Biologia Molecular
introdução OBS: Nos vírus ele terá o DNA ou o RNA,
Estrutura dos ácidos nucleicos:
Existem dois tipos de materiais genéticos
principais tanto em células procariontes
quanto em eucariontes que é o DNA e o
RNA. O que vai diferencia-los é a sua
função, estrutura em que um terá fita dupla
e o outro fita simples.
. - Citosina;
nunca será os dois juntos!
O que são essas moléculas?
São polímeros (molécula grande, formada
por unidades pequenas repetitivas de
nucleotídeos). Tanto o DNA e RNA são
moléculas que carregam as informações
genéticas, ou seja, tudo que vai constituir
as nossas proteínas, elas são importantes
porque vão controlar a síntese de
macromoléculas e a transcrição do
patrimônio genético.
Os nucleotídeos:
São as bases nitrogenadas, grupo fosfato e
uma pentose (é uma molécula de
carboidrato com 5 carbonos).
Bases nitrogenadas:
- Uracila;
- Adenina;
1
- Timina;
- Guanina.
As bases nitrogenadas tem caráter básico
por conter o NH2. Teremos então:
- A molécula de fosfato é idêntica tanto no
- DNA: Adenina, Guanina, Citosina e
RNA como DNA, sempre terá a ligação
Timina;
com os 4 O2.
- RNA: Adenina, Guanina, Citosina e
Uracila;
A diferença entre elas é a mudança de uma
das bases em que o DNA é a timina e o
RNA é a uracila. Além disso, as bases
nitrogenadas são diferentes sendo - A pentose do DNA tem um hidrogênio e
classificadas como: no RNA uma hidroxila.
- Bases púricas - adenina e guanina;

- Bases pirimídicas - timina, citosina,

uracila.
DNA- H
RNA- OH

Como os nucleotídeos se ligam entre si?

Então a diferença entre elas é que as
púricas possuem dois anéis, enquanto as
pirimídicas apenas um e a quantidade de
nitrogênio. Outro fato é que por conterem
o N, a base possui caráter básico.
Informações importantes!
- Obrigatoriamente todo carboidrato é
formado por moléculas de C, O, H
(carbono, oxigênio e hidrogênio).
Através da pentose, já que ela que vai fazer
a ligação com base e o fosfato. No DNA as
bases se ligam entre si, teremos então:
 Timina - Adenina
 Citosina - Guanina
Na formação da nossa molécula temos 3
tipos de ligação:
- Ligações de hidrogênio: que é
considerada forte, mas é possível desfazer
e refazer

2
  Adenina e timina - 2 ligações;
 Citosina e guanina - 3 ligações.
Quem possui a ligação mais forte é com as
3 ligações porque é mais difícil de quebrar.
Então quanto mais ligações de citosina e
guanina mais difícil será de quebrar a
molécula de DNA.
Dentro do DNA é hidrofóbico e básico,
justamente por conta das bases. Já a parte
externa é hidrofílica, ácida e tem caráter
negativo. Ao todo temos o DNA em si é
ácido e negativo.
O O2 é o que confere a negatividade da
molécula de DNA, porque na tabela
periódica ele é o elemento mais
eletronegativo, se encontrando na coluna
da direita e no topo.
São as ligações de hidrogênio que vão
manter a fita dupla hélice.
RESUMINDO...
Temos o polímero que é o ácido nucleico,
vários polímeros juntos formam o
monômero esse é subdivido em 2:
nucleosídeo e nucleotídeo.
Nucleosídeo = pentose + base;
Nucleotídeo = nucleosídeo + fosfato.
A diferença entre eles é a presença de
fosfato. No nucleotídeo podemos ter entre
1, 2 ou 3 fosfatos.
Nomenclatura entre RNA e DNA:
Desoxirribose – DNA (sem oxigênio)
Ribose – RNA
Nomenclatura do fosfato:
Mono - 1 fosfato;
Di - 2 fosfatos;
Tri - 3 fosfatos.
Um nucleotídeo se liga a outro nucleotídeo
através do fosfato. Ele faz a ligação no
próximo nucleotídeo no carbono 3’ dele.
A ligação entre nucleotídeos é chamada de
ligação fosfodiéster. Então o fosfato faz
ligação 5’ com o seu próprio nucleotídeo e
quando ele vai se ligar faz no carbono 3’
do outro e por quê isso?
Porque é o carbono que está livre para ser
feito a ligação.
Quando ocorre a ligação fosfodiéster são
liberados 2 fosfatos.
 Carbono 1 - base nitrogenada;
 Carbono 2 - o que vai definir se
DNA ou RNA - OH ou H;
 Carbono 3 - liga ao outro
nucleotídeo;
 Carbono 4 - se liga ao carbono 5’;
 Carbono 5 - se liga ao fosfato.
3
Existem cavidades na dupla hélice menor e
maior, servem para a inserção das
proteínas que são inseridas mais facilmente
na cavidade maior devido a carga negativa
fora do DNA e da sua conformação. Eles
têm um nível de compactação porque
precisam ficar dentro do núcleo e por
conter a carga negativa isso faria com que
eles se repulsassem e então entra alguns
cátions para reduzir a força eletrostática.
Então o cátion vai servir para estabilizar a
estrutura do DNA.
Curiosidade:
Existem variações de DNA como 3 a 4
fitas, mas isso é raro
A desnaturação das fitas acontece pelas
hidrolises das pontes de hidrogênio
lembrando que a guanina e citosina será
mais resistente, pois a ligação é mais forte.
Organização gênica
Algumas propriedades sobre a organização
cromossomal dos organismos eucariotos,
podem ser diploides e também haploide.
Existem regiões repetidas chamada de
óperon, existem regiões codificantes, DNA
extracromossomal, cromatina.
No ciclo celular temos a interfase e depois
temos a mitose, na interfase principalmente
na fase S (S de síntese) temos a fita mais
solta, como se fosse um macarrão, ele fica
assim porque é para facilitar que seja lido,
saiu da fase S, ele duplica e começa a
empacotar (enrolar), entra na mitose
especificamente na metáfase onde há o
maior nível de empacotamento.
No meio disso temos os nucleossomos que
são proteínas que também são chamados
de histonas estão envolvidas pela fita de
material genético, especificamente por 146
pares de bases que enrolam as histonas.
São elas que formam o nucleossomo e ele
se enrolam nele mesmo.
4
Ela tem duas funções que é garantir o
enovelamento de forma protegida, porque
quando for necessário abrir essa fita ela
estará em perfeita condição e protegem
contra as endonucleases (enzima capaz de
quebrar ligação entre ácidos nucleicos)
curiosidade:
Telômero - É a parte final do cromossomo,
ele dá estabilidade ao cromossomo para
que não haja replicação além do que
precisa e a separação ser certa, porém, com
o passar do tempo ele vai diminuindo e vai
acabando, não deixando a célula ter a
renovação e se isso não acontece, vamos
ficando com aspecto envelhecido.
O DNA do procarioto tem regiões
especificas. vamos ver primeiro os genes O
genoma em si, à existência de elementos
reguladores, gênicos e promotores.
- Elementos reguladores distais - que está
mais distante do gene;
- Elementos reguladores proximais –
próximo ao gene.
Esses elementos estão um ao lado do outro.
No eucarioto estão distantes diferente do
procarioto estão próximos.
Composição do gene:
O gene em si é composto de exón e intrón
no eucarioto
 O procarioto não tem o intrón
Intrón - são regiões não codificadoras
 DNA transcreve para RNA que
traduz para proteína
Os intróns e exóns são transcritos pro
RNA, a diferença é que os intróns não
codificam para proteína, somente os exóns.
Na hora da produção os intróns saem.
DNA e RNA:
DNA do procarioto tem formato circular e
do eucarioto linear.
As bactérias tem um cromossomo,
enquanto nós temos 46. Esse material
genético serve como molde para fazer a
transcrição para o RNA mensageiro e no
procarioto esse material é logo transcrito
em seguida, ocorre a tradução que vai fazer
a produção da proteína.
Curiosidade:
É feito 32 a 30 ATPs. No eucarioto o
material genético precisa passar do núcleo
para o citoplasma (RNA mensageiro) e
isso gasta energia, por isso é necessário 32
ATP. No procarioto são 30 porque o
material já está no citoplasma facilitando o
processo fazendo com que ocorra de forma
mais rápida.
Os genes são formados por regiões
promotora, gênico e reguladora
5

A bactéria sofre mais mutação porque não
tem a presença de intróns o que pode levar
um maior erro na formação da proteína
A região codificadora - só tem exón (nos
procariotos)
Polimerase - nos eucariotos não existe a
colinearidade, por causa do intrón
Existem o intrón para evitar que tenha
tanta mutação como as bactérias
Procarioto ≠
- É muito mais rápido;
- Não tem intrón;
- Tem polimerase;
- Temos parálogos, ortólogos e xenólogos
(só tem em bactérias, porque eles são
resultados de uma transferência genética)
- Tamanho pequeno do genoma
 No eucarioto tem apenas, parálogo,
ortólogo.
Depois de formada a estrutura do DNA,
temos o genoma
- Nos eucariotos a fase de maior
condensação é na metáfase e nos
procariotos é na fase exponencial
- Nos eucariotos o genoma é protegido
pelas as histonas e nos procariotos pela
Proteína associadas ao nucleoíde
- Genoma extracromossomal é o plasmídeo
que pode ter a presença em bactérias, isso
confere uma vantagem que é a resistência a
antibióticos. Ele tem a mesma
conformação do cromossomo.
- Quando o material genético vai se
duplicar ele abre a fita e isso se chama
replicon que são sequências exatas do
genoma que ocorrem a replicação. A
diferença é que em eucariotos há vários
replicons e na bactéria existem apenas uma
origem de replicação. Só existem 1 porque
o cromossomo é circular.
- Os eucariotos tem baixa densidade gênica
- Nos procariotos tem bastante gene para
ser feito a proteínas. No genoma
procarioto, cromossomal além de genes
tem outras sequências também como os
motivos (sequencias curtas), óperons,
repetições, ilhas, replicon, tem várias
sequências.
Os motivos:
- São sequencias de até 100 pares de bases,
podem estar dispersas ou agrupadas
Repetição:
6
- É a mesma sequência de pares de bases
Por sofrerem muita duplicação alguns
genes são conservados e o outros acabam
sofrendo mutação, os que são conservados
são indispensáveis para o sobrevivemento
da célula.
Óperons:
- São agrupamentos de genes que são
controlados pela mesma região reguladora.
Nessa região os genes fazem sua proteína
ao mesmo tempo são comandados pela
região reguladora. A diferença de um gene
único para o que tem sua própria região
reguladora é quando ele vai produzir,
fazendo somente a sua proteína, no óperon
uma região reguladora faz várias proteínas,
isso é para economia de tempo, espaço,
energia.
Os genes que estão nessa região reguladora
produzem proteínas em comuns. Quando a
região reguladora não quer reproduzir não
reproduz e quando reproduz é apenas um
RNA e vem a proteína em que cada gene
vai produzir sua própria proteína:
1- A região reguladora manda os genes
produzirem um RNA (chamado de
policistrônico)
2- Mas na hora que vão fazer a tradução,
cada um produz sua própria proteína.
- Nos eucariotos tem mais de 50% de
repetição e quanto no procarioto 2%.
Ilhas gênicas:
É a última região, que foram inseridas por
conta de algum processo evolutivo, confere
uma vantagem a bactéria, se não tiver ela
consegue sobreviver normalmente sem
esse gene acessório.
Na terça dia 6 foi falado sobre a
duplicação do DNA a partir do corte
dele, para ser feita a mitose
transcrição
Hoje vamos falar sobre a transcrição que é
a transferência da informação contida do
DNA para que possa ser feita a proteína e
pra isso acontecer temos alguns principais
tipos de RNA: mensageiro, transportador e
ribossômico.
Mensageiro: é aquele que transfere a
informação de um gene e transforma em
um RNA. Então ele inicia o processo de
transcrição, ele leva a informação para o
citoplasma da célula. O DNA transcrito
tem o mesmo código do RNA só muda a
timina para a uracila. A cada 3
nucleotídeos se transforma em 1
aminoácido e quem transfere esse
aminoácido correspondente é o RNA
transportador.
7
Transportador: é a macromolécula que a presença de exóns e estar presente no
transfere os aminoácidos para formar a citoplasma.
proteína. É responsável por transportador o
- Na transcrição é exón e intrón;
aminoácido de acordo com a sequência do
RNA. - Na tradução é exón;
Ribossômico: ele conecta.
 DNA polimerase adiciona os
nucleotídeos na fita
As proteínas que são utilizadas fora da
célula são feitas no RER, enquanto as que
são feitas nos ribossomos no citoplasma é Qual a diferença?
para ser utilizado dentro da célula.
Na replicação (duplicação) é utilizado o
O RNA ribossômico é formado por duas DNA polimerase para adicionar
subunidades maior e menor, primeira coisa nucleotídeos para a formação de uma nova
é que ele é uma organela, o RNA fita dupla de DNA.
mensageiro passa no meio dele, a
Para fazer uma fita de RNA é utilizado o
sequência é decodificada e depois em
RNA polimerase, na transcrição para a
proteína.
produção de uma nova fita de RNA e ele
- O ribossomo eucarioto a subunidade adiciona a uracila em vez da timina
maior é 60s e menor 40s e os dois juntos
- Na transcrição é utilizado RNA
formam 80s.
polimerase.
- O ribossomo procarioto a subunidade
O DNA polimerase primeiro adiciona o
maior é 50s e menor 30s e os dois juntos
primer e vai adicionando os outros.
formam 70s
- No RNA não precisa de primer.
Temos a família genica, elementos moveis,
replicon
Intróns e exón são os genes.

