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PROCEDIMENTOS EM TÉCNICAS LABORATORIAIS VEGETAIS

Mauren C.A.Silveira Biomédica Graduanda Eng. Biotecnológica

SUMÁRIO

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PRECAUÇÕES..........................................................................5 PREPARO DE SOLUÇÕES....................................................................7 FÓRMULAS E PROBLEMAS MAIS COMUNS...............................................................................................7 MOLARIDADE (M – G/L).....................................................................................................................7 PERCENTUAL (% - G/ML)....................................................................................................................7 OUTRAS RELAÇÕES.............................................................................................................................7 DILUIÇÕES DE SOLUÇÕES.....................................................................................................................8 SOLUÇÕES PARA TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO VEGETAL...............................9 ÁCIDO CLORÍDRICO 2,5 N.....................................................................................................9 ÁGUA DEPC 0,1%......................................................................................................................9 ÁGUA LIVRE DE RNASE........................................................................................................10 CLORETO DE LÍTIO (LICL) 5M...........................................................................................10 EDTA 0,5M PH 8.0.....................................................................................................................10 EDTA 500 MM; PH 8.0..............................................................................................................10 FENOL:CLOROFÓRMIO:ÁLCOOL ISOAMÍLICO (25:24:1)..........................................11 GEL DE AGAROSE 1% (COM BROMETO DE ETÍDIO)..................................................11 HIDRÓXIDO DE SÓDIO 10N - NAOH 10N...........................................................................11 NACL 5M -DEPC.......................................................................................................................11 NACL 5M ...................................................................................................................................12 RNASE A 10MG/ML.................................................................................................................12 SDS 20%......................................................................................................................................12 TAMPÕES..................................................................................................................................13 TRIS HCL LIVRE DE RNASE.............................................................................................................13 TRIS HCL 1M.................................................................................................................................13 SOLUÇÃO TAMPÃO (WASH BUFFER)...................................................................................................13 TAE 50X......................................................................................................................................14 TBE 10X.......................................................................................................................................14 TE PH 8.0......................................................................................................................................14 TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO 1M........................................................................................................14 STE...............................................................................................................................................15 TAMPÃO DE AMOSTRA PARA ELETROFORESE.........................................................................................15 TAMPÃO FOSFATO SALINA- PBS 10X................................................................................................16 FUNÇÕES DOS MATERIAIS, SOLUÇÕES E PROCEDIMENTOS.............................16 MACERAÇÃO ..........................................................................................................................16 CENTRIFUGAÇÃO..................................................................................................................16 TIPOS DE CENTRÍFUGAS......................................................................................................................17 VELOCIDADES DE SEPARAÇÃO DE COMPONENTES.....................................................................................18 CENTRIFUGAÇÃO X SOLVENTES..........................................................................................................19 ESPECTROFOTOMETRIA.....................................................................................................19 ELETROFORESE.....................................................................................................................21 ELETROFORESE EM GEL.....................................................................................................................22 Gel de Agarose...........................................................................................................................23 Gel de Poliacrilamida.................................................................................................................24

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DNA ............................................................................................................................................25 SENTIDO 5’- 3’................................................................................................................................28 PROTEÍNAS ..............................................................................................................................29 RNA.............................................................................................................................................30 ENZIMAS MODIFICADORAS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS...............................................34 NUCLEASES E RIBONUCLEAES.........................................................................................34 NUCLEASES..............................................................................................................................35 Enzimas de restrição tipo II .......................................................................................................36 ............................................................................................................................36 Nuclease Bal 31..........................................................................................................................36 Nuclease S1................................................................................................................................36 Desoxirribonuclease I (DNAse I)...............................................................................................37 Nuclease Microcócica................................................................................................................37 Exonuclease III...........................................................................................................................38 RIBONUCLEASES....................................................................................................................38 Ribonuclease A (RNAse A).......................................................................................................38 Ribonuclease H (RNAse H).......................................................................................................38 Ribonuclease T1.........................................................................................................................39 DNA POLIMERASES...............................................................................................................39 DNA Polimerases DNA – Dependentes....................................................................................39 DNA Polimerase I .....................................................................................................................40 Fragmento Klenow.....................................................................................................................41 T4 DNA Polimerase...................................................................................................................42 T7 DNA Polimerase...................................................................................................................42 Taq DNA Polimerase.................................................................................................................42 DNA POLIMERASES RNA – DEPENDENTES.........................................................................................43 AMV Transcriptase Reversa ......................................................................................................43 DNA Polimerase - Independente de Molde................................................................................44 RNA POLIMERASES ..............................................................................................................44 RNA Polimerases DNA – Dependentes.....................................................................................45 RNA Polimerases DNA – Independentes...................................................................................45 Polinucleotídeo Fosforilase........................................................................................................46 LIGASES ....................................................................................................................................46 T4 DNA Ligase..........................................................................................................................46 T4 RNA Ligase..........................................................................................................................47 FOSFATASES E QUINASES...................................................................................................47 Fosfatases...................................................................................................................................47 Quinases ....................................................................................................................................48 SOLUÇÃO TAMPÃO................................................................................................................48 TAMPÃO DE CORRIDA..........................................................................................................49 TAE (TRIS-ACETATO-EDTA)...............................................................................................49 CTAB 2%....................................................................................................................................49 NACL 5M......................................................................................................................................50 EDTA (ÁCIDO ETILENO DIAMONO TETRACÉTICO) 0,5 M PH 8,0............................50 CLOROFÓRMIO (ÁLCOOL ISOAMÍLICO) (E/OU FENOL)...........................................50 INCUBAÇÃO EM BANHO-MARIA.......................................................................................51 β -MERCAPTOETANOL 0,2%.............................................................................................................51 PVP (POLIVINILPIRROLIDONA) .......................................................................................51

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BROMETO DE ETÍDEO..........................................................................................................51 BSA (ALBUMINA DE SORO BOVINO)................................................................................51 DPEC...........................................................................................................................................52 TRIS- HCL; PH 7,4......................................................................................................................52 PROTEÍNA K.............................................................................................................................52 ETANOL OU ISOPROPANOL................................................................................................52 ACETATO DE SÓDIO (SAIS).................................................................................................52 TÉCNICAS MAIS UTILIZADAS..........................................................53 INOCULAÇÃO DE VIROSE EM CURCUBINÁCEAS........................................................53 EXTRAÇÃO DE DNA VEGETAL PELO MÉTODO CTAB............................53 EXTRAÇÃO DE DNA VEGETAL PELO MÉTODO DE DOYLE E DOYLE...................56 MÉTODO PARA EXTRAÇÃO DE DNA DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS.....................59 ESTIMATIVA DE CONCENTRAÇÃO DE DNA, APÓS SUA EXTRAÇÃO..........................................................62 QUANTIFICAÇÃO DE DNA (E RNA) ATRAVÉS DE ESPECTROFOTOMETRIA................................................62 ESPECTROFOTOMETRIA PARA QUANTIFICAÇÃO DE DNA........................................................................63 ISOLAMENTO DE DNA PELO MÉTODO TRIZOL..........................................65 QUANTIFICAÇÃO E EXPECTATIVA DE RENDIMENTO DE DNA...................................................................67 REAÇÃO DE RESTRIÇÃO DE ENDONUCLEASE..........................................................................................68 Guia de Solução de Problemas...................................................................................................69 VISUALIZAÇÃO DO DNA, APÓS SUA EXTRAÇÃO.....................................70 GEL DE ELETROFORESE......................................................................................................................70 ...........................................................................................................................................73 MULTIPLICAÇÃO DO DNA, APÓS SUA EXTRAÇÃO....................................74 PRINCÍPIOS DO MÉTODO REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR).....................................................74 VARIAÇÃO DO PCR .........................................................................................................................76 EXTRAÇÃO DE RNA VEGETAL PELO MÉTODO CTAB..................................77 ISOLAMENTO DE RNA PELO MÉTODO TRIZOL........................................79 Guia de Solução de Problemas...................................................................................................84 ISOLAMENTO DE PROTEÍNAS USANDO O MÉTODO TRIZOL.........................87 Guia de Solução de Problemas...................................................................................................89 GEL PARA ELETROFORESE DE PROTEÍNAS...........................................90 QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS....................................................90 MÉTODOS COLORIMÉTRICOS PARA PROTEÍNAS...................................91 MÉTODO COLORIMÉTRICO BRADFORD PARA DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA ......................................................................................................................................................92 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................................94

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PRECAUÇÕES

As precauções a serem seguidas objetivam tanto a biossegurança quanto a eficiência dos métodos utilizados.

• •

Sempre usar luvas para manipulação de reagentes. Durante extrações de RNA as luvas devem ser trocadas se houver contato com superfícies ou material não tratado com DEPC.

A vidraria deve ser aquecida a 180ºC por no mínimo 8 horas, ou 2 horas a 210ºC.

Pode-se tratar vidraria e material de plástico com DEPC 0,1%, lavando com água previamente tratada com DEPC e esterilizando-os em autoclave por 20 min a 121ºC.

O DEPC é altamente tóxico devendo ser manipulado em capela de exaustão com luvas, jaleco e óculos de proteção.

• •

Folhas coletadas para análises devem ser rapidamente congeladas a fim de inibir ação de RNAses endógenas. Fenol, clorofórmio, formaldeído e β-mercaptoetanol são tóxicos e devem ser manipulados em capela de exaustão com EPIs.

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O brometo de etídeo é mutagênico e moderadamente tóxico. Usar luvas e tomar cuidado ao retirá-las ou quando for enxaguar as mãos com luvas as luvas ainda (nunca com os dedos para cima).

A pipetagem deve ser feita com exatidão, tomando o cuidado com excessos do lado de fora da ponteira.

• • •

As ponteiras devem ser autoclavadas antes do uso. O pó do SDS é irritante. Recomenda-se o uso de máscara. O tampão CTAB não dissolve antes de o pH atingir o nível ótimo pedido na técnica.

A solução-tampão do meio para eletroforese de proteínas deve ser meticulosamente testada quanto ao pH, pois as proteínas são substâncias anfóteras, isto é, variam a sua carga, positiva ou negativa, em função do pH. Com um pH alterado a eletroforese pode revelar resultados falsos.

• •

A luz UV é mutagênica. Usar óculos de proteção e luvas. Qualquer substância ou solução deve ser acondicionada com identificação necessária (nome do composto, pH, molaridade), data e validade.

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PREPARO DE SOLUÇÕES

Fórmulas e problemas mais comuns

Molaridade (M – g/L)
Molaridade é a concentração de uma SOLUÇÃO em molar. 1 molar = 1 mol de soluto em 1L de solução final. 1 mol de soluto = soma de todas massas moleculares que compõem o soluto. Ex. 1 mol de NaCl = 58,5g (Na = 23g e Cl = 35,5g) NaCl 1M = 58,5G DE NAcL em 1L de água 58,5g/mol = 58,5MM MM = massa molar OBS. 1M de NaCl é muito concentrado, quase saturado, mas a concentração depende da massa molecular dos compostos da solução.

Percentual (% - g/mL)
Pode ser expresso em m/v (massa/volume), v/v (volume/volume), m/m (massa/massa). Ex. NaCl 2% = 2g de NaCl em 100mL de solução final. Para solutos líquidos: ex. Glicerol 10% = 10 mL de glicerol em 100 mL de solução final ( 10 mL de glicerol + 90 mL de água)

Outras Relações
mg/mL,µg/mL Ex. qualquer solução de 100mL em concentração 10 mg/mL = 1g de soluto em 100 mL de solução final = 1000mg/100mL = 10mg/1mL

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI 0,001g = 1 mg 100g = 0,1 Kg ppm (partes por milhão) Usado para soluções muito diluídas: massa de soluto (mg) = 1 = 10 ppm massa de solução (Kg) 0,1 d = massa do soluto (g) volume da solução (L) c = massa do soluto (g) volume da solução (L)

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Diluições de Soluções

Para se obter diluições de soluções tem que acrescentar solvente. Para calcular a relação entre as quantidades de soluto e solvente após a diluição: Antes da Diluição Massa de soluto (g) Volume de solução (L) Após a Diluição Massa de soluto (g) x volume de solução (L) Volume de solução (L) x volume de solução (L)

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Ou: C (g/L)1 x V (L)1 = C (g/L)2 x V (L)2 e

M (mol/L)1 x V (L)1 = M (mol/L)2 x V (L)2 Exemplo: Obter álcool etílico 70% a partir de álcool etílico 95%: Álcool 70% = 700 mL de álcool + 300 mL de água Álcool 95% = 950 mL de álcool + 50 mL de água Álcool 100% = 1000 mL de álcool + 000 mL de água Para 1L: 315,78 mL de álcool 95% + 684,22 mL de água = 1 L de álcool 30% 95% x V1 = 30% x 1 L V1 = 0,31578 L = 315,78 mL 1 L – 315,78 mL = 684,22 mL

SOLUÇÕES PARA TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO VEGETAL

ÁCIDO CLORÍDRICO 2,5 N
Água destilada HCL 37% 400 mL em béquer 104,2 mL

Completar o volume até 500 mL com água destilada em proveta

ÁGUA DEPC 0,1%
DEPC Água destilada autoclavada por 2 horas 0,5 mL 500 mL

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI Água destilada autoclavada por 2 horas = U.P.A

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ÁGUA LIVRE DE RNASE
Água UPA DEPC Reagir por 1 hora Autoclavar por 30 minutos 500 mL 0,5 mL

CLORETO DE LÍTIO (LICL) 5M
Cloreto de Lítio Água destilada 2,12 g 10 mL

EDTA 0,5M PH 8.0
EDTA Água DEPC Ajustar o pH para 8.0 com NaOH Completar o volume para 100mL com água DEPEC. 18,612 g 70 mL

EDTA 500 MM; PH 8.0
Na2EDTA.2H2O Água destilada Agitar com agitador magnético Ajustar pH para 8.0 com NaOH, aprox. 20g em pastilhas 186,1 g 800 mL

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI Completar o volume para 1L após atingir o pH 8.0.

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FENOL:CLOROFÓRMIO:ÁLCOOL ISOAMÍLICO (25:24:1)
Clorofórmio Álcool isoamílico Fenol equilibrado 480 mL 20 mL 500 mL

GEL DE AGAROSE 1% (COM BROMETO DE ETÍDIO)
Agarose TAE ou TBE 1X Adicionar brometo de etídio 1% Misturar suavemente. 2g 200 mL 1 µL

Fundir em microondas. Deixar esfriar até 70ºC aprox.

HIDRÓXIDO DE SÓDIO 10N - NAOH 10N
NaOH Água destilada 400 g 1L

NACL 5M -DEPC
NaCl Água DEPC 146 g q.s.p. 500 mL

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NACL 5M
NaCl Água destilada Esterilizar em autoclave 292,2 g q.s.p. 1 L

RNASE A 10MG/ML
RNAse pancreática (RNAse A) Acetato de sódio 10mM; pH 5.2 Ferver por 15 min.Esfriar. Ajustar pH com 0,1 volume de Tris-HCL 1M; pH 7.4 Dividir em 1 mL Armazenar a -20ºC. 100 mg

SDS 20%
SDS Água destilada Banho-maria a 50ºC, no mínimo. Água destilada q.s.p. 1 L 200 g 700 mL

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TAMPÕES

Tris HCl Livre de RNAse
Estoque

Tris HCl 1,5 M ; pH 8,0 Água DEPC 0,1% Ajustar o pH para 8.0 com HCl

18,1 g 70 mL

Completar o volume para 100 mL com água DEPC autoclavada após adição de DEPC 0,1% reagindo por 1hora (val: 3 meses 4ºC)

Tris HCl 1M
Tris base Água destilada (sem DEPC) 121,1 g 800mL

Ajustar o pH desejado com HCl concentrado nas quantidades: Para pH 7.5 – 70 mL; para pH 7.6 – 60 mL; para pH 8.0 – 42 mL Obs: 60,55g de tris- 400 mL de água dest. 30,25g de tris – 200 mL de água dest.

