Biotecnologia e Bioinformática

ESTUDO DIRIGIDO

Nome: Lorena Garcia Azevedo

Nº de matrícula: 202211346062
Prof.ª.: Camila Alvim

Ribeirão Preto/SP, Abril 2023

ESTUDO DIRIGIDO
1 Princípio da Tecnologia do DNA recombinante:
A obtenção do DNA recombinante baseia-se na técnica de clonagem molecular.
O processo pode ser resumido do seguinte modo: O primeiro passo é isolar um
fragmento de DNA, que contém o gene de interesse. Lembre-se que cada gene origina
uma proteína. O gene de interesse, agora isolado, é colocado em um meio com um
fragmento de DNA bacteriano circular, o plasmídio e as enzimas de restrição.
O plasmídio bacteriano possui sua capacidade de inserir um fragmento de DNA
externo ao seu próprio genoma.
As enzimas de restrição vão cortar uma determinada região do plasmídeo, onde será
ligado ao fragmento de DNA de interesse.
O fragmento de DNA isolado irá unir-se com o DNA bacteriano, através das enzimas de
ligação, ligases. Nesse momento, é originado o DNA recombinante.
O próximo passo é introduzir o DNA recombinante em bactérias vivas ou diretamente
em meio de cultura com as mesmas.
Após a incorporação do DNA recombinante, as bactérias serão capazes de produzir um
nova proteína, conforme os genes do fragmento de DNA isolados inicialmente.
A tecnologia do DNA recombinante e suas aplicações
-Contribuição para estudos genômicos;
-Transgênicos;
-Produção de medicamentos e enzimas;
-Produção de diversas proteínas, como o hormônio de crescimento e a insulina;
-Criação de vacinas sintéticas.

2 Enzimas de restrição:
As enzimas de restrição ou também denominadas de endonucleases de restrição, são
as ferramentas básicas da engenharia genética, desempenhando função de clivagem
(corte) da molécula de DNA em pontos específicos, em reconhecimento a
determinadas seqüências de nucleotídeos.
3 Eletrofose:
A eletroforese é um método habitualmente usado para separar e também purificar
macromoléculas, principalmente ácidos nucleicos e proteínas. Essas macromoléculas
são submetidas a um campo elétrico, na qual migram para um polo positivo ou
negativo de acordo com a sua carga. No caso de uma carga positiva, seguirá para o
polo negativo e se for negativa, irá na direção do polo positivo.
4 O que é um vetor de clonagem?
Um vector de clonagem é uma molécula de DNA que leva até à célula hospedeira o
DNA alvo, e que aí se replica. Um vector de clonagem deve apresentar uma sequência
que permite a sua replicação no interior de uma célula hospedeira bacteriana.
5 Quais as características de um vetor de clonagem?
A característica mais importante é que deve ser capaz de se replicar dentro da célula
hospedeira, de modo a que se possam produzir numerosas cópias de ADN
recombinante, sendo estes capazes de passar para as células filhas.
-Possuem locais de reconhecimento para enzimas de restrição.
-Permitem a replicação.
-De fácil isolamento.
-Pequenas dimensões.
-Permite a sua multiplicação dentro da célula com um elevado número de cópias.
6 Qual a diferença entre plasmídeo e vetor de clonagem?
O fragmento de DNA é inserido em um vetor, que é uma molécula de DNA na qual um
gene é inserido para construir a molécula de DNA recombinante. Geralmente os
plasmídeos (moléculas de DNA circulares existentes naturalmente nas bactérias) são
usados como vetores para clonar fragmentos de DNA.
Um vector de clonagem é uma molécula de DNA que leva até à célula hospedeira o
DNA alvo, e que aí se replica.
Plasmídeos ou plasmídios são cadeias circulares duplas de moléculas de DNA capazes
de se reproduzir independentemente do DNA cromossômico.
7 O que é transformação bacteriana? Qual o princípio? Quais aplicações?
A transformação é um passo fundamental na clonagem de DNA. Ocorre após clivagem
e ligação e transfere plasmídeos recém-criados para bactérias. Após a transformação,
as bactérias são selecionadas em lâminas antibióticas. As bactérias com um plasmídeo
são resistentes a antibióticos e cada uma formará uma colônia.
O termo “princípio transformante” diz respeito ao fator responsável pela
transformação bacteriana
A transformação bacteriana é um método amplamente utilizado onde o DNA estranho
é introduzido em uma bactéria, que pode então amplificar, ou clonar o DNA. Células
que têm a capacidade de facilmente pegar este DNA são chamadas células
competentes.
8 Como se faz a seleção de uma bactéria transformada?
1-Bactérias especialmente preparadas são misturadas com DNA (ex., de uma ligação).
2-Um choque térmico é dado nas bactérias, o que faz com que algumas delas
incorporem um plasmídeo. [Como funciona?]
3-Os plasmídeos usados na clonagem contém um gene para resistência a antibiótico.
Desta forma, todas as bactérias são colocadas em uma lâmina de antibiótico para
selecionar aquelas que incorporaram um plasmídeo.
4-Bactérias sem um plasmídeo morrem. Cada bactéria com um plasmídeo dá origem a
um aglomerado de bactérias idênticas, contendo plasmídeo, que são denominadas de
colônia.
5-Várias colônias são verificadas para identificar uma com o plasmídeo correto (por
exemplo, por PCR ou digestões de restrição).
6-Uma colônia contendo o plasmídeo correto cresce em volume e é usada para a
produção de plasmídeo ou proteína.
9 O que é a PCR?
A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica para fazer muitas cópias de
uma região específica do DNA, in vitro (em um tubo de ensaio, ao invés de um
organismo).
A PCR depende de uma DNA polimerase termoestável, a Taq polimerase, e requer
primers de DNA projetados especificamente para a região de interesse do DNA .
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de laboratório usada
para fazer muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA. Essa
região do DNA pode ser qualquer objeto de interesse do pesquisador. Por exemplo,
pode haver um gene cuja função o pesquisador queira compreender ou um marcador
genético usado pelos cientistas forenses para correlacionar o DNA da cena do crime
com os suspeitos.
Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da região de interesse
do DNA, de modo que essa possa ser analisada e utilizada de alguma outra maneira.
Por exemplo, DNA amplificado por PCR pode ser enviado para sequenciamento,
visualizado por eletroforese em gel, ou clonado em plasmídeo para futuros
experimentos.
A PCR é usada em muitas áreas da biologia e medicina, incluindo pesquisa em biologia
molecular, diagnósticos médicos e mesmo alguns ramos da ecologia.