Amplificação in Vitro de DNA

21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA
Amplificação
in vitro de DNA
Prof.ª Camila Freze Baez
Descrição Técnicas de amplificação e detecção de ácidos nucleicos in vitro e introdução de suas aplicações
em rotina laboratorial.
Propósito Compreender a teoria por trás da amplificação de ácidos nucleicos in vitro em suas diferentes
formas e entender quais são suas vantagens, desvantagens e aplicações em contextos diversos é
importante para o profissional de laboratório, pois lhe fornecerá poderosa ferramenta de trabalho.
Objetivos
Módulo 1 Módulo 2 Módulo 3
Elementos fundamentais Variações entre cada Aplicações apropriadas

à amplificação de ácidos técnica de PCR ao uso de cada método
nucleicos
Diferenciar as variações entre cada Identificar aplicações apropriadas ao
técnica de PCR. uso de cada método.
Reconhecer elementos fundamentais
à amplificação de ácidos nucleicos in
vitro.
meeting_room Introdução
Os ácidos nucleicos são as estruturas fundamentais que carregam informações
genéticas. Você já parou para pensar como certas características físicas passam
dos pais para os filhos? Traços físicos como formato do rosto, altura, cor da pele
e dos olhos são traduções de informações transmitidas às gerações futuras dos
ácidos nucleicos. No corpo humano e na maioria dos seres vivos, encontramos

dois tipos de ácidos nucleicos: o ácido desoxirribonucleico (ADN – também
conhecido pela sigla em inglês, DNA), e o ácido ribonucleico (ARN, ou RNA, em
inglês).
Cada uma dessas moléculas – DNA e RNA – tem funções diferentes dentro da
menor unidade viva conhecida — a célula. O DNA possui fita dupla, sendo mais
estável e resistente que o RNA. Por isso, a célula utiliza o DNA para armazenar as
informações genéticas em longo prazo. Já o RNA, normalmente, em fita simples e
mais instável, tem como principal função intermediar a informação entre o DNA e
as unidades efetoras da maioria das funções celulares, as proteínas.
Formato do rosto e altura, por exemplo, são decorrentes da estrutura óssea que,
em grande parte, é feita de proteínas. O papel das proteínas não se limita apenas
em traços físicos, mas também em funcionais.
Mas o que isso tem a ver com a amplificação de ácidos nucleicos?
Em uma célula viva e saudável, as enzimas fazem toda a amplificação do DNA por
conta própria em um ambiente extremamente complexo e controlado – do pH e
nível de oxigênio disponível, ao momento que a célula está em seu ciclo de vida.
São dezenas de enzimas envolvidas na síntese de novas moléculas de DNA,
tantas que os cientistas ainda não compreendem completamente todas as etapas
envolvidas nesse processo. Apesar de toda a complexidade da duplicação do
DNA in vivo, já somos capazes de sintetizar pequenos trechos do DNA em um
tubo de ensaio.
Incrível, não? Vamos ver com detalhes como isso é possível neste material.
Dogma central da Biologia Molecular: DNA replica-se em DNA e é transcrito em RNA, que é traduzido em
proteína.
1 - Elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos

Ao final deste módulo, você será capaz de reconhecer elementos fundamentais à amplificação de ácidos
nucleicos in vitro.
Princípios da PCR concencional

Para entendermos como funciona a amplificação de DNA in vitro, devemos primeiro
relembrar algumas informações sobre o DNA e o RNA: suas funções, composições,
similaridades e diferenças. Tanto o DNA quanto o RNA são formados por
nucleotídeos, que são como os tijolos dos ácidos nucleicos e, consequentemente, do
material genético. A partir da junção de tais tijolos, formamos as estruturas de DNA e
RNA. Mas como são esses tijolos?
Em primeiro lugar, os nucleotídeos contêm um açúcar chamado ribose. Essa ribose é

uma das formas mais simples dos carboidratos – a forma mais conhecida de um
açúcar simples é a glicose. É na ribose que reside a principal diferença entre DNA e
RNA: o RNA possui uma molécula de oxigênio ligada ao segundo carbono da ribose
que o DNA não possui – por isso, o DNA é chamado de desoxirribonucleico.
O segundo componente são as bases nitrogenadas. Para o DNA, existem quatro tipos
diferentes de bases nitrogenadas:
Desoxirribonucleico
Prefixo “des” significa a ausência (como em desinteresse), portanto, “desoxi” representa o oxigênio que está
ausente.
Adenina (A)
check_circle_outline
check_circle_outline Citosina (C)
check_circle_outline Guanina (G)
check_circle_outline Timina (T)
Para o RNA há uma diferença:
No RNA as bases nitrogenadas A, C e G são as mesmas, mas, em

vez de T, existe uma Uracila (U). Essas bases são as responsáveis
pela informação genética.
Imagine escrever um texto codificado, tão complexo quanto um ser humano, usando
apenas uma das letras do teclado do computador. Como seria possível entender a
informação que você quis codificar? Agora, se você escrever um texto com pelo
menos duas letras (ou números) do teclado, usará um código binário. Isso também
acontece com a informação genética: a célula utiliza essas cinco bases nitrogenadas
para codificar, em sequência, uma informação preciosa.
Finalmente, os nucleotídeos possuem grupamentos fosfatos no quinto carbono da

(desoxir)ribose, que são capazes de interagir com a hidroxila (álcool orgânico)
presente no terceiro carbono da (desoxir)ribose, fazendo a ligação entre um
nucleotídeo com o próximo. Essa ligação é conhecida como fosfodiéster, sendo
considerada o “cimento” dos nossos “tijolos”: a partir dela, longas sequências de DNA
ou RNA são formadas. É importante manter em mente que o grupamento fosfato
confere carga negativa à molécula de DNA – vamos voltar a falar a respeito disso
mais à frente.
Código binário
Formado por sequências de 0 e 1 que, em trechos longos, podem codificar informação, como computadores.
Esquema da estrutura básica dos desoxirribonucleotideos, compostos por fosfato, desoxirribose e base nitrogenada.
A interação entre a hidroxila no carbono 3 da (desoxir)ribose e o fosfato de outro

nucleotídeo no carbono 5 deixam as bases nitrogenadas livres para interação com
outras bases nitrogenadas, normalmente, do tipo oposto. As principais bases
nitrogenadas (A, T, C, G, U) são divididas em dois grupos químicos, de acordo com o

número de anéis aromáticos que possuem:
Pirimidinas Purinas
(C, T, U) - Possuem um anel. (A, G) - Possuem dois anéis.
As bases interagem entre si, mas entre grupos opostos: ou seja, pirimidinas pareiam
com purinas, de acordo com as cargas livres de cada base. Desse modo, A interage
com T, pois ambas têm duas cargas livres para interação, e C interage com G através
de três cargas. Essas interações são chamadas de pontes de hidrogênio e são
consideradas fracas por serem facilmente quebradas por agentes físicos, como a
temperatura, e químicos, como o pH.
Veja o esquema mostrando a estrutura do DNA e o pareamento das bases por

complementariedade. Note as pontes de hidrogênio duplas (seta verde) entre adenina
e timina, e as triplas (seta preta) entre citosina e guanina.
Pareamento de bases nitrogenadas.

No entanto, essas pontes de hidrogênio são importantes para manter a sequência de

DNA livre de erros e garantem à molécula uma de suas características fundamentais:
a complementariedade. É a partir dessa complementariedade que as enzimas
responsáveis pela síntese do DNA e do RNA, as polimerases, sabem qual nucleotídeo
adicionar para manter a mesma mensagem na hora de duplicar o DNA. Ao mesmo
tempo, é a característica que dá ao DNA seu formato em fita dupla. Chamamos essa
característica de replicação semiconservada.
Semiconservada
Uma fita original (fita parental) é mantida na duplicação, como molde para a síntese da fita nova (fita filha).
Atenção!
Se olharmos para essa fita dupla em um sentido único, da esquerda para a direita, por exemplo, veremos que
uma das fitas se encontra com o carbono 5 da desoxirribose livre na extremidade à esquerda, enquanto a
outra fita tem o carbono 3 da desoxirribose livre à esquerda. Isso acontece porque, para interagirem, as duas
fitas precisam estar em sentidos opostos – por isso, nós as chamamos de fitas antiparalelas. Esse sentido
de interação por complementariedade traz à tona outra característica do DNA: sua replicação deve ser feita
de forma semidescontínua (In vivo, apenas a fita no sentido antiparalelo (3’→5’) é lida de forma contínua, e a
fita de DNA molde no sentido paralelo (5’→3’) é lida de forma descontínua. Isso acontece por causa do
sentido de abertura da forquilha de replicação).
Reação em cadeia pela polimerase: amplificando DNA in

vitro
Em uma célula viva, as enzimas polimerases têm ao seu dispor todos os itens
necessários para duplicar o DNA, de nucleotídeos a todas as enzimas.
Representação do complexo de replicação do DNA em uma célula.
Imagine quão complexo seria reproduzir o ambiente celular em um tubo de ensaio!