RNA heterogeneonuclear- chamado

O RNA polimerase além de sintetizar os
também de primário, é o RNA mensageiro
novos nucleotídeos da fita de RNA
que contém a sequência de exóns e intróns,
mensageiro, ele reconhece o promotor. Na
só existe em eucarioto. Saiu do RNA
replicação é uma cascata de enzimas que
primário está no núcleo, quando sai é
participa depois do reconhecimento da
chamado de RNA maduro, contém apenas
8
região de replicação, na formação do RNA
polimerase é ele que faz tudo
RNA polimerase faz:
- Reconhece o promotor;
- Separa a fita;
- Mantem a fita separada e estável;
- Renatura o DNA.
A expressão gênica acontece a partir do
processo de transcrição em que um
fragmento que é o gene é codificado em
proteína. Tem 3 fases: início, alongamento
e terminação.
Início: Para a transcrição acontecer é
necessário que a região promotora (está do
lado dos intróns e exóns) seja reconhecida
pela RNA polimerase e esse
reconhecimento acontece com o auxílio de
fatores de transcrição
A região promotora é que vai dar o início
para que o RNA mensageiro seja criado.
Ela contém uma parte que é conservada
rica em adenina e timina, se chama tata
(timina e adenina) box (região contida na
região promotora). Esse Tata Box é
reconhecido junto com os fatores de
transcrição.
RNA pol = RNA polimerase
Os eucariontes tem vários fatores de
transcrição.
No procarionte tem o principal SIGMA
Tudo isso é a fase de início!
 No procarioto o fator de transcrição
SIGMA se une ao RNA polimerase
e os dois juntos vão para o Tata box
A nível de conhecimento: rancer ou
ativador, funciona como ativador da
transcrição. ele é uma sequência de
ativação da transcrição.
No eucarioto o fator de transcrição
reconhece o tata e depois o RNA
polimerase reconhece o complexo.
No procarioto o SIGMA junto com a RNA
polimerase (fator de transcrição) e ambos
reconhecem o Tata Box.
Depois que tudo isso foi reconhecido é
caracterizado como a fase de início depois
se inicia a fase de alongamento.
Alongamento: só adição de nucleotídeos.
Terminação: tem uma sequência de
terminação, não tem enzimas que
participam. A sequência é repetida e
invertida
Unidade de transcrição - o próprio gene
que é transcrito em RNA mensageiro
Processamento de RNA- acontece apenas
no eucarioto, que é tirar o exón e intrón.
1° - O primeiro passo no processamento é
a adição de CAP (é uma sequência de
guanina, 3 fosfatos) 5’ no RNA
mensageiro.
9
2° - Na extremidade 3’ do RNA
mensageiro é adicionado a calda poli-a que
é um monte de adenina.
3° - Ocorre o Splice que é a retirada dos
intróns
Para ter a formação do RNA maduro é
retirado os intróns.
Se não acontece o Splice não vai para o
citoplasma!
A molécula abre, varias enzimas atuam no
processo de abertura e ligação do
nucleotídeo.
Proteínas da replicação:
DNA polimerase- atuam no processo de
replicação (DNA replicase), reparação
(exercendo o papel de esonuclease, tirando
o nucleotídeo da molécula de DNA) e
multifuncionais.

Replicação de DNA
São enzimas que atuam no processo de
replicação e reparação. Esse processo
necessita de varias enzimas e isso vai
variar entre procarioto e eucarioto.
 Replissomo - é conjunto de
proteínas que atuam na replicação.
 O DNA tem suas fitas abertas e
delas vamos ter o surgimento de
mais duas fitas.
 A adição de nucleotídeos é sempre
5’ a 3’
 A replicação sempre se inicia em
sequencias especificas,
ORIGENS.
 Replicação pode ser unidirecional e
bidirecional
- Uni: uma forquilha parte em uma
só direção
- Bidirecional: duas forquilhas
partem em direções opostas.
Como ocorre:
Função da replicação:
Incorporar os nucleotídeos trifosfato na
extremidade 3’ e deixa o OH livre. Porém
antes devemos utilizar os primers, a
primase
Temos:
Helicase: quebra as pontes de hidrogênio
entre aas bases, separando as duas fitas
SSB: evita torções e degradação por
esonuclease
Primase: sitio de iniciação da replicação.
São pequenas regiões de RNA.
DNA Ligase: liga a fita nova
as
Topoisomerase: é uma enzima que
desempenha papel na replicação e
empacotamento do DNA.
Fragmento de Okazaki: são fragmentos da
molécula de DNA produzidos durante a
replicação. Quando a replicação ocorre,
são produzidas novas fitas usando o DNA
de molde. A síntese dessas fitas, entretanto,

10
só pode ocorrer no sentido 5'-3' da fita da
macromolécula.
Transcrição
Nada mais é que a transferência contida no
RNA, para que possa ser feita a proteína.
Para isso acontecer temos alguns principais
tipos de RNA:
- RNA mensageiro;
- RNA transportador;
- RNA ribossômico.
RNA MENSAGEIRO
˝Transfere a informação do código
genético para um sistema de decodificaçãȍ.
Ou seja, é aquele que transfere a
informação de um gene especifico e
transforma em um RNA e inicia o processo
de transcrição. - Pode observar que a única
diferença que se tem lá na duplicação para
transcrição, é a troca (o RNA transcrito
tem o mesmo código do DNA, só muda a
timina para uracila)
RNA TRANSPORTADOR
Ele transfere aminoácidos para formar
(sintetizar) a proteína. - É responsável por
transportar o aminoácido de acordo com a
sequência do RNA . - Então temos um
RNA mensageiro, ele já foi transcrito saiu
do núcleo e está no citoplasma, pronto para
ser produzido. Ai o RNA transportador vai
e começa a lê, ou seja, ele decodifica o que
está nessa fita (imagem do slide)
RNA RIBOSSÔMICO
Conecta o RNAt e RNAm para síntese
proteica - CURIOSIDADE: As proteínas
que são feitas fora das células são feitas no
reticulo endoplasmático rugoso, porque
elas pegam um caminho passam pelo
reticulo endoplasmático rugoso, saem
vesículas e são jogadas fora das células. Já
as proteínas que são usadas dentro das
células, são usadas pelos ribossomos soltos
- O RNA ribossômico é formado por duas
subunidades: uma maior e outra menor.
RNA PRIMÁRIO
- RNA HETEROGÊNIO NUCLEAR;
- Ainda tá no núcleo;
- É o RNA mensageiro contendo a
sequência de éxons e intróns.
- Ele é apenas em procarioto
- Já no RNA maduro só está presente no
eucarioto, ele contém apenas a sequência
de éxons. E ele já está no citoplasma.
RNA POLIMERASE
Realizam a transcrição, sintetizando RNA
a partir de DNA - Na replicação usa se o
DNA polimerase, para fazer a duplicação.
Já na transcrição usa se o RNA polimerase,
que tem a função de adicionar o
11
nucleotídeo. A diferença é que em vez de Procarionte: Sigma (é o principal fatores
adicionar timina vai adicionar uracila. - de transcrição)
Não precisa de primer
1. Reconhece o promotor
O QUE SÃO FATORES DE
2. Separam a fita dupla TRASNCRIÇÃO?
3. Mantém as fitas separadas São proteínas, enzimas... Que controlam a
ligação desse RNA polimerase na região
4. Mantém DNA-RNAm estável
promotora.
5. Renatura o DNA
OBS: No procarioto o fator de transcrição
6. Terminam a síntese de RNA sigma se une a RNA polimerase e os dois
TRANSCRIÇÃO juntos vão reconhecer o TATABOX. Já no
eucarioto, o fator de transcrição reconhece
- Processo de cópia de genótipo para o TATABOX e só depois a RNA
conversão em fenótipo polimerase vem e se junta.
- Expressão gênica: RNAs e proteína -Adjacente ao promotor, há uma região
- A transcrição tem três fases; regulatória: enhancer/ativador Enhancer:
funciona como ativador da transcrição\
* Fase de início tanto no procarioto como no eucarioto.
* Fase de alongamento *bacRNAP
*Fase de terminação -RNA pol bacteriano: Se liga ao sigma

FASE DE INIÍCIO: Para a fase de início *euRNAP

acontecer (transcrição) a REGIÃO
PROMOTORA precisa ser reconhecida -RNA pol eucarioto é posicionado graças
pela RNA polimerase e esse aos fatores já ligados.
reconhecimento se dá com o auxílio de
fatores de transcrição.
ALONGAMENTO
A região promotora contém uma parte que
é conservada entre as espécies (que é rica - RNA pol catalisa a ligação fosfodiéster
em adenina e timina) essa região é ao adicionar ribonucleotídeos;
chamada de TATABOX (é uma região - Adição de nucleotídeos pelo RNA
contida na região promotora) é a partir dela polimerase;
que a RNA polimerase consegue
- Não precisa de primer.
reconhecer.
Eucarionte: Vários (enzimas, ativadores,
proteínas ....) TERMINAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO

