DESCRIÇÃO

Técnicas de amplificação e detecção de ácidos nucleicos in vitro e introdução de suas aplicações em rotina laboratorial.

PROPÓSITO
Compreender a teoria por trás da amplificação de ácidos nucleicos in vitro em suas diferentes formas e entender quais são suas vantagens,
desvantagens e aplicações em contextos diversos é importante para o profissional de laboratório, pois lhe fornecerá poderosa ferramenta de trabalho.

OBJETIVOS

MÓDULO 1

Reconhecer elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos in vitro

MÓDULO 2

Diferenciar as variações entre cada técnica de PCR

MÓDULO 3

Identificar aplicações apropriadas ao uso de cada método

INTRODUÇÃO
Os ácidos nucleicos são as estruturas fundamentais que carregam informações genéticas. Você já parou para pensar como certas características
físicas passam dos pais para os filhos? Traços físicos como formato do rosto, altura, cor da pele e dos olhos são traduções de informações
transmitidas às gerações futuras dos ácidos nucleicos. No corpo humano e na maioria dos seres vivos, encontramos dois tipos de ácidos nucleicos: o
ácido desoxirribonucleico (ADN – também conhecido pela sigla em inglês, DNA), e o ácido ribonucleico (ARN, ou RNA, em inglês).

Cada uma dessas moléculas – DNA e RNA – tem funções diferentes dentro da menor unidade viva conhecida, a célula. O DNA possui fita dupla,
sendo mais estável e resistente que o RNA. Por isso, a célula utiliza o DNA para armazenar as informações genéticas em longo prazo. Já o RNA,
normalmente, em fita simples e mais instável, tem como principal função intermediar a informação entre o DNA e as unidades efetoras da maioria das
funções celulares, as proteínas.

Formato do rosto e altura, por exemplo, são decorrentes da estrutura óssea que, em grande parte, é feita de proteínas. O papel das proteínas não se
limita apenas em traços físicos, mas também em funcionais.

Fonte: Alejandro Porto/Wikimedia commons/licença(CC BY-SA 3.0).

 Dogma central da Biologia Molecular: DNA replica-se em DNA e é transcrito em RNA, que é traduzido em proteína.

Você deve estar se perguntando: o que isso tem a ver com a amplificação de ácidos nucleicos?

Em uma célula viva e saudável, as enzimas fazem toda a amplificação do DNA por conta própria em um ambiente extremamente complexo e
controlado – do pH e nível de oxigênio disponível, ao momento que a célula está em seu ciclo de vida. São dezenas de enzimas envolvidas na síntese
de novas moléculas de DNA, tantas que os cientistas ainda não compreendem completamente todas as etapas envolvidas nesse processo. Apesar de
toda a complexidade da duplicação do DNA in vivo , já somos capazes de sintetizar pequenos trechos do DNA em um tubo de ensaio. Incrível, não?
Vamos ver com detalhes como isso é possível neste material.

MÓDULO 1

 Reconhecer elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos in vitro

PRINCÍPIOS DA PCR CONVENCIONAL

Para entendermos como funciona a amplificação de DNA in vitro , devemos primeiro relembrar algumas informações sobre o DNA e o RNA: suas
funções, composições, similaridades e diferenças. Tanto o DNA quanto o RNA são formados por nucleotídeos, que são como os tijolos dos ácidos
nucleicos e, consequentemente, do material genético. A partir da junção de tais tijolos, formamos as estruturas de DNA e RNA. Mas como são esses
tijolos?

Em primeiro lugar, os nucleotídeos contêm um açúcar chamado ribose. Essa ribose é uma das formas mais simples dos carboidratos – a forma mais
conhecida de um açúcar simples é a glicose. É na ribose que reside a principal diferença entre DNA e RNA: o RNA possui uma molécula de oxigênio
ligada ao segundo carbono da ribose que o DNA não possui – por isso, o DNA é chamado de desoxirribonucleico.

DESOXIRRIBONUCLEICO

Prefixo “des” significa a ausência (como em desinteresse), portanto, “desoxi” representa o oxigênio que está ausente.
O segundo componente são as bases nitrogenadas. Para o DNA, existem quatro tipos diferentes de bases nitrogenadas:

ADENINA (A)

CITOSINA (C)

GUANINA (G)

TIMINA (T)

Para o RNA, as bases nitrogenadas A, C e G são as mesmas, mas, em vez de T, existe uma Uracila (U). Essas bases são as responsáveis pela
informação genética.

Imagine escrever um texto codificado, tão complexo quanto um ser humano, usando apenas uma das letras do teclado do computador. Como seria
possível entender a informação que você quis codificar? Agora, se você escrever um texto com pelo menos duas letras (ou números) do teclado, usará
um código binário. Isso também acontece com a informação genética: a célula utiliza essas cinco bases nitrogenadas para codificar, em sequência,
uma informação preciosa.

Finalmente, os nucleotídeos possuem grupamentos fosfatos no quinto carbono da (desoxir)ribose, que são capazes de interagir com a hidroxila (álcool
orgânico) presente no terceiro carbono da (desoxir)ribose, fazendo a ligação entre um nucleotídeo com o próximo. Essa ligação é conhecida como
fosfodiéster, sendo considerada o “cimento” dos nossos “tijolos”: a partir dela, longas sequências de DNA ou RNA são formadas. É importante manter
em mente que o grupamento fosfato confere carga negativa à molécula de DNA (Figura 1) – vamos voltar a falar a respeito disso mais à frente.

CÓDIGO BINÁRIOS

Formado por sequências de 0 e 1 que, em trechos longos, podem codificar informação, como computadores.

Fonte: Shutterstock.com
 Figura 1: Esquema da estrutura básica dos desoxirribonucleotideos, compostos por fosfato, desoxirribose e base nitrogenada.

A interação entre a hidroxila no carbono 3 da (desoxir)ribose e o fosfato de outro nucleotídeo no carbono 5 deixam as bases nitrogenadas livres para
interação com outras bases nitrogenadas, normalmente, do tipo oposto. As principais bases nitrogenadas (A, T, C, G, U) são divididas em dois grupos
químicos, de acordo com o número de anéis aromáticos que possuem:
PIRIMIDINAS
(C, T, U) - Possuem um anel

PURINAS
(A, G) - Possuem dois

As bases interagem entre si, mas entre grupos opostos: ou seja, Pirimidinas pareiam com Purinas, de acordo com as cargas livres de cada base.
Desse modo, A interage com T, pois ambas têm duas cargas livres para interação, e C interage com G através de três cargas. Essas interações são
chamadas de pontes de hidrogênio e são consideradas fracas por serem facilmente quebradas por agentes físicos, como a temperatura, e químicos,
como o pH (Figura 2).

Veja o esquema mostrando a estrutura do DNA e o pareamento das bases por complementariedade. Note as pontes de hidrogênio duplas (seta verde)
entre Adenina e Timina, e as triplas (seta preta) entre Citosina e Guanina.

Fonte: Shutterstock.com
 Figura 2: Pareamento de bases nitrogenadas.

No entanto, essas pontes de hidrogênio são importantes para manter a sequência de DNA livre de erros e garantem à molécula uma de suas
características fundamentais: a complementariedade. É a partir dessa complementariedade que as enzimas responsáveis pela síntese do DNA e do
RNA, as polimerases, sabem qual nucleotídeo adicionar para manter a mesma mensagem na hora de duplicar o DNA. Ao mesmo tempo, é a
característica que dá ao DNA seu formato em fita dupla. Chamamos essa característica de replicação semiconservada.

SEMICONSERVADA

Uma fita original (fita parental) é mantida na duplicação, como molde para a síntese da fita nova (fita filha).

 IMPORTANTE

Se olharmos para essa fita dupla em um sentido único, da esquerda para a direita, por exemplo, veremos que uma das fitas se encontra com o
carbono 5 da desoxirribose livre na extremidade à esquerda, enquanto a outra fita tem o carbono 3 da desoxirribose livre à esquerda. Isso acontece
porque, para interagirem, as duas fitas precisam estar em sentidos opostos – por isso, nós as chamamos de fitas antiparalelas. Esse sentido de
interação por complementariedade traz à tona outra característica do DNA: sua replicação deve ser feita de forma semidescontínua.

SEMIDESCONTÍNUA
 Replicação de forma semidescontínua: In vivo , apenas a fita no sentido antiparalelo (3’→5’) é lida de forma contínua, e a fita de DNA molde no
sentido paralelo (5’→3’) é lida de forma descontínua. Isso acontece por causa do sentido de abertura da forquilha de replicação.

REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE: AMPLIFICANDO DNA IN VITRO

Em uma célula viva, as enzimas polimerases têm ao seu dispor todos os itens necessários para duplicar o DNA, de nucleotídeos a todas as enzimas
(Figura 3).

Fonte: Shutterstock.com
 Figura 3: Representação do complexo de replicação do DNA em uma célula.

Imagine quão complexo seria reproduzir o ambiente celular em um tubo de ensaio! Precisamos utilizar os conhecimentos da físico-química do DNA e
os princípios básicos de sua replicação para simplificação e adaptação da técnica in vitro .

Fonte: Shutterstock.com

A primeira característica do DNA que é importante na sua replicação in vitro é a complementariedade entre fitas antiparalelas: as bases
nitrogenadas de uma fita interagem especificamente com as bases correspondentes da outra fita (A-T, C-G) por meio de interações frágeis que podem

ser desfeitas pelo calor. Ao aquecermos a solução acima de 90 oC, podemos desfazer essas interações e abrir a fita dupla em duas fitas simples. Isso
deixa as bases nitrogenadas expostas para interagirem e, ao abaixarmos a temperatura, conseguimos fazer com que a fita dupla se refaça e a
informação seja mantida. Vamos ver como esse processo funciona passo a passo mais à frente.
Fonte: Shutterstock.com

A segunda característica importante para a replicação do DNA in vitro é a síntese enzimática pela polimerase. Essa enzima lê cada base nitrogenada
da fita simples como se fosse um molde, e adiciona a base nitrogenada complementar na fita que está sendo sintetizada através da ligação
fosfodiéster. In vivo , a polimerase inicia a duplicação do DNA sozinha, pois ela não consegue abrir a fita dupla em fitas simples, identificar o local
certo de início de replicação ou adicionar os primeiros nucleotídeos. A célula utiliza enzimas para abrir a fita dupla, as helicases , e adição dos
primeiros nucleotídeos é feita por outra enzima, chamada primase .