Precisamos utilizar os conhecimentos da físico-química do DNA e os princípios
básicos de sua replicação para simplificação e adaptação da técnica in vitro. Veja:
Complementariedade entre fitas antiparalelas

Primeira característica do DNA importante na sua replicação in vitro: as bases nitrogenadas de uma
fita interagem especificamente com as bases correspondentes da outra fita (A-T, C-G) por meio de
interações frágeis que podem ser desfeitas pelo calor. Ao aquecermos a solução acima de 90ºC,
podemos desfazer essas interações e abrir a fita dupla em duas fitas simples. Isso deixa as bases
nitrogenadas expostas para interagirem e, ao abaixarmos a temperatura, conseguimos fazer com
que a fita dupla se refaça e a informação seja mantida. Vamos ver como esse processo funciona
passo a passo mais à frente.
Síntese enzimática pela polimerase
Segunda característica importante para a replicação do DNA in vitro. Essa enzima lê cada base
nitrogenada da fita simples como se fosse um molde, e adiciona a base nitrogenada complementar
na fita que está sendo sintetizada através da ligação fosfodiéster. In vivo, a polimerase não inicia a
duplicação do DNA sozinha, pois ela não consegue abrir a fita dupla em fitas simples, identificar o
local certo de início de replicação ou adicionar os primeiros nucleotídeos. A célula utiliza enzimas
para abrir a fita dupla, as helicases, e adição dos primeiros nucleotídeos é feita por outra enzima,
chamada primase.
Na amplificação do DNA in vitro, denominada reação em cadeia da polimerase

(polymerase chain reaction – PCR), a abertura do DNA em fitas simples é feita através
de calor. Para isso, utilizamos uma enzima termorresistente chamada de Taq

polimerase. Além disso, usamos pequenas sequências de nucleotídeos em fitas
simples e complementares à sequência-alvo do DNA a ser amplificado. Essas
sequências sintéticas são chamadas de iniciadores ou oligonucleotídeos (oligo =
poucos), algo em torno de 20 nucleotídeos, conhecidos como primers, em inglês.
Normalmente, são usados dois oligonucleotídeos por reação: um chamado senso, que
se liga ao DNA molde fita simples no sentido 3’→5’; e um antissenso, que se liga à fita
no sentido 5’→3’.
Lembre-se de que o sentido de duplicação contínua do DNA

ocorre apenas no sentido 5’→3’, pois o trifosfato (na posição 5)
do nucleotídeo livre dará a energia necessária à ligação
fosfodiéster com o carbono 3 da ribose do nucleotídeo que já
estará na fita. Isso acontece em ambas as fitas (paralela 5’→3’ e
antiparalela 3’→5’), e ambos os oligonucleotídeos são
sintetizados em laboratório no sentido 5’→3’. Os
oligonucleotídeos iniciadores irão demarcar a região do genoma a
ser amplificada. Essa informação é importante para dar
especificidade à PCR!
Etapas da reação em cadeia da polimerase
Já compreendemos que a fita dupla de DNA se abre em duas fitas simples quando
aquecida próximo a 100ºC, e sabemos que a reação de síntese de novas fitas de DNA
é feita por meio de uma enzima termorresistente chamada de Taq polimerase.
Também descobrimos que a enzima precisa de oligonucleotídeos iniciadores que se
ligam por complementariedade ao DNA-alvo desnaturado em uma fita simples. Agora,
podemos entender como essa última se desenvolve. Assim como em qualquer receita
de bolo, uma PCR precisa de seus ingredientes básicos – ou reagentes mínimos –
para a síntese de DNA acontecer. Desse modo, adicionamos esses ingredientes a um
microtubo. Os reagentes mínimos necessários para a amplificação são:
O DNA molde, dupla fita, extraído a partir de amostras biológicas.
Os oligonucleotídeos sintéticos que são complementares à região do DNA

molde a ser amplificado.
A Taq polimerase, termorresistente.
Cátions de magnésio (Mg2+), cofator necessário ao funcionamento eficaz da

polimerase.
Os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs – dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

– lembre-se de que os três fosfatos são usados como fonte de energia para
que a reação fosfodiéster catalisada pela Taq polimerase aconteça.
A água ultrapura, livre de contaminantes de DNA, RNA e de nucleases.
Esquema dos reagentes necessários a uma reação em cadeia da polimerase (PCR).
O microtubo com esses poucos reagentes é, então, submetido a diversos ciclos de

elevação e redução da temperatura do qual a PCR consiste. Vejamos:
1. A primeira etapa de qualquer PCR consiste na abertura da fita dupla de DNA

em suas fitas simples pelo aquecimento da reação a, pelo menos, 95ºC, por
um tempo prolongado – algo em torno de 5 a 10 minutos. Esse tempo é
necessário para abrir por completo as fitas de DNA que podem estar muito
concentradas, superenoveladas e ser muito longas.
2. Em seguida, começam os ciclos. Cada ciclo contém, pelo menos, 3 etapas:

desnaturação, anelamento e extensão.
Note na ilustração a desnaturação das fitas duplas de DNA em fitas simples, o

anelamento dos iniciadores à sequência-alvo por complementariedade e a extensão
pela Taq polimerase.
Ilustração das etapas da PCR.
Entenda melhor como acontecem estas etapas:
Desnaturação expand_more
É a primeira etapa de cada ciclo em que a temperatura é aquecida a 95ºC por

cerca de 1 minuto. O tempo de desnaturação pode variar de acordo com cada
reação e genoma. Por exemplo, genomas ricos em CG precisam de tempo e
temperatura maiores para desnaturar, pois C faz pontes triplas com G,
enquanto genomas ricos em AT precisam de tempos menores por possuírem
ligações duplas.
Anelamento expand_more
Segunda etapa de cada ciclo. A temperatura será reduzida para cerca de 50 a

65ºC por, aproximadamente, 30 segundos. Essa redução da temperatura deve
ser feita com exatidão para que os iniciadores se liguem especificamente à fita
simples de DNA. Se a temperatura for baixa demais, a fita se renatura e a PCR
não acontece, ou ainda outros fragmentos do DNA extraído podem se ligar
inespecificamente e sua reação não funcionará apropriadamente. Se for alta
demais, os oligonucleotídeos se ligarão apenas parcialmente, ou até mesmo
não se ligarão, e a eficiência da sua reação será gravemente comprometida.
Você pode estar se perguntando como saber exatamente a temperatura a ser
usada. A resposta certa dependerá de vários fatores, como o tamanho do seu
oligonucleotídeo, seu conteúdo de CG, e a concentração de sais no tampão de
PCR. De modo geral, quanto maior o tamanho e o conteúdo de CG, maior será a
temperatura de anelamento.
Uma vez que os oligonucleotídeos tenham se anelado à fita de DNA molde, a Taq
polimerase reconhecerá esse local e fará a extensão da fita dupla. Como a Taq
polimerase é termorresistente, a elevação da temperatura a 95ºC não a destrói – na
realidade, ela funciona melhor em temperaturas mais elevadas.
No caso da maioria das polimerases disponíveis comercialmente, a melhor

temperatura de adição de nucleotídeos em uma PCR é, em torno de 70ºC a 72ºC.
Atenção!
O tempo de extensão depende da velocidade da polimerase usada e do tamanho da sequência entre os

oligonucleotídeos. Uma reação para amplificar menos de 500 pares de bases que utilize uma polimerase
com uma velocidade de incorporação de nucleotídeos mediana deve ter um tempo de extensão de 30 a 40
segundos.
Após o término da extensão, a reação é aquecida novamente a > 95ºC, para que as
fitas duplas recém-sintetizadas sejam separadas, e o ciclo desnaturação-anelamento-
extensão se repita de 30 a 40 vezes. No final, é recomendável ter um ciclo final de
extensão maior para garantir que a síntese de todas as fitas seja concluída. Após o
término, a reação deve ser mantida refrigerada para preservar o material amplificado.
A PCR acontece em equipamentos que, como um ferro de passar, aquecem e resfriam

rapidamente: os termocicladores. Esses aparelhos foram um grande avanço para as
ciências biológicas e permitiram a grande difusão da PCR em diversas áreas. Graças a
eles, uma PCR convencional média dura de 1 hora e meia a 2h.
A cada ciclo, a quantidade de sequência-alvo – aquela contida entre os iniciadores

senso e antissenso, conhecida como amplicon (produto amplificado) – dobra. Dessa
forma, se, no primeiro ciclo, tínhamos apenas uma cópia de tal sequência (limite
teórico da PCR), ao final do primeiro ciclo, teremos 2 cópias; no final do terceiro ciclo,
4; depois, 8, e então 16, e assim sucessivamente.
A cada ciclo, vemos um aumento exponencial do número de cópias da sequência-

alvo. Assim, no final de 30 ciclos, teremos algo na ordem de 1 bilhão de cópias da
mesma sequência! Um número tão grande de uma mesma sequência vai ser muito
mais facilmente identificado posteriormente.
Esquema da amplificação exponencial do DNA-alvo por ciclo a partir de uma cópia,

em aparelho termociclador.
Via de regra, podemos subdividir a PCR em duas categorias:

PCR qualitativa PCR quantitativa

Todos os ciclos ocorrem em um Também conhecida como em tempo real.
termociclador comum, precisa de etapas Os ciclos se dão em um aparelho capaz
posteriores para revelar o resultado. de ler automaticamente a amplificação e,
Nesse tipo, o resultado se dá pela assim, é capaz de quantificar em tempo
constatação da presença ou ausência do real. Existem dois métodos que são mais
produto alvo da amplificação. comuns para a quantificação. Nesse
Abordaremos alguns outros tipos de PCR caso, não há necessidade de revelação
que se encaixam nessa categoria. posterior à reação, o que a torna mais
rápida.
Eletroforese em gel de agarose: separando e revelando

o resultado
Após a amplificação da sequência-alvo pela polimerase, temos um microtubo com

nosso DNA amplificado em um tampão de reação que é transparente como a água.
Naturalmente, não podemos observar a olho nu o resultado da reação: é necessário
revelá-la. Para isso, precisamos manter em mente que, após uma PCR bem-sucedida,
temos uma sequência de DNA em um tamanho exato graças ao anelamento
específico dos oligonucleotídeos à sequência-alvo. Portanto, precisamos separar as
sequências por tamanho para verificarmos se o tamanho corresponde ao do nosso
produto. Também vamos precisar de algo que revele a localização do DNA, ou um
agente revelador especial.
Dica
Para separar o DNA de acordo com seu tamanho, usamos uma espécie de malha gelatinosa chamada de
matriz ou gel de agarose.
Você deve estar familiarizado com a gelatina que fazemos na cozinha, certo? A
agarose funciona de maneira semelhante: é um polissacarídeo que se dissolve em
líquido aquoso quando aquecido e, quando resfriado, se solidifica, ou polimeriza. Ao
polimerizar, a agarose forma uma malha com pequenos orifícios que permitirão a
passagem do DNA, de modo que moléculas menores de DNA passarão com maior
facilidade e mais rapidamente, enquanto moléculas maiores de DNA terão maior
dificuldade de passar e, por isso, demorarão mais tempo para viajarem pela malha.
Assim, podemos separar as moléculas de DNA de acordo com tamanho. Dependendo
do tamanho do nosso DNA amplificado, poderemos usar uma malha mais fechada ou
mais aberta simplesmente variando a concentração da agarose que usamos para
fazer o gel.
O DNA será inserido no gel de agarose através de pequenos orifícios chamados de