12
-Procariotos: região de repetição invertida
rica em GC - É uma sequência de
terminação (repetida e invertida)
- Nenhuma enzima não participa
UNIDADE DE TRANSCRIÇÃO
-Sequencias de DNA transcritos em uma
única molécula de RNAm
PROCESSAMENTO DO RNA
-Acontece apenas no eucarioto, nada mais
que é transformar o primário e maduro (tira
os íntrons);
- Primeira fase do processamento é
ADIÇÃO DE CAP (é uma guanina) na 5
linha no RNA mensageiro;
- Na segunda fase adiciona uma CAUDA
POLI (A) (ADENINA) na extremidade 3’
do RNA primário;
- Na terceira fase, ocorre a retirada de
íntrons e união do éxons pelo complexo
spliceossomo.
CÓDIGO GENÉTICO
E TRADUÇÃO
Outros três códons e assim por diante, de
trincas em trincas temos 1 aminoácido.
Tradução é a decodificação do RNA
mensageiro em proteína, ele está em
código (são trincas de bases- 3 em 3 bases)
de 3 em 3 bases temos a formação de 1
códon. A cada códon corresponde 1
aminoácido. E então teremos a formação
da proteína, que são vários aminoácidos
- E como eu formo os aminoácidos?
De 3 em 3 bases que está no RNA
mensageiro, essa é a ideia geral da
tradução.
- Tem um tipo de RNA que transporta o
aminoácido, qual é ele?
O RNA transportador, ele pega o
aminoácido e transporta de acordo com o
códon que está lá.
Temos o código genético, que é como se
fosse uma sopa de letras, então precisamos
traduzi-las e isso ocorre em trincas de
bases (chamadas de códons). Se tenho
timinas ainda é o DNA, primeiro temos a
transcrição para o RNA mensageiro e
temos então as trincas.
Existem 64 códons e 20 aminoácidos
correspondentes, justamente porque vários
códons podem corresponder a um
aminoácido isso é para garantir que não
haja mutação e existe alguns códons que
correspondem a apenas um aminoácido
O QUE SÃO CÓDON: São trincas de
bases
Dos 64 códons – 61 códons que
correspondem a aminoácido (AA) e 3 de
terminação (não correspondem a nenhum
aminoácido) esses três são de parada ou
também chamada de terminação.
Quando a tradução acaba é necessário
esses códons de terminação são eles UAA,
UAG e UGA. Eles não necessitam estar
juntos.
13
Um dos 61 códons é de início – AUG
Tudo isso é para evitar que haja mutação.
O aminoácido está livre ali no citoplasma,
ele tem que ser transportado para o
ribossomo, onde fabrica. Ele pega o RNA
transportador e transporta o aminoácido
que corresponde a uma das trincas que é o
códon.
Diferença
Temos o RNA transportador transportando
um aminoácido que corresponde ao UAG,
cada RNA transportador tem seu próprio
aminoácido. O aminoácido que é carregado
pelo primeiro transportador
“correspondente ao códon de início” é a
metionina.
No eucarioto temos metionina
procarionte formil metionina.
Na transcrição é a produção de RNA
correspondente a sequência, esse RNA
mensageiro passa por maturação nos
eucariotos e nos procariotos não passa. No
eucarioto tem adição de cap, cauda poliA e
o splice (retirada dos intróns), no
procarioto já está pronto e está em código
(que está uma sopa de letra, e então vem o
objetivo da tradução que é a codificação e
transformar em proteína funcional).
1° passo – feito de 3 em 3 bases – forma o
códon
A cada códon temos 1 aminoácido
correspondente. Esse aminoácido chega no
ribossomo, através do RNA transportador.
Existem códons sinônimos que
correspondem ao mesmo aminoácido, se
eu tiver na fita GGU e ocorrer uma
mutação no ultimo par de base e formar a
GGC, eu vou mudar minha proteína? Não,
porque a sequência é a mesma, então a
existência desses códons sinônimos é para
evitar a mutação. SÓ MUDA A 3° BASE
e isso não vai mudar a sequência de
nucleotídeos, e por fazer essa mudança é
chamado de degenerados. Mas isso não se
aplica a todos, existem códons que
correspondem a 1 aminoácido.
Existem 2 partes cruciais pro RNAt, a 1° é
que ele transporta especifico dele, a 2° é
que na estrutura do RNAt ele tem uma
sequência chamada de anticódon que se
liga ao códon.
Temos o RNAt e aminoácido que
e corresponde ao codon e quem encontra ele
é o anticódon (sequência complementar).
Quando o RNAt está com o AA é chamado
de aminosiltransportador (só a nível de
conhecimento).
Existem dois tipos de RNA tanto em
eucariotos e procariotos, ambos formados
por 2 subunidades, a maior e menor e tem
nomenclatura definida de acordo com sua
velocidade de sedimentação, basta chamar
a subunidade maior das bactérias de 50S e
a menor 30S, junta 70S e a do eucarioto a
maior 60S e menos 40S, juntas 80S. a
subunidade maior e menor formam a
fábrica da proteína.
Maior- acontece as ligações químicas
Menor – RNAm se liga
RNA ribossômico:
14
- Sub maior e menor se junta formam 3
sítios – A (adesão), P (peptil) e E (exit).
São nesses sítios que o RNAt vai se ligar.
Todos os RNAt irão se ligar 1° no sitio A,
exceto o 1° que é de início que se liga ao
sitio P e o sitio E é o que termina o
aminoácido.
Diferença crucial
Nos procariotos o RNAm é reconhecido
pela subunidade menor do ribossomo em
uma região especifica chamada de sitio de
ligação dos ribossomos (RBS). Para dar
início a tradução é preciso ter 2 coisas: 1° o
códon de início – AUG e 2° o RBS
No eucarioto não existe o RBS, é
reconhecido pela CAP. O reconhecimento
se dá na CAP, o RNAm de eucarioto passa
por uma maturação adição de CAP em uma
extremidade, cauda poliA em outra
extremidade e a retirada dos intróns. É
justamente a CAP (sitio de reconhecimento
do ribossomo) que será reconhecida pelo
ribossomo.
Quando acontece o reconhecimento da
CAP ou do RBS as subunidades estão
separadas.
Para o reconhecimento do RNAm para a
subunidade menor ser reconhecidas devem
estar separadas, assim como na transcrição
temos as 3 fases que a mais chata é a de
início.
1° fase – início
-Com o RNA e a subunidade menor
montadas começa a fase de início
- O único que vai para o sitio P
- A subunidades ficam separadas, graças ao
fator de transcrição (s3)
- O que caracteriza o início é o RNA
transportador junto com a metionina
(eucarioto) ou formilmetionina (no
procarioto) no que se insere sitio P-
subunidade menor do ribossomo
-Depois de todo o processo fechou o sitio
P, a subunidade maior fecha o ribossomo
(tanto no eucarioto como no procarioto)
Fase de Alongamento
- Adição de aminoácidos
- Aos que vão chegando se liga no sitio A
Término
- Quando o RNA transportador encontra
1 dos 3 códons de término
Mutação genética
As mutações induzidas ou espontâneas de
modo geral podem desencadear vários
tipos de mutações, vamos focar: pontuais
(que ocorre tanto nas induzidas como nas
espontâneas), geralmente acontecem a
nível de nucleotídeo, de base. Podem ser
de 3 tipos: substituição, inserção e
deleção.
Substituição – não tem troca de trinca, ou
seja, não muda a sequencia
Deleção - mudança de trinca
Inserção – adiciona as trincas
15
Mutação e formas de recombinação não
estão associadas a um prejuízo, mas ao
contrário elas garantem a manutenção das
espécies
As mutações pontuais podem interferir nos
códons, nas trincas isso se chama fleidshirt
que é quando muda esses códons de
leitura. Mesmo havendo a troca de códons
pode ter uma proteína funcional do mesmo
jeito, porque os códons podem
corresponder ao mesmo aminoácido
Porque os códons semelhantes
correspondem ao mesmo aminoácido?
Para que no caso de mutações a função
proteica não seja modificada
Mutação silenciosa – eu tenho códon 1 que
corresponde a glicina e aconteceu uma
mutação e agora tenho o códon 2 que
também é correspondente, acontece
novamente uma mutação e ele corresponde
a glicina. Então temos que a função
proteica não vai se alterar, isso se chama
silenciosa.
As pontuais podem ocasionar 3 eventos
essencie, não essencie e silenciosa.
Silenciosa – mesmo havendo mutação o
aminoácido será o mesmo, não alterando a
função proteica. Por que, não altera a
função proteica? Porque corresponde ao
mesmo aminoácido, não alterando sua
função.
Existem alguns códons que acabam sendo
interferidos como em vez da timina foi
trocado adenina e isso ocasiona um códon
de parada, então a função proteica não vai
existir mais porque a cadeia de
aminoácidos não existe mais, então não vai
ter mais proteína. Essas são chamadas de
não licencie ou sem sentindo.
Licencie ou sentido trocado – ao invés da
timina ele trocou pela citosina e ao invés
da lisina outro aminoácido vai
corresponder, então eu tenho uma troca por
outra proteína. Existe outras mutações que
ocasiona o evento licencie que em ha troca
da lesão proteica devido o códon que
sofreu mutação corresponder outro
aminoácido.
Alterações moleculares podem ser do tipo
transição quanto transversais
Transição – quando uma purina é trocada
por outra purina ou quando uma pirimidina
é trocada por outra pirimidina e continua o
mesmo esquema.
Transversais – trocou uma purina com uma
pirimidina ou ao contrário também.
Dentro de mutações espontâneas podemos
ter outras classificações – estão incluídas
erros durante a replicação, pode ocorrer
algum erro ali. Mutações hidroliticas
devido o meio ser aquoso e vários íons que
pode acontecer alguma mutação e lesões
oxidativas principalmente devido a
radicais livres
E dentro de induzidas + 3 classificações
Erros durante a replicação, além de pontual
ainda temos deslises de replicação, ou seja,
16
o DNA polimerase está adicionando os
nucleotídeos e simplesmente deslisa, em
vez de adicionar on certo, ela passa batido
e começa a adicionar outros, modificações
tatometricas apresentam alguns
nucleotídeos que sofrem alguma
modificação química na sua estrutura e são
adicionados mesmo assim, essa é a
classificação de erros de replicação.
As lesões hidroliticas – fazem parte da
espontânea, podem incluir a desaminação
(tira o grupo amino das bases), se tira o
grupo amino, zoa a base e se zoa base zoa
o nucleotídeo, tira ela porque a RNA
polimerase vê aquilo como mutação.
Quando isso acontece temos uma mutação
espontânea por desaminação.
OBS: A timina e Uracila não sofre a
desaminação. Por que ela não sofre?
Porque ela não tem o grupo amino.
Depurinação: Quando eu tenho uma
pentose ligada a uma base eu tenho essa
ligação por N- glicosídica. Quando tem a
remoção da base inteira é chamada de
depurinação . Essa base pode corresponder
tanto a purina como a pirimidina, porém
ele tem esse nome, porque normalmente
acontece nas purinas, mas pode acontecer
nos dois. De qualquer forma acontecendo a
depurinação ele fica só com o fosfato e a
pentose e não tem mais base e se não existe
mais base, vem a DNA polimerase de lá e
tira o defeito.
REAÇÃO INDUZIDAS: Pode ser
química ou radioativa. Por agente químico
funciona como análogo (como se o agente
químico fosse protagonista, como se ele
invadisse a fita) , por exemplo: Você está
no laboratório se, luva, mexeu com Bromo
e aí o contado promoveu uma alteração em
você. Então, ele foi induzido por agente
mutagênico (bromo.). Já as induzidas por
radiação são vários tipos de mutação que
podem ser ocasionadas por radiação
ionizantes solar, por exemplo. Uma muito
importante é formação de dímeros de
timina, por exemplo: a radiação UV causa
uma mutação do tipo de dímero de
pirimidina (timina) na qual, pareiam entre
elas * são formados principalmente
mediante a ação de radiação ionizante*.
Recombinação gênica
O DNA sofre essas mutações que
comentamos semana passada, por deleção,
substituição... e uma forma do organismo
suprir essa alteração é através de algum
tipo de reparo, mas isso acontece algumas
vezes, não sempre.
Recombinação e nem mutação são
sinônimos de prejuízo, então acontece um
tipo de mutação nessa sequência de DNA
que pode ou não ter reparação, se houver.
Como podemos ver temos um DNA
lesionado posso ter a reparação correta que
vai ter um DNA restaurado, pode ter uma
reparação incorreta ou pode não ter. Em
ambos os casos terá um DNA lesionado e a
perda da atividade dessa proteína ou
manter a evolução. Então temos essas 3
alternativas, na não reparação e reparação
incorreta podemos continuar com esse
DNA alterado ou simplesmente pode
perder a atividade da proteína.
17
A recombinação e mutação nem sempre
são sinônimos de prejuízo pode ser a
manutenção ou evolução da espécie.
Mas se essa espécie não estiver para
evoluir e sim para participar da reparação
temos alguns tipos importantes: revisão de
leitura
Revisão de leitura- acontece pela enzima
esonuclease, tem funcionalidade pela
própria DNA polimerase, nesse tipo de
reparação o próprio DNA polimerase vai
adicionando nucleotídeo, encontrou um
erro qualquer que seja, ela mesmo volta e
tira esse nucleotídeo e ela mesmo adiciona
de novo, então a DNA polimerase pode
atuar como uma esonuclease do tipo de
reparação de revisão de leitura.
Cada tipo de reparo tem uma enzima
diferente.
Reparo direto- temos a reparação com
fotoliases, lembra que falei a vocês que
existe um tipo de mutação que é chamada
de dímero de pirimidina ou de dímero de
timina, principalmente da timina em que as
duas timinas da própria fita se encontram e
formam a ligação entre os nucleotídeos,
nesse tipo de dímero de timina quem
repara são as fotoliases, associando de
forma direta os dímeros de timina acontece
devido a uma exposição a radiação.
Reparo por excisão- por glicosilases,
quebram a ligação em glicolítica,
lembrando que a base nitrogenada, esta
ligada pela pentose pela ligação n-
glicosidica, então as glicosilases tiram essa
base. Com isso não temos as bases e é
retirada os nucleotídeos.
Esses são os 3 tipos
Genes SOS- passam a ser ativos quando
ocorrer a mutação, o próprio gene pensa
“pô tenho que produzir essa proteína que
vão reparar a mutação” eles só são ativados
quando ocorre a mutação.
Existem vários tipos de reparo, mas o
principal é a reparação do DNA a nível de
quebra dupla, quando acontece uma
mutação a nível de dupla fita. As fitas se
baseia na fita de baixo como molde, elas
invadem e copiam a sequencia de baixo.
1- As fitas do DNA 1 são quebradas
devida algum tipo de mutação, a do
DNA 2 está integra que vai servir
como molde
2- Uma das fitas invade o DNA 2 e
então ela começa polimerializar de
acordo com a sequencia dessa outra,
porque são homologas (são
semelhantes)
3- Tem um momento que elas se
cruzam
Recombinação por fitas não homologas
Não tem DNA 1 e 2, não tem essa questão
de cromátide irmã. A fita lesionada, usa da
mesma fita, encontra na mesma fita similar
e utiliza dela mesma, então elas
recombinam entre elas
Se o DNA não conseguir reparar de forma
nenhuma?
- Teremos uma alteração a nível proteico
(não vai ter proteína ou será reparado) ou
vamos evoluir para a evolução
18