Solução Tampão (Wash Buffer)
Tris HCl 1,5M EDTA 0,5M NaCl 2M BSA 3,33 mL 1 mL 200 mL 0,25g

Completar o volume com água UPA com DEPC (re-autoclavar a água UPA após adicionar DEPC 0,1% reagindo por 1 hora) até 500mL

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TAE 50X
Tris base Ácido acético glacial EDTA 0,5 M; pH 8.0 Água destilada q.s.p. 242g 57,1 mL 100 mL 1000 mL

Ajustar o pH da solução de EDTA com NaOH. Concentração de uso 1X. Estocar à temperatura ambiente.

TBE 10X
Tris base Ácido bórico EDTA 500 mM; pH 8.0 Água destilada q.s.p. 1L 108 g 55 g 40 mL

TE pH 8.0
Tris HCl 1M; pH 8.0 EDTA 500 mM; pH 8.0 Água destilada q.s.p. 1 mL 200 µL 100 mL

Tampão Fosfato de Sódio 1M
NaH2PO4.H2O 1M Na2HPO4 1M 13,8g + água destilada q.s.p. 100 mL 14,2g + água destilada q.s.p. 100 mL

Diluir nas seguintes proporções de acordo com o pH desejado:

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NaH2PO4.H2O 1M 53,7 mL 42,3 mL 22,6 mL 15,5 mL 10,4 mL

Na2HPO4 1M 46,3 mL 57,7 mL 77,4 mL 84,5 mL 89,6 mL

pH 6.8 7.0 7.4 7.6 7.8

STE
NaCl 5M Tris-HCl 1M EDTA 500mM; pH 8.0 200 µL Água destilada q.s.p. 100 mL 2 mL 1 mL

Tampão de Amostra para Eletroforese
Ficoll tipo 400 ou Glicerol EDTA 500 mM; pH 8.0 Azul de bromofenol Xilene Cianol FF Água destilada q.s.p. *Usar água DPEC 0,1% para géis de RNA 3g 20 µL 25 mg 25 mg 10 mL

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Tampão Fosfato Salina- PBS 10X
Na2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl Água destilada q.s.p. Ajustar o pH para 7.4. Esterilizar em autoclave 14,4 g 2,4 g 80 g 2g 1L

FUNÇÕES DOS MATERIAIS, SOLUÇÕES E PROCEDIMENTOS

MACERAÇÃO
Em cadinhos com nitrogênio líquido: as paredes celulares devem ser rompidas com o objetivo de liberar os constituintes celulares.

CENTRIFUGAÇÃO
Remoção dos resíduos celulares e precipitação das proteínas. A desproteinização é obtida através de um tratamento com fenol ou clorofórmio, pois esses solventes orgânicos desnaturam as proteínas e enzimas, e são separadas após centrifugação, permanecendo na interface entre a fase aquosa (superior) contendo os ácidos nucléicos e a fase orgânica (inferior). A centrifugação depende do raio do rotor em cm, do ângulo fixo (tubo inclinado) ou ângulo variável ou swingout (tubo pêndulo). A força centrífuga relativa (RCF) ou xg significa quantas vezes uma amostra é acelerada em relação à gravidade na superfície da Terra (9,8 N/s2 ou 1xg).

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A centrifugação é baseada no fato de um movimento circular a uma dada velocidade angular, resultar uma força(F) que atua sobre a amostra. F é diretamente proporcional ao raio ® do rotor (em cm) e ao quadrado da velocidade angular (w) em radianos: F= ω 2r Daí ou RCF= ω 2r 980 RCF= 1,119.10-5 rpm2r ou w= π (rpm) 30

Como r é diretamente proporcional à RCF, quando o raio aumenta, o RCF aumenta. No RPM a RFC varia de acordo com o raio que pode variar de acordo com o rotor usado. Por isso usa-se mais o xg do que o RPM. No caso de rotores de ângulo fixo, a distância do raio do centro do rotor ao topo ou ao fundo do tubo com a amostra é distinta. A RCF, então, é maior no fundo do tubo. No caso de rotores de ângulos pendulares, há um único RCF.

Tipos de centrífugas
Microcentrífugas 0,5 a 1,5 mL de capacidade e até 14000 rpm em segundos. Centrífugas de média velocidade São geralmente preparativas. Apresenta vários volumes, aceleração máxima até 20000 rpm e vários tipos de rotores. Pode ser feita a separação de bactérias ou outras células do meio de cultura até o fracionamento celular. Ultracentrífugas A primeira foi da marca Svedberg e hoje existem as que atingem 60000xg. Podem ser preparativas para separação de moléculas e/ou partículas ou técnicas analítica para medir as propriedades físicas de macromoléculas. Apresenta o rotor em câmara blindada, sistema de alto vácuo para eliminar o atrito com o ar e o superaquecimento. Possui sistema de refrigeração. Os rotores são em liga de titânio e o disco na parte inferior do rotor possui uma superfície clara e outra escura para a leitura óptica por fotocélula que capta o sinal quando o rotor gira e pode desligar a centrífuga, caso haja desbalanceamento dos tubos ou caso a velocidade máxima seja alterada.

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A unidade S de peso para compostos microssomais foi devido à marca Svedberg que proporcionou tal medida. É tecnicamente chamado de coeficiente de sedimentação (s): velocidade por unidade de força. S de uma partícula é a sua velocidade de sedimentação por unidade de campo de força F. As unidades Svedberg (S) são expressas em 10-13segundos porque grande parte das moléculas biológicas sedimenta a velocidades iguais ou superiores a essa. Ex: albumina sérica: coeficiente de sedimente de 4,5S Vírus da poliomielite: 150S Mitocôndria: 15000- 65000S Ribossomos: 80S DNA de bacteriófago: T5 50S tRNA de E. coli: 15 S tRNA de levedura: 4S

Velocidades de separação de componentes
Tecido homogeneizado e filtrado A 2000 xg/10min: fração nuclear O sobrenadante fica com a fração pós nuclear Fração pós nuclear a 15000 xg/10min: fração mitocondrial O sobrenadante fica com a fração pós mitocondrial Fração pós mitocondrial a 100000xg/60min: fração microssomal O sobrenadante fica com a fração pós microssomal Fração pós microssomal a 300000xg/120min: polirribossomos e subunidade de ribossomos. O sobrenadante fica com o citossol.

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Centrifugação X Solventes
Na centrifugação diferencial usa-se meio aquoso de densidade baixa que separa o solúvel no sobrenadante. Na ultra-centrifugação pode ser usado gradiente de densidade para ultra centrifugação zonal e ultra centrifugação em gradiente de equilíbrio de densidade (isopínica). Na ultra-centrifugação zonal usa-se um gradiente leve (como a sacarose) preparado com uma concentração compatível com a do material a ser separado (entre 15% e 50%) A densidade máxima do meio deve ser inferior á menos densidade das macro-moléculas de interesse. Ocorre uma migração das partículas em função de sua massa molecular. A taxa de migração é fortemente definida pelo coeficiente de sedimentação (s). Ao fim do procedimento há zonas ou faixas de material separado ao longo do gradiente. Na ultra-centrifugação zonal uma centrifugação por longo período de tempo pode levar à sedimentação não diferenciada. Na ultra-centrifugação isopínica as espécies analisadas movem-se em um gradiente até encontrarem um ponto em que sua densidade é equivalente à do meio, sem que se desloque, pois ela flutua num colchão formado pelo gradiente. Diz-se então que a partícula/molécula atingiu sua densidade de flutuação (densidade boiante). Mesmo em uma centrifugação prolongada não há sedimentação por que a concentração do gradiente é superior à maior densidade das partículas mais pesadas. Por isso para o solvente é utilizado sal alta massa molecular, como o cloreto de césio. Para separação de moléculas como ácidos nucléicos (DNA e diferentes espécies de RNA), ribossomos e lisossomos.

ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotômetro é o aparelho utilizado para quantificação do comprimento de luz absorvido ou refletido por uma substância. A cor é a luz resultante de vários comprimentos de onda que foram refletidos, assim, uma substância que tem a cor vermelha sendo refletida, é por que absorveu a cor azul.

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No espectrofotômetro há um prisma que decompõe a luz em vários comprimentos de onda. Uma fenda deixa passar apenas o comprimento de onde que se quer analisar. Através dessa fenda a luz atinge a substância colocada dentro de uma cubeta de vidro ou quartzo. A luz que é refletida do outro lado da cubeta é medida por sua intensidade. Toda substância tem um padrão de absorção de energia característico. Cada substância tem um espectro de absorção específico e um comprimento de onda específico com o qual ocorre um máximo de absorção de luz. Com esses dados um pesquisador pode saber, por exemplo, se uma amostra de DNA está ou não contaminada com proteínas, e vice-versa. Alguns dados relevantes são apresentados a seguir: dsDNA - 1,0 A260 = 50µ g/mL = 0,15 mM/ número de pares de bases ssDNA – 1,0 A260 = 33µ g/mL = 0,10 mM/ número de pares de bases ssRNA - 1,0 A260 = 40µ g/mL = 0,11 mM/ número de pares de bases Por exemplo: um fragmento de DNA com 100pb com leitura de A260 = 1,0 – 0,15 mM/100 = 0,0015 = 1,5 nM 1µg de um fragmento de DNA com 1000pb = 1,52 pmol = 9,1 x 1011 moléculas 1µg do plasmídeo pUC19 (2686pb) = 0,57 pmol = 3,4 x 1011 moléculas 1µg do plasmídeo pBR 322(4361pb) = 0,35 pmol = 2,1 x 1011 moléculas 1µg de DNA do bacteriófago M13mp19 (fita dupla com 7249pb na forma) = 0,21 pmol = 1,3 x 1011 moléculas 1µg de DNA do bacteriófago λ(48502pb) = 0,03 pmol = 1,8 x 1011 moléculas 1 pmol de um fragmento de DNA com 1000pb = 0,66 µg 1 pmol de plasmídeo pUC19 (2686pb) = 1,77 µg 1 pmol do plasmídeo pBR322(4361pb)= 2,88 µg 1pmol de DNA do bacteriófago M13mp19(fita dupla com 7249pb) = 4,78 µg 1pmol de DNA do bacteriófago λ (48502pb) = 32,01 1 Kbp de dNA pode codificar 333 aminoácidos = uma proteína de 37000 Da 10000 Da de proteína = 270 pb

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI 50000 Da de proteína = 1350 pb

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ELETROFORESE
A eletroforese é usada para separar partículas moleculares pequenas e visualizá-las com coloração posterior. O princípio da eletroforese consiste na separação das partículas por carga elétrica, através de corrente elétrica imposta em superfície aquosa salina (o sal permite o transporte de carga elétrica) que está em contato com um meio onde estão depositadas as partículas. As mais leves chegam ao pólo com carga contrária à sua primeiro que as partículas com cargas mais pesadas. Lembrando que DNA e RNA possuem carga negativa e, portanto, migram para o lado positivo, sempre. Essas partículas podem ser de DNA, RNA ou proteínas que já foram clivadas em várias partes. O meio ao qual serão depositadas deve ser sólido ou semi-sólido e não pode interferir na estrutura da partícula e deve permitir o “deslizamento” para o pólo com carga contrária à sua. Esse meio pode ser um papel de filtro, sílica em gel, membrana de acetato de celulose, gel de agarose, gel de amido ou gel de poliacrilamida. A solução salina também não pode interferir na composição das partículas, por isso é usada solução-tampão como meio de transporte de elétrons. Para a visualização das estruturas separadas é necessário recorrer a posterior coloração do meio, que pode ser revelado a olho nu ou por fluorescência com ajuda de luz ultravioleta ou quimiluminescência. Dá-se o nome de “banda” às estruturas já separadas. A direção do pulso elétrico pode ser em sentido único (negativo para positivo) ou em orientação ortogonal, onde o sentido é alterado para zigue-zague para o caso de separação de partículas muito grandes. Essa técnica é chamada de eletroforese em gel de campo pulsado, pois o pulso elétrico é interrompido para mudança de sentido. Para o sucesso da técnica em sentido único, que é o mais comum, há dois fatores prioritários a serem seguidos: a voltagem, corrente e potência devem ser constantes, e a temperatura sob a qual se realiza a eletroforese deve ser monitorada, principalmente no caso de separação de moléculas de proteínas.

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Eletroforese em Gel

No caso dos meios em gel, as partículas se movimentam dentro dele. Antes da semisolidificação é preciso colocar um pente no lugar onde serão depositadas as partículas a serem separadas, pois no lugar dos dentes do pente formam poços para o depósito das partículas. A eletroforese em gel pode ser feita em posição vertical ou horizontal, com um tipo de gel ou com dois tipos de gel. O gel é preparado como a gelatina comum, a partir da agarose ou amido ou poliacrilamida que semi-solidificam em temperaturas mais baixas que 50ºC. A estrutura do gel depende da sua composição e cada estrutura apresenta uma porosidade por onde vão transitar as partículas. Alguns géis apresentam uma malha mais estreita que outros. O que determina que as estruturas de cargas mais leves e pesadas sejam mais bem separadas. Partículas mais pesadas indicam que os seus tamanhos são maiores que as partículas de cargas mais leves. Para ter um parâmetro são usados marcadores moleculares com pesos conhecidos que migram ao lado das partículas analisadas. Eles devem ter a mesma natureza das partículas.

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O processo de eletroforese pode ser contínuo ou descontínuo. Na composição do gel é utilizada uma solução tampão que pode ser a mesma que cobrirá o gel para fazer a condução elétrica (sistema contínuo) ou pode ser diferente (sistema descontínuo). No sistema descontínuo há dois tipos de géis: o gel concentrador e o gel separador, que é usado na técnica para separação de proteínas (gel de poliacrilamida). A malha do gel de agarose é mais larga que a malha do gel de poliacrilamida, assim, o gel de agarose permite a passagem, por exemplo, de DNAs com dezenas e até mesmo centenas de quilobases, mas não diferem no peso de pares de bases específicos. Já o gel de poliacrilamida pode separar um único par de bases, mas apenas em moléculas com tamanhos de até algumas centenas de pares de bases. Por isso são usadas as enzimas de restrição anteriormente à técnica de separação em eletroforese, pois quebram as partículas em pedaços conhecidos.

Gel de Agarose
A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) linear extraído de algas marinhas que dissolve em água fervente e gelifica quando resfria, formando redes minúsculas. O diâmetro dos poros da matriz formada é diretamente proporcional à concentração do polímero utilizado. Poder de resolução do gel de agarose
Intervalo de tamanho de moléculas de DNA separadas em géis contendo diferentes concentrações de agarose*

Concentração de agarose no gel (% [m/v]) 0,3 0,6 0,7 0,9 1,2 1,5 2,0

Faixa de tamanho de DNA dupla fita e linear (Kb) 5-60 1-20 0,8-10 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2

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*Adaptado de Sambrook e Russel, 2001.