poços, feitos com um pente com pequenos dentes largos. Para podermos visualizar a
passagem do tampão da PCR pelo gel de agarose, usamos corantes como o azul de
bromofenol, o qual é mais denso do que o tampão de corrida e faz com que o DNA se
assente no fundo do poço, o que é necessário para que a separação funcione
adequadamente.
Montagem de gel de agarose com uso de pentes para formação de poços e aplicação do produto de PCR.
Uma vez que o gel de agarose esteja pronto e que o DNA tenha sido pipetado nos
poços do gel com o corante azul, podemos começar a eletroforese. Para a
eletroforese, precisaremos ainda de uma cuba, ou recipiente que contenha entradas
para corrente elétrica, uma fonte elétrica e um tampão ionizável. A eletroforese parte
do princípio de que um tampão, quando submetido a uma corrente elétrica, tem suas
moléculas ionizadas migrando em direção a um dos polos: as moléculas negativas
migram para o polo oposto, o cátodo, e as moléculas positivas migram para o polo
negativo, o ânodo.
No caso do DNA, seu grupamento fosfato lhe dá carga negativa, fazendo que o DNA
migre para o polo positivo (cátodo) quando em solução submetida à corrente elétrica.
Como o DNA está no fundo do gel de agarose graças ao corante mais pesado que o
tampão eletroforético, ele passa por dentro da agarose e, assim, será separado de
acordo com seu tamanho pela trama do gel. Por sua vez, o corante azul, também de
carga negativa e de tamanho muito inferior à complexa molécula de DNA, migrará pelo
gel mais rapidamente, servindo apenas como marcador da velocidade de migração, e
não da posição do DNA.
Representação esquemática de uma eletroforese em gel de agarose.
Para sabermos o tamanho e a posição do DNA, precisaremos de um marcador de

tamanho molecular do DNA que consiste em sequências de DNA de tamanhos
conhecidos, como se fosse uma escada cujos degraus representam os tamanhos. Ele
é um parâmetro para estimarmos o tamanho das sequências de DNA que
amplificamos – coloquialmente, chamamos essas sequências em gel de agarose de
bandas.
Também precisamos de um revelador da localização do nosso produto amplificado

(ou amplicon) no gel de agarose. Esse reagente, chamado de fluoróforo, é uma
molécula capaz de fluorescer quando excitada no comprimento de onda correto. Em
gel de agarose, usamos fluoróforo que intercale especificamente com o DNA. A
molécula mais comumente utilizada é o brometo de etídio, capaz de se intercalar com
qualquer fita dupla de DNA. Sua capacidade de se ligar ao DNA o torna potencialmente
tóxico, carcinogênico e teratogênico, e precisamos manter nossa segurança e as boas
práticas laboratoriais para evitar de nos contaminarmos com ele.
Existem diversas formas de se utilizar brometo na revelação do

gel, podendo ser adicionado antes da solidificação do gel (antes
da eletroforese) ou depois da eletroforese, com uma incubação
extra. Finalmente, o brometo de etídio é excitado no comprimento
de onda ultravioleta em um equipamento chamado
transiluminador.
Ao ser excitado, o fluoróforo emite fluorescência e dá a localização das bandas de

DNA amplificado de acordo com o marcador de tamanho molecular.
Imagem de um gel de agarose e sua revelação por fluorescência do brometo de etídio em luz ultravioleta.
Dependendo da técnica de PCR utilizada, assim como do objetivo da PCR, seu

resultado pode ser uma única banda de DNA no gel de agarose ou múltiplas bandas.
Algumas vezes, resultados inesperados também podem aparecer, como múltiplas
bandas de DNA, onde apenas uma banda única era esperada.
Cada situação demandará a experiência e o conhecimento do profissional para

interpretação e resolução de possíveis problemas.
Existem alternativas ao uso do gel de agarose para separação de ácidos nucleicos.

Um exemplo é o gel de acrilamida/bisacrilamida, usado para separar sequências de
DNA com alta resolução, de forma que bandas com até um nucleotídeo de diferença
em tamanho possam ser diferenciadas. O gel de acrilamida/bisacrilamida também
permite a separação de RNA e proteínas. No entanto, exige revelação por sistemas
diferentes, mais complexos, que nem todos os laboratórios possuem estrutura para
execução.
Além de mais tóxica que a agarose, a montagem do gel e sua corrida eletroforética
também são mais trabalhosas. Desse modo, o gel de agarose corado por brometo de
etídio é a técnica de revelação de PCR mais utilizada.
video_library PCR e eletroforese

Veja na prática a reação em cadeia pela polimerase.
Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
Vimos que a PCR é uma ferramenta molecular para amplificação do DNA in vitro.
Sobre a PCR, é correto afirmar que
a polimerase utilizada é capaz de adicionar todos os nucleotídeos

A
necessários, de maneira inespecífica.
a especificidade da reação é por oligonucleotídeos iniciadores para

B
demarcar a sequência e permitir que a polimerase inicie a síntese.
a PCR ocorre de forma linear, ou seja, nenhuma etapa de variação de

C
temperatura se repete.
a Taq polimerase é uma enzima sensível ao calor e deve ser

D
adicionada a cada novo ciclo.
apenas nucleotídeos com hidroxilas no terceiro carbono da ribose

E
são adicionados pela Taq polimerase.
Parabéns! A alternativa B está correta.
As DNA-polimerases são incapazes de reconhecer o local de início de replicação,

sendo função das primases a colocação dos primeiros nucleotídeos. Assim,
precisamos usar iniciadores que se anelarão por complementariedade específica à
sequência-alvo desejada. O anelamento dos oligonucleotídeos permite o
reconhecimento pela polimerase, que sintetizará a fita dupla a partir do molde.
Questão 2
A PCR convencional contém diversas etapas, desde pipetagem da reação até sua
leitura. Considerando as etapas, leia as afirmativas a seguir e assinale a alternativa
correta:
I - A temperatura de desnaturação deve ser alta o suficiente para separar as fitas

duplas de DNA em fitas simples.
II - A Taq polimerase é termorresistente e sua temperatura ótima de síntese de DNA

é próxima a 70ºC.
III - Logo após a amplificação, podemos facilmente visualizar o resultado, pois se
trata de reação colorimétrica.
IV - Para identificarmos se nossa sequência-alvo foi amplificada, devemos separar
as moléculas de acordo com o tamanho, através de eletroforese em gel de agarose,
e depois revelar, usando intercalantes de DNA fluorescentes em ultravioleta.
V - A eletroforese usa a carga negativa do DNA para fazê-lo migrar através do gel em
direção ao cátodo, quando submetido à corrente elétrica.
A Somente a afirmativa II está correta.
B Somente as afirmativas I, II e III estão corretas.
C Somente as afirmativas II, III, IV e V estão corretas.
D Somente as afirmativas I, IV e V estão corretas.
E Somente as afirmativas I, II, IV e V estão corretas.
Parabéns! A alternativa E está correta.
Na PCR, ocorre o aumento exponencial do número de fitas duplas de DNA

correspondentes à sequência-alvo. No entanto, esse aumento é invisível a olho nu e
precisa ser revelado.
2 - Variações entre cada técnica de PCR

Ao final deste módulo, você será capaz de diferenciar as variações entre cada técnica de PCR.
Variações da técnica de PCR

Existem situações em que a PCR qualitativa e convencional pode não ser a técnica
ideal para o nosso objetivo. Podemos nos deparar com casos em que a concentração
do DNA total da amostra é muito baixa, o que pode limitar o uso do produto
amplificado em outras aplicações, como o sequenciamento. Em determinadas
ocasiões, queremos saber o quanto de determinada sequência temos em nossas
amostras. Em outras situações, podemos estar interessados no produto da expressão
de um determinado gene, e precisamos olhar para o RNA mensageiro ao invés do
DNA, já que os níveis de DNA de uma célula são mantidos constantes, salvo raras
exceções.
Dica
Como você pode ver, existem diversos outros interesses, e uma PCR convencional dará apenas a base para
que variações mais complexas, específicas e úteis sejam desenvolvidas, validadas e usadas.
Reação de transcrição reversa
Como já sabemos, a DNA polimerase é capaz de sintetizar uma nova fita de DNA a
partir de uma fita de DNA molde. Afinal, ela é uma DNA polimerase DNA-dependente.
Mas, em muitas ocasiões, é necessário investigar a expressão de um gene, ou até
mesmo diagnosticar doenças causadas por vírus que não têm material genético feito
por DNA. Nesses casos, a molécula a ser detectada e quantificada indiretamente é o
RNA. A Taq polimerase, no entanto, não é capaz de reconhecer ou de adicionar
nucleotídeos a riboses; ela só trabalha com desoxirriboses.
Como conseguimos resolver esse problema?