Recombinação genica – começa agora o
assunto para o teste
Recombinação e mutação não são
sinônimos de prejuízo, elas contribuem
para a manunteção da espécie e adapatação
seletiva
Na recombinação existem dois tipos:
homologa (tanto para reparar como em
casos fisiológicos) em casos de reparo do
DNa é o que acabamos de ver e casos
fisiológicos vamos ver agora. Temos então
recominação homologa e não homologa,
especificamente chamada de sitio
especifico que é capacidade do DNA de se
encontrar, e se encontram e pegam a
sequencia um do outro, chamado de
rearranjo que nada mais é as próprias
sequencias de DNA de cromossomos
homólogos relacionados.
Um exemplo fisiológico, lembrando que a
recombinação homologa pode ser em casos
de reparo de DNA e fisologico, um
exemplo é crossing over que acontece nos
eucariotos. Vamos focar mais em
procarioto.
Vocês estão vendo uma fita cruzando com
a outra, esse ponto é chamada de
heteroduplex, tem duas coisas ali, detalhe
nessa recombinação fisiológica tem uma
diferença de recombinação por reparação
(temos uma mutada e uma integra), na
fisiológica as duas são clivadas
(quebradas) o outro detalhe é que na
recombinação homologa a quebra pode
acontecer em qualquer lugar, na
recominação homologa por reparo de
mutação o DNA 1 é clivado e o DNA 2 é
invadido já que esta integro.
A partir do momento que se encontram
formam a estutura de coliman, assumem
essa estrutura quando se recombinam. o
DNA 1 esta apresentado pela fita cinza e
preta, o DNA 2 pela rosa e vermelha, eles
se clivam entre eles e formam a estrtura de
Holidan. Assumindo essa forma eles tem
que clivar de novo, não vao ficar com a
estrtura de cruz, então o que acontece vem
uma endonuclease e cliva que pode ser na
direção da seta 1 ou na direção da seta 2.
Na seta 1 é chamado de recombinante
combinado e na seta 2 recombinante
remendado. Depois da estrtura de holiven
(que é uma cruz) pode ter duas formas de
clivagem
Tanto a clivagem quanto a recombinação
na sitio especifica elas clivadas e
recombinadas por recombinases é diferente
da recombinação homologa são clivadas
pela endonuclease e ligada pela DNA
ligase
Na recombinação sitio especifica não é
necessário que sejam homologas, tem que
ser uma região especifica, exemplos de
recombinação ditio especifica fagos e
transposons
Transformação é um tipo de recombinação
em procarioto acontece em células que
necessariamente não precisam estar juntas.
O cromossomo de uma bactéria, passa a se
inserir no cromossomo de outra bactéria,
mas essa bactéria que dou geralmente é
lisada (morta, informação importante
podem estar separadas. A célula receptora
é chamada de competente, ela então vai
19
captar o material genético e quando ela faz
essa captura, normalmente faz de uma fita
só. Então quais são as ações: proteínas que
se ligam (na fita roxa) se ligam na fita
simples, tem ação da nuclease e tem a ação
da reque-A (catalisa a recombinação da fita
simples com o cromossomo da célula
competente). Esse é um dos mais
importantes para produzir vacinas, pra
biotecnologia
Transdução o cromossomo é transferido
via bacteriófago, tem dois tipos
generalizado e especializado
Generalizado – vem o fago e injeta o seu
material genético, percebam que nenhum
momento ele entra no cromossomo, isso é
chamado de lítico (vai destruindo a célula
toda) a lisogênica não, entra no
cromossomo e fica lá, como acontece na
herpes e do nada pode entrar no sitio lítico
que é quando se ativa e sai destruindo a
célula, então tem dois ciclos. No
generalizado temos a ação do sitio lítico no
material genético do fago entra na bactéria
promove a destruição total do cromossomo
todo e sai empacotando os víriuns (são
estruturas que os vírus fazem após invadir
a célula em que utilizam o nosso próprio
material para se reproduzir). Quando ele
cmeça a fazer o sitio lítico, começa a
empacotar vários pedacinhos, em que
nessa ele pode tanto empacotar tanto
cromossomo verde da bactéria, quanto o
cromossomo dele mesmo que é o do vírus,
ou seja, sai o virium com o DNA do vírus e
da bactéria. O problema nessa
recombinação é que ele fragmenta de
forma aleatória, então raramente essa
sequencia vai servir, pode ser que nessa de
destruir ele fragmente a de um gene
especifico, e esse gene dentro do vírium
pode transmitir para outra bactéria, isso é
mais difícil de acontecer
Especializada – no sitio de cromossomo
ele entra e começa a fazer parte diferente
do outro. O virium contem o gene
especifico da bactéria, tem a recombinação
quando o viruim sai com esse gene
especifico e injeta em outra bactéria e essa
matéria fragmentado pode se inserir no
cromossomo da outra bactéria.
Conjugação – contato direto com as
bactérias através do pili (extensão
citoplasmática), temos basicamente 3
formas e fazer a conjugação, a 1° é quando
uma célula que tem o pili vai passar o
plasmídeo (duplicam o plasmídeo e passam
a cópia) para a f menos. F + passa a cópia
do plasmídeo para F-, no final desse tipo
tem as duas F+, porque as duas agora tem
o plasmídeo.
2° forma - O plasmídeo é inserido no
cromossomo da própria bactéria, chamada
de hFr (alta frequência de recombinação)
3° forma de conjugação – quando a célula
que tem o hfr, que tem um pedação de
plasmídeo no cromossomo passa para uma
F-, só que isso não surte efeito porque o
plasmídeo não está completo e permanece
f- (continua sendo f- porque não tem o
plasmídeo completo
Controle de expressão
.
20
É o controle de um gene que vai ser
expresso, então nem sempre o gene vai ser
transcrito para RNA e depois traduzido
para proteína porque isso seria muito gasto
de energia, principalmente para os
procariotos.
Quais são os fatores que influenciam nessa
expressão genica?
Temos vários fatores como doenças, a
própria fisiologia, ambiente então são
vários mecanismos que levam os genes a
serem expressos, o exemplo clássico é o
leite.
De uma forma aproximada o ser humano
tem 30 mil genes. Então esses fatores vão
interferir na forma de expressar ou não
esses genes.
Genes constitutivos – são os genes
expressos de uma forma constante, forma
frequente. Como por exemplo: os genes
envolvidos na síntese de enzimas presente
na glicólise, ele é o substrato natural para
se obter o ATP. Se vocês verem essa
chavinha temos o on e off, esse gene está
sempre on, a condição desse gene é sempre
ligada, significa que sempre está
transcrevendo, sempre tem proteína
correspondente a esse gene.
Genes induzíveis – tem condição do modo
desligar, porque ele vai precisar de um
indutor para que o gene seja transcrito, é
preciso de algo para estimular, das duas
chaves ele seria o off, geralmente está
associado a procarioto
AMBOS TÊM OS DOIS, justamente pela
questão das bactérias para ter realmente
esse controle para não gastar as energias.
Só faz aquela enzima se tiver o indutor no
meio.
O gene regulador, promotor e os genes.
A região promotora tem uma região que o
RNA polimerase se liga caracterizada pela
adenina e timina, o tata box. Dentro desse
promotor temos uma região que vamos
conhecer hoje que se chama operador.
Promotor – dentro dele tem uma região
rica em adenina e timina em que o RNA
polimerase se liga, adjacente a ele temos
uma região que ainda faz parte do
promotor que é chamada de operador, é
muito importante para a regulação.
Região de regulação vai sintetizar, vai ser
responsável por codificar a proteína
chamada de repressor.
Temos 4 nomes para não confundir.
Regulador - faz parte do operador e produz
o repressor
Repressor
Promotor – tem duas regiões o tata box e o
operador
Operador
Como temos mais de 30 mil genes, seria
impossível estudar todos eles, então vamos
entender a dinâmica da regulação, temos
como um exemplo o óperon lac que é bem
estudado, mas lembrando que temos vários
outros, esse é apenas um exemplo.
O óperon lac é um agrupamento de genes
que vem simbolizado com essa letras, cada
gene faz sua função. Não vamos focar na
função do gene vamos entender como
funciona essa dinâmica.
21
Na presença de lactose, esses genes (o
óperon) é estimulado a ser produzido,
Repressão catabólica- na presença de
quando não há presença ele tranca e o gene
substratos prioritários e outros são
fica inativo. Como que isso acontece?
reprimidos. Na presença de glicose, ela é
Como ele pode ser ligado e desligado?
sempre prioridade, assim que acaba e tem a
Como acontece essa dinâmica?
lactose ela então começa a ser utilizada e
Vamos supor que nesse meio de cultura começa a transcrição do óperon lac.
tem a ausência de lactose, os genes não
precisam sintetizar mais as enzimas para
não gastar mais energia, então como que Os eucariotos temos vários elementos já
acontece esse bloqueio? que é um ser mais complexo, neles podem
ter genes que podem estar separados e
O regulador vai sintetizar o repressor, ele
denominados SIS e TRANS.
vai se ligar ao operador e então a RNA
polimerase não consegue se ligar ao tata e Os fatores de regulação ou elementos de
não consegue transcrever. regulação que estão presentes de forma
adjacente (do lado) do gene são chamados
Na ausência da lactose os genes/óperons
de SIS e os distantes em outro cromossomo
estará desligado, significa que ele não vai
são o TRANS.
transcrever. Como acontece?
Além dos fatores de regulação existem
Quando o repressor (sintetizado pelo gene
outras regiões nos eucariotos henracer e
regulador) se liga no operador impedindo
silenciador, uma ativa e o outro bloqueia.
que o RNAp se ligue ao tatabox não
ocorrendo a transcrição, normalmente esta Henracer – ativa
desligado porque ele precisa de um Silenciador – bloqueia
estimulo para ser ligado.