Na amplificação do DNA in vitro , chamada de reação em cadeia da polimerase (em inglês, polymerase chain reaction – PCR), a abertura do DNA
em fitas simples é feita através de calor. Para isso, utilizamos uma enzima termorresistente chamada de Taq polimerase. Além disso, usamos
pequenas sequências de nucleotídeos em fitas simples e complementares à sequência-alvo do DNA a ser amplificado. Essas sequências sintéticas
são chamadas de iniciadores ou oligonucleotídeos (oligo = poucos), algo em torno de 20 nucleotídeos, que, em inglês, são chamados de primers .
Normalmente, são usados dois oligonucleotídeos por reação: um chamado senso, que se liga ao DNA molde fita simples no sentido 3’→5’; e
um antissenso, que se liga à fita no sentido 5’→3’.

Lembre-se de que o sentido de duplicação contínua do DNA ocorre apenas no sentido 5’→3’, pois o trifosfato (na posição 5) do nucleotídeo livre dará
a energia necessária à ligação fosfodiéster com o carbono 3 da ribose do nucleotídeo que já estará na fita. Isso acontece em ambas as fitas (paralela
5’→3’ e antiparalela 3’→5’), e ambos os oligonucleotídeos são sintetizados em laboratório no sentido 5’→3’. Os oligonucleotídeos iniciadores irão
demarcar a região do genoma a ser amplificada. Essa informação é importante para dar especificidade à PCR!

ETAPAS DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

Agora, já compreendemos que a fita dupla de DNA se abre em duas fitas simples quando aquecida próximo a 100 oC, e sabemos que a reação de
síntese de novas fitas de DNA é feita por meio de uma enzima termorresistente chamada Taq polimerase. Também descobrimos que a enzima
precisa de oligonucleotídeos iniciadores que se ligam por complementariedade ao DNA-alvo desnaturado em uma fita simples. Agora, podemos
entender como essa última se desenvolve. Assim como em qualquer receita de bolo, uma PCR precisa de seus ingredientes básicos – ou reagentes
mínimos – para a síntese de DNA acontecer. Desse modo, adicionamos esses ingredientes a um microtubo. Os reagentes mínimos necessários para a
amplificação são:

O DNA molde, dupla fita, extraído a partir de amostras biológicas.

Os oligonucleotídeos sintéticos que são complementares à região do DNA molde a ser amplificado.

A Taq polimerase, termorresistente.

Cátions de magnésio (Mg2+), cofator necessário ao funcionamento eficaz da polimerase.

Os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs – dATP, dGTP, dCTP, dTTP) – lembre-se de que os três fosfatos são usados como fonte de
energia para que a reação fosfodiéster catalisada pela Taq polimerase aconteça.
 A água ultrapura, livre de contaminantes de DNA, RNA e de nucleases. (Figura 4).

 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal

Fonte: Shutterstock.com
 Figura 4: Esquema dos reagentes necessários a uma reação em cadeia da polimerase (PCR).

O microtubo com esses poucos reagentes é, então, submetido a diversos ciclos de elevação e redução da temperatura do qual a PCR consiste.

A primeira etapa de qualquer PCR consiste na abertura da fita dupla de DNA em suas fitas simples pelo aquecimento da reação a, pelo menos, 95 oC,
por um tempo prolongado – algo em torno de 5 a 10 minutos. Esse tempo é necessário para abrir por completo as fitas de DNA que podem estar muito
concentradas, superenoveladas e ser muito longas.

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Em seguida, começam os ciclos. Cada ciclo contém, pelo menos, 3 etapas: desnaturação, anelamento e extensão (Figura 5).

Note na ilustração a desnaturação das fitas duplas de DNA em fitas simples, o anelamento dos iniciadores à sequência-alvo por complementariedade
e a extensão pela Taq polimerase.

Fonte: Shutterstock.com
 Figura 5: Ilustração das etapas da PCR.

DESNATURAÇÃO
É a primeira etapa de cada ciclo em que a temperatura é aquecida a 95 oC por cerca de 1 minuto. O tempo de desnaturação pode variar de acordo
com cada reação e genoma. Por exemplo, genomas ricos em CG precisam de tempo e temperatura maiores para desnaturar, pois C faz pontes triplas
com G, enquanto genomas ricos em AT precisam de tempos menores por possuírem ligações duplas.

ANELAMENTO
A segunda etapa de cada ciclo é o anelamento. A temperatura será reduzida para cerca de 50 a 65 oC por, aproximadamente, 30 segundos. Essa
redução da temperatura deve ser feita com exatidão para que os iniciadores se liguem especificamente à fita simples de DNA. Se a temperatura for
baixa demais, a fita se renatura e a PCR não acontece, ou ainda outros fragmentos do DNA extraído podem se ligar inespecificamente e sua reação
não funcionará apropriadamente. Se for alta demais, os oligonucleotídeos se ligarão apenas parcialmente, ou até mesmo não se ligarão, e a eficiência
da sua reação será gravemente comprometida. Você pode estar se perguntando como saber exatamente a temperatura a ser usada. A resposta certa
dependerá de vários fatores, como o tamanho do seu oligonucleotídeo, seu conteúdo de CG, e a concentração de sais no tampão de PCR. De modo
geral, quanto maior o tamanho e o conteúdo de CG, maior será a temperatura de anelamento.

Uma vez que os oligonucleotídeos tenham se anelado à fita de DNA molde, a Taq polimerase reconhecerá esse local e fará a extensão da fita dupla.

Como a Taq polimerase é termorresistente, a elevação da temperatura a 95 oC não a destrói – na realidade, ela funciona melhor em temperaturas
mais elevadas. No caso da maioria das polimerases disponíveis comercialmente, a melhor temperatura de adição de nucleotídeos em uma

PCR é, em torno, de 70 oC a 72 oC.

 ATENÇÃO

O tempo de extensão depende da velocidade da polimerase usada e do tamanho da sequência entre os oligonucleotídeos. Uma reação para amplificar
menos de 500 pares de bases que utilize uma polimerase com uma velocidade de incorporação de nucleotídeos mediana deve ter um tempo de
extensão de 30 a 40 segundos.

Após o término da extensão, a reação é aquecida novamente a > 95 oC, para que as fitas duplas recém-sintetizadas sejam separadas, e o ciclo
desnaturação-anelamento-extensão se repita de 30 a 40 vezes. No final, é recomendável ter um ciclo final de extensão maior para garantir que a
síntese de todas as fitas seja concluída. Após o término, a reação deve ser mantida refrigerada para preservar o material amplificado.

A PCR acontece em equipamentos que, como um ferro de passar, aquecem e resfriam rapidamente: os termocicladores. Esses aparelhos foram um
grande avanço para as ciências biológicas e permitiram a grande difusão da PCR em diversas áreas. Graças a eles, uma PCR convencional média
dura de 1 hora e meia a 2h.

A cada ciclo, a quantidade de sequência-alvo – aquela contida entre os iniciadores senso e antissenso, conhecida como amplicon (Produto
amplificado) – dobra. Dessa forma, se, no primeiro ciclo, tínhamos apenas uma cópia de tal sequência (limite teórico da PCR), ao final do primeiro
ciclo, teremos 2 cópias; no final do terceiro ciclo, 4; depois, 8, e então 16, e assim sucessivamente.

A cada ciclo, vemos um aumento exponencial do número de cópias da sequência-alvo. Assim, no final de 30 ciclos, teremos algo na ordem de 1
bilhão de cópias da mesma sequência! Um número tão grande de uma mesma sequência vai ser muito mais facilmente identificado posteriormente
(Figura 6).

Fonte: Shutterstock.com
 Figura 6: Esquema da amplificação exponencial do DNA-alvo por ciclo a partir de uma cópia, em aparelho termociclador.

Via de regra, podemos subdividir a PCR em duas categorias:

PCR qualitativa, em que todos os ciclos ocorrem em um termociclador comum, precisa de etapas posteriores para revelar o resultado. Nesse tipo, o
resultado se dá pela constatação da presença ou ausência do produto alvo da amplificação. Abordaremos alguns outros tipos de PCR que se
encaixam nessa categoria.

PCR quantitativa, também conhecida como em tempo real, em que os ciclos se dão em um aparelho capaz de ler automaticamente a amplificação e,
assim, é capaz de quantificar em tempo real. Existem dois métodos que são mais comuns para a quantificação. Nesse caso, não há necessidade de
revelação posterior à reação, o que a torna mais rápida.
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE: SEPARANDO E REVELANDO O
RESULTADO

Após a amplificação da sequência-alvo pela polimerase, temos um microtubo com nosso DNA amplificado em um tampão de reação que é
transparente como a água. Naturalmente, não podemos observar a olho nu o resultado da reação: é necessário revelá-la. Para isso, precisamos
manter em mente que, após uma PCR bem-sucedida, temos uma sequência de DNA em um tamanho exato graças ao anelamento específico dos
oligonucleotídeos à sequência-alvo. Portanto, precisamos separar as sequências por tamanho para verificarmos se o tamanho corresponde ao do
nosso produto. Também vamos precisar de algo que revele a localização do DNA, ou um agente revelador especial.

 DICA

Para separar o DNA de acordo com seu tamanho, usamos uma espécie de malha gelatinosa chamada de matriz ou gel de agarose.