Pelos organismos que conseguem sintetizar DNA a partir de RNA!
Assim como o SARS-CoV2, coronavírus causador da covid-19, existem outros vírus de

genoma RNA. Os primeiros vírus a serem estudados pela humanidade foram os de
genoma RNA chamados de retrovírus. Esses vírus têm algo de especial: a capacidade
de inverter a ordem DNA → RNA → proteína do dogma central da Biologia Molecular,
usando uma enzima para sintetizar um DNA complementar (cDNA) ao seu genoma
RNA. Isso mesmo, os retrovírus usam o RNA de seu genoma como molde para síntese
de DNA.
Os retrovírus possuem uma enzima capaz de sintetizar DNA a partir de RNA, cujo
nome oficial é DNA polimerase RNA-dependente. Corriqueiramente, ela é chamada de
transcriptase reversa, ou TR, pois faz o reverso da transcrição: sintetiza DNA a partir
do RNA. Uma vez que os pesquisadores conseguiram isolar a TR, ela passou a ser
usada para reações in vitro. Na maioria dos casos, é usada uma TR purificada a partir
de vírus aviários, de forma que as TR não representam nenhum risco de infecção ao
manipulador e são seguras para diagnóstico e pesquisa.
Assim como uma reação pela polimerase, a reação de transcrição reversa (RT - usada
daqui em diante para designar a reação em si) precisa de alguns fatores elementares.
O primeiro fator necessário é o RNA de polaridade positiva (RNA+) de qualidade, o que
requer muito cuidado na manipulação e extração do material. Esse RNA é assim
chamado por possuir o mesmo sentido de transcrição e tradução que um RNA
mensageiro (mRNA), mas expande o entendimento para vírus que nem sempre tem
seu RNA+ diretamente traduzido na célula, como os próprios retrovírus. Além do
RNA+, a RT também precisará da enzima transcriptase reversa para fazer a síntese de
cDNA a partir do RNA+.
Assim como as primeiras DNA-polimerases usadas na PCR mais rudimentar, a TR não

é resistente à temperatura. Dessa forma, a reação de transcrição reversa deve
preceder a PCR, pois a TR é inativada pelas temperaturas de desnaturação. Da junção
de reação de transcrição reversa (RT) seguida por PCR, vem o termo RT-PCR. A TR
precisará de pequenos oligonucleotídeos, menores ainda que os usados em uma PCR
convencional, para iniciar a transcrição.
Esses oligonucleotídeos têm, em média, apenas 6 bases e, por isso, são chamados de
hexâmeros. Eles podem ser específicos para determinada sequência de RNA, ou
podem ser uma sequência curta rica em timinas (poli-T), que se anelará à cauda poli-A
do mRNA, ou podem ser aleatorizados, sendo este último o mais usado por permitir a
síntese e o armazenamento do cDNA derivado de diversas sequências diferentes.
check_circle_outline Primeiro caso
Sintetizamos apenas cDNAs correspondentes ao RNA (mensageiros ou não)

ao qual os hexâmeros se anelam.
check_circle_outline Segundo caso
Podemos criar cDNA complementares a todos os mRNA da célula, o que

constitui uma biblioteca de expressão gênica.
check_circle_outline Terceiro caso
Com uso de iniciadores aleatorizados, criamos uma biblioteca de cDNA

correspondente a todos os RNAs da célula, mensageiros ou não. Similar à
PCR, uma vez que os oligonucleotídeos se ligam à fita de RNA+, a TR começa
a sintetizar uma fita de cDNA complementar usando o quarto reagente, os
desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs).
Ao contrário da PCR, que contém ciclos que se repetem várias vezes para a
amplificação de determinada sequência, a RT é linear: cada etapa acontece apenas
uma vez, o que não permite amplificação de sinal. Primeiro, a reação começa com o
anelamento dos hexâmeros ao RNA+ por poucos minutos. Na maioria dos casos, não
há necessidade de temperaturas altas de desnaturação, pois o RNA+ já é uma fita
simples. Contudo, podem ocorrer estruturas secundárias no RNA que precisam de
temperaturas moderadas para desnaturação.
Veja na imagem a desnaturação de eventuais estruturas secundárias do RNA, seguido

por anelamento dos hexâmeros iniciadores à sequência-alvo por complementariedade,
e síntese de cDNA pela transcriptase reversa.
Ilustração das etapas da reação de transcrição reversa (RT).

Em seguida, o tubo será aquecido ou resfriado até a temperatura de extensão pela TR.
Diferentemente da PCR convencional, a RT possui diversas TR de origens diferentes
que podem ser usadas. Assim, os protocolos variam entre diferentes marcas de
enzimas. Em alguns casos, a RT pode ter apenas essas duas temperaturas, de
anelamento e extensão, de 25 e 37ºC, respectivamente. O cDNA produzido pode ser
armazenado por meses a anos em geladeira (4ºC) ou freezer (-20ºC), ou usado
imediatamente como molde em uma PCR – a chamada RT-PCR.
Resumo esquemático dos reagentes necessários, das etapas e da amplificação do cDNA em uma RT-PCR.
Nested-PCR
A PCR convencional é muito útil, mas, às vezes, não consegue amplificar determinada
sequência que esteja presente em pouquíssima quantidade. Quando há dificuldade em
se amplificar o DNA alvo na PCR convencional, o gel de agarose pode não ter
capacidade suficiente para evidenciar o amplicon. Nós chamamos essa capacidade de
o resultado representar a realidade de sensibilidade.
A sensibilidade da PCR reflete a capacidade de detecção do sinal do DNA-alvo, em

amostras que possuem o DNA-alvo na realidade. Normalmente, a PCR tem ótima
sensibilidade por aumentar exponencialmente a sequência-alvo. No entanto, em
alguns casos, a sensibilidade da PCR convencional pode não ser suficiente, pois existe
uma saturação da reação por volta do 35º ciclo: atingimos um platô em que não há
aumento do número de fitas devido ao esgotamento dos reagentes. Então, ter mais de
40 ciclos em uma PCR não oferecerá nenhum benefício, porém, pode aumentar as
chances de produtos inespecíficos que atrapalharão a interpretação.
Observe no gráfico que a quantidade de DNA, detectada por fluorescência, aumenta

exponencialmente até chegar a um platô, em que não há mais aumento significativo
de DNA a cada ciclo.
Gráfico representativo das qPCR.
A solução para PCR com baixa sensibilidade é relativamente simples: usar uma fração
da primeira reação como molde para uma segunda PCR, em uma técnica conhecida
como nested-PCR (ou PCR aninhada). Para isso, utilizamos dois pares de iniciadores,
sendo o par de primers para a primeira reação, chamado de iniciadores externos, e os
primers usados na segunda PCR, conhecidos como internos.
Dessa maneira, a segunda PCR sempre gera um produto menor que a primeira reação,
e conseguimos aumentar o número de ciclos de amplificação de, no máximo, 40 (na
PCR convencional) para entre 60 e 80 ciclos no total de ciclos combinados nas duas
reações subsequentes. Consequentemente, aumentamos a quantidade de DNA
amplificado obtido ao final da segunda PCR. Caso seja utilizada corretamente, a
adição de etapa nested pode melhorar muito a sensibilidade e a especificidade da
PCR.
Para isso, são necessários alguns cuidados especiais. O primeiro deles está no
desenho da reação, que deve ser pensada como um conjunto. A primeira PCR deve
possuir oligonucleotídeos que, ao se anelarem a determinada região, permitam que a
polimerase produza um amplicon longo e específico o suficiente para ser usado como
DNA-molde na segunda reação.
Saiba mais
Caso desejemos amplificar sequências altamente repetitivas, precisaremos levar em consideração uma
primeira PCR cujo amplicon contenha regiões específicas ao redor das repetições, para que haja uma boa
reação secundária. Isso porque, essa última precisa de iniciadores que se anelem especificamente à região
que foi amplificada anteriormente.
Contudo, devemos evitar o uso dos mesmos oligonucleotídeos da primeira reação, já

que podem reduzir a eficácia da segunda reação, além de gerar produtos
inespecíficos. Outro cuidado recomendável para a segunda reação é a purificação do
produto da primeira reação antes de utilizá-lo na segunda, o que evita contaminações
entre amostras, reduz o risco de inespecificidade e aumenta a eficácia da segunda
PCR. Note o uso de iniciadores externos na primeira reação, amplificando um produto
que será usado como molde de amplificação na segunda reação, que usa iniciadores
internos.
Representação esquemática de uma nested-PCR.
PCR quantitativo em tempo real – qPCR
Até agora, todas as técnicas que discutimos precisam da eletroforese em gel de

agarose para separação dos produtos da PCR e posterior revelação das bandas
através de agentes intercalantes do DNA que emitem fluorescência; por exemplo, o
brometo de etídio, quando submetido à luz ultravioleta. Esses tipos de PCR são
categorizados como qualitativos e podem ser muito úteis, especialmente, quando o
DNA amplificado for utilizado em outra técnica subsequente. Entretanto, existem
situações em que a PCR qualitativa se torna pouco informativa.
Exemplo
Quando queremos determinar se um tratamento está surtindo efeito na redução de um marcador genético
específico. Nesse caso, a PCR convencional e suas variações vistas até agora não informam o suficiente
para tomada de decisões. Precisamos, assim, de técnicas que revelem a quantidade de certa sequência
específica de DNA com o máximo de precisão possível. Entra em cena a PCR quantitativa - também
conhecida como PCR em tempo real - (qPCR).
A qPCR tem a capacidade de quantificação da sequência-alvo e de leitura em tempo

real dos resultados, sem necessidade de revelação posterior. Isso porque, ela possui
dois fatores adicionais a uma PCR qualitativa: a adição de fluoróforos à própria reação
e o uso de um termociclador capaz de detectar o sinal fluorescente. Dessa forma, a
cada novo ciclo de desnaturação-anelamento-amplificação, ocorre aumento da
quantidade de DNA-alvo e da emissão de fluorescência proporcional à quantidade de
DNA sendo sintetizada naquele ciclo.
Para que a fluorescência seja detectada, a qPCR exige a utilização de termocicladores

que contenham lasers para excitação do fluoróforo e detectores da fluorescência.
Esse aparelho é mais sofisticado, mais caro e mais complexo do que um
termociclador convencional, porém seus resultados podem ser igualmente mais
informativos e precisos. Outra diferença da qPCR é que, em alguns casos, podemos
ter uma temperatura única para anelamento e extensão: todas as duas acontecem a
60 oC.
Exemplo dos ciclos de temperatura usados em SYBR qPCR contendo a fase de amplificação e a fase de curva de dissociação.
Existem duas técnicas de qPCR largamente usadas: SYBR Green e TaqMan. Elas
diferem especialmente na forma como a fluorescência é emitida e na especificidade
do sinal fluorescente. As formas de quantificação são, por outro lado, semelhantes.
Vamos explorar as duas em mais detalhes? Vejamos!
SYBR Green
O SYBR é fluoróforo que, como o brometo de etídio, é capaz de intercalar em fitas