Regulação positiva- é quando o gene está

Temos a lactose nesse exemplo
funcionando como um indutor, essa
bolinha verde e para que o gene comece a
transcrever ele vai se ligar no repressor sai
do operador e o RNAp vai poder
transcrever. pronto para ser transcrito, ou seja, quando
o indutor ou ativador, se liga no repressor
ativando o gene.
Na presença de um indutor como por
exemplo a lactose o gene passa a Regulação negativa – quando o repressor
transcrever a partir da ligação do indutor a está ligada no operador bloqueando é uma
ele se ligar ao repressor, dessa forma o regulação negativa, ou seja, nessa
repressor se desliga do operador deixando regulação – a condição normal do gene é
livre a ligação do RNAp e a transcrição. desligada, mas comum no procarioto.

22

Extração do DNA
Nada mais é que uma técnica da biologia
molecular, ela deve ser a primeira técnica a
ser realizada para começar qualquer tipo de
análise, claro que existe outras analises que
não dependem só da extração do DNA.
Então o nome é bem sugestivo você tira o
DNA seja de procarioto ou eucarioto e
trabalha com ele. Então a partir da extração
temos as outras técnicas, PCR,
eletroforese, sequenciamento, então
quando falamos que vamos fazer a PCR
saiba que o DNA foi extraído antes, por
isso ela vem com a primeira aula já que o
que vem antes dessas técnicas.
Aqui vamos ter um gel de eletroforese, tem
um leadder que é um marcador de peso
molecular, ele é um liquido que você sabe
o peso molecular dele, por exemplo essa
banda aqui tem mil pares de base, essa
outra tem 750 pares de bases e assim por
diante, então você vem com sua amostra e
aplica, o que der de positivo, eu sei que a
banda que amplificou, por exemplo tem
3000 pares de bases e se eu to trabalhando
com aquele gene, eu sei que ele tem mais
ou menos esses pares de bases. Por
exemplo: eu estou trabalhando com um
gene que codifica a lactose, aquele gene
tem 50 pares de base, se eu colocar ele
aqui vai saber que é ele? Não, entende?
Então eu trabalho em relação ao tamanho
do gene.
Se eu for fazer a extração de uma bactéria
eu vou precisar fazer o cultivo dela antes,
se for de uma amostra, eu vou precisar
primeiro extrair o DNA para em seguida
vim com as analises subsequentes. Então
eu vou ter como requisito a extração e
depois seguir a analises, claro que existem
técnicas que não será necessário a
extração.
Quais são as amostras que trabalhamos na
extração? Podem usar qualquer tipo de
amostra com o tanto que tenha DNA, como
faz PCR e a pessoa sabe que está com
COVID? É a extração do RNA. Quando
temos um teste de paternidade será
extraído o DNA do filho e do suposto pai e
observamos as bandas de DNA, o exame
sempre da 99,99%, já que pode ter a
possibilidade de ter um erro. Para fazer o
teste de paternidade e ou o laboratório de
pesquisa é preciso fazer a extração do
DNA. As amostras mais recorrentes são a
da saliva, sangue e de bactérias.
Digamos que queremos confirmar a
espécie bacteriana, isso geralmente não é
feito em clínica, porque seria muito
custoso, então digamos que estamos em
um laboratório de pesquisa tem uma
bactéria que estamos querendo descobrir a
sua espécie fazemos o seu cultivo e assim
que ela cresce vamos fazer a extração dela
no PCR, em que vamos ter os genes, os
primers que falaremos depois em PCR.
Temos um banco de dados que vamos
observar qual é a da bactéria que está
batendo com a do banco, então será que
essa bactéria de estafilococus áureos é
resistente a penicilina ou não? Qual a
diferença entre as duas? A estafilococus
áureos apenas não é resistência a
penicilina, já essa linhagem é resistente é
chamado de MRSA ele tem um gene
especifico o MEC-A é o que difere de
MRSA para o estafilococus normal que é
sensível a antibiótico, então como vou
saber se é resistente ou não? Então eu jogo
ela no PCR o MEC-A, se ela tiver beleza e
23
provavelmente então é ela, então tudo isso
é para ver se tenho aquele gene mesmo.
Então tudo é feito com a iniciação da PCR,
então mulheres gravidas podem fazer o
PCR para ver se suspeitam que a criança
tem alguma doença, então é retirado a
célula da placenta para ver bate com
alguma doença.
Como vou saber se é aquele gene? Eu vou
lá no marcador e vejo é um trabalho
manual.
Ela mostrou o teste de paternidade, ele não
trabalha com um gene, trabalha com vários
genes para descobrir quem é o pai e por
conta disso, o exame se torna mais caro
quando é feito somente com o pai e o filho
e quando é feito com o pai, o filho e a mãe
é mais barato já que se torna mais fácil
conseguir o resultado.
o objetivo então é extrair o DNA e também
RNA.
Primer é especifico para o gene.
Qualquer outro material pode acabar
interferindo no resultado do material, por
isso, deve ter muita atenção para não
ocorrer interferência no resultado. Extrair
tem as palavras chaves: extrair, purificar
porque eu quero o material genético puro,
somente ele, sem contaminação isso é
muito importante.
Vamos ver algumas etapas pré extração,
então antes de extrair o DNA
especificamente em procarioto, antes de
extrair o DNA da bactéria, temos que ter a
certeza que é ela, não posso ter outras
bactérias misturadas. Então existem
algumas técnicas pré extração para que eu
possa isolar aquele material.
1° temos o cultivo, pode ser feito em caldo
nutriente ou em meio de cultura, é mais
sugestivo fazer em caldo já que ele tem
mobilização melhor, ele simula o
ambiente, então para as células isso não é
tão estressante, já que não tem uma
mudança tão grande do meio, isso não
invalida passar no agar, existem milhões de
protocolos, esse método é o mais viável.
Então por exemplo passamos o swab na
privada e jogamos no caldo e no outro dia
temos o meio turvo e vocês concordam que
aqui não temos só a estafilococos temos
outras espécies, porém eu quero a extração
de estafilo então eu começo a restringir
aquela espécie, então jogou em uma agar
seletivo e cresceu uma colônia sugestiva de
estafilo, em que foi utilizado o meio sal-
monitol que é seletivo para o estafilo,
porque ele cresce em meio salgado. Então
digamos que cresceu uma colônia
sugestiva e você começa a fazer os testes
bioquímicos.
2° teste bioquímico
Que é muito importante, há vários tipos de
testes para cada espécie. Então encosta a
alça, joga ele em um meio para começar o
crescimento e faz o teste bioquímico. Eu
preciso então da esterilidade do teste para
que a gente consiga ter somente ele e não o
crescimento de colônias que não são de
interesse, isso em humano é mais fácil. A
bactéria é mais difícil porque tem todo esse
processo até conseguir isolar somente ela.
A palavra chave para extração do DNA,
principalmente em procarioto é realmente
isolar essa célula e purificar o material,
essas são as pré etapas de extração.
Etapa da extração:
24
Eu trouxe 4 partes para vocês, agora saiba
que existem milhares de técnicas. Então
vamos começar a extrair o material
genético na etapa de pré extração eu
preciso isolar essa célula, então em caso de
bactéria tenho que isolar o máximo que
conseguir, no caso de humanos é mais fácil
já que é mais especifica, é o sangue,
sêmen. Então isolou essa célula eu começo
com a extração com a lise celular, porque
eu quero atingir o material genético então é
preciso digerir a célula.
1° lise celular
2° remoção dos lipídeos, principalmente os
da membrana plasmática e da carioteca
3° remoção das proteínas inclusive as
histonas.
4° precipitação do DNA
Lise celular
Nada mais é que o rompimento da
membrana plasmática, onde possui uma
bicamada lipídica no meio hidrofóbico e
suas extremidades possuem afinidade com
a água, temos os lipídeos recobrindo essa
membrana então para lisar essa membrana
plasmática posso usar vários meios para
isso como bioquímico principalmente em
laboratórios mais pobrinhos procuram
vários meios, como por exemplo a
utilização de detergente. Os mais utilizados
para a lise celular é o tampão de lise, então
para lisar a membrana temos os fins
físicos, químicos, bioquímicos, existem
protocolos que tabém utilizam enzimas
para lisar a membrana, outra forma é com
o vórtex é que ele faz a lise da membrana
fazendo a agitação do material que está
presente no tubo, uma forma física é as
pedras vidro. Todas essas técnicas é para
romper a membrana.
Remoção Lipídica
A segunda etapa é em relação lipídica,
utilizando métodos para retirar a os
lipídeos, utilizando detergentes específicos
para isso, temos a utilização de enzimas
que vão degradar os lipídeos que estão ali
contaminando o local, podemos usar as
lisoenzimas para degradar os carboidratos
ali presentes, quanto mais etapas de
limpeza você fizer na extração mais pura o
DNA vai ficar.
Depois que fazemos a lise, tem essa
contaminação na célula, fazemos essa
etapa lipídica para retirar esse teor de
proteína, lipídeos usa também detergentes,
nessa etapa dois pode ser utilizado o SDS-
PAGE que é para ver a fragmentação da
proteina.
Se eu tenho a membrana degradada eu
tenho a sujeira e para tirar essas impurezas
e ter somente o material genético eu
preciso do uso dos detergentes para tira-los
e ficar com o material, então depois que
faço isso, tenho a separação de fases, no
exemplo temos a célula que foi usado a
SDS proteanase K, aqui tem a célula, tem o
apendorfe, temos a célula integra e
digamos que aqui tivemos a ruptura, 1°
fase, beleza. Teve então a adição de SDS e
proteanase K significa que eu vou limpar
esse material genético, então esse material
fica em cima e os lipídeos acabam
descendo e é nessa etapa que temos a
separação de fases.
Essa fase é chamada de fase aquosa que
tem o material genético e as fases dos
lipídeos é chamada de fase lipídica ou
25
também orgânica, tem resto de lipídeos,
proteínas degradadas, e então você vem
com a pipeta e puxa só a parte de cima e
passa para um tubo estéril.
Pegou a fase do DNA puro e jogou em um
tubo estéril nesse tubo o DNA genético o
queremos no fundo e separado da água e
para isso, usamos o álcool absoluto ou
isoproponol que faz descer e fica com a
pallet (é um formato que fica no fundo do
tubo)
Precipitação – última fase
É o uso do álcool absoluto e isoproponol
que vai formar o pallet que é um
acumulado de alguma coisa, no nosso caso
é o material genético.
Vamos imaginar colocamos o material no
tubo em uma centrifuga e deixamos lá,
quando a fomos retirar ela vai estar
inclinada verticalmente já que a centrifuga
