maturação de anticorpos em linfócitos B durante a
resposta imune tardia.
NOTA: A concentração em equilíbrio de uma proteína vai possuir vários níveis de controlo.
Controlo transcricional
Regulação Negativa Regulação Positiva (indução)
a proteína liga ao DNA com factores e inibe a a proteina liga ao DNA e induz a expressão do
expressão do gene gene.
Gene Procariota:
Operão: É um grupo de proteínas que é regulado segundo o mesmo promotor.
Operão Lac:
É regulado por diversos factores, em particular pela disponibilidade de glicose e lactose no
meio extracelular. A lactose é um composto indutor natural do promotor dos promotores Lac
e tac. O operão é desreprimido por acção da lactose, sendo que a molécula efectora é a
alolactose.
Permite às bactérias uma digestão eficiente da lactose. A célula pode utilizar lactose como
uma fonte de energia ao produzir a enzima β-galactosidase, codificada pelo gene lacZ, que
digere lactose em glicose e galactose.
A sua estrutura consiste em três genes estruturais, um promotor para os genes estruturais e
um para os genes regulados, um terminador, um regulador, e um operador.
O promotor está
sempre reprimido, a
não ser que haja
alolactose.
Os três genes estruturais são:

lacZ: Codifica a β-galactosidase, uma enzima intracelular que degrada o dissacarídeo lactose
em glicose e galactose.
lacY: Codifica a permease de β-galactosídeos, uma permease de membrana plasmática que
bombeia a lactose para dentro da célula.
lacA: Codifica a transacetilase de β-galactosídeos, uma enzima que transfere um grupo acetil
de acetil-CoA para β-galactosídeos.
Operão Triptofano:
O triptofano é um aminoácido essencial nos
eucariotas, porém as bactérias podem sintetizá-lo,
mas isso só ocorre se ele não estiver disponível no
meio. Quando adicionado ao meio de cultura a
bactéria cessa a produção de triptofano em
aproximadamente 10 minutos.
Na presença de Trp, o gene não é transcrito. Este
operão está sempre expresso.
É responsável pela produção de Trp em células procariotas.
Na presença de escasso Trp, a proteína repressora liga Trp, ficando activa e liga o operão.
Este operão é mais complexo, porque codifica para mais proteínas estruturais. Este possui 5
genes (Trp A-E).
Na AUSÊNCIA de triptofano, o gene regulador
produz um repressor inactivo. O gene
operador está livre, sendo que a RNA
polimerase pode ligar-se ao promotor. Dá-se a
transcrição. E ocorre a síntese das 5 enzimas.
Na PRESENÇA de triptofano, este aminoácido

liga-se ao repressor, activando-o. O repressor
liga-se ao operador, sendo que a RNA polimerase
não pode ligar-se ao gene promotor. Os genes
estruturais não são transcritos, nem ocorre a
síntese das enzimas.
Além da regulação ao nível da transcrição, ele
também sofre regulação ao nível da tradução, sendo que nesta a regulaçao de Trp é feita
através da atenuação.
Triptofano: atenuação
Em muitos operões repressíveis, a transcrição inicia-se no promotor e pode terminar
prematuramente numa região líder que precede o primeiro gene estrutural. (i.e. a polimerase
termina a transcrição antes de chegar ao primeiro gene do operão).
ATENUAÇÃO: É o término prematuro da transcrição. Na biossíntese de aminoácidos a atenuação

é regulada pela disponibilidade de um tRNA aminoacilado cognato.
O operão contém, antes da zona que codifica para genes estruturais, uma zona que codifica
para uma pequena sequência que para ser traduzida necessita de triptofano. Ou seja, quando
estamos a transcrever, a bactéria está ao mesmo tempo a traduzir.
Se houver Trp, o polipeptídeo é traduzido, fazendo com que haja impedimento do resto da
tradução, havendo, desta forma, sucessivamente, uma diminuição do número de traduções,
por isso se chama atenuação.
Quando a transcrição é iniciada no promotor, ela começa na verdade antes do primeiro gene
estrutural e um transcrito líder é feito. Esta região líder contém um sinal de início e um sinal de
stop da síntese proteica.
Uma vez que a bactéria não tem uma membrana nuclear, a transcrição e a tradução podem
ocorrer simultaneamente. Assim, um pequeno peptídeo pode ser formado enquanto a RNA
polimerase está transcrevendo a região líder. O peptídeo-teste contém alguns resíduos de Trp
no meio dele. Assim, se tem uma quantidade suficiente de triptofanil-t-RNA para traduzir o
peptídeo-teste, o peptídeo inteiro será formado e o ribossoma vai chegar até ao sinal de
terminação.
A sequência no mRNA líder contém quatro regiões, as quais têm sequências complementares:
Região 1  Região 2
A possibilidade do ribossoma traduzir o peptídeo-teste afecta a formação das várias estruturas