Você deve estar familiarizado com a gelatina que fazemos na cozinha, certo? A agarose funciona de maneira semelhante: é um polissacarídeo que se
dissolve em líquido aquoso quando aquecido e, quando resfriado, se solidifica, ou polimeriza. Ao polimerizar, a agarose forma uma malha com
pequenos orifícios que permitirão a passagem do DNA, de forma que moléculas menores de DNA passarão com maior facilidade e mais rapidamente,
enquanto moléculas maiores de DNA terão maior dificuldade de passar e, por isso, demorarão mais tempo para viajarem pela malha. Assim, podemos
separar as moléculas de DNA de acordo com tamanho. Dependendo do tamanho do nosso DNA amplificado, poderemos usar uma malha mais
fechada ou mais aberta simplesmente variando a concentração da agarose que usamos para fazer o gel.

O DNA será inserido no gel de agarose através de pequenos orifícios chamados de poços, feitos com um pente com pequenos dentes largos. Para
podermos visualizar a passagem do tampão da PCR pelo gel de agarose, usamos corantes como o azul de bromofenol, o qual é mais denso do que o
tampão de corrida e faz com que o DNA se assente no fundo do poço, o que é necessário para que a separação funcione adequadamente.

Fonte: Shutterstock.com
 Montagem de gel de agarose e uso de pentes para formação de poços para aplicação do produto de PCR.

Uma vez que o gel de agarose esteja pronto e que o DNA tenha sido pipetado nos poços do gel com o corante azul, podemos começar a eletroforese.
Para a eletroforese, precisaremos ainda de uma cuba, ou recipiente que contenha entradas para corrente elétrica, uma fonte elétrica e um tampão
ionizável. A eletroforese parte do princípio de que um tampão, quando submetido a uma corrente elétrica, tem suas moléculas ionizadas migrando em
direção a um dos polos: as moléculas negativas migram para o polo oposto, o cátodo, e as moléculas positivas migram para o polo negativo, o ânodo.

No caso do DNA, seu grupamento fosfato lhe dá carga negativa, fazendo que o DNA migre para o polo positivo (cátodo) quando em solução submetida
à corrente elétrica. Como o DNA está no fundo do gel de agarose graças ao corante mais pesado que o tampão eletroforético, ele passa por dentro da
agarose e, assim, será separado de acordo com seu tamanho pela trama do gel. Por sua vez, o corante azul, também de carga negativa e de tamanho
muito inferior à complexa molécula de DNA, migrará pelo gel mais rapidamente, servindo apenas como marcador da velocidade de migração, e não da
posição do DNA.
Fonte: Shutterstock.com
 Representação esquemática de uma eletroforese em gel de agarose.

Para sabermos o tamanho e a posição do DNA, precisaremos de um marcador de tamanho molecular do DNA que consiste em sequências de DNA
de tamanhos conhecidos, como se fosse uma escada cujos degraus representam os tamanhos. Ele é um parâmetro para estimarmos o tamanho das
sequências de DNA que amplificamos – coloquialmente, chamamos essas sequências em gel de agarose de bandas.

Também precisamos de um revelador da localização do nosso produto amplificado no gel de agarose. Esse reagente, chamado de fluoróforo, é uma
molécula capaz de fluorescer quando excitada no comprimento de onda correto. Em gel de agarose, usamos fluoróforo que intercale especificamente
com o DNA. A molécula mais comumente utilizada é o brometo de etídio, que é capaz de se intercalar com qualquer fita dupla de DNA. Sua
capacidade de se ligar ao DNA o torna potencialmente tóxico, carcinogênico e teratogênico, e precisamos manter nossa segurança e as boas práticas
laboratoriais para evitar de nos contaminarmos com ele.

Existem diversas formas de se utilizar brometo na revelação do gel, podendo ser adicionado antes da solidificação do gel (antes da eletroforese) ou
depois da eletroforese, com uma incubação extra. Finalmente, o brometo de etídio é excitado no comprimento de onda ultravioleta em um
equipamento chamado transiluminador. Ao ser excitado, o fluoróforo emite fluorescência e dá a localização das bandas de DNA amplificado de acordo
com o marcador de tamanho molecular.

Fonte: Shutterstock.com à esquerda e Joseph Elsbernd/Flickr/licença(CC BY-SA 2.0) à direita.

 Imagem de um gel de agarose e sua revelação por fluorescência do brometo de etídio em luz ultravioleta.

Dependendo da técnica de PCR utilizada, assim como do objetivo da PCR, seu resultado pode ser uma única banda de DNA no gel de agarose ou
múltiplas bandas. Algumas vezes, resultados inesperados também podem aparecer, como múltiplas bandas de DNA, onde apenas uma banda única
era esperada. Cada situação demandará a experiência e o conhecimento do profissional para interpretação e resolução de possíveis
problemas. Existem alternativas ao uso do gel de agarose para separação de ácidos nucleicos. Um exemplo é o gel de acrilamida/bisacrilamida,
usado para separar sequências de DNA com alta resolução, de forma que bandas com até um nucleotídeo de diferença em tamanho possam ser
diferenciadas. O gel de acrilamida/bisacrilamida também permite a separação de RNA e proteínas. No entanto, exige revelação por sistemas
diferentes, mais complexos, que nem todos os laboratórios possuem estrutura para execução. Além de mais tóxica que a agarose, a montagem do gel
e sua corrida eletroforética também são mais trabalhosas. Desse modo, o gel de agarose corado por brometo de etídio é a técnica de revelação
de PCR mais utilizada.
PCR E ELETROFORESE

VERIFICANDO O APRENDIZADO

1. VIMOS QUE A PCR É UMA FERRAMENTA MOLECULAR PARA AMPLIFICAÇÃO DO DNA IN VITRO. SOBRE A PCR,
É CORRETO AFIRMAR QUE:

A) A polimerase utilizada é capaz de adicionar todos os nucleotídeos necessários, de maneira inespecífica.

B) A especificidade da reação é por oligonucleotídeos iniciadores para demarcar a sequência e permitir que a polimerase inicie a síntese.

C) A PCR ocorre de forma linear, ou seja, nenhuma etapa de variação de temperatura se repete.

D) A Taq polimerase é uma enzima sensível ao calor e deve ser adicionada a cada novo ciclo.

E) Apenas nucleotídeos com hidroxilas no terceiro carbono da ribose são adicionados pela Taq polimerase.

2. A PCR CONTÉM DIVERSAS ETAPAS, DESDE PIPETAGEM DA REAÇÃO ATÉ SUA LEITURA. CONSIDERANDO AS
ETAPAS, É INCORRETO AFIRMAR QUE:

A) A temperatura de desnaturação deve ser alta o suficiente para separar as fitas duplas de DNA em fitas simples.

B) A Taq polimerase é termorresistente e sua temperatura ótima de síntese de DNA é próxima a 70oC.

C) Após a amplificação, podemos facilmente visualizar o resultado, pois se trata de reação colorimétrica.

D) Para identificarmos se nossa sequência-alvo foi amplificada, devemos separar as moléculas de acordo com o tamanho, através de eletroforese em
gel de agarose, e depois revelar, usando intercalantes de DNA fluorescentes em ultravioleta.
E) A eletroforese usa a carga negativa do DNA para fazê-lo migrar através do gel e em direção ao cátodo, quando submetido à corrente elétrica.

GABARITO

1. Vimos que a PCR é uma ferramenta molecular para amplificação do DNA in vitro. Sobre a PCR, é correto afirmar que:

A alternativa "B " está correta.

As DNA-polimerases são incapazes de reconhecer o local de início de replicação, sendo função das primases a colocação dos primeiros nucleotídeos.
Assim, precisamos usar iniciadores que se anelarão por complementariedade específica à sequência-alvo desejada. O anelamento dos
oligonucleotídeos permite o reconhecimento pela polimerase, que sintetizará a fita dupla a partir do molde.

2. A PCR contém diversas etapas, desde pipetagem da reação até sua leitura. Considerando as etapas, é incorreto afirmar que:

A alternativa "C " está correta.

Na PCR, ocorre o aumento exponencial do número de fitas duplas de DNA correspondentes à sequência-alvo. No entanto, esse aumento é invisível a
olho nu e precisa ser revelado.

MÓDULO 2

 Diferenciar as variações entre cada técnica de PCR

VARIAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR

Existem situações em que a PCR qualitativa e convencional pode não ser a técnica ideal para o nosso objetivo. Podemos nos deparar com casos em
que a concentração do DNA total da amostra é muito baixa, o que pode limitar o uso do produto amplificado em outras aplicações, como o
sequenciamento. Em determinadas ocasiões, queremos saber o quanto de determinada sequência temos em nossas amostras. Em outras situações,
podemos estar interessados no produto da expressão de um determinado gene, e precisamos olhar para o RNA mensageiro ao invés do DNA, já que
os níveis de DNA de uma célula são mantidos constantes, salvo raras exceções.

 DICA

Como você pode ver, existem diversos outros interesses, e uma PCR convencional dará apenas a base para que variações mais complexas,
específicas e úteis sejam desenvolvidas, validadas e usadas.

REAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO REVERSA

Como já sabemos, a DNA polimerase é capaz de sintetizar uma nova fita de DNA a partir de uma fita de DNA molde. Afinal, ela é uma DNA polimerase
DNA-dependente. Mas, em muitas ocasiões, é necessário investigar a expressão de um gene, ou até mesmo diagnosticar doenças causadas por vírus
que não têm material genético feito por DNA. Nesses casos, a molécula a ser detectada e quantificada indiretamente é o RNA. A Taq polimerase, no
entanto, não é capaz de reconhecer ou de adicionar nucleotídeos a riboses; ela só trabalha com desoxirriboses.

Como conseguimos resolver esse problema?

 RESPOSTA

Pelos organismos que conseguem sintetizar DNA a partir de RNA!