os tubos ficam inclinados. Então tira esse
álcool ou isoproponol e assim está pronto
para você utilizar esse material genético
para outras técnicas como o PCR,
sequenciamento, eletroforese, então é
importante você ter esse material genético
ali extraído
Informação extra:
Esse aparelho se chama nanodrope porque
ele é usado? Concorda comigo que esse
material genético pode ser mais ou pode
ser menos, comparada com outros tubos
que você esteja fazendo? Então para a
gente conseguir padronizar utilizamos o
nanodrope.
PCR
É uma técnica que simula a replicação a
partir de temperatura e alguns reagentes,
então todas a técnicas são básicas a pessoa
que está por trás, o biomédico deve saber o
princípio. PCR é da sigla inglês e significa
a reação em cadeia da polimerase (é a
enzima que vai adicionando), então nela
vamos amplificar o gene de interesse para
a duplicação de milhares de copias dele,
duas coisas importantes para relacionar
com a PCR a 1° é a amplificação, de uma
copia eu tenho milhares à milhões de
copias, 2° coisa é que eu tenho essas
copias do meu fragmento de interesse, por
exemplo eu quero saber se a pessoa tem
um tipo de gene então vou usar essa
técnica, no final o que vai estar duplicado é
aquele meu gene de interesse e como faço
isso? Através dos meus reagentes.
Tudo que acontece na replicação
Então tenho genoma que é o que extraiu e
esta no empedorfe, trato ele e jogo os
reagentes e no final tenho ele todo
amplificado e o segmento de interesse e
como ele simula a reação? Através de
agentes que simulam as enzimas que são
na verdade as próprias enzimas, algumas
delas e a temperatura.
Então para fazer o PCR eu uso o genoma e
alguns reagentes e alguns deles são
enzimas que na replicação in vivo fazem
parte do replissomo.
Amplificar fragmentos específicos, então
quero saber se fulano tem aquele gene, eu
extraio o DNA 1° e vou amplificar, é usado
no diagnostico de doenças, controle de
qualidade.
O essencial para entender a PCR é
entender o replissomo porque o teste de
PCR simulamos tanto as enzimas em
26
forma de reagente quanto também a
temperatura aplicadas nessa técnica.
Relembrando
Ligação entre a pentose e fosfato é ligação
fosfoester
Ligação entre a pentose e a base é n-
glicosidica, porque esta se tratando de uma
pentose um sacarídeo
Ligação entre as bases de duas fitas é por
ponte de hidrogênio que são cruciais para a
PCR
Ligações entre nucleotídeos da mesma fita
ligação fosfodiéster
Na PCR eu uso o principio da desnaturação
e renaturação, na desnaturação eu vou
romper as pontes de hidrogênio e renaturar
é voltar com elas, na replicação in vivo
vamos utilizar isso, na replicação quem vai
separar in vivo é a helicase (separa as
pontes de hidrogênio), na PCR quem
separa é a temperatura, quem aumenta a
temperatura é um aparelho chamado de
termociclador.
Na PCR não temos a atuação do RNA,
somente dos reagentes específicos. Onde a
helicase trabalha em in vivo nas pontes de
hidrogênio vamos ter na PCR a
temperatura
Componentes
1° Componente - DNA amostra,
precisamos da amostra para realizar a
técnica, so que ali temos o genoma inteiro
que acaba sendo amplificado, mas o que
vai ser amplificado em milhões de copias
no final da reação será o nosso fragmento
de interesse, que acontecerá com os
primers que vão selecionar o nosso
fragmento de interesse.
2° componente - Primers ou também
chamados de iniciadores são fragmentos
que reconhecem as extremidades desses
genes de interesse, são utilizados dois, um
pra ir e outro para voltar. Primer é a
sequencia da extremidade e como vou ter
essa reação? Vamos pesquisar no blaste
que é um banco de dados, onde possui
milhares genes, você vai procurar o que
esta querendo para utilizar na reação, pega
as sequencias da extremidade e manda
fabricar.
Dependendo da sequência do primer se
tem maior conteúdo de adenina e timina a
temperatura de desnaturação pode ser
menor, por conta da ligação possuírem
apenas 2 pontes de hidrogênio e se o
primer for para ligação que possua maior
quantidade de guanina e citosina pode
utilizar uma temperatura até 96°C.
Temos dois primers – F e R (reverse)
sempre vamos trabalhar com o par de
primer, ele representa o gene especifico. O
par de primer é desenhado de acordo com a
sequencia já conhecida e como que
conhece? Através do banco de dados.
3° componente- TAQ polimerase, é DNA
polimerase proveniente de uma bactéria
hemofílica, então essa bactéria
termoaquatica foi isolada de uma região
vulcânica por ela ter a capacidade de
sobreviver a temperatura elevadas, então a
TAQ foi retirada dela, para ser utilizada no
termociclador, já que trabalhamos com a
oscilação de temperatura nesse aparelho. O
que aconteceria se pegássemos uma DNA
27
polimerase de uma bactéria proveniente de trabalhando com um genoma e pego os
um estafilococos áureos? genes específicos então tudo tem que está
estéril porque se não, vai acabar alterando.
Esse DNA polimerase se desnatura por
conta da temperatura Outra coisa é que ela completa o volume
total da reação de PCR.
O DNA polimerase é a TAQ polimerase
4° componente – nucleotídeos.
mix- nele temos todos esses componentes,
São adicionados também os DNDPs, são
exceto o DNA que não faz parte dele ao
os nucleotídeos. Desoxinucleosideo
menos que você esteja trabalhando com
trifosfato significa que estou trabalhando
apenas uma amostra. esse mix vai
com o nucleotídeo que tem 3 fosfatos, à
depender do protocolo, existem mix que o
medida que vou adicionando vai saindo
volume final tem 20 microlitros ou 30
dois fosfatos.
microlitros, enfim cada um vai ter um
5° componente – cloreto de magnésio, ele volume, por exemplo a TAQ vai ter 20
atua tanto sendo cofator da enzima TAQ microlitos, cada componente vai ter um
polimerase, ela se torna funcional a ponte volume. No final, por exemplo se eu tiver
de ir adicionando os nucleotídeos 10 microlitros de cada um, como que eu
Função 2 – ele diminui a repulsão complemento pro volume final?
eletrostática, quando temos ions de carga Colocando 10, no volume final. Então a
igual e então eles se repelem, o DNA é agua serve para complementar o volume
negativo por fora e para que não ocorra a final do mix.
repulsão já que ele precisa ficar
E quanto tem que ter no volume final? Vai
empacotado vem o cloreto de magnésio e
depender do protocolo.
então ele consegue se juntar e a fita vai se
enrolando E quanto tenho que colocar dos
componentes? Vai depender do protocolo.
Cofator – é uma unidade que pode ser um
íon, como por exemplo o cloreto de
magnésio, ele se junta e forma a enzima
O mix é a mistura de todos os
inteira, sem ela a enzima não se torna
componentes.
funcional.
Se eu for trabalhar APENAS com 1 DNA,
Sem ele não consegue se ligar ao substrato,
eu posso adiciona-lo no mix, se for
ele forma um aloenzima que é uma enzima
trabalhar com o DNA de varias pessoas,
funcional. Elas duas juntas podem se ligar
faço o mix separado e distribuo em cada
ao substrato.
DNA em cada pote diferente.
6° componente – tampão de reação vai
O que eu preciso então para fazer a PCR?
ajudar a garantir o Ph dessa reação, ajuda
como um estabilizador de Ph Preciso de todos esses componentes e o
termociclador (serve para a PCR e é um
7° componente – água ultrapura, ele tem
equipamento que vai trabalhar com a
que ser ultrapura porque se estou
28
oscilação de temperatura, então ele confere
aquecimento e resfriamento da amostra)
Então no termociclador colocamos as
amostras e fechamos a tapa, os reagentes
estão todos ali, o que falta agora é a
temperatura, e esse aparelho oscila a
temperatura em 3 etapas.
Ele possui 3 ciclos -1,2,3 e então ele volta
para esse ciclo cerca de 20 a 30 vezes.
Cada finalização dessa etapa é chamada de
ciclo, por exemplo 1,2,3 é um ciclo e
depois volta. Então no final de cada ciclo
temos a replicação, no final de 30 ciclos
temos milhares de copias
Temperatura: é a parte crucial
Etapa 1- 94°C
Chamada de desnaturação, que acontece
mais ou menos a 95°C, o que vai
determinar se vai ser 94,95 ou 96°C?
O conteúdo do primer e o tamanho do gene
também. Se eu tiver G e C (guanina e
citosina) subo para 97°C. nessa fase ocorre
a desnaturação da fita do genoma todo, no
aparelho fica mais ou menos 2 minutos a
94°C.
Etapa 2- 50 a 65°C
Chamada de anelamento, é acoplar o
primer no local de interesse. Pode ocorrer
dele se acoplar em genes que não são do
nosso interesse, mas o que estamos
buscando será o que possui as bandas
maiores
Etapa 3- 72°C
Chamada de amplificação ou elogamento,
onde tem a atuação da TAQ polimerase,
adicionando as DNDPs. Vamos ter no final
a amplicação do gene todo, porém será
mais do gene de interesse.
No final de 25 a 30 ciclos temos milhões
de copias, ocorre o crescimento
exponencial, ao mesmo tempo que temos a
amplificação do gene de interesse temos
também do genoma inteiro.
Com o gene de interesse podemos fazer
varias coisas, como a eletroforese e outras
técnicas.
Na hora de fazer o mix colocamos o
tampão primeiro e por último a TAQ já
que ela é bem trabalhada. Além disso,
quando vamos prepara-lo temos que fazer
uma quantidade a mais, por exemplo vou
fazer para 10 amostras, faço então para 13
ou 14, porque no final vai faltar por conta
do erro de pipetagem, é multiplicado todos
os componentes, menos o DNA para fazer
o mix.
Eletroforese
É uma técnica que vem após o PCR, onde
vamos visualizar os fragmentos
amplificados. Para que serve a
eletroforese? É a corrida de fragmentos
que depois que foram amplificados para
conseguirmos observar as bandas de DNA.
Se baseia na diferença do potencial elétrico
e ele é promovido por um campo elétrico,
o positivo e o negativo. A posição do pente
vai influenciar também. É uma técnica que
vai se basear no tamanho e carga da
molécula.
29
O DNA possui carga negativa e por isso
ele vai ser atraído para o polo positivo,
porque ele possui o oxigênio que tem carga
negativa.
La na PCR posso amplificar diferentes
genes, posso colocar 1 par de primer, 2
pares, se por exemplo eu colocar 2 o
primer 1 pode ser responsável por
amplificar o gene que possui 100 pares de
bases e o primer 2 se anela amplificando
uma sequência que possui 500 pares de
bases, concorda que 1 vai ficar retido e o
outro vai descer?
Porque o gel de agarose possui malhas
(buraquinhos) permitindo que o mais
pesado fique retido e o mais leve desça,