duplas de DNA. Quando está associado ao DNA, o SYBR pode ser excitado em
comprimento de onda azul, e então emite fluorescência verde. Quando não está ligado
ao DNA fita dupla, o SYBR tem sua fluorescência drasticamente reduzida. Por sua
capacidade de fluorescer quando ligado ao DNA fita dupla, ele também é usado como
um sistema alternativo na revelação da PCR convencional em gel de agarose, já que é
menos tóxico que o brometo de etídio.
Quando adicionado à qPCR, o SYBR emitirá o máximo de fluorescência na fase de

extensão, pois esse é o momento em que há maior número de bases pareadas em
fitas duplas. O aparelho termociclador irá incidir um laser, excitando o SYBR a emitir
fluorescência verde. Essa fluorescência será detectada pelo aparelho, que mostrará a
quantidade de fluorescência por ciclo. A cada novo ciclo, maior será a fluorescência
emitida, pois maior será a quantidade de DNA fita dupla sendo sintetizada.
Desse modo, a progressão de fluorescência será proporcional à quantidade de DNA

amplificado a cada ciclo, até que a reação atinja sua saturação, e um platô após a
curva de crescimento exponencial será observado. Repare que, quando não está
ligado ao DNA dupla fita, devido à sua desnaturação, o SYBR não emite fluorescência.
Ao ligar-se à fita dupla de DNA, durante a sua extensão, a fluorescência é emitida.
Esquema ilustrando a teoria por trás da fluorescência do SYBR.
É importante considerarmos que essa interação entre o SYBR e a fita dupla de DNA
não é controlada:
O SYBR irá se intercalar com qualquer fita dupla de DNA. Isso faz
com que a emissão de fluorescência seja menos específica: como
em uma reação convencional, apenas os oligonucleotídeos
iniciadores são responsáveis pela especificidade. Assim, outras

formas de controle da reação foram criadas para garantirmos que
o sinal fluorescente usado na quantificação corresponda apenas
ao produto desejado.
Portanto, adicionamos um passo a mais a qPCR: a curva de dissociação (melting

curve). Nessa etapa, o termociclador aquecerá a PCR lentamente, para medir em qual
temperatura 50% das fitas duplas de DNA sintetizadas se dissociam. Essa dissociação
será medida, mais uma vez, através da fluorescência pelo SYBR. Essa temperatura
dependerá de dois fatores principais: o conteúdo CG e o tamanho da sequência.
Por isso, reações de SYBR tem amplicons com tamanho limitado em cerca de 100
nucleotídeos em média. Em uma curva de dissociação boa e específica, todas as
moléculas amplificadas irão se dissociar na mesma temperatura e, assim, só um pico
é observado no gráfico. Em uma qPCR por SYBR sem especificidade, mais de um pico
será visto na curva de dissociação, e a reação precisará ser ajustada. Esse é um
importante nível de controle de qualidade da reação que não deverá ser ignorado.
A existência de um único pico (a 76,49 °C) indica que há apenas um produto

amplificado, o que confirma a especificidade da qPCR. Observe:
Exemplo de resultado de uma curva de dissociação dos produtos de uma qPCR por
SYBR Green.
video_library Quantificação absoluta por SYBR

Confira mais detalhes sobre PCR em tempo real pela metodologia SYBR para fazer
uma curva de quantificação absoluta.
TaqMan
Outra forma bastante comum de qPCR, cujo nome vem da referência ao jogo de
videogame dos anos 1980, PacMan. Assim como na técnica SYBR, a quantificação em
tempo real na TaqMan ocorre através da emissão e detecção de fluorescência a cada
ciclo de amplificação. Entretanto, a TaqMan difere do SYBR na forma como a emissão
da fluorescência acontece: Além de todos os reagentes que uma PCR convencional
possui, temos a presença de uma sequência extra, complementar à região interna dos
iniciadores. Essa sequência extra é conhecida como sonda e é curta, com tamanho
aproximadamente igual ao dos oligonucleotídeos iniciadores, e possui temperatura de
anelamento pouco superior à deles. A sonda contém uma molécula fluorescente na
extremidade 5’, e outra molécula na extremidade 3’, que bloqueia a emissão de
fluorescência.
A existência de uma sonda que se anela à região alvo a ser amplificada não representa
muito, se a molécula fluorescente não for liberada de seu bloqueador. Para isso, a
enzima Taq polimerase usada na TaqMan é diferente das outras Taq polimerases. Ela
adiciona nucleotídeos (polimerização), como as demais polimerases, e remove
nucleotídeos (função exonuclease).
A remoção de nucleotídeos é fundamental para a detecção da fluorescência, pois,

quando a enzima chega ao nucleotídeo da sonda que contém o fluoróforo e o remove

da sequência, o fluoróforo estará livre de seu bloqueador e poderá emitir fluorescência
detectável. A cada novo ciclo da PCR, as fitas duplas serão desnaturadas, os
iniciadores e a sonda se anelarão, e a TaqMan polimerase fará síntese do DNA. Com
remoção dos nucleotídeos da sonda, o fluoróforo nela contida é liberado para emitir
fluorescência proporcional a cada nova sequência-alvo sintetizada.
Repare na ilustração que a sonda anelada entre os dois iniciadores é clivada pela
TaqMan polimerase durante a extensão do DNA, permitindo a emissão de
fluorescência.
Representação esquemática da qPCR pelo método de TaqMan.
A TaqMan apresenta uma vantagem extra para especificidade da reação: o

anelamento da sonda é específico para a região alvo a ser amplificada. A
especificidade dada pela sonda é tamanha que diferenças de apenas um nucleotídeo

podem ser detectadas – essas mutações são conhecidas como single nucleotide
polymorphism (SNP).
Assim sendo, a TaqMan dispensa técnica complementar para avaliação da

especificidade, como a curva de dissociação, o que a faz mais rápida do que a técnica
de SYBR. Entretanto, as sondas tornam a reação mais cara. Outra vantagem que a
TaqMan traz em relação ao SYBR é a capacidade de múltiplas detecções na mesma
reação com maior precisão e confiabilidade. Veremos mais detalhes à frente.
Tanto a técnica de SYBR quanto a TaqMan são capazes de quantificar o DNA ou

cDNA. A técnica como a quantificação é obtida varia, mas a maioria das análises
posteriores podem ser usadas igualmente – uma vez que resultados confiáveis
tenham sido obtidos através de rigoroso controle de qualidade.
Quantificação
Na qPCR, cada ciclo desnaturação-anelamento-extensão produzirá fluorescência, que

será detectada pelo aparelho.
filter_1 Deve-se ajustar o programa do aparelho para que ele saiba qual laser e quais
filtros usar para a excitação de cada fluoróforo e em qual espectro da
emissão ele deverá buscar o sinal para detecção. Isto é, você é o responsável
em dizer ao aparelho o que ele deve fazer.
filter_2 Deve-se ajustar o aparelho para que ele determine, nos ciclos iniciais de
amplificação, qual é o nível em que o sinal obtido é superior ao sinal de ruído.
Como a qPCR utiliza fluoróforos para a quantificação, por vezes existe um
“vazamento” de fluorescência no início da reação que não está relacionada
com a amplificação da sequência-alvo em si.
filter_3 Esse sinal inespecífico, geralmente, obtido nos primeiros ciclos, chamamos
de sinal de ruído (background). O ruído vai ser utilizado para determinar o
limiar de detecção (threshold).
O primeiro ciclo em que a fluorescência de determinada amostra ultrapassa o limiar de

detecção acima do ruído (ou da fluorescência de base) é chamado de valor de Ct.
Esse valor é importante por estar diretamente relacionado à quantidade inicial de
DNA-alvo da amostra amplificada. A relação entre concentração inicial de DNA-alvo na
amostra e Ct é inversamente proporcional, o que significa que, quanto menor for o Ct
de uma amostra, maior a quantidade de DNA que ela originalmente continha.
Outros dois parâmetros usados pelo aparelho para ajustar (ou

normalizar) a reação internamente são a ROX, um fluoróforo
passivo (cuja fluorescência não aumenta de acordo com a
amplificação do DNA) usado como referência, e o Rn, que
representa um ajuste (ou normalização) entre o sinal do fluoróforo
de escolha (SYBR ou da sonda TaqMan) e a referência ROX. A

maioria dos reagentes para qPCR já possuem ROX adicionados ao
tampão, cabendo a nós apenas a observação para eventual
detecção de anomalias que podem invalidar a reação. Mais uma
vez, a qPCR tem que manter padrões rígidos de controle de
qualidade para que diferenças mínimas na quantidade sejam
confiáveis.
Com todos esses fatores ajustados corretamente, os aparelhos mais modernos

detectarão o sinal emitido a cada ciclo e darão, em tempo real, o resultado na tela do
computador ao qual ele precisa estar ligado para funcionar, em um gráfico chamado
de curva de amplificação.
Veja o exemplo de gráfico de amplificação para o gene Suc2 da Saccharomyces

cerevisae. Note a reta paralela ao eixo x (horizontal), que representa o valor de limiar
de detecção / quantificação. Abaixo dela, temos o ruído da reação. As curvas
amarelas e vermelhas representam a quantificação das amostras e, como você pode
observar, existem 4 amostras em duplicata; a com maior quantidade de DNA é a mais
à esquerda no gráfico, com menor Ct.
Você consegue dizer qual é o Ct da amostra mais concentrada?

Gráfico de amplificação.
Existem duas formas de se quantificar o produto amplificado: pela curva padrão e por
quantificação relativa, ou método de delta-delta-CT (ou ΔΔCt).
Pela curva padrão
Em muitos casos, a quantificação absoluta do DNA alvo na amostra é necessária.