Assim como o SARS-CoV2, coronavírus causador da COVID-19, existem outros vírus de genoma RNA. Os primeiros vírus a serem estudados pela
humanidade foram os de genoma RNA chamados de retrovírus. Esses vírus têm algo de especial: a capacidade de inverter a ordem DNA → RNA →
proteína do dogma central da Biologia Molecular, usando uma enzima para sintetizar um DNA complementar (cDNA) ao seu genoma RNA. Isso
mesmo, os retrovírus usam o RNA de seu genoma como molde para síntese de DNA.

Fonte: Shutterstock.com

Os retrovírus possuem uma enzima capaz de sintetizar DNA a partir de RNA cujo nome oficial é DNA polimerase RNA-dependente.
Corriqueiramente, ela é chamada de transcriptase reversa, ou TR, pois faz o reverso da transcrição: sintetiza DNA a partir do RNA. Uma vez que os
pesquisadores conseguiram isolar a TR, ela passou a ser usada para reações in vitro . Na maioria dos casos, é usada uma TR purificada a partir de
vírus aviários, de forma que as TR não representam nenhum risco de infecção ao manipulador e são seguras para diagnóstico e pesquisa.

Fonte: Shutterstock.com

Assim como uma reação pela polimerase, a reação de transcrição reversa (RT (Usada daqui em diante para designar a reação em si.) ) precisa de
alguns fatores elementares. O primeiro fator necessário é o RNA de polaridade positiva (RNA+) de qualidade, o que requer muito cuidado na
manipulação e extração do material. Esse RNA é assim chamado por possuir o mesmo sentido de transcrição e tradução que um RNA mensageiro
(mRNA), mas expande o entendimento para vírus que nem sempre tem seu RNA+ diretamente traduzido na célula, como, por exemplo, os próprios
retrovírus. Além do RNA+, a RT também precisará da enzima transcriptase reversa para fazer a síntese de cDNA a partir do RNA+.

Assim como as primeiras DNA-polimerases usadas na PCR mais rudimentar, a TR não é resistente à temperatura. Dessa forma, a reação de
transcrição reversa deve preceder a PCR, pois a TR é inativada pelas temperaturas de desnaturação. Da junção de reação de transcrição reversa (RT)
seguida por PCR, vem o termo RT-PCR. A TR precisará de pequenos oligonucleotídeos, menores ainda que os usados em uma PCR convencional,
para iniciar a transcrição. Esses oligonucleotídeos têm, em média, apenas 6 bases e, por isso, são chamados de hexâmeros. Eles podem ser
específicos para uma determinada sequência de RNA, ou podem ser uma sequência curta rica em timinas (poli-T) que se anelará à cauda poli-
A do mRNA, ou podem ser aleatorizados, sendo este último o mais usado por permitir a síntese e o armazenamento do cDNA derivado de diversas
sequências diferentes.
PRIMEIRO CASO
Sintetizamos apenas cDNAs correspondentes ao RNA (mensageiros ou não) ao qual os hexâmeros se anelam.

SEGUNDO CASO
Podemos criar cDNA complementares a todos os mRNA da célula, o que constitui uma biblioteca de expressão gênica.

TERCEIRO CASO
Com uso de iniciadores aleatorizados, criamos uma biblioteca de cDNA correspondente a todos os RNAs da célula, mensageiros ou não. Similar à
PCR, uma vez que os oligonucleotídeos se ligam à fita de RNA+, a TR começa a sintetizar uma fita de cDNA complementar usando o quarto reagente,
os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs).

Ao contrário da PCR, que contém ciclos que se repetem várias vezes para a amplificação de determinada sequência, a RT é linear: cada etapa
acontece apenas uma vez, o que não permite amplificação de sinal. Primeiro, a reação começa com o anelamento dos hexâmeros ao RNA+ por
poucos minutos. Na maioria dos casos, não há necessidade de temperaturas altas de desnaturação, pois o RNA+ já é uma fita simples. Contudo,
podem ocorrer estruturas secundárias no RNA que precisam de temperaturas moderadas para desnaturação. (Figura 7)

Veja na imagem a desnaturação de eventuais estruturas secundárias do RNA, seguido por anelamento dos hexâmeros iniciadores à sequência-alvo
por complementariedade e síntese de cDNA pela transcriptase reversa.

Fonte: Shutterstock.com
 Figura 7: Ilustração das etapas da reação de transcrição reversa (RT).

Em seguida, o tubo será aquecido ou resfriado até a temperatura de extensão pela TR. Diferentemente da PCR convencional, a RT possui diversas TR
de origens diferentes que podem ser usadas. Assim, os protocolos variam entre diferentes marcas de enzimas. Em alguns casos, a RT pode ter

apenas essas duas temperaturas, de anelamento e extensão, de 25 e 37 oC, respectivamente. O cDNA produzido pode ser armazenado por meses a

anos em geladeira (4 oC) ou freezer (-20 oC), ou usado imediatamente como molde em uma PCR – a chamada RT-PCR. (Figura 8)
Fonte: Shutterstock.com
 Figura 8: Resumo esquemático dos reagentes necessários, das etapas e da amplificação do cDNA em uma RT-PCR.

NESTED -PCR

A PCR convencional é muito útil, mas, às vezes, não consegue amplificar uma determinada sequência que esteja presente em pouquíssima
quantidade. Quando há dificuldade em se amplificar o DNA alvo na PCR convencional, o gel de agarose pode não ter capacidade suficiente para
evidenciar o amplicon . Nós chamamos essa capacidade de o resultado representar a realidade de sensibilidade. Em outras palavras, a sensibilidade
da PCR reflete a capacidade de detecção do sinal do DNA-alvo, em amostras que possuem o DNA-alvo na realidade. Normalmente, a PCR tem ótima
sensibilidade por aumentar exponencialmente a sequência-alvo. No entanto, em alguns casos, a sensibilidade da PCR convencional pode não ser
suficiente, pois existe uma saturação da reação por volta do 35º ciclo: atingimos um platô em que não há aumento do número de fitas devido ao
esgotamento dos reagentes. Então, ter mais de 40 ciclos em uma PCR não oferecerá nenhum benefício, porém, pode aumentar as chances de
produtos inespecíficos que atrapalharão a interpretação. (Figura 9).

Observe no gráfico que a quantidade de DNA, detectada por fluorescência, aumenta exponencialmente até chegar a um platô, em que não há mais
aumento significativo de DNA a cada ciclo.

Fonte: EnsineMe.
 Figura 9: Gráfico representativo das qPCR.

A solução para PCR com baixa sensibilidade é relativamente simples: usar uma fração da primeira reação como molde para uma segunda PCR, em
uma técnica conhecida como nested -PCR (Ou PCR aninhada, em português.) . Para isso, utilizamos dois pares de iniciadores, sendo o par de
primers para a primeira reação chamado de iniciadores externos, e os primers usados na segunda PCR conhecidos como internos. Dessa
maneira, a segunda PCR sempre gera um produto menor que a primeira reação, e conseguimos aumentar o número de ciclos de amplificação de, no
máximo, 40 (na PCR convencional) para entre 60 e 80 ciclos no total de ciclos combinados nas duas reações subsequentes. Consequentemente,
aumentamos a quantidade de DNA amplificado obtido ao final da segunda PCR. Caso seja utilizada corretamente, a adição de etapa nested pode
melhorar muito a sensibilidade e a especificidade da PCR.

Para isso, são necessários alguns cuidados especiais. O primeiro deles está no desenho da reação, que deve ser pensada como um conjunto. A
primeira PCR deve possuir oligonucleotídeos que, ao se anelarem a uma determinada região, permitam que a polimerase produza um amplicon longo
e específico o suficiente para ser usado como DNA-molde na segunda reação.

 SAIBA MAIS

Isso significa que, caso desejemos amplificar sequências altamente repetitivas, precisaremos levar em consideração uma primeira PCR cujo
amplicon contenha regiões específicas ao redor das repetições para que haja uma boa reação secundária. Isso porque, essa última precisa de
iniciadores que se anelem especificamente à região que foi amplificada anteriormente.

Contudo, devemos evitar o uso dos mesmos oligonucleotídeos da primeira reação, já que podem reduzir a eficácia da segunda reação, além de gerar
produtos inespecíficos. Outro cuidado recomendável para a segunda reação é a purificação do produto da primeira reação antes de utilizá-lo na
segunda, o que evita contaminações entre amostras, reduz o risco de inespecificidade e aumenta a eficácia da segunda PCR (Figura 10). Note o uso
de iniciadores externos na primeira reação, amplificando um produto que será usado como molde de amplificação na segunda reação, que usa
iniciadores internos.

Fonte: EnsineMe.
 Figura 10: Representação esquemática de uma nested -PCR.

PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL – QPCR

Até agora, todas as técnicas que discutimos precisam da eletroforese em gel de agarose para separação dos produtos da PCR e posterior revelação
das bandas através de agentes intercalantes do DNA que emitem fluorescência; por exemplo, o brometo de etídio, quando submetido à luz ultravioleta.
Esses tipos de PCR são categorizados como qualitativos e podem ser muito úteis, especialmente, quando o DNA amplificado for utilizado em outra
técnica subsequente. Entretanto, existem situações em que a PCR qualitativa se torna pouco informativa.

 EXEMPLO

Quando queremos determinar se um tratamento está surtindo efeito na redução de um marcador genético específico. Nesse caso, a PCR convencional
e suas variações vistas até agora não informam o suficiente para tomada de decisões. Precisamos, assim, de técnicas que revelem a quantidade de
certa sequência específica de DNA com o máximo de precisão possível. Entra em cena a PCR quantitativa (também conhecida como PCR em tempo
real.) (qPCR).