em emparelhamento e alça.
Se o ribossoma atinge o sinal de stop da transcrição ele vai cobrir a região 2 e assim essa
região não vai estar disponível para emparelhar com outras regiões. Isto permite a geração do
sinal de término da transcrição, porque a região 3 vai estar disponível para parear com a região
4. Assim, quando tiver bastante triptofanil-t-RNA para traduzir o peptídeo-teste a atenuação
vai ocorrer e os genes estruturais não serão transcritos.
Pelo contrário, quando tiver quantidade de triptofanil-t-RNA insuficiente para traduzir o
peptídeo-teste não vai ocorrer
atenuação. Isto porque o ribossoma vai
parar nos 2 codões de Trp na região 1,
permitindo a região 2 parear com a
região 3, impedindo a formação do sinal
de atenuação, isto é, a região 3 pareia
com a 4. Desta forma, os genes
estruturais vão ser transcritos.
A quantidade de Trp vai influenciar a velocidade da tradução.
Ausência de atenuação: A tradução é lenta, sendo que a RNA polimerase vai mais à frente.
 Em procariotas:
Princípios básicos da regulação da expressão genética:
1. Esses organismos necessitam de ter mecanismos rápidos e eficientes de adaptação a
mudanças no ambiente.
2. Produtos genéticos que funcionem em conjunto, normalmente têm regulação da expressão
semelhante, ou estão organizados em operões.
3. A transcrição da maioria dos genes está num estado “bloqueado” devido à ligação de
proteínas inibidoras.
4. A dissociação dessas depende de um indutor, normalmente uma molécula pequena, que
“sinaliza” a mudança ambiental.
 Em Eucariotas:
Princípios básicos da regulação da expressão genética:
1. A iniciação da transcrição é o ponto mais crítico do controlo da expressão genética, por isso
os genes eucariotas possuem um maior número de regiões regulatórias upstream da “open
reading frame‟.
2. Genes eucariotas não se organizam em operões, mas a regulação conjunta pode ser obtida
pela presença de mais sítios reguladores da iniciação da transcrição.
3. Acesso às regiões promotoras é restrito pela estrutura da cromatina, e o remodelamento da
cromatina é necessário.
Controlo da transcrição em eucariotas:

- Interferência com o complexo de iniciação da transcrição;
- Regulação da estrutura da cromatina;
- Modulação dos níveis de actividade dos activadores e dos repressores da transcrição.
Remodelação da cromatina:
Um DNA muito compactado não é legível, por isso é necessário modelar o estado de
compactação do DNA, isto é, o grau de compactação do DNA à volta das histonas. Para isso é
necessário blocos enzimáticos que relaxem os nucleossomas, desenrolando o DNA à volta das
histonas.
A acetilação das histonas (feito por um processo enzimático) faz com que haja mais espaço à
volta destas. Assim, esta acetilação diminui a compactação da cromatina, pois diminui a
interacção do “core complex” com o DNA. Com isto, os sítios promotores e reguladores estão
mais acessíveis para a ligação de factores de transcrição. Isto tudo ocorre devido às cargas que
as histonas e o DNA apresentam, permitindo, desta forma, a transcrição e a tradução.
Para cada tecido, as zonas acetiladas são diferentes.
1. Heterocromatina: Tipicamente, 10% da cromatina está sempre supercondensada, essas
regiões são transcricionalmente inactivas.
2. Eucromatina: Corresponde à cromatina mais “relaxada”, estando, desta forma,
transcricionalmente activa.
NOTA: A cromatina é remodelada por acetilação ou movimentação dos nucleossomas.
Regulação da expressão da ferritina:

Na ponta 3’ do mRNA do receptor de transferrina há a estrutura do elemento de resposta ao
ferro, esse liga uma proteína reguladora de ferro (IRP) quando a célula estiver sem este metal.
A ligação de IRP à ponta 3’ do mRNA do receptor de transferrina protege o mRNA da

degradação e resulta num aumento do nível do mRNA do receptor de transferrina e um
aumento correspondente no nível da proteína receptora de transferrina.
A ferritina é uma proteína armazenadora de ferro.
Na ponta 5’ da molécula de mRNA de ferritina há uma estrutura haste-alça que liga IRP quando
o ferro está ausente na célula. A ligação de IRP à ponta 5’ do mRNA de ferritina bloqueia a
tradução deste mRNA e resulta numa diminuição de ferritina. Quando o ferro está em
abundância, o mRNA de ferritina não liga mais IRP e traduz activamente a proteína ferritina.
Ao mesmo tempo, a abundância de ferro evita que IRP se ligue à ponta 3’ do mRNA do
receptor de transferrina e o mRNA é degradado, o que reduz o nível da proteína receptora de
transferrina.
Expressão heteróloga de proteínas

Expressão ≠ Clonagem
Aqui pretendemos expressar uma proteína de um indivíduo num outro indivíduo, em que o
vector que contém o gene que codifica uma proteína tem de ser introduzido num outro
organismo.
O processo de expressão tem de ocorrer de modo a não interferir com o modo de vida da
célula, para isso temos de garantir que a sequência que vamos colocar no organismo que vai
expressar interprete a sequência da mesma maneira que o organismo de origem.
Podemos provocar uma mutação base a base para mudar o codão, ou então mudar o
organismo de expressão.
Estrutura de proteínas:
As proteínas são polímeros de L-α-aminoácidos (a natureza foi quem escolheu a família L).
Cadeias Laterais
Apolares Polares Carregadas
aromáticos neutros básicos ácidos
carga positiva carga negativa
Níveis de estrutura proteica:

Primária: Estrutura covalente.
Secundária: Arranjos repetitivos locais.
Terciária: Enovelamento tridimensional.
Quaternária: Oligomerização.
Aplicações das proteínas recombinantes:

Terapia génica:
Possibilidade da introdução de um gene que codifica para uma proteína que auxiliará no
processo de tratamento de doenças genéticas ou outras.
Melhoramento animal e vegetal:

Plantas mais resistentes e animais mais férteis e com carne de melhor qualidade.
Criação de modelos animais:

Ideais para estudo da estrutura, função e regulação de um gene.
Engenharia genética:
Tecnologia de DNA recombinante:
É o conjunto de técnicas que permite a combinação de segmentos de DNA com origens
diferentes, de forma a originar uma nova molécula de DNA.
É usada na clonagem de genes, na modificação genética de organismos e na biologia molecular
de uma forma geral.
Clonagem genética:
Obtenção de grande número de cópias de um gene.
Gene repórter:
É um gene que produz uma proteína que pode ser detectada e quantificada utilizando um
teste simples.
Exemplos:
- GFP (Green fluorescent protein);
- LacZ (β-galactosidase) (ONPG produz cor amarela, sendo uma forma de seguirmos a
actividade das enzimas que estão fundidas com proteínas);
- Luc (luciferase).
Efeito da diferente utilização de codões na expressão génica:

Haverá baixa expressão proteica se o DNA clonado tiver codões pouco utilizados em E. coli.
Soluções: Mutagénese sítio-específica (alteração de nucleótidos sem alteração de
aminoácidos).
Vector de clonagem:
É um elemento genético com capacidade de replicação autónoma, usualmente um vírus ou um
plasmídeo. Este tipo de vector não possui promotor.
Contém:
- Origem de replicação;
- Local de resistência a antibióticos;
- Normalmente tem um gene que codifica para uma proteína (repressor);
- Local de introdução de fragmentos que clonamos;
- Zonas de sequência conhecida que permite o corte da sequência que clonamos (zonas de
clivagem);
- Tag.
Funções do tag:
O tag é uma sequência curta de nucleótidos que codifica um péptido com poucos aminoácidos.
Pode ser adicionado à extremidade N ou C do produto do gene clonado.
Permite a detecção e purificação de proteínas.
Péptidos de fusão específicos conferem vantagens à proteína alvo durante a expressão, tais
como, aumentam a solubilidade, protegem da proteólise, melhoram a conformação e
aumentam a produção.
São vários os tags utilizados nos vectores de clonagem:

- 6 His;
- Glutationa-S-transferase (GST);
- Proteína de ligação a maltose (MBP);
- Proteína verde fluorescente (GFP);
- Epítopos (determinante antigénico).
NOTA: A proteína de fusão pode estar no N-terminal ou no C-terminal, sendo que é mais
comum estar no N-terminal.
Anterior à proteína de fusão existe a sequência de reconhecimento dos ribossomas (sequência
de Shine-Dalgarno nos procariotas).
Vector de Expressão:
É um vector de clonagem que também dirige a expressão do gene clonado com vista à
obtenção de proteína em grande quantidade.
Queremos que actue a DNA e a RNA polimerase, de modo a transcrever qualquer coisa, no
entanto para isso é necessário um promotor e um codão de iniciação.
Possui um promotor específico para a expressão na célula hospedeira, sendo que é este
promotor que garante ao plasmídeo ser traduzido. As características do promotor vão fazer
com que aquilo que clonamos seja mais ou menos expresso (o promotor pode ser forte ou
fraco).
Este vector precisa que a RNA polimerase leia o gene que clonamos (o gene é clonado com o
material que queremos expressar), mas não queremos que a RNA polimerase transcreva o
gene todo, mas sim a parte que nos interessa.
Os vectores de expressão controlada dão resposta à necessidade de superproduzir, de uma
forma controlada, o produto de expressão de um gene (uma proteína recombinada: r-
proteína).
Assim, num vector de expressão, para que a informação possa ser traduzida, necessitamos
de:
- Promotor para a RNA polimerase;
- Sequência de terminação para a RNA polimerase;
- Um terminador da transcrição a jusante da sequência codificante para evitar a formação de
mRNA demasiado longo;
- Codões stop para os ribossomas (para a terminação da tradução);
- Sequência indicadora da ancoragem ao ribossoma, designada de Shine-Dalgarno, que garante
uma ligação efectiva do mRNA ao ribossoma onde se dá a tradução garantindo que o processo
se dê eficientemente e que a expressão do gene clonado não fique limitada ao nível da
tradução;
- O codão de iniciação ATG que inicia a transcrição da maioria dos genes dos procariotas.
Estes vectores têm uma origem de replicação e marcas genéticas de selecção.
No caso do vector de expressão controlada para a expressão numa célula bacteriana

(usualmente E. coli) o vector deverá apresentar:
- Uma região promotora reconhecida no hospedeiro e que permita uma eficiente transcrição
do gene clonado a usar para superprodução na r-proteína;
- É conveniente que este promotor seja regulável de modo a que possa ser “ligado ou
desligado”, daí o nome de vectores de expressão controlada.
NOTA: Codão stop ≠ Sequência de terminação.
Funções do terminador da transcrição: A jusante da sequência clonada impede a transcrição

através de outro promotor, o que pode inibir a sua função, fenómeno conhecido por oclusão
do promotor. Aumenta a estabilidade do mRNA.
Vector de expressão comercial:

O IPTG é um análogo da lactose, mas nunca é degradado no meio de cultura, mantendo-se
com a mesma concentração durante o crescimento celular que ocorre na sua presença, esta é
uma vantagem deste. Este remove a proteína Lac I repressora do operador. O IPTG é o indutor
da maior parte dos promotores dos vectores de expressão
Locais comuns aos vectores de clonagem e aos de expressão:

- Local de clonagem (multiple clonning site);
- Origem de replicação;
- Pelo menos um gene que confere resistência a antibióticos.
Vectores de expressão
Vectores de fusão transcricional Vectores de expressão traducional
fornecem apenas o promotor fornecem o promotor e os sinais de tradução

(RBS e codão de iniciação da tradução)
têm todas as informações para transcreverem têm todas as informações para traduzirem
O que clonamos tem de conter todas as informações para a transcrição e para a tradução.
Fusões transcricionais e traducionais:

Na fusão transcricional, o promotor e o gene constituem uma unidade transcricional, isto é, a
transcrição iniciada a partir do promotor continua através do gene clonado.
O vector fornece o promotor.
O insert contém os sinais de tradução - RBS e codão de iniciação da tradução.
É produzida proteína nativa.
Na fusão traducional, também se forma uma unidade transcricional.