Para isso, devemos ter em mãos uma curva padrão, com concentrações conhecidas
do DNA alvo. Essa curva pode ser comprada de laboratórios especializados em sua
fabricação ou produzida por nós mesmos, através de clonagens e purificação. A partir
da concentração mais alta, faremos uma diluição seriada. Para isso, colocamos uma
fração da solução de maior concentração em um tubo contendo apenas água, e
depois deste tubo para outro com apenas água, e assim sucessivamente até termos
pelo menos 5 pontos de curva.
Diluição seriada usando a escala em mililitro (mL) como exemplo, porém para a nossa metodologia
é utilizada a escala em microlitro (µL).
Em seguida, informamos ao aparelho em quais posições cada concentração da curva

está, de forma que o próprio computador calcule os parâmetros de qualidade da
curva. Com esses valores, o computador calcula a quantidade de DNA existente nas
nossas amostras de concentração desconhecida. Alguns dos principais valores dados
pela curva padrão que usamos para determinar a concentração da amostra-teste são
a linearidade da curva e a eficiência de amplificação.
Repare na imagem a seguir que existem 5 quantidades diferentes da curva padrão (em
vermelho), obtidas pela diluição seriada, e três amostras desconhecidas (em azul) cuja
quantidade de DNA foi calculada a partir de seus Cts e com base na linearidade da
curva padrão.
Exemplo de curva padrão para quantificação absoluta do DNA.
Linearidade da curva Eficiência de amplificação

Matematicamente conhecida como R2,, Com ela, a cada ciclo, espera-se que a
deve ser superior a 0.985 para que a quantidade de DNA-alvo amplificado
reação seja aceitável, e a quantificação dobre, o que significaria uma eficiência
de sua amostra-teste seja calculada com de 100% da reação. Porém, devido a
máximo de precisão. Usando fórmulas de pequenos erros, podemos considerar
linearidade, calculamos o valor preciso aceitáveis eficiências que variem entre
de DNA-alvo na amostra antes da 90 e 110%. Esses parâmetros serão mais
amplificação começar, baseado no Ct de robustos com uso de replicatas
cada uma. (repetições da mesma reação em poços

diferentes.).
Por quantificação relativa, ou método de delta-delta-CT

(ou ΔΔCt)
Nesse método, você precisará quantificar dois DNA-alvos diferentes: o DNA de

interesse, cuja quantidade é desconhecida na amostra, e o DNA de referência. A
determinação da quantidade de um DNA-alvo de interesse é feita a partir da subtração
(ou seja, o delta) do Ct (ciclo em que a amostra ultrapassou o limiar) pelo Ct do outro
DNA quantificado na amostra, o de referência. Isso porque, a quantidade do gene de
interesse pode variar de acordo com diversos fatores biológicos, mas também pode
ser devido à quantidade de material usado na extração.
Nesse caso, o ideal é fazer uma normalização pela quantidade de cDNA total e, para
isso, usamos um cDNA de referência, que, geralmente, é um gene constitutivo
expresso em níveis estáveis nas células. O segundo delta, ou a segunda subtração, é
feita entre a diferença da primeira subtração na amostra-teste e uma amostra controle,
usada como calibradora. A amostra calibradora também precisará ter passado pela
primeira subtração; ou seja, também terá sido normalizada. Dessa forma, temos:
Δ Ct = Ct gene alvo − Ct gene de refer éncia Seguidopor Δ Δ Ct = (Ct gene alvo − Ct gene de referencia ) calibrador − (Ct gene alvo − Ct gene de re
Essas subtrações são possíveis apenas quando as curvas de quantificação dos dois
DNAs-alvo têm eficiência entre 90-110%, e não devem diferir em mais de 10% entre si.
Por isso, curvas-padrão iniciais para cada gene devem ser construídas para se verificar
as eficiências da reação, antes de procedermos para a técnica de quantificação
relativa.
Se quisermos comparar a expressão de dois genes entre uma amostra e um

calibrador, usamos um método especial. Você consegue identificar qual? A pista mais
importante é: você está investigando a expressão gênica, e não a existência do gene
em si. Portanto, você não está olhando diretamente o genoma, mas um produto dele.
Qual produto do DNA podemos detectar via PCR?
Resposta
Se você respondeu RNA, acertou! Nesse caso, o nome correto e completo da técnica utilizada é RT-qPCR:
uma reação de transcrição reversa acoplada a uma reação em cadeia da polimerase quantitativa.
PCR em multiplex
Até agora, falamos sobre detectar apenas um DNA-alvo por reação, seja de PCR
convencional, nested-PCR, RT-PCR ou qPCR. Contudo, podemos detectar mais de um
alvo por reação. Precisaremos ajustar as reações separadamente, utilizando pares de
oligonucleotídeos iniciadores específicos para cada produto desejado, e depois fundir
as duas PCRs em uma. Esse tipo de PCR em que mais de um produto alvo é
identificado chamamos de multiplex – múltiplos produtos são detectados, e até
quantificados.
Em uma PCR convencional, vamos utilizar todos os reagentes que já conversamos e, é

claro, os quatro (ou mais) oligonucleotídeos necessários, sendo cada par
correspondente à sua sequência-alvo. O mais importante para fazermos um multiplex
em uma PCR convencional é que os amplicons tenham tamanhos distintos o
suficiente para serem separados pelo gel de agarose, a fim de que os sinais de
ultravioleta não sejam confundidos. Normalmente, os produtos menores de 1000
pares de base (pb) devem ter mais de 200 pb de diferença. Para produtos maiores de
1000 pb, a diferença entre os produtos também deve ser maior.
Lembre-se de que você deverá levar em consideração o tamanho

do maior produto para o tempo de extensão. Outro fator ao qual
você deverá estar atento é a temperatura de anelamento dos
múltiplos pares de iniciadores, que devem ter temperaturas o mais
próximas possível.
Em uma qPCR-TaqMan, a amplificação e quantificação de diferentes sequências na

mesma reação é possível ao utilizarmos duas (ou mais) sondas distintas, cada uma
capaz de hibridizar especificamente a sua sequência-alvo, e ambas marcadas com
fluoróforos que se excitem e emitam fluorescência em comprimentos de onda
diferentes.
Você poderá usar um fluoróforo que seja excitado no comprimento de onda azul e
emita fluorescência no espectro verde, e outro fluoróforo que seja excitado e floresça
no comprimento vermelho, e assim por diante.
Por outro lado, reações multiplex quantitativas usando o sistema SYBR são mais
difíceis. Isso porque a emissão de fluorescência pelo SYBR é inespecífica e ocorre
sempre que o fluoróforo intercala com fitas duplas do DNA. Assim, a reação multiplex
fica limitada e, muitas vezes, não é possível distinguirmos entre os sinais dos
diferentes produtos.
Em alguns casos, entretanto, a distinção é possível graças à curva de dissociação.

Isso ocorre quando os produtos distintos têm sequências diferentes o suficiente para
terem temperaturas de dissociação de 50%. Então, observamos dois picos na curva de
dissociação, em temperaturas diferentes. No entanto, sequências distintas sem
diferença suficiente em seus conteúdos CG não poderão ser multiplexadas, pois não
veremos diferenças em suas curvas de dissociação.

Questão 1
A PCR possui diversas aplicações, sejam elas práticas ou na pesquisa. A respeito da

aplicação da PCR e de suas variações, é correto afirmar que
na nested-PCR, fazemos duas reações em um único tubo,

A amplificando regiões diferentes que geram produtos de tamanhos
distintos.
o SYBR é um fluoróforo presente em PCR multiplex que dá maior

B
estabilidade à reação.
na RT-PCR, ocorrem duas reações subsequentes: uma de síntese de

C cDNA a partir de RNA, e outra de amplificação da sequência-alvo
presente no cDNA.
uma PCR multiplex consiste em utilizar duas reações subsequentes,

D sendo que o produto amplificado da primeira serve como molde para
amplificação na segunda.
E a reação de transcrição reversa utiliza uma polimerase especial,

capaz de sintetizar RNA a partir de DNA.
Parabéns! A alternativa C está correta.
A Taq polimerase usada para amplificação de DNA não é capaz de reconhecer e

polimerizar RNA. Quando queremos analisar RNAm, precisamos que o cDNA seja
sintetizado pela DNA-polimerase RT dependente, ou transcriptase reversa. Então,
usamos o cDNA sintetizado como molde em uma PCR.
Questão 2
Existem diferentes técnicas de PCR com aplicações variadas. Considerando isso,

leia as afirmativas abaixo e, em seguida, assinale a alternativa correta.
I – Podemos usar PCR convencional para amplificar um gene e cloná-lo em um vetor,

e modificarmos geneticamente um organismo simples.
II – Pelo uso de diferentes sondas marcadas com sinais diferentes, a qPCR TaqMan
pode ser usada na identificação e quantificação de mutações em diferentes alelos.
III – As técnicas moleculares são de pouca importância na rotina clínica, pois são
demoradas e de aplicações muito restritas.
IV – O tamanho de STRs é relevante no diagnóstico de doenças genéticas.
A Somente as afirmativas I, II e IV estão corretas.
B Somente as afirmativas I e IV estão corretas.