Para a visualização do DNA a técnica pode ser acrescentada de brometo de etídeo que é um análogo de base que se intercala na molécula de DNA e emite fluorescência violeta quando exposto aos raios UV. Na sua presença ocorre redução de velocidade de migração, pois o DNA aumenta o seu tamanho e muda de forma. A forma do DNA pode ser circular superenovelada (I), circular relaxada (II) e linear (III). A forma I migra mais rápido que a forma III em géis comuns. A forma II é a mais lenta de todas.

Gel de Poliacrilamida
Usado para técnica de separação de proteínas. Pode ser usado o SDS (dodecil sulfato de sódio) na composição do gel. A proteína deve ser previamente desnaturada por aquecimento na presença de β-mercaptoetanol para romperem as pontes de dissulfeto e os polipeptídeos adquirirem a carga negativa do SDS. A migração do complexo SDS-proteína não depende da conformação protéica, mas do seu tamanho. Na saturação, cerca de 1,4g de SDS é ligado por grama de proteína, o que corresponde a uma molécula de SDS para cada dois resíduos de aminoácidos. O sistema SDS-Page é formado por dois géis diferentes: o gel concentrador e o gel separador. O gel concentrador é formado por uma malha de grande porosidade (gel de poliacrilamida 5%). Tem função de compactar a amostra em um pequeno volume, depositando-a sobre a superfície - limite do gel separador como uma banda estreita. O gel separador tem uma malha mais estreita (poliacrilamida a 8-20%) que tem a função de separar os complexos SDS-proteína em função de suas massas moleculares. O que permite que a amostra seja compactada para a faixa estreita entre os dois géis é a diferença de pH entre a constituição do gel e o tampão de corrida utilizado.

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molar

bisacrilamida/acrilamida.

Faixa efetiva de separação de proteínas no sistema SDS-PAGE Concentração do Gel de Poliacrilamida* (%) 15 10 7,5 5,0 Faixa Linear de Separação de Proteínas (kDa) 12-43 16-68 36-94 57-212

* A relação molar acrilamida/bisacrilamida é de 29;1.adaptado de sambrook&Russel,2001.

Para visualização das bandas de proteínas mergulha-se o gel, após a migração, em corante comassie-blue ou sais de prata.

DNA

Em uma amostra normal de DNA espera-se encontrar: Quantidade de (T +C) é sempre igual à de (A+G).

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A quantidade de T é sempre igual à de A e C é sempre igual à de G, mas (A+T) não precisa ser igual à de G+C). Essa proporção varia em indivíduos de espécies diferentes, mas é a mesma em tecidos diferentes do mesmo organismo. G-C tem 3 pontes de H e A-T tem 2 pontes de H. Portanto DNA com muito G-C é mais estável que DNA com muito A-T. Há um padrão na configuração do DNA: Adenina e Guanina são moléculas maiores ligadas ao açúcar. Timina e Citosina são moléculas menores ligadas ao açúcar.

Cada molécula de açúcar liga-se a um fosfato que se liga a outra molécula de açúcar. O tamanho da ligação entre açúcar –fosfato – açúcar é de 3.4 A. O tamanho da ligação entre aprox. 10 grupos de ligações de pares de bases é de 34 A. Isso muda para aprox. 11 pares de bases em alta concentração de sal ou desidratando o DNA. “In vivo “ou “in vitro” essa situação pode ocorrer se houver formação de heterodúplices como DNA-RNAc ou dúplices RNA-RNA. O giro da fita é pela direita, mas certas seqüências giram para esquerda (zDNA- DNA zigue-zague). Segmentos específicos no DNA podem sofrer mudanças de sentido.

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Uma mesma molécula de DNA pode se apresentar sob três formas ou topoisômeros distintos. A forma do DNA pode ser circular superenovelada (I), circular relaxada (II) e linear (III). Uma bactéria como a E.coli contém aproximadamente 4 milhões de pares de bases em seu genoma. O genoma humano é composto por aproximadamente 3 bilhões de pares de bases. A salamandra africana contém cerca de 50 bilhões de pares de bases e o lírio tem cerca de 250 bilhões de pares de bases. Em procariotos a maior parte do DNA parece ser codificante, já em eucariotos, grande parte são seqüências repetidas ao longo de todo o genoma (DNA - não codificante).

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Sentido 5’- 3’

O fósforo diéster liga o carbono 5’ ao carbono 3’ do outro açúcar na fita. Quem se liga à T, G, A ou C é o açúcar, sempre pelo carbono 1’. A ligação do fósforo diéster e o açúcar se dá no sentido 5’-3’, o que faz com que a torção da fita fique para a direita.

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PROTEÍNAS

As proteínas são sintetizadas a partir do código genético. “In vivo”, a ação da síntese de proteínas ocorre nos ribossomos. A primeira etapa para síntese de proteínas é retransmitir a informação do DNA para os ribossomos. Para isso, as enzimas celulares sintetizam uma cópia funcional de um gene para levar seu código genético até os ribossomos. Essa

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cópia funcional é chamada RNA mensageiro, que é uma molécula muito parecida com o DNA. Em uma segunda etapa os códons do RNAm é associado aos aminoácidos corretos pelo RNT transportador. Na terceira etapa, os aminoácidos são ligados para formar uma cadeia protéica. O ribossomo que é formado de proteínas e RNA executa essa função. Quando a cadeia protéica termina um sinal de terminação é adicionado à cadeia fazendo com que o ribossomo não tenha mais como ligar aminoácidos e libere a cadeia formada. Existem 20 aminoácidos que se combinam para formar milhares de proteínas. Uma proteína de tamanho médio requer cerca de 1200 bases de seqüências codificante. Além da combinação entre aminoácidos, as proteínas podem se enovelar tendo uma característica tridimensional, expondo ligações onde se encaixarão aos receptores com estrutura química compatível.

RNA
O RNA é formado por nucleotídeos compostos por açúcar, fosfatos e uma das quatro diferentes bases orgânicas. O RNA difere química e estruturalmente do DNA. Diferença química: no lugar do açúcar desoxirribose, o RNA contém ribose e no lugar da Timina, o RNA contém Uracila. Diferença estrutural: apesar das bases do RNA também poderem formar pares complementares, o RNA geralmente é formado por apenas uma única fita de esqueleto açúcarfosfato e bases. Embora seja capaz de parear com fitas simples não forma dupla hélice. Síntese do RNAm Assemelha-se à replicação do DNA.

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A dupla hélice de DNA é desenrolada e as bases são expostas. Nucleotídeos que estão no meio separados se pareiam com os nucleotídeos complementares da fita. A Uracila se pareia com a Adenina. Ligações fosfodiésteres são formadas entre os nucleotídeos e o RNAm recém sintetizado possui uma seqüência de bases que é exatamente completar à fita molde de DNA. O processo de usar uma fita molde de DNA para criar uma molécula de RNAm complementar transcrição. Os RNA transportadores e ribossomais não são traduzidos em proteínas. Diferenças entre transcrição e replicação Na replicação do DNA ambas as fitas são usadas como molde para geração de duas novas fitas para duas novas hélices. Na transcrição, apenas uma fita simples de RNA é produzida e a nova molécula de RNAm é liberada do molde conforme é sintetizada e a dupla hélice de DNA volta que “solta” a fita de RNAm Essa síntese só é possível polimerase. Ação da RNA polimerase A hélice do DNA contém milhões de pares de bases. A RNA polimerase reconhece o início e o término dos pares de bases que são os constituintes de um gene, e a partir daí liga os códons complementares e para de ligá-los quando há uma sequencia no DNA que indica o término do gene. Essa sequencia de pares de bases no DNA que indica o começo de genes é chamada de promotor e a que indica o término de genes é o terminador. a enrolar-se à medida sintetizada. através das RNA é chamado de

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O ribossomo reconhece o RNAm e o prende na posição adequada para que seus códons sejam “lidos” corretamente. A tarefa é traduzir o código que o RNAm trás do DNA em aminoácidos e estes serão agrupados e determinarão a proteína formada. No RNAt há um anticódon que é o complementar do RNAm que só se liga a uma sequencia específica de três bases. Na outra extremidade do RNAt está um aminoácido que é ligado a esse RNAt através de uma enzima, a aminoacil sintetase. Assim o aminoácido correto correspondente ao códon do RNAm é trazido ao ribossomo e pode ser ligado à cadeia de aminoácidos em uma sequencia específica que determinará a proteína. Esse processo é a tradução.

Tradução em bactérias No RNAm há sinais, seqüências específicas de bases que têm complemento no ribossomo de bactérias que fica a 8 e 13 nucleotídeos antes do códon de iniciação (geralmente esse códon de iniciação em bactérias é o AUG). Essas seqüências são formadas por 5’GAGG-3’ ou 5’-AGGA-3’. No RNAm também há uma sequencia de terminação. Não existe um RNAt que se pareie com uma sequencia de terminação. Uma proteína é a responsável pela terminação da tradução. Como os sinais de começo e término de uma proteína estão no RNAm, estão também no DNA. Por isso é importante saber reconhecer os sinais de comando das bactérias que são os vetores de estudo em Biotecnologia.

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ENZIMAS MODIFICADORAS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

Enzimas purificadas a partir dos organismos nos quais foram inicialmente identificadas. A nomenclatura é feita pelas iniciais desse organismo, incluindo a sua linhagem, e por algarismos romanos que indicam a ordem em que foi encontrada a cepa. Exemplo: EcoR I, primeira enzima isolada de Escherichia coli, cepa R. Para evitar a desnaturação das enzimas numa reação, a concentração de proteína nunca deve ser inferior a 0,1 mg/mL. A fração V da albumina bovina (BSA) é uma fonte de proteína neutra para estabilizar a enzima. Geralmente são classificadas de acordo com os tipos de reações que elas catalisam. As mais utilizadas são: Nucleases e Ribonucleases, DNA polimerases, RNA polimerases, Ligases, Fosfatases e quinases.

NUCLEASES E RIBONUCLEAES
Nucleases são responsáveis pela quebra enzimática da ligação fosfodiéster do DNA e às vezes do RNA também e as ribonucleases são responsáveis pela quebra enzimática da ligação fosfodiéster do RNA. As nucleases têm atividade exonucleásicas ou endonucleásica, as ribonucleases têm atividade endorribonucleásica.

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Além de reconhecer diferentes sítios-alvo, as diferentes endonucleases também clivam em diferentes posições dentro desses sítios. Assim, são produzidas moléculas com extremidades cegas ou com extremidades 5’ ou 3’coesivas.

EcoRI cliva as duas fitas do seu sítio de reconhecimento, originando extremidades 5’ coesivas. Essas são chamadas de extremidades coesivas uma vez que aderem rapidamente a outras moléculas clivadas com a mesma fita, que apresentam extremidades de fita simples complementares, unindo-se por pareamento de bases.

NUCLEASES
Dentre outras, estão incluídas as endonucleases de restrição ou enzimas de restrição. Reconhecem pequenas regiões de 4 a 8 pb específicas do DNA, chamadas de sítio de restrição, e clivam estas regiões em ambas as fitas de DNA. Levam o termo “restrição” porque algumas enzimas específicas clivam o DNA exógeno que o bacteriófago implanta na célula bacteriana. Para que essa enzima não clive o próprio DNA, existem enzimas modificadoras que metilam o DNA endógeno, modificando o sítio de restrição, impedindo ligação de enzimas clivadoras. Há enzimas de restrição que clivam o mesmo sítio no DNA, mas que foram isoladas de microrganismos diferentes, estas são chamadas de isosquizômeros. As endonucleases de restrição I e III clivam o DNA fora do sítio de especificidade, enquanto as do tipo II clivam dentro do próprio sítio.

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Enzimas de restrição tipo II

Nuclease Bal 31, Nuclease S1, Desoxirribonuclease I (DNAse I), Nuclease Microcócica, Exonuclease III. As enzimas de restrição tipo II têm um padrão de clivagem previsível se for conhecida a seqüência de DNA analisada. Funcionam reconhecendo uma seqüência palindrômica, isto é, que possui um duplo eixo rotacional, tendo a mesma seqüência quando lida no sentido 5’- 3’ em ambas as fitas. Por exemplo: 5’- GAATTCC-3’, que é o sítio de restrição da EcoR I. Atua melhor em fita dupla de DNA do que em fita simples. São aplicadas em digestão total ou parcial de DNA para serem clonadas ou em análise de restrição.

Nuclease Bal 31
São exonucleases 3’- 5’ que remove progressivamente nucleotídeos da extremidade 3’OH de DNA fita simples ou DNA fita dupla, mas têm alta especificidade para DNA fita simples. São aplicadas na deleção controlada a partir das extremidades de DNA fita dupla e geram subclones de DNA sobrepostos para sequenciamento.

Nuclease S1
São endonucleases de fita simples que atuam melhor em DNA de fita simples do que em RNA de fita simples. São aplicadas para análise de híbridos de DNA-RNA para identificação de íntrons, ma identificação da seqüência terminal dos transcritos (S1 Nuclease Mapping) e na

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remoção de bases salientes para produção de bases abruptas (a diferença está na forma como as extremidades foram clivadas). A ação dessa nuclease é interrompida com a adição de EDTA.

Desoxirribonuclease I (DNAse I)
São endonucleases que degradam DNA fita simples ou dupla. São aplicadas para cortar moléculas de DNA antes de fazer marcação isotópica; identificam regiões do DNA onde se ligam proteínas; removem DNA em preparações de RNA; removem moldes de DNA após transcrição in vitro; detecta regiões transcricionalmente ativas na cromatina.

Nuclease Microcócica
Têm atividade nucleásica não específica sobre DNA e RNA fita simples ou dupla. São aplicadas para remoção de ácidos nucléicos de extratos celulares e para estudos em cromatina.

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Exonuclease III
São específicas para DNA fita dupla com terminal 3’-OH, atuando como exonuclease 3’- 5’; removem grupos fosfatos da região 3’ terminal de DNA fita simples e DNA fita dupla através da ação da parte 3’ fosfatase que apresenta e funciona como endonuclease atuando assim especificamente para RNA e híbridos DNA-RNA. São aplicadas como End-labelling de DNA fita dupla que têm extremidades abruptas; geram subclones de DNA sobrepostos para sequenciamento; fazem deleção controlada de seqüências a partir de extremidades de DNA fita simples ( em conjunto com uma endonuclease específica para fita simples, como a Nuclease S1) e em técnicas de mutagênese.

RIBONUCLEASES
Ribonuclease A (RNAse A), Ribonuclease H (RNAse H), Ribonuclease T1. São usadas para eliminar RNA, ou quando se mapeia, quantifica ou sequencia um RNA. Para o sequenciamento de RNA é preciso usar uma combinação de RNAses que clivam em seqüências específicas, como as RNAses T1, U2 e CL3.

Ribonuclease A (RNAse A)
São endorribonucleases que clivam ligações fosfodiésteres na posição 3’ de uma pirimidina. São aplicadas na remoção de preparações de DNA. Antes de usar essa enzima pela primeira vez, deve-se ferver a solução a 100ºC por quinze minutos a fim de inativar eventuais contaminações com DNAse.

Ribonuclease H (RNAse H)
São endorribonucleases que clivam ligações fosfodiésteres de RNA em híbridos DNARNA. Atenção: estas não degradam RNA fita simples, RNA fita dupla, DNA fita simples nem DNA fita dupla.