A qPCR tem a capacidade de quantificação da sequência-alvo e de leitura em tempo real dos resultados, sem necessidade de revelação posterior.
Isso porque, ela possui dois fatores adicionais a uma PCR qualitativa: a adição de fluoróforos à própria reação e o uso de um termociclador capaz de
detectar o sinal fluorescente. Dessa forma, a cada novo ciclo de desnaturação-anelamento-amplificação, ocorre aumento da quantidade de DNA-alvo e
da emissão de fluorescência proporcional à quantidade de DNA sendo sintetizada naquele ciclo.

Para que a fluorescência seja detectada, a qPCR exige a utilização de termocicladores que contenham lasers para excitação do fluoróforo e
detectores da fluorescência. Esse aparelho é mais sofisticado, mais caro e mais complexo do que um termociclador convencional, porém, seus
resultados podem ser igualmente mais informativos e precisos. Outra diferença da qPCR é que, em alguns casos, podemos ter uma temperatura única

para anelamento e extensão: todas as duas acontecem a 60 oC (Figura 11).

Fonte: EnsineMe.
 Figura 11: Exemplo dos ciclos de temperatura usados em SYBR qPCR contendo a fase de amplificação e a fase de curva de dissociação.

Existem duas técnicas de qPCR largamente usadas: SYBR Green e TaqMan. Elas diferem especialmente na forma como a fluorescência é emitida
e na especificidade do sinal fluorescente. As formas de quantificação são, por outro lado, semelhantes. Vamos explorar as duas em mais detalhes?

SYBR GREEN

O SYBR é fluoróforo que, como o brometo de etídio, é capaz de intercalar em fitas duplas de DNA. Quando está associado ao DNA, o SYBR pode ser
excitado em comprimento de onda azul, e então emite fluorescência verde. Quando não está ligado ao DNA fita dupla, o SYBR tem sua fluorescência
drasticamente reduzida. Por sua capacidade de fluorescer quando ligado ao DNA fita dupla, ele também é usado como um sistema alternativo na
revelação da PCR convencional em gel de agarose, já que é menos tóxico que o brometo de etídio.

Quando adicionado à qPCR, o SYBR emitirá o máximo de fluorescência na fase de extensão, pois esse é o momento em que há maior número de
bases pareadas em fitas duplas. O aparelho termociclador irá incidir um laser, excitando o SYBR a emitir fluorescência verde. Essa fluorescência será
detectada pelo aparelho, que mostrará a quantidade de fluorescência por ciclo. A cada novo ciclo, maior será a fluorescência emitida, pois maior será a
quantidade de DNA fita dupla sendo sintetizada. Desse modo, a progressão de fluorescência será proporcional à quantidade de DNA amplificado a
cada ciclo, até que a reação atinja sua saturação, e um platô após a curva de crescimento exponencial será observado (Figura 12). Repare que,
quando não está ligado ao DNA dupla fita, devido à sua desnaturação, o SYBR não emite fluorescência. Ao ligar-se à fita dupla de DNA, durante a sua
extensão, a fluorescência é emitida.

Fonte: Cindy J. Smith, A. Mark Osborn, 2009

 Figura 12: Esquema ilustrando a teoria por trás da fluorescência do SYBR.
É importante considerarmos que essa interação entre o SYBR e a fita dupla de DNA não é controlada – o SYBR irá se intercalar com qualquer fita
dupla de DNA. Isso faz com que a emissão de fluorescência seja menos específica: como em uma reação convencional, apenas os oligonucleotídeos
iniciadores são responsáveis pela especificidade. Assim, outras formas de controle da reação foram criadas para garantirmos que o sinal fluorescente
usado na quantificação corresponde apenas ao produto desejado.

Portanto, adicionamos um passo a mais a qPCR: a curva de dissociação (melting curve ). Nessa etapa, o termociclador aquecerá a PCR lentamente,
para medir em qual temperatura 50% das fitas duplas de DNA sintetizadas se dissociam. Essa dissociação será medida, mais uma vez, através da
fluorescência pelo SYBR. Essa temperatura dependerá de dois fatores principais: o conteúdo CG e o tamanho da sequência. Por isso, reações de
SYBR tem amplicons com tamanho limitado em cerca de 100 nucleotídeos em média. Em uma curva de dissociação boa e específica, todas as
moléculas amplificadas irão se dissociar na mesma temperatura e, assim, só um pico é observado no gráfico. Em uma qPCR por SYBR sem
especificidade, mais de um pico será visto na curva de dissociação, e a reação precisará ser ajustada. Esse é um importante nível de controle de
qualidade da reação que não deverá ser ignorado.

Note na figura a seguir, a existência de um único pico (a 76,49 °C) indica que há apenas um produto amplificado, o que confirma a especificidade da
qPCR.

Fonte: EnsineMe.
 Figura ilustrativa: Exemplo de resultado de uma curva de dissociação dos produtos de uma qPCR por SYBR Green.

QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA POR SYBR

TAQMAN

Outra forma bastante comum de qPCR é chamada de TaqMan, cujo nome vem da referência ao jogo de videogame dos anos 1980, PacMan. Assim
como na técnica SYBR, a quantificação em tempo real na TaqMan ocorre através da emissão e detecção de fluorescência a cada ciclo de
amplificação. Entretanto, a TaqMan difere do SYBR na forma como a emissão da fluorescência acontece. No TaqMan, além de todos os reagentes que
uma PCR convencional possui, temos a presença de uma sequência extra, complementar à região interna dos iniciadores. Essa sequência extra é
conhecida como sonda e é curta, com tamanho aproximadamente igual ao dos oligonucleotídeos iniciadores, e possui temperatura de anelamento
pouco superior à deles. A sonda contém uma molécula fluorescente na extremidade 5’, e uma outra molécula na extremidade 3’, que bloqueia a
emissão de fluorescência.

A existência de uma sonda que se anela à região alvo a ser amplificada não representa muito, se a molécula fluorescente não for liberada de seu
bloqueador. Para isso, a enzima Taq polimerase usada na TaqMan é diferente das outras Taq polimerases. Ela adiciona nucleotídeos
(polimerização), como as demais polimerases, e remove nucleotídeos (função exonuclease).

A remoção de nucleotídeos é fundamental para a detecção da fluorescência, pois, quando a enzima chega ao nucleotídeo da sonda que contém
o fluoróforo e o remove da sequência, o fluoróforo estará livre de seu bloqueador e poderá emitir fluorescência detectável (Figura 13). A cada novo
ciclo da PCR, as fitas duplas serão desnaturadas, os iniciadores e a sonda se anelarão, e a TaqMan polimerase fará síntese do DNA. Com remoção
dos nucleotídeos da sonda, o fluoróforo nela contida é liberado para emitir fluorescência proporcional a cada nova sequência-alvo sintetizada.

Repare na ilustração que a sonda anelada entre os dois iniciadores é clivada pela TaqMan polimerase durante a extensão do DNA, permitindo a
emissão de fluorescência.

Fonte: Shutterstock.com
 Figura 13: Representação esquemática da qPCR pelo método de TaqMan.

 SAIBA MAIS

A TaqMan apresenta uma vantagem extra para especificidade da reação: o anelamento da sonda é específico para a região alvo a ser amplificada. A
especificidade dada pela sonda é tamanha que diferenças de apenas um nucleotídeo podem ser detectadas – essas mutações são conhecidas como
single nucleotide polymorphism (SNP) .
Assim sendo, a TaqMan dispensa técnica complementar para avaliação da especificidade, como a curva de dissociação, o que a faz mais rápida do
que a técnica de SYBR. Entretanto, as sondas tornam a reação mais cara. Outra vantagem que a TaqMan traz em relação ao SYBR é a capacidade de
múltiplas detecções na mesma reação com maior precisão e confiabilidade. Veremos isso em mais detalhes à frente.

Tanto a técnica de SYBR quanto a TaqMan são capazes de quantificar o DNA ou cDNA. A técnica como a quantificação é obtida varia, mas a maioria
das análises posteriores podem ser usadas igualmente – uma vez que resultados confiáveis tenham sido obtidos através de rigoroso controle de
qualidade.

QUANTIFICAÇÃO

Na qPCR, cada ciclo desnaturação-anelamento-extensão produzirá fluorescência, que será detectada pelo aparelho.

Primeiro, deve-se ajustar o programa do aparelho para que ele saiba qual laser e quais filtros usar para a excitação de cada fluoróforo e em qual
espectro da emissão ele deverá buscar o sinal para detecção. Em outras palavras, você é o responsável em dizer ao aparelho o que ele deve fazer.

Em seguida, o aparelho determinará, nos ciclos iniciais de amplificação, qual é o nível em que o sinal obtido é superior ao sinal de ruído. Como a
qPCR utiliza fluoróforos para a quantificação, por vezes existe um “vazamento” de fluorescência no início da reação que não está relacionada com a
amplificação da sequência-alvo em si. Esse sinal inespecífico, geralmente, obtido nos primeiros ciclos, chamamos de sinal de ruído, ou background ,
em inglês. O ruído vai ser utilizado para determinar o limiar de detecção.

O primeiro ciclo em que a fluorescência de uma determinada amostra ultrapassa o limiar de detecção acima do ruído (Ou da fluorescência de base) é
chamado de valor de Ct. Esse valor é importante por estar diretamente relacionado à quantidade inicial de DNA-alvo da amostra amplificada. A
relação entre concentração inicial de DNA-alvo na amostra e Ct é inversamente proporcional, o que significa que, quanto menor for o Ct de uma
amostra, maior a quantidade de DNA que ela originalmente continha.

Outros dois parâmetros usados pelo aparelho para ajustar (Ou normalizar) a reação internamente são a ROX, um fluoróforo passivo usado como
referência, e o Rn, que representa um ajuste (Ou normalização) entre o sinal do fluoróforo de escolha (SYBR ou da sonda TaqMan) e a referência
ROX. A maioria dos reagentes para qPCR já possuem ROX adicionados ao tampão, cabendo a nós apenas a observação para eventual detecção de
anomalias que podem invalidar a reação. Mais uma vez, a qPCR tem que manter padrões rígidos de controle de qualidade para que diferenças
mínimas na quantidade sejam confiáveis.