então temos a banda mais leve la embaixo
e a mais pesada retida, temos dois
princípios básicos.
1° tamanho- o mais pesado fica retido na
ponta do gel, mas próximo a aplicação e o
mais leve desce
2° carga – independentemente do tamanho
todo o DNA vai correr para o positivo
E como consigo diferenciar um do outro?
O mais pesado fica retido e o mais leve
desce.
A diferença entre os genes é o TAMANHO
Aplicação
A primeira filiera é o marcador de peso
molecular e com consigo comparar com o
tamanho do fragmento.
Por esse motivo que em uma mesma
reação, eu não posso usar dois ou mais
pares de primers para amplificar a mesma
quantidade de pares de bases, porque se no
mix
Cor influencia?
Se tiver uma banda muito fraca, você pode
suspeitar que ocorreu amplificação.
A importância do controle negativo que é
para ver se algum dos reagentes está
contaminado, ele é colocado puro, sem
conter o DNA, se amplificar nele é porque
esta contaminado e vai ter que fazer de
novo.
Se eu usei apenas um par de primer quer
dizer que eu apliquei apenas um
fragmento, você pode usar vários pares de
primers se você quiser, porem isso pode
causar interferência, basta não ser o mesmo
tamanho de fragmento.
Componentes do gel de agarose
Agarose é tipo um meio de cultura, ele é
um polissacarídeo e forma uma malha,
então são vários monômeros formados por
galactose, podem ser de diferentes
concentrações, então quanto mais
concentrado, mais separado eu consigo ter
esses fragmentos.
É correto eu usar um par de primer que
amplifique o fragmento que amplifique
100 pares de bases e outro que amplifica
105 pares de bases?
Não vou conseguir visualizar, agora se eu
tiver um com 100 e outro com 150
dependendo da concentração eu consigo
visualizar.
30
Se eu fizer o gel mais concentrado eu
consigo visualizar melhor. Então não é
recomendado utilizar pares de primers de
fragmentos muito próximos, existem
algumas exceções que podem ser utilizados
os fragmentos próximos 1° 100 à 150 e o
outro fator é a concentração do gel.
Na concentração do gel vamos ter 0,5% e
3%, então quanto mais concentrado, ele
fica mais retido e assim eu consigo
visualizar melhor, então se eu usar os
fragmentos de 100 e 150 utilizado o mais
concentrado, talvez eu consigo observar
melhor e vai depender de cada caso,
ajustando.
O mecanismo é o tamanho e carga.
Então para fazer o gel de agarose é
utilizado a agarose, o tampão de corrida (é
a solução que vai manter o Ph estável para
garantir a ionização das moléculas,
garantindo que todos corram para o polo
positivo) o mais comum é o tampão TAE,
o outro tampão de carregamento, ele é
colocado na própria amostra, o que ele faz
é conferir o peso para a molécula de DNA,
o mais usado é o azul de bromofenol
também chamado de suco azul ele vai da o
peso a molécula de DNA e ele poder correr
com mais eficácia outro componente é o
leadder e a amostra, dos campos do 1 ao 6
temos as amostras e o n é o marcador de
peso molecular.
Porque do 4 ao 6 esta mais fraco e mais
forte que o outro, seria por conta da
concentração do DNA, por isso, existem
aparelhos para padronizar o nanodrope . a
diferença de intensidade de um para o
outro mesmo contendo os mesmos
fragmentos pode estar relacionado com a
concetração do DNA.
Outro componente são os marcadores e o
transulimador.
Os marcadores são de extrema importância
porque eles permitem a visualização do
fragmento, são moléculas florescentes, não
o confunda com o marcador (leadder) de
peso molecular, no caso desse, ele
consegue se inserir na molécula de DNA e
a partir da radiação, a luz UV eu consigo
visualizar e acender e interagir com a
fluorescência e consigo então visualizar do
transulimador é um outro equipamento que
eu consigo visualizar as bandas da
eletroforese, então como eu consigo?
O transulimador vai incidir a luz UV em
cima do pares de bases que estão
intercalados com os marcadores
fluorescentes.
Terminando os componentes temos a cuba
(para fazer o gel), o pente (é para fazer os
poços) ele é colocado no gel antes de
endurecer e quando endurece tiramos o
pente e aplicamos as amostras para ser
feito a corrida e outro componente é a
fonte que tem os polos negativo e positivo.
Etapas da eletroforese:
1- Preparo do gel, pesa a agarose com a
concentração que você vai precisar.
Joga ele na cuba e coloca pente e
quando ele solidificar teremos a
formação dos poços, joga mais
tampão e fica todo submerso.
2- O brometo de etideo pode ser tanto
na amostra, quanto no gel (é
colocado nesse caso, quando está
preparando), porem ele é muito
31
 perigoso porque é cancerígeno então
é recomendado que utilize no gel
para não ter tanto contato com a
amostra.
3- A segunda etapa é a migração em
que começa a migrar para o polo
positivo
4- A ultima etapa é para a visualização
com transulimador
Outro tipo de gel é o SDS-PAGE é o gel de
poliacrilamida é um outro tipo de
polímero, tem algumas diferenças entre o
de poliacrilamida e o de agarose, 1° a
malha é muita mais formada você
consegue separar muito mais, a 2°
diferença é que ela serve para a corrida de
DNA, mas o mais usado é para a corrida de
proteína. O SDS-PAGE se baseia na
desnaturação da proteína, a proteína é
desnaturada deixando-a linear pelo SDS
além de conferir carga negativa
conseguindo seguir para o polo positivo.
Uma diferença crucial é que no gel de
agarose temos a etapa do PCR, nesse caso,
após fazermos a extração da proteína,
pulamos direto para o gel de SDS-PAGE,
porque proteína não amplifica, só se
amplifica o material genético.
O gel de SDS é aplicado de forma vertical,
além de demorar 3 dias para visualizar
O gel de agarose é aplicado de forma
horizontal e demora 40 minutos para
visualizar
Endonucleases,
vetores de clonagem e
biblioteca de DNA
Endonucleases também pode ser
encontrada como enzimas de restrição,
atuam na biologia molecular, vamos ver os
vetores também. Para fazermos uma
clonagem celular vamos precisar desses
elementos que são de grande importância.
Clonagem molecular também chamado de
tecnologia do DNA recombinante,
significa que tem DNA que foi
recombinado para ser clonado, para isso
utilizamos os elementos que comentei.
Utilizamos então o inserto do DNA de um
organismo e de outro e conseguimos então
utilizar esses dois DNA.
Então primeiramente pegamos o material
do organismo A, isolamos e modificamos,
ou seja, trato ele e reinsiro no organismo
B. vamos ver os elementos que precisa
para obter esse material clonado.
Temos diversas aplicações por exemplo a
insulina, as estratégias vacinais são feitas
por essa técnica, temos diversas aplicações,
então vamos utilizar todas aquelas técnicas
que vimos, a extração para obter o DNA,
que também é chamado de inserto (é uma
coisa que pego e insiro em algum lugar)
Então usamos o gene, que pode ser o
fragmento ou inteiro, quando é humano é
provavelmente o fragmento, temos também
o vetor de clonagem, por exemplo o
plasmídeo. Eu vou então tirar o gene do ser
humano, vou inserir no plasmídeo e esse
32
conjunto vou inserir dentro de uma célula
que pode ser uma bactéria.
Temos dois tipos de vetores: clonagem e
de expressão.
Vetor de clonagem- é a molécula de DNA
que vou inserir o meu inserto, então aqui
tenho gene e vou inserir ele no vetor de
clonagem, juntando as moléculas de DNA,
elas juntas vou chamar de DNA
recombinante, vou inserir então no vetor de
expressão (é a célula que vai expressar o
conteúdo que coloquei ali dentro).
Exemplo a insulina, como é feita: é
separado e isolado o fragmento que
codifica a insulina, ele é cortado com as
endonucleases que são enzimas, então
usamos ela para cortar o fragmento de
interesse, então ligamos esse gene no vetor
de clonagem e a célula começa a produzir
a proteina do gene que eu quero, que no
caso é a insulina.
Para eu ter o resultado desse DNA
recombinante eu preciso de uma molécula
de DNA recombinante (que é o inserto + o
vetor de clonagem)
O mais usado é o plasmídeo como vetor de
clonagem, então 1° eu tenho o DNA de
interesse e corto ele com a enzima
endonuclease, e pego o meu vetor de
clonagem que pode ser o plasmídeo,
lembrando que existem vários vetores de
clonagem. Então vou juntar o inserto
(DNA) com o vetor de clonagem
(plasmídeo) com a DNA ligase que vai
fazer a junção deles dois e finalmente
temos o DNA recombinante ou de
plasmídeo recombinante, mas porque pode
ter essas duas nomenclaturas?
Nem sempre o inserto será recombinado
com o plasmídeo, pois existem outros tipos
de vetores de clonagem, mas o plasmídeo é
o mais utilizado por ser mais fácil inserir
nele.
Componentes
1- Gene de interesse
2- Vetor de clonagem
3- Molécula de DNA recombinante
(inserto + vetor de clonagem)
Temos dois momentos: a inserção DNA
inserto (dentro do vetor de clonagem) e a
segunda inserção ocorre dentro da célula.
Então o plasmídeo recombinante, no
exemplo que temos, ele vai ser inserido no
vetor de expressão (bactéria, mas também
há outros vetores). Essa técnica de inserir o
DNA recombinante no vetor de expressão
é chamado de transformação, como se
fosse uma transformação in vitro.
Essa célula ao apresentar características
adequadas para capturar esse DNA
recombinante é chamada de célula
competente ou transformante. Tem
métodos para confirmar se o inserto foi
inserido no vetor de clonagem e tem
métodos para ver se o DNA recombinante
foi inserido no vetor de expressão. Além
do DNA recombinante e da célula
competente ainda temos essa galera aqui,
temos as nucleases (enzimas de restrição),
enzimas modificadoras e DNA ligase
(catalisar uma ligação fosfodiéster, entre os
insertos).
Então temos as endonucleases,
esonucleases e ribonucleases (não precisa
focar nessa), qual a diferença entre uma e
outra?
33
A endonuclease clica no meio, já a
esonuclease cliva na extremidade 3’ e 5’,
damos mas ênfase nas endonucleases.
Além delas temos as enzimas de
modificação de DNA, que é a DNA
polimerase e transcritase reversa (pega o
RNA mensageiro e consegue converter em
DNA).
- A fosfatase alcalina remove o grupo
fosfato, enzima que corta e tira o fosfato e
porque tira? Para diversos fins para
garantir que a DNA ligase vai ligar, enfim,
para vários fins.
- Outra enzima é polinucleotideo quinase
que adiciona o fosfato.
- Nucleotídeo transferase terminal que vai
adicionar nucleotídeos na extremidade 3’
5’ linha.
- Metiltransferase é adiciona uma molécula
de metano no nucleotídeo.