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São aplicadas para eliminar de fita de RNAm após a síntese da primeira fita do DNAc (é a fita de DNA sintetizada a partir de um molde de RNA – DNA complementar), para facilitar a síntese da segunda fita de DNAc.

Ribonuclease T1
São endorribonucleases que clivam ligações fosfodiésteres de RNA após um resíduo G. São usadas para sequenciamento de RNA, mapeamento e quantificação de moléculas de RNA por proteção pela nuclease em conjunto com a RNAse A e quantificação de transcritos feitos por transcrição in vitro a partir de um molde de DNA sem G. Dependendo da concentração de NaCl ela atua diferente. Em concentrações de NaCl entre 0 e 100mM, a ribonuclease T1 cliva RNA de fita dupla, fita simples e a fita de RNA em heteroduplexes DNA:RNA. Na concentração de NaCl 0,3M ou acima, atua somente sobre RNA fita simples.

DNA POLIMERASES
Fazem a duplicação e reparo do DNA nas células vivas. São agrupadas em três grupos de acordo com o molde (template) que utilizam: DNA polimerase DNA – dependentes; DNA polimerases RNA – dependentes; DNA polimerases independentes de molde.

DNA Polimerases DNA – Dependentes
DNA polimerases I, fragmentos Klenow, T4 DNA polimerase, T7 DNA polimerase, Taq DNA polimerase. Adicionam desoxirribonucleotídeos (dNTP) a uma extremidade 3’OH de um fragmento de DNA (ou RNA) que esteja pareado com uma molécula complementar de DNA que serve como molde. A direção de síntese é sempre no sentido 5’- 3’, a partir da extremidade 3’-OH do DNA iniciador (primer).

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Algumas DNA polimerases tiram nucleotídeos da extremidade 5’ (exonuclease) ou 3’(exonuclease também). Quando ela corta a partir da extremidade 5’, pode ser aproveitada junto com a DNAse I que corta o DNA de fita dupla para marcar a molécula pela técnica de nick translation. Quando a atividade de retirar nucleotídeos a partir da extremidade 5’ é indesejada, tratase a DNA polimerase I com uma protease que elimina a porção N- terminal da molécula que tem atividade de retirada de nucleotídeos. Por engenharia genética é possível obter o gene de DNA polimerase I truncada (quebrada) na porção N-terminal. Quando o gene é transcrito, resulta uma polimerase sem a porção N-terminal que recebe o nome de fragmento grande da DNA polimerase de E. coli (por ser obtido através deste vetor) ou fragmento Klenow. Quando a polimerase não se dissocia do DNA molde e adiciona nucleotídeos continuamente a partir de um primer, diz-se que esse processo é a processividade da polimerase. A maioria das polimerases tem baixa processividade, sendo uma das exceções a T7 DNA polimerase que é usada para incorporar milhares de nucleotídeos em reações de sequenciamento de DNA.

DNA Polimerase I
Geralmente age adicionando açúcar à ponta 3’ de uma cadeia de nucleotídeos. Tendo formas de trifosfato de desoxirribonucleotídeos como substrato e energia. A energia para a ligação vem da própria quebra da ligação do trifosfato, sobrando bifosfato e sendo adicionado um fosfato. Pode agir no sentido 5’-3’(DNA polimerase), para isso, requer molde de DNA fita simples iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH. Pode agir retirando nucleotídeos no sentido 5’-3’(ação exonucleásica), degradando DNA

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fita dupla ou híbridos DNA-RNA a partir da extremidade 5’-PO4, liberando nucleotídeos 5’ fosfatos ou pequenos oligonucleotídeos de até 10 nucleotídeos de tamanho. Pode agir retirando nucleotídeos no sentido 3’-5’ (ação exonucleásica) degradando a fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3’-OH, o que remove os pareamentos errados de bases. É aplicada na marcação de DNA por nick translation e na síntese da segunda fita de cDNA (em combinação com a RNAse H). “In vivo” a reação para replicação do DNA pela polimerase I é muito lenta( aprox. 20 nucleotídeos/ seg.) e muito abundante( aprox. 400 moléculas/ célula) e a polimerase I se dissocia do DNA após a incorporação de 20 a 50 nucleotídeos. Por isso os pesquisadores desconfiaram que a polimerase I não poderia ser a única responsável pela maioria das sínteses de DNA. Foi descoberto mais tarde que a polimerase III catalisa a síntese de DNA na forquilha da replicação.

Fragmento Klenow
Age no sentido 5’-3’(DNA polimerase) requerendo molde de DNA fita simples, iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH livre Pode agir retirando nucleotídeos (ação exonucleásica) no sentido 3’-5’, degradando o DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3’-OH. É aplicado em end-filling e marcação de DNA fita dupla com extremidade 5’ saliente; na marcação de DNA por random priming; no sequenciamento de DNA pelo método de terminação de cadeia; na síntese de segunda fita de cDNA; na mutação sítio-dirigida, n síntese da segunda fita e na produção de sondas de DNA fita simples por primer extension.

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T4 DNA Polimerase
Pode agir no sentido 5’-3’(DNA polimerase) requerendo molde de DNA fita simples e iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH. Pode agir retirando nucleotídeos no sentido 3’-5’ (ação exonucleásica), degradando ativamente o DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3’-OH. Não age retirando nucleotídeos no sentido 5’-3’. É aplicado em end-filling e marcação de DNA fita dupla com extremidade 5’ saliente; na marcação de DNA fita dupla pela técnica de replacement synthesis; na geração de subclones de DNA sobrepostos para sequenciamento e em gap-filling na manutenção sítio-dirigida.

T7 DNA Polimerase
Pode agir no sentido 5’-3’(DNA polimerase) requerendo molde de DNA fita simples iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH. Pode agir retirando nucleotídeos no sentido 3’-5’(ação exonucleásica) degradando o DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3’-OH. Não retira nucleotídeos no sentido 5’-3’. É aplicado no sequenciamento de DNA pelo método da terminação em cadeia e na síntese da segunda fita de DNA. Esta enzima substitui a Polimerase Klenow quando se deseja mais rapidez e afinidade pelo molde de DNA. Há um aversão dessa enzima (Sequenase) que não possui a capacidade de retirada de nucleotídeos da extremidade 3’-5’, sendo ideal pra o sequenciamento de DNA, pois é altamente processiva.

Taq DNA Polimerase
Foi isolada de bactéria termófilas. Pode agir no sentido 5’-3’(DNA polimerase) requerendo um molde de DNA fita simples iniciador de DNA ou RNA cm extremidade 3’-OH.

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Pode agir retirando nucleotídeos na extremidade 3’-5’(ação exonucleásica) degradando DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 5’-PO4. È aplicado em PCR; sequenciamento da DNA a altas temperaturas e em DNA footprinting. Existem outras polimerases termoestáveis no mercado: Bst Polimerase, rTth Polimerase, Vente Polimerase, Pirostase, Hot Tub.

DNA Polimerases RNA – Dependentes
AMV Transcriptase reversa Duplicam genomas baseados em RNA, como o dos retrovírus. Essas enzimas são empregadas por esses organismos para sintetizar uma cópia de DNA a partir de seus genomas de RNA. Esta é a chamada transcrição reversa, as enzimas que as promovem são as Transcriptases Reversas. Essas enzimas são multifuncionais, mas é mais empregada na síntese de DNA a partir de um molde de RNAm, tendo como iniciador um oligo (dT). A fita de DNA que é sintetizada a partir do RNA é chamada cDNA (DNA complementar). Também podem polimerizar uma molécula de DNA a partir de um molde de DNA.

AMV Transcriptase Reversa
Age como DNA polimerase 5’-3’requerendo molde de RNA fita simples ou fita dupla e um iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3’-OH. Não possui atividade exonucleásica. Pode agir no sentido 5’-3’ e 3’-5’ como exorribonuclease degradando especificamente o componente de RNA dos híbridos DNA-RNA. Essa atividade é denominada “atividade tipo RNAse H”

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É aplicada para síntese da primeira fita de cDNA; no sequenciamento de DNA pelo método da terminação de cadeia (sobretudo em moldes ricos em G e C), pois não possui atividade exonucleásica 3’-5’; identificação de estruturas secundárias do RNA e marcação da extremidade 3’ do DNA.

DNA Polimerase - Independente de Molde
Terminal Transferase Enzima isolada de timo de novilho que catalisa a incorporação de dNTP (ribonucleotídeo) a uma extremidade 3’-OH de DNA sem necessidade de molde. Essa capacidade foi utilizada para tornar compatíveis as extremidades de insertos e vetores de clonagem através da construção de extremidades homopoliméricas complementares. Terminal Deoxinucleotidil Transferase (Terminal Transferase) Adiciona dNTP(ribonucleotídeo) à extremidade 3’-OH de DNA fita simples ou DNA fita dupla, mas a reação ocorre com mais eficiência em fita simples. Para aumentar a eficiência em fita dupla tem que adicionar Co++. È aplicada na adição de cauda homopolimérica e na marcação de extremidade 3’-OH como 3’- dNTP(ribonucleotídeo), 3’NTP ou ddNTP marcados radioativamente.

RNA POLIMERASES
São as principais enzimas responsáveis pela transcrição do DNA em RNA. Catalisam a adição de ribonucleotídeos a uma extremidade 3’-OH sem a necessidade de um iniciador anelado. As RNA polimerases são divididas em três classes: DNA dependentes; DNA – independentes e RNA – dependentes RNA – dependentes(Replicases).

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI Responsáveis pela duplicação de certos genomas virais de RNA. DNA– dependentes Podem ter origem bacteriana ou viral. Bacteriana: RNA polimerase DNA - dependentes RNA polimerase de E. coli responsável pelo reconhecimento das regiões RNA polimerases dos vírus SP6, T7 e T3. RNA polimerases DNA – independentes

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-10 e -35 do

promotor bacteriano. Têm baixa processividade “in vitro”, portanto são preferíveis as

Poli (A) polimerase isolada de E. coli que não requer molde de DNA e que adiciona resíduos de AMP a uma extremidade 3’-OH de RNA a partir de ATP. Polinucleotídeo fosforilase foi a enzima chave para a síntese das moléculas de RNA que permitiu a elucidação do código genético. Age como a Poli (A) polimerase, mas a partir de precursores de NDP.

RNA Polimerases DNA – Dependentes
RNA polimerase de E. coli Transcreve a partir de promotores que possuem a seqüência consenso de promotores de E. coli. É aplicada em transcrição in vitro e na síntese de RNA marcado radiotivamente. RNA polimerase de fagos (SP6, T3 e T7) Têm transcrição altamente específica a partir de promotores dos fagos SP6, T3, T7. É aplicada em produção de RNA anti-sense; na síntese de RNA marcado radioativamente; na síntese de RNAm para tradução in vitro e no sequenciamento de RNA.

RNA Polimerases DNA – Independentes
Poli (A) polimerase

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI Adicionam cauda poli (A) à extremidade 3’-OH de RNA fita simples.

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É aplicada na marcação radioativa de RNA e na adição de cauda poli (A) para servir de molde para oligo (dT) durante síntese de cDNA.

Polinucleotídeo Fosforilase
Adiciona ribonucleotídeo a uma extremidade 3’-OH de um RNA aceptor. É aplicada na síntese artificial de moléculas de RNA.

LIGASES
As ligases catalisam a formação de uma ligação fosfodiéster entre grupos justapostos 3’OH e 5’-PO4. A reação ocorre entre moléculas de DNA fita dupla com extremidades abruptas ou coesivas. Podem ser de origem bacteriana ou viral. A DNA ligase de E. coli de origem bacteriana usa como fonte de energia o NADH. A T4 DNA ligase de origem viral usa como fonte de energia o ATP, por isso são preferenciais em clonagens moleculares para ligar extremidades abruptas. A RNA ligase une moléculas de RNA ou DNA fita simples na presença de ATP. Há evidências de que a T4 RNA ligase estimula a atividade da T4 DNA ligase na ligação de extremidades abruptas.

T4 DNA Ligase
Catalisa a formação da ligação fosfodiéster entre extremidades adjacentes 3’-OH e 5’PO4 intramolecularmente em regiões de corte (nicks) ou entre extremidades coesivas ou abruptas. É aplicada entre moléculas de DNA para clonagem de fragmentos.

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T4 RNA Ligase
Catalisa a formação da ligação fosfodiéster entre extremidades 3’-OH e 5’-PO4 de DNA fita simples e RNA fita simples. È aplicada na união de moléculas de DNA fita simples ou RNA fita simples; no aumento de eficiência da T4 DNA ligase em ligações de extremidades abruptas e na marcação da extremidade 3’-OH de RNA.

FOSFATASES E QUINASES
Fosfatases são empregadas para desfosforilar extremidades 5’-PO4 de vetores de clonagem para evitar o religamento dos mesmos após a adição da DNA ligase na presença de insertos, assim aumenta o número de clones transformantes contendo insertos clonados no vetor. Podem agir em associação com as Quinases, pois a Polinucleotídeo Quinase transfere um grupo fosfato terminal do ATP (y fosfato) à extremidade 5’-OH das extremidades defosforiladas. Esse grupo terminal pode ser marcado radiotivamente. As quinases também podem trocar o grupo 5’-PO4 do DNA para o ADP, mas essa reação é menos eficiente que a atividade de transferência do grupo fosfato do ATP ao 5’-OH.

Fosfatases
Fosfatase alcalina bacteriana (Bacterial Alkaline Phosphatase – BAP); Fosfatase alcalina de intestino de novilho (Calf Intestinal Phosphatase – CIP); Fosfatase alcalina de camarão (Shrimp Alkaline Phosphatase – SAP). Removem grupos fosfato de extremidade 5’de rNA fita simples, DNA fita simples, RNA fita dupla, DNA fita dupla, dNTP e NTP São aplicadas em defosforilação de DNA fita dupla para evitar autoligação de vetores de clonagem; na defosforilação de DNA e RNA para posterior marcação da extremidade 5’ com Polinucleotídeo Quinase e como componente de conjugado de anticorpo para imunodecção.

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Quinases
T4 Polinucleotídeo Quinase 5’quinase: transfere y- fosfato de ATP para uma extremidade 5’-OH de DNA fita simples, DNA fita dupla, RNA fita simples ou RNA fita dupla. 3’fosfatase: remove grupos fosfato da extremidade 3’ de DNA fita simples, DNA fita dupla, RNA fita simples ou RNA fita dupla. São usadas na marcação de extremidade 5’ de DNA ou RNA para sequenciamento de DNA pela técnica de Maxam-Gilbert; no sequenciamento de RNA e na remoção de 3’PO4.

Cuidados quanto ao uso de enzimas de restrição: • Contaminantes (polifenóis, polissacarídeos etc.) interferem na atividade das enzimas, reduzindo a eficiência. A contaminação por polissacarídeos consiste na principal contaminação afetando a pureza do DNA extraído de plantas. Esses carboidratos podem inibir a atividade de várias enzimas usadas em manipulações biológicas de DNA, tais como ligases, polimerases, e enzimas de restrição. A contaminação por fenóis, e a conseqüente oxidação do DNA, pode ser evitada agregando PVP, β-mercaptoetanol ao tampão de extração. composto dietilditiocarbamato (0,1 M) pode ser adicionado. Em casos extremos, o

SOLUÇÃO TAMPÃO
Soluções capazes de manter o pH constante mesmo que pequena quantidade de ácido ou base seja a ela adicionada. Para a escolha do tampão: a) escolher um sistema ác/bas conjugado com pKa (da base ou do ácido ) mais próximo possível do pH desejado. pKa: ponto de inflexão da curva de neutralização de um grupamento ácido ou básico.