C Somente as afirmativas III e IV estão corretas.
D Somente as afirmativas I e II estão corretas.
E Somente as afirmativas I, III e IV estão corretas.
Parabéns! A alternativa A está correta.
A PCR convencional pode ser utilizada para clonar um gene através de um vetor,
como plasmídeo. Na qPCR-TaqMan, as sondas auxiliam na quantificação de
mutações de alelos diferentes. O tamanho e conteúdo das STRs oferecem grande
precisão na identificação de indivíduos. As técnicas moleculares, como a PCR e as
suas variações, têm ganhado muito espaço na rotina clínica. Há situações em que o
diagnóstico por amplificação de ácidos nucleicos é o padrão-ouro e, às vezes, é a
única opção. Suas aplicações vão de diagnóstico de doenças genéticas e
infecciosas ao acompanhamento da evolução e tratamento de cânceres e infecções
crônicas, assim como determinação de riscos genéticos e aconselhamentos.
3 - Aplicações apropriadas ao uso de cada método

Ao final deste módulo, você será capaz de identificar aplicações apropriadas ao uso de cada método.
Aplicações da PCR
Até agora, vimos os reagentes necessários à amplificação exponencial de uma
sequência específica de DNA até termos milhões e bilhões de cópias da mesma exata
sequência, ou amplicon, que pode ser visualizada a partir de técnicas especiais.
Também vimos algumas variações da PCR que a tornam ainda mais relevante e útil
em diversos contextos.
Mas, afinal, para que precisamos de tantas sequências idênticas? Quais são as
aplicações disso? Para ilustrar melhor o quão útil a PCR é, veremos alguns exemplos a
seguir.
A PCR e as suas variantes em ciências forenses
A primeira, e talvez uma das mais famosas para o grande público, é a aplicação
forense. Você já deve ter entrado em contato com a identificação de um criminoso a
partir do seu DNA deixado na cena do crime, seja por ter assistido a alguma série
policial, seja por ter lido alguma reportagem da vida real. Isso só é possível porque
cada ser humano possui um genoma completamente único, exceto de gêmeos
idênticos.
Em nosso genoma, temos regiões especiais nas quais um cientista forense pode olhar
para confirmar a origem do DNA. Denominadas marcadores moleculares, elas são
conhecidas pela alta frequência de polimorfismos genéticos – regiões com grande
variação na sequência de DNA entre indivíduos sem causar nenhum tipo de
interferência funcional, pois são mais frequentes em regiões não codificantes.
Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises forenses são as

repetições curtas em tandem (ou STRs – short tandem repeats).
As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre as pessoas e

oferecem grande precisão na identificação de indivíduos se a
detecção de várias STRs for usada em conjunto.
As regiões de interesse são amplificadas por PCR e, em seguida, o perfil genético pode
ser visualizado por separação das bandas em gel de agarose e coloração por brometo
de etídio.
Existem casos em que é necessário aumentar o material genético a ser usado para,
assim, aumentarmos o sinal durante a revelação. Nesse caso, o perito pode optar pelo
uso de uma nested-PCR, lembrando que os primers externos e interno precisam de
regiões não repetidas para se anelarem. Um cientista forense, além de fazer a
extração do DNA e sua amplificação por PCR, fará a identificação de indivíduos
através do seu perfil genético.
Ilustração de um gel de agarose mostrando múltiplas bandas e representando os marcadores moleculares.
A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças

genéticas
Existe uma gama de aplicações de PCR e suas variações na Medicina, de prevenção

ao diagnóstico, acompanhamento e prognóstico, ou evolução, de doenças. Ao
amplificarmos certas regiões do DNA, podemos identificar a presença ou ausência de
sequências que deveriam ou não existir em determinado contexto. Seu uso pode
auxiliar, ou até mesmo determinar, o diagnóstico de diversas doenças que variam
desde genéticas a infecciosas. As doenças genéticas podem ser muito complexas em
sua apresentação e possuir diferentes perfis – autossômico dominante ou recessivo,
ligado ao cromossomo X, multifatoriais e multigênicas. O uso da PCR no diagnóstico
dessas doenças pode ser feito de diversas maneiras, dependendo de qual é a doença
e de seu perfil genético.
O PCR multiplex pode ser utilizado para

verificar qual alelo está sendo expresso,
dentre dois alelos distintos, em uma
mesma reação e assim ajudar no
reconhecimento de pequenas mutações
que levariam ao desenvolvimento de uma
doença genética. Mas temos outras
aplicações, usando PCR convencional.
Vamos usar a doença de Huntington como exemplo. Nessa doença genética

autossômica dominante, ocorre um excesso de repetição de três nucleotídeos (CAG)
do DNA que codifica uma proteína chamada Huntingtina. Esse excesso leva a uma
doença neurodegenerativa sem cura que causa perdas motoras, cognitivas e
psiquiátricas ainda na idade adulta, apesar de poder aparecer em forma juvenil
também. A PCR torna-se uma importante ferramenta diagnóstica, pois, ao amplificar
sequências próximas da região de repetição, pode nos dizer seu tamanho e, assim,
informar o risco e até o prognóstico da doença em si.
Em um gene saudável, é normal ter cerca de 20 repetições (CAG); em pessoas

portadoras de Huntington, o número de repetições aumenta para 35 ou mais. De modo
geral, quanto maior o número de repetições, maior o risco de aparecimento e de
progressão da doença. Essa gradação de fenótipo – no caso da doença de
Huntington, de sintomas – é algo conhecido em genética como penetrância.
Atenção!
Lembre-se de que, para regiões repetitivas, é necessário usar iniciadores que se anelem próximo a STRs, mas
não nas STRs em si, pois isso geraria inespecificidade e muitas bandas em um gel de agarose.
A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças

infecciosas
Outro exemplo diagnóstico que você já pode ter ouvido falar é o uso da PCR para
diagnóstico de doenças infecciosas. Ao utilizar a técnica para amplificar o DNA (ou
RNA) de algum agente infeccioso, podemos diagnosticar uma infecção, já que o
material genético de tal agente não deveria estar presente naquela amostra biológica.
Sua simples presença pode indicar o agente etiológico e, assim, descobrir a causa da
doença.
A PCR é especialmente útil no diagnóstico de organismos fastidiosos, que não

crescem bem em cultivo, como o Mycobacterium tuberculosis, por possuir alta
sensibilidade e especificidade. Em outros casos, a presença do material genético de
determinado microrganismo não é suficiente para seu diagnóstico como agente
causador da doença, e testes complementares a PCR podem ser necessários, assim
como técnicas de PCR mais elaboradas que darão maiores informações.
Temos, como exemplo, o diagnóstico molecular da covid-19. O SARS-CoV2 (severe

acute respiratory syndrome coronavirus 2), assim como os demais coronavírus, tem
RNA fita simples como material genético. Dessa forma, usamos a transcrição reversa
para sintetizarmos um cDNA viral, e o utilizamos em qPCR – ou seja, fazemos uma RT-
qPCR.
Esse é considerado o melhor teste, ou padrão-ouro, para a identificação de casos

ativos de infecção pelo SARS-CoV2. Isso porque, o material genético viral é
identificado de forma relativamente rápida – entre coleta, extração, RT e qPCR, o
resultado pode sair em algumas horas. Além disso, esse método é muito sensível e
específico, conseguindo detectar nas amostras pequenas concentrações do vírus
(carga viral).
A RT-qPCR também é utilizada no diagnóstico e acompanhamento de outras infecções

virais. A efetividade do tratamento para HIV pode ser monitorada através de RT-qPCR,
sendo esperadas reduções drásticas na carga viral após introdução da terapia. O
mesmo princípio de quantificação de cDNA obtido por transcrição reversa também é
aplicado em tratamentos oncológicos, especialmente, em leucemias e linfomas: o
oncologista pode requerer uma RT-qPCR para acompanhamento de determinado
marcador gênico do câncer em questão.
Nos dois casos, a redução (ou não) das sequências alvo na RT-qPCR ao longo do
tempo podem ser cruciais no tratamento e evolução do paciente. A PCR convencional
multiplex também pode ser utilizada no diagnóstico diferencial entre dois patógenos
que possam causar os mesmos sintomas, mas que exigem abordagens clínicas
diferentes.
Exemplo
Um paciente transplantado renal pode apresentar alteração em exames bioquímicos que levem o
nefrologista a pensar em duas possibilidades: na primeira, uma infecção por um vírus sem gravidade pode
estar acontecendo no órgão, e nenhum tratamento seria necessário; na segunda, pode estar acontecendo
uma infecção viral grave no rim transplantado que poderia rapidamente levar à perda do órgão e até mesmo
ao óbito do paciente.
A PCR e as suas variantes em pesquisa científica
Outro campo que utiliza a PCR é a pesquisa científica. Em diversas ocasiões, a PCR
pode ser utilizada para manipulação genética de organismos simples, como bactérias,
leveduras e células em cultivo. Nesse contexto, podemos usar a PCR para, por
exemplo, clonarmos um gene. Fazemos isso ao amplificarmos a sequência gênica que
desejamos clonar usando oligonucleotídeos longos que têm duas regiões distintas. A
primeira região liga-se ao gene que queremos manipular – deletar, adicionar ou mutar
– no organismo alvo; a segunda é a região que se liga ao DNA molde do vetor dentro
do qual queremos colocar nosso gene clonado.
O vetor é, em muitos casos, uma sequência independente do genoma do organismo

alvo, mas que é capaz de se replicar autonomamente quando inserido na célula. Um
exemplo de vetores muito usados são os plasmídeos, pequenos DNA circulares
autorreplicantes e transferíveis de uma célula a outra, comuns em bactérias.
Representação esquemática de uma técnica de

clonagem por restrição, com a inserção (ou
clonagem) de um gene de origem diferente, que foi
amplificado por PCR, ao vetor original.
Normalmente, usamos a clonagem por PCR em duas etapas: uma para amplificarmos
o gene alvo que queremos clonar; na segunda etapa, usamos o produto amplificado,
juntamente com o vetor, para inserirmos o gene clonado no vetor. Outra forma de
clonagem inclui o uso de enzimas de restrição para cortar o DNA em pontos
específicos, após amplificação por PCR.
A pesquisa científica é uma área de atuação muito grande e, por

vezes, ela está interessada em entender mecanismos complexos
de regulação genética sob diversas condições. A RT-qPCR é uma
ferramenta muito útil nesse caso, para a avaliação dos níveis de
expressão de genes em células submetidas a diversas condições
diferentes.
É comum utilizarmos a quantificação relativa (em que comparamos a quantidade de

um gene de interesse com um gene constitutivo de expressão estável) para
avaliarmos como o metabolismo celular pode mudar mediante o meio que se
encontra. Em geral, você pode considerar que qualquer aplicação que determinado
método ou técnica tenha em rotinas laboratoriais das mais diversas áreas não apenas
é usada em pesquisa científica, como, provavelmente, foi originada de uma.
Quantificação relativa de genes por RT-qPCR

video_library e seu uso em pesquisa
Veja mais sobre quantificação relativa usando RT-qPCR pelo método de SYBR.