Então essas são algumas enzimas de
restrição lembrando que as principais são
as endonucleases e esonucleases, DNA
ligase e essas enzimas de restrição de DNA
As endonucleases e esonucleases vão
romper as ligações fosfodiéster de ambas
as fitas (de cima e embaixo) é correto dizer
que a ação da ligase é inverso da enzima de
restrição, porque a ligase catalisa a reação
fosfodiéster e a enzima de restrição quebra
a ligação fosfodiéster.
Essas enzimas de restrição reconhecem as
enzimas especificas na sequência, então
temos mais de 1.500 enzimas de restrição,
o importante é compreender que elas
reconhecem sequencias especificas da
sequencia que vou cortar, vamos focar
agora nas enzimas de restrição. Também
chamadas de endonucleases e esonucleases
quebram a ligação fosfodiéster, são muito
comuns nos procariotos. Então como as
enzimas restrição não quebram sua própria
fita?
Elas não agem no DNA da própria bactéria
porque elas mesmas fazem o processo de
metilação, as enzimas de restrição que
estão presentes nelas vão fazer a quebra do
material de que não é da própria célula,
porque ela tem mecanismos, então quando
ocorre a invasão na célula a enzima vai
agir nesse material que esta fora dela.
Como ocorre a proteção dela mesma?
Ocorre a metilação, que é adição de um
grupo metil nos nucleotídeos da sequência
especifica que seria reconhecida.
A metilação acontece nas duas fitas,
normalmente o sitio de reconhecimento
chamado também de sitio de clivagem,
onde a enzima vai atuar, normalmente ela
tem o nome calidrômica isso significa que
a sequência da esquerda pra direita é a
mesma da direita pra a esquerda e são
sequencias curtas de 6 a 10 pares de bases,
existem duas formas delas agirem, quando
agem podem produzir extremidades
coesivas (duas fitas simples são quebradas)
ou cegas (cliva de uma vez só) qual é a
melhor? Depende de várias coisas, qual a
bactéria, qual o estudo.
A maioria é coesiva
Temos mais de 150 enzimas de restrição
em uso, geralmente recebem a
nomenclatura do organismo que as gerou,
elas são retiradas nos procariotos. As 3
principais ECO-R1, RIND-III, BANR1,
todas reproduzem extremidades coesivas
que é a liberação de fitas simples.
Os vetores de clonagem
34
Podem ser diversos, mas o mais comum é
o plasmídeo. O ideal é que tenha
replicação autônoma, ou seja, ele não
precisa que a bactéria mande ele se
replicar. Por isso, ele é tão usado como
vetor de clonagem e tem apenas um único
sitio de clonagem, esse único local é onde
a enzima de restrição vai cortar ele, porem
esse local pode ser alvo de uma ou varias
enzimas, só que continua sendo nesse
único local, por exemplo se eu entrar com
a enzima A ou B elas vão cortar nesse
mesmo local, porem com sequencias
diferentes. Esse sitio é único, porem pode
ser múltiplo sitio, varias enzimas podem
atuar nesse pedaço, quem oferece isso é o
plasmídeo, podem ser modificados.
O plasmídeo além do sitio de inserção e
restrição que pode ter a inserção de uma
enzima ou várias além disso, pode ter o
ORI-C que é a origem de replicação, além
do sitio de restrição onde as enzimas vão
atuar, esse plamídeo vai ter que ter apenas
1 ORIC, tem que ter o gene de resistência,
o local do sitio de restrição que pode ser
para uma enzima ou múltiplas, mas elas
vão atuar em um único pedaço e tem que
ter outras sequencias como os genes do
óperon LAC,
Percebam que o sitio de restrição, onde as
enzimas de restrição atuam ele esta
inserido no óperon lac
Outro exemplo no bacteriófago que tem o
lambida, funciona também como um vetor
de clonagem. O lambida funciona com
vários pontos onde é clivado, chamado de
cós, por esse motivo a engenharia genética
viu uma possibilidade uso de clonagem
porque da para as enzimas de restrição
serem inseridas e o DNA de interesse entre
elas.
A enzima de restrição vai cortar o cós e o
DNA de interesse é inserido no local da
sequência staff (é um local inútil do fago)
Então falamos de dois vetores de clonagem
principal o plasmídeo e o bacteriófago
lambida, existem outros chamados de
cosmídeo, YAC, BAC, são cromossomos
artificiais (yac e bac)
Como funciona a tecnologia do DNA
recombinante
Se eu tenho os componentes como eu
chego na inserção desse vetor no inserto?
Então a primeira coisa como que eu
construo esse DNA recombinante (DNA de
interesse com o vetor de clonagem) ambos
foram cortados com enzimas de restrição, a
mesma enzima. No plasmídeo temos a
região que codifica a resistência a
antibiótico e tem outras sequências, tem
ORI e tem essa galera roxo e verde que
codifica o gene para LAC-Z o DNA de
interesse vai ser inserido aqui, porque esse
é o sitio da enzima de restrição, vem e
corta e se liga aqui construindo o DNA
recombinante.
Esse exemplo que trouxe para vocês é o
DNA da insulina.
Qual enzima vou escolher para cortar a
sequência? Vai depender da sequência, tem
duas maneiras de avaliar, a 1° sequência é
a própria sequência ter a disponibilidade da
enzima agir, ou seja, a própria sequência
pode ter o sitio de ação da enzima outra
maneira é utilizar da engenharia genética
para inserir a enzima nessa sequência para
que ela seja alvo da enzima e ela cortar.
35
Quando esse inserto é inserido ele precisa
ser ligado no outro pela DNA ligase, então
tem que ser complementar para que seja é
preciso que ele seja cortado pela mesma
enzima de restrição, então essa enzima está
agindo tanto no vetor de clonagem quanto
no DNA inserto, e assim eles podem se
ligar
Formou isso temos o DNA recombinante,
agora precisamos colocá-lo dentro uma
bactéria competente, tem que esta com o
poro aberto para que o DNA seja captado,
como fazemos ela se tornar competente?
Induzimos ela principalmente com cloreto
de cálcio que vai desestabilizar o meio
iônico que ela está e assim os seus poros
vão se abrir e assim vamos utilizar alguns
métodos para que esse DNA entre na
bactéria.
O que vai definir a técnica que vou usar? O
vetor de clonagem que estou utilizando e
qual a célula que vou fazer ela entrar, isso
significa que para o vetor plasmidial
existem técnicas especificas chamadas de
químicas e eletrocoração e podemos ter
técnicas para o fago, ambas recombinantes.
Essas duas técnicas do plasmídeo é que
vão fazer que o DNA recombinante entre
na célula competente.
A química é mais manual, pega a solução
onde está o plasmídeo com a bactéria
junta, pega o cloreto de cálcio para abrir o
poro, para fazer com que entre na bactéria
é através de choque térmico, faz com que
ele capture o plasmídeo.
Eletrocoração ao invés do choque térmico
temos o choque elétrico, que é feito com
um equipamento e então faz com que entre
o plasmídeo na célula.
Então essas técnicas diz respeito da entrada
do plamideo recombinante na célula
competente
Como faz para o fago recombinante entrar
na célula? In vivo quando o fago consegue
infectar a célula bacteriana, ele so
consegue infectar caso essa bactéria
expresse o receptor LAMB, ou seja, o que
é uma célula competente referente a
entrada do fago é aquela que está
expressando o LAMB na sua parede
celular, então para bactéria expressa-lo o
meio tem que ter maltose e não pode ter
glicose e finalmente quando fizer ela fazer
isso, e então vai simplesmente entrar, não é
preciso das técnicas do plasmídeo, seja em
37°C ou até em temperatura ambiente.
Apenas 0,01% do fago ou plasmídeo
recombinante consegue entrar na célula
1- Como saber se a o DNA inserto
entrou no plasmídeo, tornando DNA
recombinante?
2- Como saber se o DNA recombinante
entrou na célula?
A 1° coisa que precisamos saber é que o
plasmídeo tem essa sequencia especifica é
que o gene é o OPERON LAC.
Para conseguirmos responder essas duas
perguntas vamos entrar no gene penicilina
e lac -z
Lac-z ele codifica fica essa proteina
betagalactosidase que vai clivar o X gau
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(ele é um glicosídeo cromógeno, ele é
sintético) em uma coloração azul. Então
temos o Xgau que é colocado em um meio
de cultura. Se a bactéria tem o plasmídeo
dentro dela e esteja codificando a LAC-Z,
a proteina betagalactosidade quebra Xgau e
forma a coloração azul, significa dizer que
o DNA inserto não foi inserido, e como
saber que foi inserido? Quando o LAC-Z
não codifica a betagalactosidade
Se eu tiver sucesso na inserção do DNA,
eu interrompo o LAC, por tanto o LAC não
vai mais produzir a enzima o meio então
fica não azul.
A colônia em azul significa que ela não
teve o plasmídeo
Pergunta 2 – pelo simples fato do
plasmídeo ter o gene que tem codifica a
penicilina então no meio de cultura basta
colocar o antibiótico, se ela crescer
significa que ela possui o plasmídeo com o
gene de resistência, se não crescer significa
que a bactéria não conseguiu inserir o
plasmídeo, então ela não é resistente.
O meu interesse nessas placas são as
colonias crescidas e brancas, porque o
crescimento, significa que tem o plasmídeo
e porque branca? Porque interrompeu o
LAC e não produziu a proteina não
deixando o meio ficar azul.
Temos 3 situações:
Bactéria que não recebe ninguém e não
cresce
Bactéria que recebe só o plasmídeo e não
recebe o DNA – cresce e fica azul
Bactéria que recebeu o plasmídeo com o
DNA – cresce e fica branca, essa é a do
nosso interesse
Quando pegamos essa colônia branca e
vamos coloca-la em um meio de cultura
para crescer, esse meio vai continuar tendo
antibiótico.
Esse meio vai ter duas coisas: 1°
antibiótico e vai ter um indutor o
HIPERTG, serve para induzir o promotor
fazer a transcrição do DNA cortando o
LAC-Z
Voltando o DNA inserto foi inserido no
dentro do LAC-Z, o promotor vem antes
do LAC-Z de qualquer forma se eu colocar
o indutor ele vai fazer o LAC-Z
transcrever, porem quem está inserido no
LAC-Z é o DNA inserto, então o DNA
começa a produzir o gene, então quanto
mais HIPERTG eu colocar mais ele vai
produzir por exemplo a insulina
Ultima coisa: só vai produzir a proteina
que eu tiver interesse e não vai produzir
mais nenhuma? Sim, porque o plasmídeo
foi construído justamente para isso, com o
que estamos querendo que produza a
proteina de interesse.
Depois que essa bactéria cresce no meio de
cultura com o HIPERTG, tem todo um
protocolo, centrifuga e o sombrenadante a
gente passa nessa coluna e acopla uma
seringa passando para o meio de cultura,
essa parte da purificação não vai cair, pega
a proteina e passa ela pro empedorfe.
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