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A capacidade tamponante será maior em um pH próximo ao pKa, pois nessa faixa é mais fácil absorver radicais OH- e H+ gerados nessa solução. b) permitir o preparo de solução tampão de menor concentração depende da capacidade tamponante do par ácido /base. c) não alterar outras variáveis como a força iônica. Deve-se evitar a ação de DNAses (nucleases), que podem degradar o DNA. Por esse motivo os tampões de extração de DNA possuem pH por volta de 8,0 (enquanto o pH ótimo para ação de DNAses endógenas fica por volta de 7,0) :

TAMPÃO DE CORRIDA
A composição e a força iônica do tampão de corrida influenciam na migração e na qualidade do resultado de uma eletroforese. Em baixa força iônica, a migração é muito lenta, e em extrema força iônica provoca uma alta condutividade elétrica, que gera calor e pode levar à desnaturação das partículas analisadas. Os tampões mais utilizados são: TAE e TBE

TAE (TRIS-ACETATO-EDTA)
Tem baixo custo, mas capacidade tamponante menor que o TBE. Não deve ser utilizado em corridas longas nem em altas voltagens. Caso seja necessário seu uso nesses casos, deve-se trocar o tampão no meio da corrida. O TAE promove uma corrida cerca de 10% mais rápida quando o DNA apresenta-se sob a forma linear ou supernoveladas.

CTAB 2%
• As membranas celulares devem ser rompidas para liberação do DNA: detergente catiônico CTAB (Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide - Brometo de etiltrimetilamônio).

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Os ácidos nucléicos devem ser separados de polissacarídeos, porque inibem a ação de enzimas de restrição e torna a amostra de DNA excessivamente viscosa, interferindo na migração do DNA em corridas eletroforéticas. Polissacarídeos e ácidos nucléicos possuem solubilidade diferenciada na presença desse detergente.

Os ácidos nucléicos são poliânions solúveis em água.

Os sais de sódio e

potássio de ácidos nucléicos são insolúveis na maioria dos solventes orgânicos, incluindo numa mistura de etanol e água, mas eles não são desnaturados por solventes orgânicos. O detergente catiônico CTAB solubiliza membranas celulares, e dependendo da concentração de NaCl no tampão, CTAB forma um complexo com o DNA, e é utilizado para precipitar DNA seletivamente.

NaCl 5M
• • Precipitação do DNA Neutralizante

EDTA (ÁCIDO ETILENO DIAMONO TETRACÉTICO) 0,5 M PH 8,0
• Também para evitar ação de DNAses. Este agente quelante imobiliza cations de Mg, que são cofatores para várias endonucleases.

CLOROFÓRMIO (ÁLCOOL ISOAMÍLICO) (E/OU FENOL)
• • Os ácidos nucléicos devem ser separados das proteínas. Desnaturam as proteínas tornando-as insolúveis à fase aquosa. A utilização de solução fenol/clorofórmio seguida de clorofórmio /álcool isoamílico é usada para remover qualquer traço de fenol remanescente. Nesse processo as proteínas desnaturadas ficam na interface das fases fenólica e aquosa.

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INCUBAÇÃO EM BANHO-MARIA
• Hidrólise do RNA

β-Mercaptoetanol 0,2%
• Antioxidante: O DNA deve ser protegido da ação de compostos fenólicos, como peroxidades e polifenoloxidades que oxidam o DNA (a contaminação por compostos fenólicos pode ser evidenciada pela coloração do DNA marrom). Ação: quebra parte do dissulfeto para a molécula ficar linear, eliminando a contaminação por fenóis.

PVP (POLIVINILPIRROLIDONA)
• Também antioxidante, evita a oxidação de polifenóis, eliminando a contaminação por fenóis.

BROMETO DE ETÍDEO
• É um análogo de base que se intercala na molécula de DNA e emite fluorescência violeta quando exposto aos raios UV. Na sua presença ocorre redução de velocidade de migração, pois o DNA aumenta o seu tamanho e muda de forma.

BSA (ALBUMINA DE SORO BOVINO)
• • Também antioxidante, evita a oxidação de polifenóis. Proteína neutra que estabiliza enzimas de restrição.

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DPEC
• Inibidor de RNA. Para extração de RNA, é comum tratar as soluções com dietil pirocarbonato (DEPC) de forma a desnaturar RNAses. Entretanto, em certos casos e situações, apenas a esterilização em autoclave já é suficiente para inativar ribonucleases. Não é necessário tratar o tampão de extração. Todos os tubos de centrífugas, cadinhos, almofariz, pipetas (plásticas ou de vidro) devem ser autoclavadas e secadas antes do uso, ou tratados com DEPC. • Não misturar DEPC e TRIS. Caso o protocolo necessite de TRIS livre de RNAse, usar água livre de RNAse.

TRIS- HCl; pH 7,4
• Solução neutralizante.

PROTEÍNA K
• Alguns protocolos incorporam proteases (proteinase K) para facilitar a separação do DNA das proteínas da cromatina.

ETANOL OU ISOPROPANOL
• Recuperação dos ácidos nucléicos totais por precipitação em álcool (etanol ou isopropanol).

ACETATO DE SÓDIO (SAIS)
• Eliminação do RNA por digestão com RNAse, ou separação de RNA e DNA por solubilidade diferencial em sais. Sob condições de alta concentração de sais (Ex. 7,5 M de Acetato de Sódio), DNA e os RNA pequenos (principalmente tRNA) permanecem em solução, enquanto que RNA (> que 60 bases) precipita.

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TÉCNICAS MAIS UTILIZADAS

INOCULAÇÃO DE VIROSE EM CURCUBINÁCEAS
Tampão USO: 7,0 ml tampão fosfato monobásico 12,0 ml tampão fosfato dibásico 181 ml água destilada Por último: 12 g bissulfito Macerar alíquota de aprox.20g de folha positiva para vírus em 20 ml de tampão uso. Usar Carburundum 400 mesh para esfoliar a folha de mudas novas em estágio de até 3 folhas (folhas cotiledonares expandidas) e esfregar o macerado nas folhas. Transplantar as mudas após 3 dias de inoculação.

EXTRAÇÃO DE DNA VEGETAL PELO MÉTODO CTAB

Tampão CTAB para extração de DNA vegetal de folhas cotiledonares expandidas
Estoque Concentração Final Volume Final 15 mL

CTAB 5% NaCl 5M EDTA 0,5 M Tris-HCl (pH8)1,0M PVP* sólido β-Mercaptoetanol** H2O completar o volume para •

2% 1,4 M 20 mM 100 mM 2% 0,2%

6 mL 4,2 mL 0,6 mL 1,5 mL 0,3 g 30 µL 15 mL

PVP - polivinilpirrolidona; **Colocar imediatamente antes do uso e sob capela.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI PROCEDIMENTO: • • • • • • • • • • • Macerar em nitrogênio líquido 3g de tecido vegetal.

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Transferir para tubo de polipropileno com 15 mL de tampão CTAB pré aquecido a 65ºC. Incubar a 65ºC e agitar a cada 10 min por 30 min suavemente. Adicionar 1 volume de clorofórmio( álcool isoamílico) ou trisol e agitar o tubo manualmente ou com agitador por 10 min. Centrifugar por 10 min a 5000g (8000 rpm) Transferir o sobrenadante para outro tubo. Repetir a extração com clorofórmio ou trisol e agitar o tubo manualmente ou com agitador por 10 min Centrifugar por 10 min a 5000g (8000rpm) Opcionalmente, adicionar RNAse a uma concentração final de 100mg/ml e incubar a 37ºC por 30 min. Adicionar 0,6 volume de isopropanol gelado ou 2,5 volumes de etanol absoluto gelado. Misturar suavemente por inversão do tubo. Se o complexo DNA-CTAB formar uma rede filamentosa visível, recuperar esse DNA com um gancho feito de pipeta de Pasteur. Caso o DNA não aparecer ou ficar floculento, centrifugar a 10000 g (12.000 rpm) por 20 min e descartar o sobrenadante.

A agitação suave emulsifica as fases formadas preservando o DNA.

Quanto mais repetição, mais pura a amostra, mas com menos DNA.

Sempre que possível, evitar a centrifugação por levar a uma co-precipitação de DNA e polissacarídeos. • Lavar o precipitado com aproximadamente 5 mL de etanol 70%. Se o precipitado se soltar do fundo, centrifugar por 3 min a 10000g (12.000 rpm) para “grudar” o precipitado no fundo do tubo. • Secar invertendo o tubo em papel toalha ou em câmera de fluxo laminar. O precipitado não deve conter resíduos de isopropanol ou secar demais, por que pode dificultar a ressuspensão do DNA.

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Dissolver o precipitado em 200 a 500 mL de TE e incubar a 4ºC por uma hora ou mais. Para uma purificação posterior, seguir para a etapa de acetato de amônio ou fazer purificação por gradiente de CsCl.

Maceração

15 ml de tampão CTAB

+ um volume de

Clorofórmio

Centrifugado

Sobrenadante em outro tubo, repetir centrifugação com clorofórmio

Centrifugado Sobrenadante em outro tubo, repetir centrifugação com clorofórmio: Transferir fase superior para novo tubo com etanol ou isopropanol 0,6 volumes e RNAse:

Misturar por inversão de tubo suavemente:

Filamento de DNA

lavar precipitado de DNA com etanol 70%

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Inverter tubo para secar

Dissolver o precipitado em 200 a 500 µL de TE

Sem RNAse, nem centrifugação:

desproteinização, os compostos

celulares apresentam-se assim, após

1ºProteína, 2°DNA, 3ºRΝΑ:

EXTRAÇÃO DE DNA VEGETAL PELO MÉTODO DE DOYLE E DOYLE

O DNA de plantas será extraído de acordo com protocolo modificado de Doyle e Doyle (l990). Esse método foi adaptado de um método proposto por Saghai-Maroof et al. (1984). Ler considerações em Ferreira e Grattapaglia (1995) (pg 121 a 139).

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1. Coletar as amostras de folhas jovens e saudáveis das plantas, evitando áreas atacadas por pragas e doenças. De modo geral devem-se lavar as folhas em água corrente, usando, sempre que necessária água sanitária e/ou sabão. Enxaguar, e em seguida rinsar em água destilada, e secar com papel toalha. Esse material pode ser congelado, liofilizado, seco em estufa a aproximadamente 4oC, ou usado diretamente. 2. Utilizar cerca de 150 mg de lâminas de folha frescas ou 50 mg de folhas liofilizadas ou secas. As amostras serão trituradas em almofariz na presença de nitrogênio líquido. Uma possibilidade é utilizar discos foliares cortados com a tampa dos microtubos Eppendorf de 1,5 ml. O material pode ser triturado em cadinho e transferido para o tubo, ou diretamente no tubo usando um micro-pistilo. 3. O material será transferido para um tubo de centrífuga, e 650 µ1 do tampão de extração será adicionado: 10 ml 2% CTAB 1.4 M NaCl 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) 20 mM EDTA, pH 8,0 0,2 g do produto 2,8 ml do estoque 5 M NaCl 1 ml estoque 1 M Tris Cl pH 8,0 400 µl do estoque 0,5 M EDTA, pH 8,0

1% polivinilpirrolidona MW10,000 0,1 g do produto

4. Adicionar a uma alíquota do tampão a ser usado, pouco antes do uso: 0,2 % β-mercaptoethanol 50 µ g ml-l de proteinase K 5. Misturar os tubos em vórtex, e colocá-los em banho-maria a 55oC por 60 minutos. 6. Adicionar 650 µl de clorofórmio: álcool isoamil (24:1) e misturar até formar uma emulsão. 7. Microcentrifugar a solução por 5 minutos a 12000 rpm.

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8. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, com cuidado para não pipetar a interfase. Caso o volume da fase superior não for superior à fase intermediária com fragmentos de tecido, adicionar mais tampão e misturar vigorosamente e re-centrifugue. 9. Adicionar 200 µl.tubo-1 do tampão de extração sem proteinase K e β-mercaptoetanol, e adicionar 650 µl de clorofórmio: álcool isoamil (24:1), misturando até formar uma emulsão. 10. Microcentrifugar a solução por 5 minutos a 12000 rpm. 11. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, com cuidado para não pipetar a interfase. 12. Repetir esses três passos anteriores mais uma vez. 13. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, e adicionar um volume igual de isopropanol. 14. Centrifugar o DNA por 5 minutos a 12000 rpm. 15. Lavar o pellet com 1 ml de Etanol 70% para remover sais por duas vezes, e secar ao ar ou sob vácuo num dessecador. 16. Ressuspender o DNA em 20 µl de tampão TE contendo ribonuclease [RNAse] (10µg.ml-l). A RNAse deve ser fervida dependendo da origem comercial. Várias preparações são contaminadas por DNAses, que são inativadas pela fervura, enquanto que as RNAses não são (demonstrando a resistência dessas enzimas). Em geral prepara-se estoque dissolvendo 100 mg de RNAse em 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5) e 15 mM NaCl; aquecer em água fervente por 15 minutos e resfriar lentamente a temperatura ambiente. Fazer alíquotas de 1 ml e armazenar a –20oC.

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MÉTODO

PARA

EXTRAÇÃO

DE

DNA

DE

CÉLULAS

EUCARIÓTICAS
Preparação de DNA de células eucarióticas (Sambrook&Russel, 2001). Método adequado para Southern Blot e para construção de banco genômico por obter um DNA genômico de alta qualidade de elevada massa molecular. Soluções e material TBS • • Tris-HCl 20mM; pH7.4 NaCl 150mM

Proteinase K Tampão de extração • • • Tris HCl 10 mM ; pH 8.0 EDTA 0,1M SDS 0,5%

RNAse a 20 µg/mL Dissolvida em tampão acetato de sódio 50 mM; pH 4.8 e fervida em banho-maria por vinte minutos para eliminar qualquer DNAse contaminante. Conservar em eppendorf de 1,5 mL a -20ºC. Fenol equilibrado • • • • 1 volume de fenol 1 volume de Tris 1M B-Hidroxiquinolina 0,1% (p/v) B-Meracaptoetanol 0,2% (p/v)

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Solução equilibrada com Tris-HCl 100mM; pH8.0; EDTA 1mM; NaCl 200mM

Etanol absoluto Etanol 70% (v/v) TE • • Tris-HCl 10mM; pH8.0 EDTA 1mM; pH 8.0

Solução de ácido cítrico / glicose • • • • Ácido cítrico Citrato de sódio Glicose Água destilada 0,48 g 1,32 g 1,47 g q.s.p. 100 mL

Materiais: Incubadora com agitação, tubos de vidro e plástico, centrífuga, bastão de vidro em forma de gancho. Método 1. Usar 0,5 mL de TBS para raspar as células da placa de cultura 2. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga e colocar no gelo 3. Lavar a placa 1x com 1 mL de TBS e juntar a primeira suspensão (pode ser utilizado 0,5 g de tecido mole) 4. Centrifugar a 1500xg/10 min a 4ºC. Ressuspender as células em 5 a 10 volumes de TBS gelado e repetir a centrifugação. 5. Transferir a solução para um enlermeyer (para uma suspensão de 1 mL de células, usar frasco de 50 mL) e adicionar 10 mL de tampão de extração para cada 1 mL de suspensão de células 6. Incubar a 37ºC por 1 hora
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7. Adicionar proteinase K para uma concentração final de 100g/mL.Misturar lentamente com um bastão de vidro 8. Incubar a 50ºC por 3 horas 9. Resfriar a temperatura ambiente 10. Transferir as células para um tubo de centrífuga e adicionar igual volume de fenol equilibrado. Misturar lentamente. 11. Centrifugar a 5000xg/15 min à temperatura ambiente 12. Transferir a fase aquosa para um tubo limpo e repetir a extração mais duas vezes. 13. Para se obter DNA de alta massa molecular (= 200Kb), depois da 3ª extração com fenol, dialisar a fase aquosa a 4ºC contra 4 litros de uma solução de Tris-HCl 50mM; pH8.0; EDTA 10mM até que a A270 do dialisado esteja menor que 0,05. 14. Para isolar DNA com tamanho entre 100 e 150 Kb, transferir a fase aquosa final para um tubo de centrífuga novo e adicionar 0,2 volumes de etanol e, usando um bastão de vidro, enrolar o DNA. Se o DNA precipitado tornar-se fragmentado, coletar por centrifugação a 5000 xg/5min à temperatura ambiente. Lavar o DNA com etanol 70%. 15. Secar e ressuspender o DNA em 1 mL de TE para cada 5x106 células. Deixar o DNA dissolvendo na geladeira (4ºC) durante a noite. 16. Estimar a concentração por espectrofotometria a 260nm ou usar 1/10 do volume final para análise em gel de agarose. 17. Preparação de DNA de tecidos Mesmo protocolo a partir do item 7 . Congelar o tecido em nitrogênio líquido e pulverizar usando cadinho. Deixar o nitrogênio evaporar e adicionar ao tecido aproximadamente 10 volumes de tampão de extração e transferir a suspensão para um tubo de centrífuga. Em seguida iniciar passo 7. Obs: Ao trabalhar com DNA cromossomal usar pipetas de grosso calibre ou cortar as pontas das pequenas, pois o pequeno diâmetro pode causar quebra mecânica do DNA.