FLUORÓFORO PASSIVO

Cuja fluorescência não aumenta de acordo com a amplificação do DNA.




Com todos esses fatores ajustados corretamente, os aparelhos mais modernos detectarão o sinal emitido a cada ciclo e darão, em tempo real, o
resultado na tela do computador ao qual ele precisa estar ligado para funcionar, em um gráfico chamado de curva de amplificação.

Veja o exemplo de gráfico de amplificação para o gene Suc2 da Saccharomyces cerevisae . Note a reta paralela ao eixo x (horizontal), que representa
o valor de limiar de detecção / quantificação. Abaixo dela, temos o ruído da reação. As curvas amarelas e vermelhas representam a quantificação das
amostras e, como você pode observar, existem 4 amostras em duplicata; a com maior quantidade de DNA é a mais à esquerda no gráfico, com menor
Ct.

Você consegue dizer qual é o Ct da amostra mais concentrada?

Fonte: EnsineMe.
 Figura 14: Gráfico de amplificação.

Existem duas formas de se quantificar o produto amplificado:

PELA CURVA PADRÃO

Em muitos casos, a quantificação absoluta do DNA alvo na amostra é necessária. Para isso, devemos ter em mãos uma curva padrão, com
concentrações conhecidas do DNA alvo. Essa curva pode ser comprada de laboratórios especializados em sua fabricação ou produzida por nós
mesmos, através de clonagens e purificação. A partir da concentração mais alta, faremos uma diluição seriada. Para isso, colocamos uma fração da
solução de maior concentração em um tubo contendo apenas água, e depois deste tubo para outro com apenas água, e assim sucessivamente até
termos pelo menos 5 pontos de curva.
Fonte: Shutterstock.com
 Diluição seriada usando a escala em mililitro (mL) para a nossa metodologia é utilizado em microlitro (µL).

Em seguida, informamos ao aparelho em quais posições cada concentração da curva está, de forma que o próprio computador calcule os parâmetros
de qualidade da curva. Com esses valores, o computador calcula a quantidade de DNA existente nas nossas amostras de concentração desconhecida.
Alguns dos principais valores dados pela curva padrão que usamos para determinar a concentração da amostra-teste são a linearidade da curva e a
eficiência de amplificação.

Repare na imagem a seguir que existem 5 quantidades diferentes da curva padrão (em vermelho), obtidas pela diluição seriada, e três amostras
desconhecidas (em azul) cuja quantidade de DNA foi calculada a partir de seus Cts e com base na linearidade da curva padrão.

Fonte: EnsineMe.
 Exemplo de curva padrão para quantificação absoluta do DNA.

LINEARIDADE DA CURVA

Matematicamente conhecida como R2,, deve ser superior a 0.985 para que a reação seja aceitável, e a quantificação de sua amostra-teste seja
calculada com máximo de precisão. Usando fórmulas de linearidade, calculamos o valor preciso de DNA-alvo na amostra antes da amplificação
começar, baseado no Ct de cada uma.

EFICIÊNCIA DE AMPLIFICAÇÃO

Com ela, a cada ciclo, espera-se que a quantidade de DNA-alvo amplificado dobre, o que significaria uma eficiência de 100% da reação. Porém,
devido a pequenos erros, podemos considerar aceitáveis eficiências que variem entre 90 e 110%. Esses parâmetros serão mais robustos com uso de
replicatas.
 REPLICATAS

São repetições da mesma reação em poços diferentes.

POR QUANTIFICAÇÃO RELATIVA, OU MÉTODO DE DELTA-DELTA-CT (OU ΔΔCT)

Nesse método, você precisará quantificar dois DNA-alvos diferentes: o DNA de interesse, cuja quantidade é desconhecida na amostra, e o DNA de
referência. A determinação da quantidade de um DNA-alvo de interesse é feita a partir da subtração (ou seja, o delta ) do Ct (ciclo em que a amostra
ultrapassou o limiar) pelo Ct do outro DNA quantificado na amostra, o de referência. Isso porque, a quantidade do gene de interesse pode variar de
acordo com diversos fatores biológicos, mas também pode ser devido à quantidade de material usado na extração.

Nesse caso, o ideal é fazer uma normalização pela quantidade de cDNA total e, para isso, usamos um cDNA de referência, que, geralmente, é um
gene constitutivo expresso em níveis estáveis nas células. O segundo delta, ou a segunda subtração, é feita entre a diferença da primeira subtração na
amostra-teste e uma amostra controle, usada como calibradora. A amostra calibradora também precisará ter passado pela primeira subtração; ou
seja, também terá sido normalizada. Dessa forma, temos:

ΔCt = Ctgene alvo – Ctgene de refer ê ncia

Seguido por

ΔΔCt = (Ctgene alvo – Ctgene de refer ê ncia )calibrador – (Ctgene alvo – Ctgene de refer ê ncia )amos

 Atenção! Para visualização completa da equação utilize a rolagem horizontal

Essas subtrações são possíveis apenas quando as curvas de quantificação dos dois DNAs-alvo têm eficiência entre 90-110%, e não devem diferir em
mais de 10% entre si. Por isso, curvas padrão iniciais para cada gene devem ser construídas para se verificar as eficiências da reação, antes de
procedermos para a técnica de quantificação relativa.

Se quisermos comparar a expressão de dois genes entre uma amostra e um calibrador, usamos um método especial. Você consegue identificar qual?
A pista mais importante é: você está investigando a expressão gênica, e não a existência do gene em si. Portanto, você não está olhando diretamente
o genoma, mas um produto dele. Qual produto do DNA podemos detectar via PCR?

 RESPOSTA

Se você respondeu RNA, acertou! Nesse caso, o nome correto e completo da técnica utilizada é RT-qPCR: uma reação de transcrição reversa
acoplada a uma reação em cadeia da polimerase quantitativa.

PCR EM MULTIPLEX

Até agora, falamos sobre detectar apenas um DNA-alvo por reação, seja de PCR convencional, nested-PCR, RT-PCR ou qPCR. Contudo, podemos
detectar mais de um alvo por reação. Precisaremos ajustar as reações separadamente, utilizando pares de oligonucleotídeos iniciadores específicos
para cada produto desejado, e depois fundir as duas PCRs em uma. Esse tipo de PCR em que mais de um produto alvo é identificado chamamos de
multiplex – múltiplos produtos são detectados, e até quantificados.
Em uma PCR convencional, vamos utilizar todos os reagentes que já conversamos e, é claro, os quatro (ou mais) oligonucleotídeos necessários,
sendo cada par correspondente à sua sequência-alvo. O mais importante para fazermos um multiplex em uma PCR convencional é que os amplicons
tenham tamanhos distintos o suficiente para serem separados pelo gel de agarose para que os sinais de ultravioleta não sejam confundidos.
Normalmente, os produtos menores de 1000 pares de base (pb) devem ter mais de 200 pb de diferença. Para produtos maiores de 1000 pb, a
diferença entre os produtos também deve ser maior.

 ATENÇÃO

Lembre-se de que você deverá levar em consideração o tamanho do maior produto para o tempo de extensão. Outro fator ao qual você deverá estar
atento é a temperatura de anelamento dos múltiplos pares de iniciadores, que devem ter temperaturas o mais próximas possível.

Em uma qPCR por TaqMan, a amplificação e quantificação de diferentes sequências na mesma reação é possível ao utilizarmos duas (ou mais)
sondas distintas, cada uma capaz de hibridizar especificamente a sua sequência-alvo, e ambas marcadas com fluoróforos que se excitem e emitam
fluorescência em comprimentos de onda diferentes.

 EXEMPLO

Você poderá usar um fluoróforo que seja excitado no comprimento de onda azul e emita fluorescência no espectro verde, e outro fluoróforo que seja
excitado e floresça no comprimento vermelho, e assim por diante.

Por outro lado, reações multiplex quantitativas usando o sistema SYBR são mais difíceis. Isso porque a emissão de fluorescência pelo SYBR é
inespecífica e ocorre sempre que o fluoróforo intercala com fitas duplas do DNA. Assim, a reação multiplex fica limitada e, muitas vezes, não é possível
distinguirmos entre os sinais dos diferentes produtos. Em alguns casos, entretanto, a distinção é possível graças à curva de dissociação. Isso ocorre
quando os produtos distintos têm sequências diferentes o suficiente para terem temperaturas de dissociação de 50%. Então, observamos dois picos na
curva de dissociação, em temperaturas diferentes. No entanto, sequências distintas sem diferença suficiente em seus conteúdos CG não poderão ser
multiplexadas, pois não veremos diferenças em suas curvas de dissociação.

VERIFICANDO O APRENDIZADO

1. A PCR É UMA TÉCNICA MUITO ÚTIL, ESPECIALMENTE, POR TER VARIAÇÕES QUE PODEM SER AINDA MAIS
INFORMATIVAS. SOBRE AS VARIAÇÕES DA PCR, ASSINALE A ALTERNATIVA CORRETA:

A) Na nested-PCR, fazemos duas reações em um único tubo, amplificando regiões diferentes que geram produtos de tamanhos distintos.

B) O SYBR é um fluoróforo presente em PCR multiplex que dá maior estabilidade à reação.

C) Na RT-PCR, ocorrem duas reações subsequentes: uma de síntese de cDNA a partir de RNA, e outra de amplificação da sequência-alvo presente
no cDNA.

D) Uma PCR multiplex consiste em utilizar duas reações subsequentes, sendo que o produto amplificado da primeira serve como molde para
amplificação na segunda.

E) A reação de transcrição reversa utiliza uma polimerase especial, capaz de sintetizar RNA a partir de DNA.