O vector fornece o promotor e os sinais de tradução.
É produzida uma proteína de fusão ou proteína híbrida, em que parte do produto da tradução
(proteína ou polipeptídeo) é derivado do insert e outra parte do vector.
NOTA: As modificações pós-traducionais são necessárias para a actividade biológica da

proteína.
Requisitos da fusão traducional:

É preciso conhecer a sequência de nucleótidos do insert e avaliar o resultado da clonagem
num determinado local. O insert deve estar na mesma grelha de leitura do ATG do vector.
Pode ser necessário mudar de vector, ou modificar o vector ou o insert, utilizando linkers ou
adaptadores. Alternativamente, o insert pode ser produzido por PCR.
Vector de expressão – RESUMO:

Contém:
- Promotor forte e eficiente para produzir elevadas quantidades da proteína desejada e de
baixo nível basal para evitar toxicidade;
- Terminador a fim de evitar a transcrição não desejada;
- Sequência Shine-Dalgarno para o início da tradução (no caso de procariotas);
- Tags e proteínas de fusão para permitir a purificação das proteínas de interesse e adicionar
características vantajosas;
- Zonas de clivagem para remover os tags;
- Repressor para evitar a produção de proteína em quantidades tóxicas;
- Sequência de um péptido sinal para uma secreção correcta da proteína.
Transcriptase reversa:
É capaz de ler mRNA e escrever DNA, o que permite fazer a cópia de mRNA para DNA. Este
DNA é designado de DNA cópia (cDNA), sendo clonado num vector com vista à expressão de
proteínas.
Nos eucariotas, o DNA original não pode ser utilizado, uma vez que este contém muito mais
informação do que aquela que é usada para expressar uma proteína.
NOTA: O DNA tem de ter zonas de encaixe para a DNA polimerase (tem de ter um promotor). O
RNA, por sua vez, tem de ter zonas de encaixe para o ribossoma.
Isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas:

O fragmento do DNA de interesse, chamado insert (inserto) é ligado a uma outra molécula de
DNA chamada de vector para formar o que se chama de DNA recombinante.
A molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeira compatível, num
processo chamado de transformação. A célula hospedeira que adquiriu a molécula do DNA
recombinante é agora chamada de transformante ou célula transformada.
Promotor
Forte Fraco
pode provocar o excesso de produção

rapidamente
pode complicar o processo de produção
Promotor regulável no vector de expressão:

Para que este processo de produção excessiva e descontrolada de proteína não ocorra temos
de baixar a taxa de produção desta através do uso de lactose em vez de IPTG, uma vez que a
lactose vai provocar uma transcrição não tão forte como o IPTG.
Um promotor diz-se regulável quando, na dependência das condições ambientais ou

genéticas, promove a síntese de mRNA (por exemplo, despoletada por um indutor) a partir do
gene que se coloca sob a sua regulação ou, pelo contrário, “desliga” o mecanismo de síntese
de mRNA, levando-o a níveis basais (por exemplo, na ausência de um indutor). O indutor activa
o promotor a transcrever o fragmento que clonamos.
Promotores artificiais:
São fortes tacI e tacII, que resultam da fusão da região -35 do promotor do operão do
triptofano com a região -10 do promotor do operão lac de E. coli. O interesse destes
promotores artificiais é que promove muito mais eficazmente (cerca de 10 vezes mais) a
transcrição de qualquer gene colocado do que os promotores naturais em que estão
originalmente.
Por quê regular a expressão de um gene?

Efeito tóxico da proteína recombinante: É o efeito danoso sobre a bactéria. Monitorar a sua
síntese pode impedir a acumulação em níveis tóxicos.
Diminuição do nível de transcrição: Um nível muito alto pode afectar a capacidade de

replicação do plasmídeo recombinante, levando à sua eventual perda na cultura.
Enovelamento dentro da célula:

Bactérias
- Ambiente redutor não permite formação de pontes dissulfeto dentro do citosol, somente
permite no espaço periplasmático;
- Não fazem modificações pós-traducionais;
- Degradação proteolítica;
- Proteínas retidas em corpos de inclusão;
- Secreção para o espaço periplasmático.
Eucariotas:
- Pontes dissulfeto;
- Modificações pós-traducionais diversas;
- Glicosilação;
- Secreção para o meio extracelular.
Sistemas de expressão heteróloga:

Procariotas: E. coli
- Profunda caracterização genética e fisiológica;
- Tempo de geração curto;
- Fácil manipulação e baixo custo;
- Pode acumular proteínas heterólogas em mais de 20% do conteúdo proteico total da célula.
Sistemas procarióticos alternativos:

Têm uma capacidade secretora superior.
Exemplo: B. subtilis: Gram +;
B. megaterium: Gram +, menor número de proteases periplasmáticas;
Staphilococcus carnosus;
Streptomyces lividans.
Eucariotas: Leveduras (S. cerevisiae, P. pastoris, K. lactis, etc.)

- Baixo custo e cultivadas em altas densidades;
- Secretam bem;
- Modificações pós-traducionais;
- Não patogénicas e apirogénicas.
Plantas: Nicotiana tabacum

- Baixo custo de produção;
- Síntese de proteínas funcionais;
- Fácil recuperação e purificação;
- Direcionamento da proteína recombinante (frutas, tubérculos, folhas ou
sementes);
- Baixo rendimento;
- Condições de cultivo variáveis;
- Padrão de glicolisação diferente.
Produção de proteínas recombinantes em sistemas de expressão:

Vantagens Limitações
Níveis elevados de expressão das Acumulação intracelular de proteína
proteínas recombinantes. produzida.
Bactérias Crescimento rápido da população Possibilidade de degradação do
celular num meio de cultura produto por proteases contaminantes.
simples. Produção de endotoxinas.
Não produzem endotoxinas.
São capazes de glicosilar proteínas.
A glicosilação das proteínas não é
Níveis elevados de expressão das
Leveduras exactamente como nos sistemas de
proteínas recombinantes.
mamíferos.
Crescimento rápido num meio de
cultura simples.
São capazes de glicosilar as O custo de produção nestes sistemas é
Células de proteínas nos locais correctos, muito mais elevado devido ao seu
mamíferos embora com algumas diferenças no lento crescimento e necessidade de
tipo de modificação glicosídicas. meio nutritivo dispendioso.
Produção de proteínas
recombinantes no leite.
Variabilidade dos níveis de expressão.
Animais Níveis de expressão altos.
Falta de caracterização exacta das
transgénicos Baixo investimento de capital.
modificações pós-traducionais.
Baixos custos operacionais e
reprodutibilidade.
Contaminação com fertilizantes e
Plantas Potenciais de economia e de outros produtos químicos.
transgénicas alargamento de escala. Doenças e pestes típicas.
Condições de cultivo muito variáveis
Insulina
Diabetes tipo I:
Não podemos controlar, porque é o desaparecimento da produção de insulina por parte do
pâncreas.
Diabetes tipo II:

Está relacionado com o modo de vida da pessoa (obesidade), com o facto das nossas células se
tornarem pouco sensíveis à insulina.
Função da insulina:
Na tentativa de encontrar a capacidade de produção da insulina humana, esta passou pela
produção de insulina de animais compatíveis, sendo que o primeiro animal a ser estudado foi o
bovino, no entanto a insulina produzida por este dava origem a várias alterações no organismo
humano.
Depois, chegou-se à conclusão de que, imunologicamente, o animal mais próximo do ser
humano era o porco, sendo que o nosso sistema imunitário reconhece a insulina produzida
pelo porco e não a rejeita.
A insulina suína possui apenas uma troca de um aminoácido, isto é, tem uma alanina em vez
de uma treonina. O nosso sistema vê essa alteração e reconhece que não é nossa, no entanto
como a diferença é pouca não faz mal.
NOTA: A insulina humana não é modificada pós-traducionalmente.
A insulina é produzida como uma pro-insulina, não sendo, por isso, activa. Quando a insulina é
produzida contém 1 polipeptídeo que liga as 2 cadeias, só depois para ser activa há a remoção
desse polipeptídeo, fazendo com que as 2 cadeias sejam ligadas por pontes dissulfeto.
Produção de insulina heteróloga:

In frame: A sequência está direitinha.
Temos de contar o número de bases entre o promotor e o ATG para que a sequência possa ser
lida de acordo com os codões que lá
estão.
Links
http://www.youtube.com/watch?v=3offBO3sweg
http://www.youtube.com/watch?v=teV62zrm2P0
http://highered.mcgraw-
hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120076/micro
04.swf::DNA%20Replication%20Fork
http://www.youtube.com/watch?v=JRAA4C2OPwg&feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=_zxr-52KwKo&feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=YdfDEugbar8
http://www.youtube.com/watch?v=2xMhfdeeU8Y
http://www.youtube.com/watch?v=1Q-_qgCtk3c&feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=zfvihIzYyAc&feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=Mn6DivNYu8U&feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=oYpllbI0qF8
http://highered.mcgraw-hill.com/sites/9834092339/student_view0/chapter16/animation_-
_exon_shuffling.html
http://www.youtube.com/watch?feature=endscreen&NR=1&v=2gT1eAcK7T8
http://pathmicro.med.sc.edu/portuguese/chapter_9_bp.htm
http://www.youtube.com/watch?v=oBwtxdI1zvk
http://www.youtube.com/watch?v=eYrQ0EhVCYA
http://www.youtube.com/watch?v=vi-zWoobt_Q
http://www.youtube.com/watch?v=LfDYGanMi6Q
http://www.youtube.com/watch?v=u38LjCOvDZU
The End!
Now you can read it again. xD

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Licenciatura em Bioquímica

Nucleótido: Grupo fosfato (liga ao C5 do açúcar) + base azotada (liga ao

NOTA: Uma adição nova ao nucleótido liga ao C3 do açúcar.

Nucleosídeo: É o nucleótido sem o grupo fosfato.

Estrutura básica das bases azotadas:

Purinas: Adenina (A) e Guanina (G). Contêm2 anéis.

Pirimidinas: Uracilo (U), Timina (T) e Citosina (C).

Direccionalidade das ligações no DNA:

O DNA é uma fita com torção:

Temperatura de fusão do DNA:

Factores que afectam a desnaturação/renaturação da dupla hélice:

Acção de ácidos, bases e sais sobre a molécula de

Forças que estabilizam o DNA:

Estrutura do cromossoma eucariótico:

- Eucromatina: Regiões nas quais a cromatina encontra-se desespiralada na interfase. Nestas

- Heterocromatina: É a parte da cromatina condensada (parte mais compactada). Os genes

Existem dois principais tipos de proteínas:

proteínas (factores de transcrição). Estabiliza o DNA em termos de carga.

DNA dupla hélice

Voltas de DNA ao redor das O DNA dá 1,7 voltas no octâmero.

Formação das cadeias de DNA.

DNA, RNA e a passagem da informação:

Dogma central da biologia: Todo o nosso

Existem 2 tipos de topoisomerases:

A DNA polimerase tem 3 actividades diferentes:

Existem três tipos de DNA polimerase:

Forquilha de replicação em procariotas:

Na forquilha de replicação, os procariotas têm

Origem de replicação em E. coli:

- Sistemas circulares: Plasmídeos e cromossomas

No final da replicação, as cadeias estão encaixadas uma

DNA ligase: Promove a ligação de todos os fragmentos de Ocasaki da cadeia descontínua.

Os eucariotas contêm 5 polimerases: α, β, γ, δ e ε. As suas principais funções são:

Replicação de cromossomas lineares:

FISH (Fluorescence in situ hibridization):

Forquilhas de Replicação em eucariotas:

Origem de replicação em eucariotas:

Vector: Onde vamos colocar o DNA que queremos recombinar.

PCR: Reacção de polimerização em cadeia

Problema inicial da técnica: Durante a etapa de quebra das

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Corta nas duas cadeias

Mais comum (gera fragmentos Corta nas duas cadeias

III Raro Cliva apenas uma cadeia Não é útil

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Modificação do DNA- metilação:

Exemplo: Metilase de E.corI metila a segunda adenina.

Nomenclatura das enzimas de restrição:

Elaboração de um mapa de restrição:

Utilização de apenas uma enzima de restrição:

Conceitos-chave para a tecnologia do DNA recombinante:

quando queremos quando queremos

Vectores Grupos de vectores:

O fago λ também está manipulado de modo a transportar resistência a antibióticos. No

 Artificiais: Foram criados de maneira a serem células vectores com características de

BAC (bacterial artificial chromossome):

YAC (yeast artificial chromossome):

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Função evolutiva dos plasmídeos nas células bacterianas