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Estimativa de Concentração de DNA, Após Sua Extração Quantificação de DNA (e RNA) Através de Espectrofotometria
O DNA de fita simples absorve mais que o DNA de fita dupla helicoidal por que as bases estão encontradas no interior das hélices. Essa informação permite monitorar por espectrofotometria o momento da desnaturação da fita dupla, que é de rápida transição, que é caracterizada por aumento da absorbância da mistura analisada (efeito hipercrômico). Ao contrário dos peptídeos, as bases aminadas nos ácidos nucléicos são cromóforos fortes. As 5 bases encontradas no DNA ou RNA absorvem entre 250 e 280nm. O padrão de absorção típico de proteínas é a 280nm. O padrão de absorção típico de DNA é a 260nm. *Razão ótima entre A260/ A280 DNA 1,8 - 1,9 RNA 1,9 – 2,0 Quando há proteínas, esses valores são diminuídos. Campos aromáticos (fenóis) também interferem e eles são usados na purificação de DNA e RNA. Espectrofotometria para avaliação de pureza, e quantificar a partir do passo 8. 1. Diluir a amostra de DNA 1:500 em 1mM Tris-HCL; pH 7.5 2. Preparar o TE: (10mM tris-HCL; pH 8.0; 1mM EDTA) 3. Adicionar 1mL de TE à cubeta de quartzo e zerar a 260 nm com o branco (branco=TE) Não usar cubeta de vidro que é opaca á radiação ultravioleta. 4. Adicionar 1mL da diluição na cubeta (sem o TE) 5. Ler a 260nm 6. Repetir as leituras em 230, 280 e 320 nm

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Se o aparelho não for de feixe duplo, zerar com o branco em cada comprimento de onda. 7. *Avaliar a pureza: A260 /A280 >ou igual 1,8 A320< 0,1 . A260 8. Calcular a [DNA] ou [RNA] conforme a fórmula mais conveniente

A estimativa da concentração de DNA depende do tipo e quantidade de amostra disponível. Para amostras com certo grau de pureza, com baixo nível de contaminação por proteínas, fenóis, polissacarídeos, álcool, ou outros ácidos nucléicos, a estimativa por espectrofotômetro, medida pela absorbância das bases a 260 nm consiste num método simples, rápido e com certa precisão. Para quantificação de DNA, as leituras devem ser feitas entre 230 nm até 320 nm. A leitura a A260nm permite o cálculo da concentração de ácidos nucléicos na amostra. Uma DO (Densidade óptica) de l corresponde aproximadamente a 50 µg ml-1 para DNA dupla fita, 40 µg ml-1 para DNA e RNA fita simples, e cerca de 20 µg ml-1 para oligonucleotídeos. *A relação entre A260nm e A280nm (DO260/DO280) fornece uma estimativa da pureza dos ácidos nucléicos. Soluções puras de DNA e RNA possuem valores de DO260/DO280 entre 1,8 e 2, respectivamente. Se existe contaminação com fenol ou proteínas, a relação DO260/DO280 será muito menor, e a precisão nas quantidades de ácidos nucléicos será baixa.

Espectrofotometria Para Quantificação de DNA
Nessa prática utilizaremos o espectrofotômetro, gel de agarose, fluorômetro e placa de Petri com padrão. Para leitura a 320nm: Ligar o espectrofotômetro 15 minutos antes. 1 . Colocar o comprimento de onda para 320 nm.

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Fazer uma solução diluída em água da amostra de DNA (1:100, 1: 500, ou até 1: 1000). Zerar o instrumento com água em Abs320nm. Fazer leituras de Abs230nm, AbS260nm, Abs280nm e Abs320nm Estimar a concentração de DNA pela fórmula (Abs260nm – Abs320nm) x 50 x fator de diluição = [DNA] em µg ml-1

Obs. Existe um superestimativa da concentração por espectrofotômetro devido a impurezas na solução. 6. Fazer um estoque de trabalho com a concentração de 5 ng µl-1

Para leitura a 260nm: Para quantificação: Diluir a 1:1000 ou 1:500 em água ou solução tamponada com Tris 1 mM, pH 8.0. ler a 260 nm da amostra e do branco Fita dupla [ds DNA (µ/mL)] = Fita simples [ss DNA (µ/mL)] = RNA [RNA (µg/mL)] = 50 . A260 . diluição 33 . A260 . diluição 40 . A260 . diluição

Oligonuc. sintéticos [DNA (pmol/µL)] =_ 100 . A260 . diluição___________ 1,5 Na + 0,71 Nc + 0,2 Ng + 0,84 Nt Porque a diferença dos sintéticos: como a estrutura molecular modifica a absorção, tem que adaptar a fórmula, pois os sintéticos de DNA só são obtidos na forma Cis e os normais são Trans. O uso de protocolos de extração de DNA simplificados, que utilizam pouco material de origem, ou possuem poucos passos de purificação, tendem a produzir ácidos nucléicos com maior contaminação.

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Em plantas tropicais, existe um grande problema de contaminação com polifenóis e polissacarídeos. Nesses casos, a estimativa por espectrofotometria não permitem uma determinação acurada da concentração de DNA. Nesse caso, o método de escolha consiste na fluorometria. A amostra de DNA a ser estimada é tratada com um corante específico para DNA dupla fita (ex. Hoechst 33258), e esse corante é excitado a um comprimento de onda (365 nm) e com emissão a 460 nm proporcional a concentração de DNA. RNA, proteínas e nucleotídeos não afetam as leituras. (ver descrição na página 124-125 de Ferreira e Grattapaglia, 1995). Outros métodos empregados utilizam a característica da fluorescência em ultravioleta induzida pela intercalação de brometo de etídeo na dupla fita de DNA. A fluorescência é proporcional à concentração de DNA, e pode-se determinar a quantidade de DNA numa amostra por comparação com padrões conhecidos. A comparação de fluorescência pode ser feita num mini-gel, que permite também a separação de DNA do RNA. Uma outra possibilidade é aplicar a amostra numa placa de petri com 1% agarose contendo brometo de etídeo (0,5 mg ml -1), e comparar com padrões. Manter a placa a 37'C por cerca de 30 minutos e observar no transiluminador. (usar 0,5 g de agarose 1% em 50 ml de tampão TAE, adicionar 5 µl de brometo de etídeo 10 mg/ml e analisar alíquotas de 2 µL).

ISOLAMENTO DE DNA PELO MÉTODO TRIZOL
Depois de completada a remoção da fase aquosa, como descrito no protocolo de isolamento de RNA, o DNA pode ser isolado na interfase e fase fenólica a partir do homogeneizado inicial. Seguindo precipitação e uma série de banhos, o DNA é solubilizado em 8mM NaOH. O DNA recuperado a partir de tecidos e culturas celulares permite o uso de reagente Trizol para a determinação do DNA contido na análise de amostras. Simultâneas extrações de DNA genômico permitem normalização de resultados de Northern Blot por DNA genômico em vez de maior variação de peso de RNA total ou tecido. (Dependendo da fonte, o pellet de DNA obtido pode requerer purificação - ex. extração por fenol - primeiramente para outras aplicações).

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Reagentes requeridos: Etanol Citrato de sódio 0,1 M em 10% de etanol Etanol 75% NaOH 8 mM Exceto sob outros aspectos, o experimento é transcorrido entre 15 a 30ºC. 1. PRECIPITAÇÃO DE DNA Remover a fase aquosa remanescente demasiadamente a interfase e precipitar o DNA da fase orgânica e da interfase com etanol. Adicionar 0,3 mL de 100% de etanol por 1 mL de reagente Trizol. Reagente usado pela homogeneização inicial, e misturar amostras por inversão. Depois estocar as amostras entre 15 a 30ºC por 2 a 3 minutos e sedimentar o DNA por centrifugação por não mais de 2.000 xg por 5 min entre 2 e 8ºC. Remover cuidadosamente a fase aquosa é crítico para a qualidade do isolado de DNA. 2. LAVAGEM DO DNA Remover o sobrenadante etano-fenol e se desejar, salvar este para precipitação de proteínas. Lavar o pellet de DNA duas vezes numa solução contendo 0,1 M de citrato de sódio em 10% de etanol. Usar 1 mL da solução por 1 mL de reagente Trizol usado na homogeneização inicial. Para cada lavagem, estocar o pellet de DNA em solução de lavagem por 30 minutos entre 15 a 30ºC (com mistura periódica) e centrifugar a 2.000 xg por 5 minutos entre 2 e 8ºC.

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Seguindo estas duas lavagens, suspender o pellet de DNA em 75% de etanol (1,5-2 mL de etanol 75% por 1 mL de reagente Trizol), estocar por 10-20 minutos entre 15 e 30ºC (com agitação periódica) e centrifugar a 2.000 xg por 5 minutos entre 2 a 8ºC. Uma lavagem adicional em solução de citrato de sódio a 0,1 M (em etanol 10%) é requerida para grandes pellets contendo 200 µ g de DNA ou grandes quantidades de material que não DNA. 3. REDISSOLVENDO O DNA Secar o DNA ao ar de 5 a 15 minutos em tubo aberto. (Não secar em centrífuga; isso fará ficar mais difícil para dissolver). Dissolver o DNA em NaOH 8 mM de modo que esta concentração de DNA seja 0,20,3 µg/µL. Tipicamente, adicionar 300-600 µL de NaOH 8 mM para DNA isolado de 107 células ou 50-70 mg de tecido. Ressuspendendo em base fraca é ALTAMENTE recomendável desde que o isolado de DNA não ressuspenda bem em água ou em Tris. O pH de NaOH 8 mM é apenas 9 e deveria ser facilmente ajustado com TE ou HEPES uma vez que o DNA está na solução. Para este estágio, a preparação de DNA (especialmente de tecidos) pode conter material gel insolúvel (fragmentos de membranas, etc.). Remover o material insolúvel por centrifugação de >12.000 xg por 10 minutos. Transferir o sobrenadante contendo o DNA para um novo tubo. O DNA solubilizado em NaOH 8 mM pode ser estocado toda noite a 4ºC; para períodos prolongados, amostras podem ser ajustadas com HEPES para pH 7-8 e suplementados com 1 mM de EDTA. Uma vez que o DNA é ajustado, pode ser estocado a 4º C ou -20ºC.

Quantificação e Expectativa de Rendimento de DNA

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Pegar uma alíquota da preparação de DNA solubilizada em NaOH 8 mM, misturar com água e a solução final medir a A260. Calcular o teor de DNA usando o valor A260 por duplo traçado de DNA. Uma unidade A260 equivale a 50 µg de duplo traçado de DNA/mL. Para calcular o número de células em amostras analisadas, admitir que uma porção de DNA por 1 x 106 células humanas diplóides (e de ratos e camundongos) originais equivalem a 7,1 µg, 6,5 µg e 5,8µg respectivamente. Aplicações: Amplificação de DNA por PCR Depois de redissolvido o DNA em NaOH 8 mM, ajustar o pH para 8.4 com HEPES 0,1 M. Adicionar entre 0,1 e 1,0 µg de amostra de DNA para sua reação de PCR , misturar e aplicar o protocolo de PCR padrão.

Reação de Restrição de Endonuclease
Ajustar o pH do DNA para um valor requerido usando HEPES. Alternativamente, amostras podem ser dualizadas em preparação para 1 mM de EDTA; pH 8.0. Usar 3-5 unidades de enzimas por micrograma de DNA. Usar as condições recomendadas pela fábrica das enzimas em particular, e permitir fazer o processo da reação entre 3 a 24 horas. Num ensaio típico, 80-90% do DNA é digerido. Ajustamento de pH de amostra de DNA em NaOH 8 mM:

pH Final 8.4 8.2 8.0 7.8

HEPES 0,1 M 86 93 101 117

pH Final 7.2 7.0

HEPES 1 M (µL) 23 32

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Notas para isolamento de DNA: 1. A fase fenólica e interfase podem ser estocadas entre 2 e 8ºC durante a noite. 2. Amostras suspensas em etanol 75% podem ser estocadas entre 2 e 8ºC por meses. 3. Amostras dissolvidas em NaOH 8 mM podem ser estocadas toda a noite entre 2 e 8ºC. Para estocagem de longos períodos ajustar o pH para 7-8 e ajustar a concentração de EDTA para 1 mM.

Guia de Solução de Problemas
ISOLAMENTO DE DNA * Expectativas de rendimento de DNA por mg de tecido ou 1 x 106 cultura celular Fígado e rim, 3-4 µg Músculo esquelético e cérebro e placenta, 2-3 µg Células humanas, ratos e camundongos (1 x 106 cultura celular), 5-7 µg Fibroblastos, (1 x 106 cultura celular) 5-7 µg * Baixo rendimento Homogeneização incompleta ou lise de amostra. Pellet de DNA final não dissolvido completamente. * Razão A260/280 < 1.70 Amostra de DNA foi diluída em água ao invés de TE primariamente para analise espectrofotômetra. O fenol não foi suficientemente removido da preparação de DNA. Lavar o pellet de DNA uma vez adicional com citrato de sódio 0,1 M em 10% de etanol.

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Tecidos não forma imediatamente processados ou refrigerados depois de remover do animal. Amostras usadas para isolamento ou a preparação isolada de RNA são estocadas entre -5 e -20ºC ao invés de entre -60 e -70ºC. Amostras foram homogeneizadas com uma Polytron ou outra homogeneização de alta velocidade. * Contaminação por RNA Incompleta remoção de fase aquosa. Pellets de DNA insuficientemente lavados com citrato de sódio 0,1 M em 10% de etanol. * Outras aplicações: Primariamente usar para amplificação em PCR, ajustando o pH para 8.4. Para digestão do DNA com restrição de endonucleases, ajustar o pH para o valor desejado, usar 3-5 unidades de enzima por micrograma de DNA e permitir que a reação seja feita até 3-24 horas dentro das condições ótimas da enzima em particular. Tipicamente 80-90% do DNA é digerido.