2. VIMOS QUE PODEMOS QUANTIFICAR UMA OU MAIS SEQUÊNCIAS DE DNA-ALVO ATRAVÉS DE QPCR.
CONSIDERANDO O MATERIAL ESTUDADO, ESCOLHA A ALTERNATIVA CORRETA:

A) A quantificação do DNA ou cDNA na amostra se dá através da intensidade do sinal total, detectado pelo aparelho, dependendo apenas da
fluorescência de ROX.
B) O SYBR e um fluoróforo que se liga de forma inespecífica ao DNA dupla hélice e, com isso, a curva de dissociação informa qual é a quantidade de
DNA para cada amostra.

C) A quantificação na técnica TaqMan é proporcional à fluorescência emitida na remoção de nucleotídeos da sonda marcados com fluoróforos, o que
permite a realização de reações quantitativas multiplex.

D) A quantificação do DNA alvo pode ser feita pelo uso de curva padrão, em que as diferenças entre Cts de dois genes é subtraída da diferença entre
amostras-teste e amostra de calibração.

E) A quantificação de uma sequência em amostra-teste, de concentração desconhecida, é feita por ΔΔCt, a partir da linearidade da diluição seriada.

GABARITO

1. A PCR é uma técnica muito útil, especialmente, por ter variações que podem ser ainda mais informativas. Sobre as variações da PCR,
assinale a alternativa correta:

A alternativa "C " está correta.

A Taq polimerase usada para amplificação de DNA não é capaz de reconhecer e polimerizar RNA. Quando queremos analisar RNAm, precisamos
que o cDNA seja sintetizado pela DNA-polimerase RT dependente, ou transcriptase reversa. Então, usamos o cDNA sintetizado como molde em uma
PCR.

2. Vimos que podemos quantificar uma ou mais sequências de DNA-alvo através de qPCR. Considerando o material estudado, escolha a
alternativa correta:

A alternativa "C " está correta.

A qPCR-TaqMan possui uma enzima polimerase capaz tanto de polimerizar DNA quanto de remover nucleotídeos. Quando a TaqMan chega à sonda,
que é marcada com fluoróforo e bloqueador, a enzima cliva os nucleotídeos, liberando o fluoróforo de seu bloqueador. Assim, o fluoróforo poderá emitir
seu sinal, que será proporcional à quantidade de sondas ligadas e clivadas. Graças ao fato das sondas se ligarem especificamente às suas
sequências alvo, e serem passíveis de marcação por diferentes fluoróforos, qPCR-TaqMan multiplex são possíveis.

MÓDULO 3

 Identificar aplicações apropriadas ao uso de cada método

APLICAÇÕES DA PCR
Até agora, vimos os reagentes necessários à amplificação exponencial de uma sequência específica de DNA até termos milhões e bilhões de cópias
da mesma exata sequência, ou amplicon , que pode ser visualizada a partir de técnicas especiais. Também vimos algumas variações da PCR que a
tornam ainda mais relevante e útil em diversos contextos.

Mas, afinal, para que precisamos de tantas sequências idênticas? Quais são as aplicações disso? Vamos ver um pouco sobre alguns exemplos delas
para ilustrar melhor o quão útil a PCR é.

A PCR E AS SUAS VARIANTES EM CIÊNCIAS FORENSES

A primeira, e talvez uma das mais famosas para o grande público, é a aplicação forense. Você já deve ter entrado em contato com a identificação de
um criminoso a partir do seu DNA deixado na cena do crime, seja por ter assistido a alguma série policial seja por ter lido alguma reportagem da vida
real. Isso só é possível porque cada ser humano possui um genoma completamente único, exceto de gêmeos idênticos.
Em nosso genoma, temos regiões especiais nas quais um cientista forense pode olhar para confirmar a origem do DNA. Chamadas de marcadores
moleculares, elas são conhecidas pela alta frequência de polimorfismos genéticos – regiões com grande variação na sequência de DNA entre
indivíduos sem causar nenhum tipo de interferência funcional, pois são mais frequentes em regiões não codificantes.

Fonte: Shutterstock.com

 ATENÇÃO

Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises forenses são as repetições curtas em tandem (ou STRs – short tandem repeats ,
em inglês). As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre as pessoas e oferecem grande precisão na identificação de indivíduos se a detecção
de várias STRs for usada em conjunto.

As regiões de interesse são amplificadas por PCR e, em seguida, o perfil genético pode ser visualizado por separação das bandas em gel de agarose
e coloração por brometo de etídio.

Existem casos em que é necessário aumentar o material genético a ser usado para, assim, aumentarmos o sinal durante a revelação. Nesse caso, o
perito pode optar pelo uso de uma nested-PCR, lembrando que os primers externos e interno precisam de regiões não repetidas para se anelarem. Um
cientista forense, além de fazer a extração do DNA e sua amplificação por PCR, fará a identificação de indivíduos através do seu perfil genético.

Fonte: Shutterstock.com
 Ilustração de um gel de agarose mostrando múltiplas bandas e representando os marcadores moleculares.

A PCR E AS VARIAÇÕES USADAS NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS

GENÉTICAS
Existe uma gama de aplicações de PCR e suas variações na Medicina, de prevenção ao diagnóstico, acompanhamento e prognóstico, ou evolução, de
doenças. Ao amplificarmos certas regiões do DNA, podemos identificar a presença ou ausência de sequências que deveriam ou não existir em
determinado contexto. Seu uso pode auxiliar, ou até mesmo determinar, o diagnóstico de diversas doenças que variam desde genéticas a infecciosas.
As doenças genéticas podem ser muito complexas em sua apresentação e possuir diferentes perfis – autossômico dominante ou recessivo, ligado ao
cromossomo X, multifatoriais e multigênicas. O uso da PCR no diagnóstico dessas doenças pode ser feito de diversas maneiras, dependendo de qual
é a doença e de seu perfil genético.

Fonte: Shutterstock.com

O PCR multiplex pode ser utilizado para verificar qual alelo está sendo expresso, dentre dois alelos distintos, em uma mesma reação e assim ajudar no
reconhecimento de pequenas mutações que levariam ao desenvolvimento de uma doença genética. Mas temos outras aplicações, usando PCR
convencional. Vamos usar a doença de Huntington como exemplo. Nessa doença genética autossômica dominante, ocorre um excesso de repetição
de três nucleotídeos (CAG) do DNA que codifica uma proteína chamada Huntingtina. Esse excesso leva a uma doença neurodegenerativa sem cura
que causa perdas motoras, cognitivas e psiquiátricas ainda na idade adulta, apesar de poder aparecer em forma juvenil também. A PCR torna-se uma
importante ferramenta diagnóstica, pois, ao amplificar sequências próximas da região de repetição, pode nos dizer seu tamanho e, assim, informar o
risco e até o prognóstico da doença em si.

Em um gene saudável, é normal ter cerca de 20 repetições (CAG); em pessoas portadoras de Huntington, o número de repetições aumenta para 35 ou
mais. De modo geral, quanto maior o número de repetições, maior o risco de aparecimento e de progressão da doença. Essa gradação de fenótipo –
no caso da doença de Huntington, de sintomas – é algo conhecido em genética como penetrância.

 ATENÇÃO

Lembre-se de que, para regiões repetitivas, é necessário usar iniciadores que se anelem próximo a STRs, mas não nas STRs em si, pois isso geraria
inespecificidade e muitas bandas em um gel de agarose.

A PCR E AS VARIAÇÕES USADAS NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS

INFECCIOSAS

Outro exemplo diagnóstico que você já pode ter ouvido falar é o uso da PCR para diagnóstico de doenças infecciosas. Ao utilizar a técnica para
amplificar o DNA (ou RNA) de algum agente infeccioso, podemos diagnosticar uma infecção, já que o material genético de tal agente não deveria estar
presente naquela amostra biológica. Sua simples presença pode indicar o agente etiológico e, assim, descobrir a causa da doença. A PCR é
especialmente útil no diagnóstico de organismos fastidiosos, que não crescem bem em cultivo, como o Mycobacterium tuberculosis , por possuir alta
sensibilidade e especificidade. Em outros casos, a presença do material genético de um determinado microrganismo não é suficiente para seu
diagnóstico como agente causador da doença, e testes complementares a PCR podem ser necessários, assim como técnicas de PCR mais
elaboradas que darão maiores informações.
Fonte: Shutterstock.com

Temos, como exemplo, o diagnóstico molecular de COVID-19. O SARS-CoV2, assim como os demais coronavírus, tem RNA fita simples como material
genético. Dessa forma, usamos a transcrição reversa para sintetizarmos um cDNA viral, e o utilizamos em qPCR – ou seja, fazemos uma RT-qPCR.
Esse é considerado o melhor teste, ou padrão-ouro, para a identificação de casos ativos de infecção pelo SARS-CoV2. Isso porque, o material
genético viral é identificado de forma relativamente rápida – entre coleta, extração, RT e qPCR, o resultado pode sair em algumas horas. Além disso,
esse método é muito sensível e específico, conseguindo detectar nas amostras pequenas concentrações do vírus (carga viral).

Fonte: Shutterstock.com

A RT-qPCR também é utilizada no diagnóstico e acompanhamento de outras infecções virais. A efetividade do tratamento para HIV pode ser
monitorada através de RT-qPCR, sendo esperadas reduções drásticas na carga viral após introdução da terapia. O mesmo princípio de quantificação
de cDNA obtido por transcrição reversa também é aplicado em tratamentos oncológicos, especialmente, em leucemias e linfomas: o oncologista
pode requerer uma RT-qPCR para acompanhamento de determinado marcador gênico do câncer em questão. Nos dois casos, a redução (ou
não) das sequências alvo na RT-qPCR ao longo do tempo podem ser cruciais no tratamento e evolução do paciente. A PCR convencional multiplex
também pode ser utilizada no diagnóstico diferencial entre dois patógenos que possam causar os mesmos sintomas, mas que exigem
abordagens clínicas diferentes.