Questão 1
A PCR possui diversas aplicações, sejam elas práticas ou na pesquisa. A respeito da

aplicação da PCR e de suas variações em ciências forenses, é correto afirmar que:
a nested-PCR não é útil, uma vez que o material genético é

A
encontrado em abundância em situações forenses.
a PCR pode nos dar informações importantes, mas não pode

B
determinar a identidade de indivíduos.
as STRs são regiões cuja variabilidade as tornam úteis para

C
distinguir indivíduos geneticamente.
a qPCR é uma ferramenta necessária para amplificação do material

D
genético de uma amostra antes de seu sequenciamento.
o sequenciamento do genoma não é uma ferramenta viável para a

E
identificação de indivíduos, além de ser trabalhoso e caro.
Short tandem repeats (STRs) apresentam grande variação de sequência e de

tamanho entre indivíduos. Pela identificação de diferentes padrões de um conjunto
de STRs, podemos correlacionar amostras com grande precisão, além ser possível
também estabelecer grau de parentesco.
Questão 2
A técnica de PCR e suas variações são metodologias importantes para

amplificações na pesquisa e diagnósticos. Sobre a PCR, escolha a alternativa
correta:
Um dos principais métodos utilizados em análises forenses é o

A
sequenciamento de genes conservados dentro de um DNA.
As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre genes diferentes

dentro de um mesmo organismo e oferecem grande precisão na
B
identificação de cromossomos se a detecção de várias STRs for
usada em conjunto.
Ao utilizar a técnica para amplificar o DNA (ou RNA) de algum agente

infeccioso, podemos diagnosticar uma infecção, já que o material
C
genético de tal agente não deveria estar presente naquela amostra
biológica.
Normalmente, para usarmos a clonagem por PCR basta a

D
amplificação do gene alvo que queremos clonar.
O diagnóstico molecular da covid-19, o SARS-CoV2, assim como os

demais coronavírus, tem o DNA como material genético. Isso facilita
E
o processo de laboratório porque o material já está disponível para
qPCR.
Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises forenses são as

repetições curtas em tandem e não sequências conservadas. As STRs variam em
tamanho e em conteúdo entre as pessoas e oferecem grande precisão na
identificação de indivíduos se a detecção de várias STRs for usada em conjunto.
Este processo não compara genes entre cromossomos de um único indivíduo, mas
vários. Normalmente, usamos a clonagem por PCR para amplificar o gene alvo e
depois inserir o gene clonado no vetor. O diagnóstico molecular da covid-19, o SARS-
CoV2, assim como os demais coronavírus, tem RNA fita simples como material
genético. Dessa forma, usamos a transcrição reversa para sintetizarmos um DNA
viral, e o utilizamos em qPCR – ou seja, fazemos uma RT-qPCR.
Considerações finais
Vimos que a amplificação de DNA in vitro é feita pela reação em cadeia da polimerase,
em que a variação cíclica de temperatura permite a desnaturação, o anelamento e a
extensão de sequências-alvo específicas, de acordo com aquelas que desejamos
detectar. Como estudado, os oligonucleotídeos iniciadores se ligam à fita simples de
DNA que foi aberta por desnaturação por complementariedade entre as bases
nitrogenadas. Essas últimas são elementos fundamentais dos nucleotídeos por
conterem a informação genética.
As variações da PCR são úteis de diferentes formas, e devemos conhecê-las para

podermos escolher qual a melhor técnica para cada caso: para aumentar a quantidade
final de DNA-alvo amplificado; para síntese de cDNA a partir de RNA polaridade
positiva; para quantificação de DNA ou cDNA; e para diferenciação rápida entre
diferentes produtos de amplificação.
Além disso, aprendemos algumas das diversas aplicações que a PCR e as suas
variações têm em áreas da ciência, como na forense, na pesquisa e na clínica,
participando do diagnóstico, acompanhamento e prognóstico.
Agora você está pronto para continuar progredindo no conhecimento da Biologia

Molecular, uma área empolgante e que se torna, a cada dia, mais importante para
diversas áreas das ciências biológicas.
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Acesse o conteúdo de Biologia DNA como o material genético: Replicação

do DNA no portal da Khan Academy, para mais detalhes e vídeos sobre
replicação do DNA.
Assista ao vídeo 4. Teste de Paternidade, de Carlos Simeão, no Youtube.

Você aprenderá mais sobre a variabilidade genética estudada em análises
forenses e em testes de paternidade.
Assista ao vídeo Técnicas de Biologia Molecular – PCR- Animação 3D, de

Carlos Simeão, no Youtube. Você irá conhecer o passo a passo da técnica de
PCR.
Para conhecer mais sobre a história do PCR, leia o texto O desenvolvimento

da reação em cadeia pela polimerase (PCR).
Para conhecer mais sobre as técnicas de PCR, leia Outras aplicações da PCR
e as suas variações.
Referências
ASSOCIAÇÃO BRASIL HUNTINGTON. O que é a Doença de Huntington. ABH.
Consultado na internet em: 18 out. 2020.
CABELLO, G. M. K. Genética Clínica: Métodos de diagnóstico. DBBM FIOCRUZ.

Consultado na internet em: 18 out. 2020.
DOLINSKY, L. C.; PEREIRA, L. M. C. V. DNA forense: Artigo de revisão. Saúde &

Ambiente em Revista, 2(2), p.11-22, 2007.
NELSON, D. L. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2014.
NEW ENGLAND BIOLABS’ FEATURE ARTICLES. Polymerase Fidelity: What is it, and
what does it mean for your PCR? NEB. Consultado na internet em: 18 out. 2020.
REAL-TIME PCR BASICS. TaqMan vs. SYBR Chemistry for Real-Time PCR.
ThermoFisher Scientific website. Consultado na internet em: 18 out. 2020.
VANDESOMPELE, J. Q. PCR Guide por Eurogentec – plataforma GenEx. Gene

Quantification. Consultado na internet em: 18 out. 2020.
ZHAO, M.; et al. Improved high sensitivity screen for Huntington disease using a one-
step tripletprimed PCR and melting curve assay. PLoS ONE. Consultado na internet
em: 18 out. 2020.
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21/09/2023, 11:47 Amplificação in vitro de DNA

Módulo 1 Módulo 2 Módulo 3

Elementos fundamentais Variações entre cada Aplicações apropriadas

ácidos nucleicos. No corpo humano e na maioria dos seres vivos, encontramos

Mas o que isso tem a ver com a amplificação de ácidos nucleicos?

1 - Elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos

Princípios da PCR concencional

Em primeiro lugar, os nucleotídeos contêm um açúcar chamado ribose. Essa ribose é

check_circle_outline Citosina (C)

check_circle_outline Guanina (G)

check_circle_outline Timina (T)

Para o RNA há uma diferença:

No RNA as bases nitrogenadas A, C e G são as mesmas, mas, em

Finalmente, os nucleotídeos possuem grupamentos fosfatos no quinto carbono da

A interação entre a hidroxila no carbono 3 da (desoxir)ribose e o fosfato de outro

nitrogenadas (A, T, C, G, U) são divididas em dois grupos químicos, de acordo com o

Veja o esquema mostrando a estrutura do DNA e o pareamento das bases por

Pareamento de bases nitrogenadas.

No entanto, essas pontes de hidrogênio são importantes para manter a sequência de

Reação em cadeia pela polimerase: amplificando DNA in

Representação do complexo de replicação do DNA em uma célula.

Imagine quão complexo seria reproduzir o ambiente celular em um tubo de ensaio!

Complementariedade entre fitas antiparalelas

Síntese enzimática pela polimerase

Na amplificação do DNA in vitro, denominada reação em cadeia da polimerase

de calor. Para isso, utilizamos uma enzima termorresistente chamada de Taq

Lembre-se de que o sentido de duplicação contínua do DNA

Etapas da reação em cadeia da polimerase

O DNA molde, dupla fita, extraído a partir de amostras biológicas.

Os oligonucleotídeos sintéticos que são complementares à região do DNA

A Taq polimerase, termorresistente.

Cátions de magnésio (Mg2+), cofator necessário ao funcionamento eficaz da

Os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs – dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

A água ultrapura, livre de contaminantes de DNA, RNA e de nucleases.

Esquema dos reagentes necessários a uma reação em cadeia da polimerase (PCR).

O microtubo com esses poucos reagentes é, então, submetido a diversos ciclos de

1. A primeira etapa de qualquer PCR consiste na abertura da fita dupla de DNA

2. Em seguida, começam os ciclos. Cada ciclo contém, pelo menos, 3 etapas:

Note na ilustração a desnaturação das fitas duplas de DNA em fitas simples, o

Ilustração das etapas da PCR.

Entenda melhor como acontecem estas etapas:

É a primeira etapa de cada ciclo em que a temperatura é aquecida a 95ºC por

Segunda etapa de cada ciclo. A temperatura será reduzida para cerca de 50 a

realidade, ela funciona melhor em temperaturas mais elevadas.

No caso da maioria das polimerases disponíveis comercialmente, a melhor

O tempo de extensão depende da velocidade da polimerase usada e do tamanho da sequência entre os

A PCR acontece em equipamentos que, como um ferro de passar, aquecem e resfriam

A cada ciclo, a quantidade de sequência-alvo – aquela contida entre os iniciadores

A cada ciclo, vemos um aumento exponencial do número de cópias da sequência-

Esquema da amplificação exponencial do DNA-alvo por ciclo a partir de uma cópia,

Via de regra, podemos subdividir a PCR em duas categorias:

PCR qualitativa PCR quantitativa

Eletroforese em gel de agarose: separando e revelando

Após a amplificação da sequência-alvo pela polimerase, temos um microtubo com

O DNA será inserido no gel de agarose através de pequenos orifícios chamados de

Para sabermos o tamanho e a posição do DNA, precisaremos de um marcador de

Também precisamos de um revelador da localização do nosso produto amplificado

Existem diversas formas de se utilizar brometo na revelação do

Ao ser excitado, o fluoróforo emite fluorescência e dá a localização das bandas de

Dependendo da técnica de PCR utilizada, assim como do objetivo da PCR, seu

Cada situação demandará a experiência e o conhecimento do profissional para

Existem alternativas ao uso do gel de agarose para separação de ácidos nucleicos.

video_library PCR e eletroforese