VISUALIZAÇÃO DO DNA, APÓS SUA EXTRAÇÃO Gel de Eletroforese
A eletroforese em gel permite o fracionamento eficiente de ácidos nucléicos, e possui um importante papel analítico, e às vezes um papel preparativo. A matriz de separação usada é normalmente agarose e seus derivativos. Outra possibilidade empregada é o gel de poliacrilamida, usada normalmente para o fracionamento de moléculas de baixo peso molecular (i.e. < 1 kilopares de base). O poder de resolução da poliacrilamida permite a detecção de diferenças de tamanho de até um par de bases, comumente usada em géis de sequenciarnento e microssatélites. Os géis podem ser nativos (sem tratamento) ou

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desnaturantes (com a adição de uréia, formamida etc.) para evitar a formação de estruturas secundárias, evitando a interferência na mobilidade através do gel. Os ácidos nucléicos migram com base nas diferenças de peso molecular. De modo geral, todos ácidos nucléicos possuem aproximadamente uma densidade de carga por base, e a conformação da molécula em geral é semelhante. Portanto, a dificuldade de penetração no gel é proporcional ao peso molecular. A mobilidade é aproximadamente inversamente proporcional ao logaritmo do peso molecular. Parâmetros que afetam a mobilidade do DNA em gel eletroforese: 1. Concentração de agarose: com a maior concentração de agarose, a separação de fragmentos maiores é reduzida. Menores concentrações facilitam a separação de fragmentos de maior peso molecular. A faixa de trabalho encontra-se entre 0,5% até 2% de agarose. 2. Gradiente de voltagem: expressa em V/cm. Consiste no ponto crítico na separação de fragmentos de DNA. Correndo um gel sob alto gradiente, reduz tremendamente a separação de fragmentos de alto peso molecular, apesar de ser aceitável usá-lo para checar a qualidade de digestão (teste mais rápido). Entretanto, a separação típica de digestões usando enzimas de restrição é mais bem conduzida a baixos gradientes (l a 2 V/cm) por toda a noite. O problema consiste na difusão dos fragmentos de baixo peso molecular (<1 kpb) e resultam em bandas menos distintas. Esses fatores devem ser considerados dependendo do uso e análise. Como aproximação, a distância de migração de um fragmento de DNA é proporcional ao log do seu tamanho. Ao plotar migração por peso num papel semi-log (antigamente!), obtinha-se uma curva padrão com o peso dos fragmentos e peso desconhecido. É sempre recomendável incluir padrões de peso molecular em todos os géis.

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Preparação de Gel de Agarose: Preparar gel de 0,7 a l % para analisar qualidade e quantidade do DNA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Pesar l g de agarose por 100 ml de tampão de corrida l x TAE (estoque 50x) num erlenmeyer e cobrir com vidro ou plástico e nunca papel alumínio. Aquecer por cerca de 2 minutos em forno de microondas até ferver. Misturar com cuidado, pois a solução ferve para fora do frasco. Esperar a solução esfriar até cerca de 50oC (ponto que tolere encostar na sua pele), para evitar danos à forma do gel. Verter o gel na forma fechada nas extremidades e com o pente em posição. Esperar esfriar e remover bolhas com ponteiras. Remover o pente com cuidado (levantar um lado primeiro com cuidado!) Colocar o gel na cuba e completar o volume do tampão até cobrir o gel Enquanto isso, preparar as amostras a serem carregadas no gel Adicionar o volume necessário de amostra num tubo (1 a 5 µl), e acrescentar o tampão de amostra (1 µl) contendo azul de bromofenol. A função do tampão da amostra é aumentar a densidade (com glicerol ou sucrose), e o azul de bromo fenol corre no gel com tamanho equivalente a 300 pares de base. 11. 12. Transferir as amostras para os poços do gel Conectar os eletrodos à fonte e ligar. Os ácidos nucléicos encontram-se no pH do tampão TAE carregados negativamente e migram para o positivo - correm para o vermelho!

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Após a corrida, transferir o gel para uma bandeja contendo brometo de etídeo em água (10 µl de uma solução 10 mg/ml de brometo de etídeo em 500 ml de água) e agitar com cuidado por 20 minutos - BROMETO DE ETÍDEO É CARCINOGÊNICO E MUTAGÊNICO - USE LUVAS SEMPRE QUANDO MANIPULÁ-LO.

14.

Observar sob luz ultravioleta no transiluminador. Observar a presença de rastros indicadores de RNA; formação de banda simples de DNA; comparar a intensidade das bandas das amostras; detectar a presença de degradação e/ou contaminação nas amostras.

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MULTIPLICAÇÃO DO DNA, APÓS SUA EXTRAÇÃO

Princípios do Método Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Copia e amplifica as seqüências específicas de DNA de até 1 KB de comprimento. A enzima DNA polimerase I foi isolada de bactérias termoestáveis (Termus aquaticus por isso o nome Taq. Polimerase), portanto, não sofre desnaturação pelo calor alcançado com o termociclador. São comumente empregados 20 ciclos para amplificação de DNA, o que dá mais ou menos 1 milhão de cópias do DNA original. O primer pode ser específico para uma parte do DNA, excluindo assim os exons, ou para a fita completa. Para utilizar o PCR é preciso conhecer a seqüência de uma região curta do DNA em cada extremidade da seqüência maior que se deseja copiar. Essas seqüências curtas são usadas para especificar os primers de oligonucleotídeos. O método consiste em ciclos repetidos de desnaturação, anelamento e síntese de DNA. O DNA de dupla hélice com a seqüência a ser copiada e amplificada é misturada com excesso de molar de dois oligonucleotídeos de DNA de hélice única (os primers). O primeiro primer é idêntico à extremidade 5’ da fita de DNA a ser copiada e o segundo primer é idêntico à fita de DNA de sentido inverso na extremidade 3’. * Como o DNA de dupla hélice é antiparalelo, o segundo primer também é o complemento invertido da hélice de sentido normal.

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Início: Desnaturação do DNA de dupla hélice em altas temperaturas e resfriamento para se reanelar.

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No reanelamento o primeiro primer (em excesso molar) irá hibridizar com a extremidade 3’ da hélice de sentido inverso e o segundo primer (também em excesso molar) irá hibridizar com a extremidade 3’ do sentido certo. A mistura reanelada é incubada com DNA polimerase I e com todos os quatro trifosfatos de desoxinucleotídeos (A, T, G, C) (a-substratos) para permitir que novo DNA seja sintetizado.

A DNA polimerase I irá estender a extremidade 3’ de cada primer ligado para sintetizar o complemento dos moldes de DNA de hélice única (a). O segundo ciclo é idêntico ao primeiro. O produto do PCR pode ser lido em gel de agarose (b), por exemplo.

Variação do PCR
PCR-Transcriptase reversa ou RT-PCR Usa o RNA extraído da amostra e dele se faz cópia do DNA. O DNA é replicado como no PCR normal. O RT-PCR é usado para análises de translocações cromossômicas.

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EXTRAÇÃO DE RNA VEGETAL PELO MÉTODO CTAB
PROCEDIMENTO: • • • • • • • • • • Macerar em nitrogênio líquido 3g de tecido vegetal. Transferir para tubo de polipropileno com 15 mL de tampão CTAB pré aquecido a 65ºC. Incubar a 65ºC e agitar a cada 10 min por 30 min suavemente. Adicionar 1 volume de trisol e agitar o tubo manualmente ou com agitador por 10 min. Centrifugar por 10 min a 5000g (8000 rpm) Transferir o sobrenadante para outro tubo. Repetir a extração com trisol e agitar o tubo manualmente ou com agitador por 10 min Centrifugar por 10 min a 5000g (8000rpm) Adicionar 0,6 volume de isopropanol gelado ou 2,5 volumes de etanol absoluto gelado. Misturar suavemente por inversão do tubo. Se o complexo RNA-CTAB formar uma rede filamentosa visível, recuperar esse DNA com um gancho feito de pipeta de Pasteur. Caso o RNA não aparecer ou ficar floculento, centrifugar a 10000 g (12.000 rpm) por 20 min e descartar o sobrenadante. Sempre que possível, evitar a centrifugação por levar a uma co-precipitação de RNA e polissacarídeos. • Lavar o precipitado com aproximadamente 5 mL de etanol 70%. Se o precipitado se soltar do fundo, centrifugar por 3 min a 10000g (12.000 rpm) para “grudar” o precipitado no fundo do tubo. • Secar invertendo o tubo em papel toalha ou em câmera de fluxo laminar. O precipitado não deve conter resíduos de isopropanol ou secar demais, por que pode dificultar a ressuspensão do RNA. Quanto mais repetição, mais pura a amostra, mas com menos DNA. A agitação suave emulsifica as fases formadas preservando o RNA.

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Dissolver o precipitado em 200 a 500 mL de TE e incubar a 4ºC por uma hora ou mais.

Maceração

15 ml de tampão CTAB

+ um volume de

Trisol

Centrifugado

Sobrenadante em outro tubo, repetir centrifugação com Trisol

Centrifugado Sobrenadante em outro tubo, repetir centrifugação com Trisol: Transferir fase superior para novo tubo com etanol ou isopropanol 0,6 volumes

Misturar por inversão de tubo suavemente:

Filamento de RNA

lavar precipitado de RNA com etanol 70%

Inverter tubo para secar

Dissolver o precipitado em 200 a 500 µL de TE

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ISOLAMENTO DE RNA PELO MÉTODO TRIZOL
Reagente para isolamento de RNA de células e tecidos. É composto por uma solução mono fásica de fenol e guanidina isotiocianato. Foi desenvolvido por Chomezynski e Sacchi. Durante a homogeneização da amostra ou lise, o reagente Trizol mantém a integridade do RNA durante a ruptura celular e dissolvimento dos componentes celulares. A adição de clorofórmio seguido de centrifugação separa a solução em duas fases: aquosa e orgânica. O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa. Após a transferência da fase aquosa, o RNA é recuperado por precipitação com álcool isopropílico. Depois de removida a fase aquosa, o DNA e proteínas na amostra pode ser recuperada por precipitação seqüencial. A precipitação com álcool etanol resulta DNA a partir da interfase, e uma precipitação adicional com álcool isopropílico resulta proteínas a partir da fase orgânica. Co-purificação do DNA pode ser útil na normalização de RNAs produzidos de amostra para amostra. Essa técnica bem executada com pequenas quantidades de tecido (50 - 100 mg) e células (5x106), e abundantes quantidades de tecido (> 1 g) e célula (> 107), de humanos, animais, plantas ou origem bacteriana. Todo processo pode ser completado em uma hora. O RNA total isolado por Trizol é livre de contaminação protéica e DNA. Isto pode ser útil para ser usado em análise por Northem blot, hibridização Dot blot, seleção poli (A), translação in vitro, teste de proteção de RNAse e clone molecular. Para uso no PCR, o tratamento do isolado de RNA com amplificação gradual de DNAse I é recomendado quando os dois primers posicionam-se dentro de um só exon.

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O reagente Trizol facilita isolamento de uma variedade de espécies de RNA de grande ou pequeno tamanho molecular. Por exemplo, o RNA isolado de fígado de rato, eletroforesado no gel de agarose, e corado com brometo de etídeo, mostra discreta banda de alto peso molecular de RNA entre 7 Kb e 15 Kb no tamanho, (composto de RNAm e RNAhn) duas bandas predominantes de RNA ribossomal de aproximadamente 5 Kb (28 S) e de aproximadamente 2 Kb (18 S), e RNA de baixo peso molecular entre 0,1 e 0,3 Kb (RNAt, 5 S). O isolado de RNA tinha na A 260/A280 razão de > 1.8 quando diluído em TE. PRECAUÇÕES PARA PREVENIR CONTAMINAÇÃO POR RNASE RNAses podem ser introduzidas acidentalmente dentro da preparação em qualquer ponto no processo de isolamento através de técnica inadequada. Pela dificuldade para inibir a atividade da RNAse, é essencial prevenir esta introdução. As seguintes pautas devem ser observadas quando se trabalha com RNA: Sempre usar luvas descartáveis. A pele muitas vezes contém bactérias e fungos que podem contaminar uma preparação de RNA e ser uma fonte de RNAses. Usar esterilização, plásticos descartáveis e pipetas automáticas reservadas pra trabalho com RNA para prevenir cross-contaminação com RNAses de equipamentos compartilhados. Por exemplo, um laboratório que está usando investigação de RNA provavelmente estará usando RNAse A ou T1 para reduzir formação no fundo de filtro, e muitos itens não disponíveis ( como uma pipeta automática) podem ser ricas fontes de RNAses. Vidros devem ser esterilizados a 150ºC por 4 horas e plásticos devem ser embebidos em 0,5 M de NaOH por 10 min, lavado cuidadosamente com água e autoclavado. Reagentes para a técnica:

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Água livre de RNAse ou solução SDS 0,5% ( Para preparar água livre de RNAse, extrair água em garrafas de vidro livre de RNAse. Adicionar DEPC 0,01% (v/v). Deixar parado durante a noite e autoclavar. A solução de SDS pode ser preparada usando DEPC tratado e água autoclavada). 1. HOMOGENEIZAÇÃO a) Tecidos Homogeneizar amostras de tecido em 1 mL de reagente Trizol por 50-100 mg de tecido usando um vidro- Teflon ou forte homogeneização (Polytron, ou Tissumizer ou equivalente). O volume da amostra não pode exceder 10% do volume de reagente Trizol usada para homogeneização. b) Células de cultivo em meios de crescimento Lisar celular diretamente no disco de cultura adicionando 1 mL de reagente Trizol para 3,5 cm de diâmetro do disco, passando as células lisadas diretamente para uma pipeta. A porção de reagente Trizol adicionado é baseado na área do disco de cultura (1 mL por 10 cm2) e não no número de células presentes. Uma porção insuficiente de reagente Trizol pode resultar em contaminação do isolado de RNA com DNA. c) Células de cultivo em suspensão Fazer um pellet celular por centrifugação. Lise celular no Trizol por repetidas pipetagens. Usar 1 mL do reagente por 5 – 10 x 106 células animais , vegetais ou leveduras, ou por 1 x 107 células bacterianas. Lavando as células antes de adicionar Trizol poderia ser evitado, todavia isto aumenta de possibilidade de degradação de RNAm. Ruptura de algumas células fúngicas e bactérias podem requerer o uso de homogeneizador. Opcional: Um passo do isolamento adicional pode ser preciso para amostras com alto conteúdo de proteínas, gordura, polissacarídeos ou material extracelular tal como músculos, tecido gorduroso, e partes tuberosas de vegetais.