 EXEMPLO

Um paciente transplantado renal pode apresentar alteração em exames bioquímicos que levem o nefrologista a pensar em duas possibilidades: na
primeira, uma infecção por um vírus sem gravidade pode estar acontecendo no órgão, e nenhum tratamento seria necessário; na segunda, pode estar
acontecendo uma infecção viral grave no rim transplantado que poderia rapidamente levar à perda do órgão e até mesmo ao óbito do paciente.

Nesse último caso, seria necessário reduzir as drogas que suprimem o sistema imunológico e impedem que o paciente rejeite o rim novo, para que o
próprio sistema imunológico consiga combater a infecção viral – o que leva ao risco de o paciente rejeitar o órgão enxertado. Uma PCR multiplex
poderia identificar a presença ou ausência de dois ou mais tipos de genomas virais na urina ou sangue do paciente, acelerando o diagnóstico e a
tomada de decisão por parte do médico nefrologista.

A PCR E AS SUAS VARIANTES EM PESQUISA CIENTÍFICA

Outro campo que utiliza a PCR é a pesquisa científica. Em diversas ocasiões, a PCR pode ser utilizada para manipulação genética de organismos
simples, como bactérias, leveduras e células em cultivo. Nesse contexto, podemos usar a PCR para, por exemplo, clonarmos um gene. Fazemos isso
ao amplificarmos a sequência gênica que desejamos clonar usando oligonucleotídeos longos que têm duas regiões distintas. A primeira região liga-se
ao gene que queremos manipular – deletar, adicionar ou mutar – no organismo alvo; a segunda é a região que se liga ao DNA molde do vetor dentro
do qual queremos colocar nosso gene clonado.

O vetor é, em muitos casos, uma sequência independente do genoma do organismo alvo, mas que é capaz de se replicar autonomamente quando
inserido na célula. Um exemplo de vetores muito usados são os plasmídeos, pequenos DNA circulares autorreplicantes e transferíveis de uma célula a
outra, comuns em bactérias.

Fonte: Takometer/Wikimedia commons/licença(CC BY 2.5).

 Figura 14: Representação esquemática de uma técnica de clonagem por restrição, com a inserção (ou clonagem) de um gene de origem diferente,
que foi amplificado por PCR, ao vetor original.

Normalmente, usamos a clonagem por PCR em duas etapas: uma para amplificarmos o gene alvo que queremos clonar; na segunda etapa, usamos o
produto amplificado, juntamente com o vetor, para inserirmos o gene clonado no vetor. Outra forma de clonagem inclui o uso de enzimas de restrição
para cortar o DNA em pontos específicos, após amplificação por PCR.

 SAIBA MAIS

A pesquisa científica é uma área de atuação muito grande e, por vezes, ela está interessada em entender mecanismos complexos de regulação
genética sob diversas condições. A RT-qPCR é uma ferramenta muito útil nesse caso, para a avaliação dos níveis de expressão de genes em
células submetidas a diversas condições diferentes.

É comum utilizarmos a quantificação relativa (em que comparamos a quantidade de um gene de interesse com um gene constitutivo de expressão
estável) para avaliarmos como o metabolismo celular pode mudar mediante o meio que se encontra. Em geral, você pode considerar que qualquer
aplicação que determinado método ou técnica tenha em rotinas laboratoriais das mais diversas áreas não apenas é usada em pesquisa científica,
como, provavelmente, foi originada de uma.
QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE GENES POR RT-QPCR E SEU USO
EM PESQUISA

VERIFICANDO O APRENDIZADO

1. A RESPEITO DA APLICAÇÃO DA PCR E DE SUAS VARIAÇÕES EM CIÊNCIAS FORENSES, É CORRETO AFIRMAR

QUE:

A) A nested-PCR não é útil, uma vez que o material genético é encontrado em abundância em situações forenses.

B) A PCR pode nos dar informações importantes, mas não pode determinar a identidade de indivíduos.

C) As STRs são regiões cuja variabilidade as tornam úteis para distinguir indivíduos geneticamente.

D) A qPCR é uma ferramenta necessária para amplificação do material genético de uma amostra antes de seu sequenciamento.

E) O sequenciamento do genoma não é uma ferramenta viável para a identificação de indivíduos, além de ser trabalhoso e caro.

2. ESCOLHA A ALTERNATIVA INCORRETA:

A) A RT-qPCR é a técnica considerada ideal para diagnóstico do SARS-CoV2.

B) Podemos usar PCR convencional para amplificar um gene e cloná-lo em um vetor, e modificarmos geneticamente um organismo simples.

C) Pelo uso de diferentes sondas marcadas com sinais diferentes, a qPCR-TaqMan pode ser usada na identificação e quantificação de mutações em
diferentes alelos.

D) As técnicas moleculares são de pouca importância na rotina clínica, pois são demoradas e de aplicações muito restritas.

E) O tamanho de STRs é relevante no diagnóstico de doenças genéticas, pois as STRs sempre estão localizadas em regiões não-codificantes.

GABARITO

1. A respeito da aplicação da PCR e de suas variações em ciências forenses, é correto afirmar que:

A alternativa "C " está correta.

Short tandem repeats (STRs) apresentam grande variação de sequência e de tamanho entre indivíduos. Pela identificação de diferentes padrões de
um conjunto de STRs, podemos correlacionar amostras com grande precisão, além ser possível também estabelecer grau de parentesco.

2. Escolha a alternativa incorreta:

A alternativa "D " está correta.

As técnicas moleculares, como a PCR e as suas variações, têm ganhado muito espaço na rotina clínica. Há situações em que o diagnóstico por
amplificação de ácidos nucleicos é o padrão-ouro e, às vezes, é a única opção. Suas aplicações vão de diagnóstico de doenças genéticas e
infecciosas ao acompanhamento da evolução e tratamento de cânceres e infecções crônicas, assim como determinação de riscos genéticos e
aconselhamentos.

CONCLUSÃO

CONSIDERAÇÕES FINAIS
Vimos que a amplificação de DNA in vitro é feita pela reação em cadeia da polimerase, em que a variação cíclica de temperatura permite a
desnaturação, o anelamento e a extensão de sequências-alvo específicas, de acordo com aquelas que desejamos detectar. Como estudado, os
oligonucleotídeos iniciadores se ligam à fita simples de DNA que foi aberta por desnaturação por complementariedade entre as bases nitrogenadas.
Essas últimas são elementos fundamentais dos nucleotídeos por conterem a informação genética.

As variações da PCR são úteis de diferentes formas, e devemos conhecê-las para podermos escolher qual a melhor técnica para cada caso: para
aumentar a quantidade final de DNA-alvo amplificado, para síntese de cDNA a partir de RNA polaridade positiva, para quantificação de DNA ou cDNA
e para diferenciação rápida entre diferentes produtos de amplificação.

Além disso, aprendemos algumas das diversas aplicações que a PCR e as suas variações têm em áreas da ciência, como na forense, na pesquisa e
na clínica, participando do diagnóstico, acompanhamento e prognóstico.

Agora você está pronto para continuar progredindo no conhecimento da Biologia Molecular, uma área empolgante e que se torna, a cada dia, mais
importante para diversas áreas das ciências biológicas.

AVALIAÇÃO DO TEMA:

REFERÊNCIAS
ASSOCIAÇÃO BRASIL HUNTINGTON. O que é a Doença de Huntington. In : ABH. Consultado em meio eletrônico em: 18 out. 2020.

CABELLO, G. M. K. Genética Clínica: Métodos de diagnóstico. In : DBBM FIOCRUZ. Consultado em meio eletrônico em: 18 out. 2020.

DOLINSKY, L. C.; PEREIRA, L. M. C. V. DNA forense: Artigo de revisão. In : Saúde & Ambiente em Revista, 2(2), p11-22, 2007.

NELSON, D. L. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2014.

NEW ENGLAND BIOLABS’ FEATURE ARTICLES. Polymerase Fidelity: What is it, and what does it mean for your PCR? In : NEB. Consultado em
meio eletrônico em: 18 out. 2020.

REAL-TIME PCR BASICS. TaqMan vs. SYBR Chemistry for Real-Time PCR. In : ThermoFisher Scientific website. Consultado em meio eletrônico
em: 18 out. 2020.
VANDESOMPELE, J. Q. PCR Guide por Eurogentec – plataforma GenEx. In : Gene Quantification. Consultado em meio eletrônico em: 18 out.
2020.

ZHAO, M.; et al . Improved high sensitivity screen for Huntington disease using a one-step tripletprimed PCR and melting curve assay. In :
PLoS ONE. Consultado em meio eletrônico em: 18 out. 2020.

EXPLORE+
Para aprofundar os seus conhecimentos no assunto deste tema:

Acesse o conteúdo de Biologia (DNA como o material genético: Replicação do DNA) no portal da Khan Academy para maiores detalhes e vídeos
sobre replicação do DNA.

Assista ao vídeo “4. Teste de Paternidade”, no canal do Youtube de Carlos Simeão, material produzido pela USP-UNIVEST. Você aprenderá mais
sobre a variabilidade genética estudada em análises forenses e em testes de paternidade.

Assista ao vídeo “Técnicas de Biologia Molecular – PCR- Animação 3D”, no canal do Youtube de Carlos Simeão, material produzido pela USP-
UNIVEST. Você irá conhecer o passo a passo da técnica de PCR.

Aprendemos a tão famosa técnica de PCR, para conhecer mais sobre a história do PCR leia o texto O desenvolvimento da reação em cadeia
pela polimerase (PCR).

Conhecemos algumas técnicas de PCR, para apreender um pouco mais sobre esse assunto leia Outras aplicações da PCR e as suas
variações.

CONTEUDISTA
Camila Freze Baez

 CURRÍCULO LATTES