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Seguindo a homogeneização, remover material insolúvel do homogeneizado por centrifugação de 12.000xg por 10 min entre 2 a 8ºC. O resultado é um pellet contendo membrana extracelular, polissacarídeos, e grandes moléculas de alto peso molecular de DNA, enquanto o sobrenadante contém RNA. Em amostras de tecidos gordurosos um excesso de gordura coletada assim como uma camada colocada que pode ser removida. Em cada caso, transferir a solução homogeneizada limpa para um tubo novo e proceder com adição de clorofórmio e separação de fase descrita. 2. FASE DE SEPARAÇÃO Incubar a amostra homogeneizada por 5 min entre 15 a 30ºC para permitir completa dissociação do complexo núcleo-protéico. Adicionar 0,2 mL de clorofórmio para 1 mL de reagente Trizol. Tampar os tubos de amostras com segurança. Misturar vigorosamente manualmente por 15 segundos e incubá-los entre 15 a 30ºC entre 2 e 3 min. Centrifugar as amostras por não mais de 12.000 xg por 15 min entre 2 e 8ºC. Seguindo a centrifugação, a mistura isolada dentro do pouco vermelho, fase fenolclorofórmio, na interfase, e uma descolorida fase aquosa superior. O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa. O volume de fase aquosa é por volta de 60% do volume de reagente Trizol usado para homogeneização. 3. PRECIPITAÇÃO DE RNA Transferir a fase aquosa para um tubo novo, e salvar a fase orgânica se desejar isolar DNA ou proteína. Precipitar o RNA da fase aquosa por mistura com álcool isopropílico. Usar 0,5 mL de álcool isopropílico por 1 mL de reagente Trizol usado para iniciar a homogeneização.

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Incubar amostras entre 15 a 30º C por 10 min e centrifugar por não mais de 12.000 xg por 10 min entre 2 e 8ºC. O precipitado de RNA muitas vezes invisível antes da centrifugação forma um gel como um pellet no lado e no fundo do tubo.

4. LAVAGEM DE RNA Remover o sobrenadante. Lavar o pellet de RNA uma vez com 75% de etanol, adicionando o mínimo de 1 mL dos 75% de etanol por 1 mL de reagente Trizol usado para a homogeneização inicial. Misturar a amostra em vórtex e centrifugar por não mais que 7.500 xg por 5 min entre 2 e 8ºC. 5. REDISSOLVENDO O RNA No final do procedimento, secar brevemente o pellet de RNA (ao ar ou em câmara de vácuo por 5-10 min). Não secar o RNA por centrifugação a baixo vácuo. É importante não permitir que o pellet de RNA seque completamente, visto que isto diminui grandemente sua solubilidade. Parcialmente dissolvida, a amostra de RNA tem uma razão A260/280 < 1.6. Dissolver RNA em água livre de RNASe ou 0,5% de solução SDS por passagem solução uns pouco de tempo através de uma ponta de pipeta e incubando por 10 min entre 55 e 60ºC. (Evitar SDS quando o RNA for usado em reações enzimáticas subseqüentes) O RNA pode também ser redissolvido em 100% de formamida (deionizada) e estocar a -70ºC. Notas para o isolamento de RNA:

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1. Isolamento de RNA de pequenas quantidades de tecido (1 a 10 mg) ou amostras celulares (102 a 104): Adicionar 800 µL de reagente Trizol para o tecido ou células. Seguindo a lise da amostra, adicionar clorofórmio e proceder com a separação de fase como descrito no item 2. Prévia precipitação de RNA com álcool isopropílico, adicionar 5-10 µg de glycogen livre de RNAse conduzindo assim para a fase aquosa. Para reduzir a viscosidade, cortar o DNA genômico com 2 passagens através de uma agulha de 26 calibre primariamente para posterior adição de clorofórmio. O glycogen sobra na fase aquosa e é co-precipitado com o RNA. Isto não inibe a síntese first-strand para concentrações acima de 4 mg/mL e não inibe PCR. 2. Depois da homogeneização e antes da adição de clorofórmio, amostras podem ser estocadas entre -60 e -70ºC por no máximo um mês. 3. Centrífugas de mesa que podem atingir um máximo de 2.600 xg são adequadas para uso nestes protocolos se o tempo de centrifugação for aumentado para 3060 minutos nos itens 2 e 3.

Guia de Solução de Problemas
ISOLAMENTO DE RNA Expectativa de rendimento de RNA por mg de tecido ou 1 x 106 cultura de células Fígado e baço, 6-10 µg Rim, 3-4 µg Músculo esquelético e cérebro, 1-1,5 µg Placenta, 1-4µg Células epiteliais (1 x 106 cultura celular), 8-15 µg Fibroblastos, (1 x 106 cultura celular) 5-7 µg

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI * Baixo rendimento Homogeneização incompleta ou lise de amostra Pellet de RNA final não dissolvido completamente

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* Razão A260/A280 <1.65 Amostra de RNA foi diluída em água em vez de TE primariamente para análise espectrofotômetra. Baixa resistência iônica e baixa pH de soluções aumenta absorbância para 280 nm. Amostras homogeneizadas em pouco volume de reagente. Seguidamente a homogeneização, amostras não são estocadas ao espaço de temperatura por 5 min. A fase aquosa foi contaminada com a fase fenólica. Incompleta dissolução final de pellet de RNA. * Degradação de RNA Tecidos não foram imediatamente processados ou refrigerados depois de removidos do animal. Amostras usadas para isolamento ou o preparado isolado de RNA estavam entre -5 e -20ºC, ao invés de entre -60 e -70ºC. Células forma desfeitas por digestão de tripsina. Soluções aquosas ou tubos não estavam livres de RNAse. Formaldeído usado para eletroforese em gel de agarose estava com pH abaixo de 3.5. * Contaminação de DNA Amostras homogeneizadas em pequeno volume de reagente.

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Amostras usadas para o isolamento continham solventes orgânicos (ex: etanol, DMSO), fortes tampões ou solução alcalina. *Contaminação de Proteoglicanos e Polissacarídeos A conseguinte modificação da precipitação de RNA (item 3) remove estes compostos contaminantes do isolado de RNA Adicionar para a fase aquosa 0,25 mL de isopropanol seguido de 0,25 mL de um solução com alta salinidade (Citrato de Sódio 0,8 M e NaCl 1,2 M) por 1 mL de reagente Trizol usado para a homogeneização. Misturar a solução resultante, centrifugar e proceder com o isolamento descrito no protocolo. A precipitação alterada efetivamente precipita RNA enquanto conserva polissacarídeos e proteoglicanos na forma solúvel. Uma combinação do precipitado modificado com uma adicional centrifugação do homogeneizado inicial ( nota 2 do protocolo de isolamento de RNA) é requerido para isolar RNA puro de material vegetal contendo um alto nível de polissacarídeos.

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ISOLAMENTO DE PROTEÍNAS USANDO O MÉTODO TRIZOL
Proteínas são isoladas a partir do sobrenadante fenol-etanol obtidos depois da precipitação de DNA com etanol (item 1, Precipitação de DNA). A preparação resultante pode ser analisada pela presença de proteínas específicas por Western Blotting.

Reagentes para a técnica: Álcool isopropílico Cloreto de Guanidina 0,3 M em 95% de etanol SDS 1% 1. PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNA Precipitar proteínas a partir do sobrenadante etanol-fenol (aproximadamente 0,8 mL por 1 mL de reagente Trizol) com álcool isopropílico. Adicionar 1,5 mL de isopropanol para 1 mL de reagente Trizol usado para iniciar a homogeneização. Estocar amostras por 10 min entre 15 e 30ºC e sedimentar as proteínas precipitadas a 12.000 xg por 10 min entre 2 e 8ºC.

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2. LAVAGEM DE PROTEÍNAS Remover o sobrenadante e lavar o pellet de proteína 3 vezes em solução contendo 0,3 M de cloreto de Guanidina em 95% de etanol. Adicionar 2 mL de solução de lavagem por 1 mL de reagente Trizol usado para a homogeneização inicial. Durante cada ciclo de lavagem estocar os pellets de proteína na solução de lavagem por 20 min entre 15 e 30ºC e centrifugar a 7.500 xg por 5 min entre 2 e 8ºC. Depois da lavagem final, misturar 2 mL de etanol ao pellet de proteína em vórtex. Estocar o pellet de proteína em etanol por 20 min entre 15 e 30ºC e centrifugar a 7.500 xg por 5 min entre 2 e 8ºC. 3. REDISSOLVENDO O PELLET DE PROTEÍNA Secar o pellet de proteína a vácuo por 5-10 min. Dissolver isto em SDS 1% com pipetagem. Completar a dissolução do pellet de proteína pode requerer incubação da amostra a 50ºc. Sedimentar qualquer material insolúvel por centrifugação a 10.000 xg por 10 min entre 2 e 8ºC e transferir o sobrenadante para um tubo novo. A amostra é lida usando Western Blotting ou pode ser estocada entre -5 e -20ºC para uso futuro. Notas para isolamento de proteínas: 1. Os pellets de proteína suspensos em cloreto de Guanidina 0,3 M em 95% de etanol ou em etanol podem ser estocadas por no máximo um mês entre 2 e 8ºC ou por no máximo um ano entre -5 e -20ºC. 2. O seguinte protocolo é uma alternativa aproximada que permite uma mais eficiente recuperação de proteínas. Dialisar o sobrenadante fenol-etanol contra três trocas de SDS1% entre 2 e 8ºC.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI Centrifugar o material dialisado a 10.000 xg por 10 min. Usar o sobrenadante limpo para Western Blotting.

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3. Proteínas podem ser quantificadas pelo método Bradford já que a concentração de SDS é o suficientemente baixa (<0,1%), então isto não irá interferir. Métodos que não têm problemas de detergente-interfase e que não são confiados em leituras a A260/A280 podem ser usados (traços de fenol podem causar superestimação na concentração de proteínas).

Guia de Solução de Problemas
ISOLAMENTO DE PROTEÍNA * Rendimento baixo Homogeneização incompleta ou lise de amostra. Pellet de DNA final não dissolvido completamente. * Degradação de proteína Tecidos não foram imediatamente processados ou refrigerados depois de removido do animal. * Deformação de banda em PAGE Pellet de proteína insuficientemente lavada.

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GEL PARA ELETROFORESE DE PROTEÍNAS
Gel separador 12% volume total de 10 mL Acrilamida/bis acrilamida 4,0 mL (2 º) Tris HCL 1,5 M pH 8.8 2, 5 mL (3º) SDS 10% 100µL (4º) Persulfato de amônio 10% 100µL (5º) TEMED 4,0 µL (6º) Água destilada 3,3 mL (1º) Gel Concentrador volume final de 10 mL Acrilamida/bis acrilamida 0,83 mL (2º) Tris HCl 0,5 M pH 6,8 0,63 mL (3º) SDS 10% 50 µL (4º) Persulfato de amônio 10% 50µL (5º) TEMED 5 µL (6º) Água destilada 3,4 mL (1º)

QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

Ligações peptídicas absorvem a A215.

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Resíduos aromáticos (Tyr, Phe, Trp) absorvem em torno de 280nm, portanto, na região ultravioleta. A absortividade das proteínas é muito baixa. A absortividade da proteína depende do conteúdo de resíduos aromáticos. Portanto, cada proteína requer um cálculo individual. Absorvidade a A280 para BSA - 0,7 (em sol. a 1 mg/mL) IgG - 1,35 (em sol. a 1 mg/mL) IgM - 1,2 (em sol. a 1 mg/mL) Prot. A estafilocóccica - 0,14 (em sol. a 1 mg/mL) Extrato proteico - 1,0 (em sol. a 1 mg/mL) Como as ligações peptídicas absorvem a 215nm, a concentração de proteínas pode ser monitorada nesse comprimento de onda. A absorvidade em 215nm é quinze vezes maior que a 280 nm e não depende, contudo de aminoácidos aromáticos. 1mg/mL de proteínas: A280 = 1 e A215 = 15. Mas a leitura a 215nm sofre influência da interferência de nucleotídeos livres ou ácidos nucléicos presentes na amostra. Por isso, pode ser “descontada” essa presença possível, considerando o componente de absorção a 260nm: Concentração de proteína (mg/mL) = 1,55 . A280 – 0,76 . A260.

MÉTODOS COLORIMÉTRICOS PARA PROTEÍNAS

Soluções diluídas de proteínas podem ser quantificadas por diversos métodos colorimétricos eficientes e reprodutíveis. A escolha do método depende de possíveis substâncias interferentes na solução testada. Métodos mais comuns: Lowry, Bradford, BCA (otimização do método Lowry). Dependendo do método, a sensibilidade de detecção de proteínas aumenta. Ex: Biureto Absorção no U.V 1000 - 5000 µg é detectável 200 - 2000 µg é detectável

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI Lowry (BCA) Bradford Fluorescamina 5 - 40 µg é detectável 1 - 10 µg é detectável 0,1 - 2 µg é detectável

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MÉTODO COLORIMÉTRICO BRADFORD PARA DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA

O corante Coomassie Blue reage com a cadeia polipeptídica. Há poucos agentes interferentes. Não funciona bem com proteínas básicas e sofre interferência de detergentes como o Triton X-100, SDS e NP-40 quando estes estão em concentração acima de 0,2%. Reagente de Bradford: 100 mg de Coomassie Blue G 250 Dissolver em 50 mL de etanol a 95%. Adicionar 100 mL de ácido fosfórico (H3PO=17M) Completar com água para volume final de 200 mL. Estável a 4º por até 6 meses. Tampão PBS NaCl 150 mM NaHPO4 10mM pH 7,2 Solução padrão de: Albumina Bovina (BSA) 1mg/mL em tampão PBS Imunoglobulina G (IgG) 1mg/mL em tampão PBS Método:

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1. Montar curva padrão de diluição da solução-padrão de proteína em um volume final de 100 µL. Cobrir a faixa de 0 a 150 µg de proteína. Fazer cada tubo em triplicata. 2. Preparar as amostras em volume final de 100 µL para teste diluindo as em PBS, de modo que a concentração final caia na faixa até 150 µg. Fazer dois ou três pontos diferentes caso não tenha idéia da concentração da amostra. Testar diluições de 1: 100, 1; 500 e 1; 1000 é um começo. 3. Diluir a solução de Bradford cinco vezes em água destilada (ex; 10 mL de reagente de Bradford misturados a 40 mL de água para cerca de 50 tubos).Se houver precipitado, filtrar em papel de filtro. 4. Misturar 900 µL de solução de Bradford diluída em cada um dos tubos da curvapadrão e das amostras

TUBOS

REAGENTES SOL. PADRÃO DE PROTEÍNA (µL) AMOSTRA (µL)

1 0 100 900

2 10 90 900

3 20 80 900

4 40 60 900

5 80 20 900

6 100 900

7 10 90 900

8 100 900

ÀGUA (µL)

Reagente Bradford (µL)

5. Deixar a cor estabilizar por 5’ não mais que 30’. 6. Determinar a A595 para cada um dos pontos experimentais.

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7. Calcular a curva padrão com papel gráfico linear. Quotar cada ponto da curva de calibração, determinar a melhor reta e calcular a concentração protéica da amostra. 8. Para uma maior precisão, calcular a melhor reta matematicamente por regressão linear.

Referências bibliográficas
Vanzela, L.L. A.; Souza, R. F. Avanços da Biologia Celular e da Genética Molecular. São Paulo, ed. UNESP, 2009. Kreuzer, H.; Massey, A. Engenharia Genética e Biotecnologia. Porto Alegre, ed. Artmed, 2002. Michel, A.; Cesaro, T. Contribuições da Biotecnologia para a Agricultura. Azevedo, O. M.; Felipe, S. M.; Brígido, M.M.; Maranhão, Q. A.; Souza, T. M. Técnicas Básicas em Biologia Molecular. Brasília, ed. Brasília, 2003.

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