APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR NO

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

NATÁLIA GINDRI FIORENZA

MARIA PAULA SAMPAIO

UNIDADE 03
 UNIDADE 3 | INTRODUÇÃO

A biologia molecular possui uma grande

aplicabilidade em uma rotina laboratorial,
contendo diversas técnicas e um programa
de controle de qualidade eficiente.

Fonte:Freepik
 OBJETIVOS

1. Controle de qualidade em laboratório de Biologia

Molecular.
2. Detecção de vínculo genético.
3. Detecção de mutações.
4. Detecção de doenças infecto-parasitárias e
Imunogenética.
 CONTROLE DE QUALIDADE EM
LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

Existem diversas técnicas em biologia

molecular que são métodos
fundamentais no diagnóstico das
doenças humanas que resultam de
lesões do DNA. Esses testes podem ser
realizados com amostras advindas dos
mais diversos tipos de tecidos
 Fase Pré-analítica
Os principais erros que podem ocorrer nessa fase:
• Escrita ilegível ou erro nos dados do paciente;
• Interpretação incorreta do exame;
• Falta de orientação para realização do exame;
• Troca de amostras;
• Uso de tubo e anticoagulante errados;
• Volume excedido ou insuficiente para exame;
• Hemólise de hemácias e lipemia;
• Contaminação de material e amostra.
FASE ANALÍTICA

Nessa fase podem ocorrer erros de:

• Má pipetagem;
• Reagentes mal conservados,
contaminados ou fora da validade;
• Tempo de reação;
• Cálculos de concentração e diluição.
 FASE PÓS-ANALÍTICA

Os erros mais frequentes nessa etapa são:

• Transcrição de dados do paciente
incorreta;
• Resultado ilegível;
• Falta de identificação de interferentes
possíveis;
• Falta de especificidade e sensibilidade
do teste utilizado.
 PROGRAMAS DE ACREDITAÇÃO EM
LABORATÓRIO CLÍNICO

O Programa de Acreditação específico para

Laboratórios Clínicos (PALC) e os programas de
acreditação, em geral, avaliam o laboratório
como um todo, incluindo o sistema de
qualidade, competência da equipe do
laboratório, equipamentos, reagentes,
métodos, controles interno e externo da
qualidade, segurança, preparo do paciente,
métodos e laudos
Fonte: rochalima
 DETECÇÃO DE VÍNCULO GENÉTICO

A investigação do DNA é utilizada para

detecção de vínculo de paternidade ou
identidade genética

Fonte: Pixabay
 PATERNIDADE

O exame de paternidade é focado nas

repetições de pares de bases que estão
presentes em determinados locus
gênicos dos progenitores e o resultado
mostra esse locus, o polimorfismo nesse
locus de todos os participantes e o
filho(a) precisa herdar, necessariamente,
uma repetição do locus do pai e outra
repetição do locus da mãe.
 EXAME DE PATERNIDADE

Após a coleta do material de todos os

participantes, a amostra é encaminhada
diretamente ao laboratório que irá
realizar o exame e o protocolo é
diferente a depender do material
colhido.
 CARTÃO FTA

O método de extração envolvendo o

cartão FTA é uma forma invasiva de
obter amostra biológica para a
extração do DNA de todos os
participantes, pois ela envolve a
retirada de uma gota de sangue
através de um pequeno furo com uma
lanceta na ponta do dedo
Fonte: equipaL
 SWAB BUCAL

A técnica de swab é uma forma

alternativa de se coletar a amostra
biológica, é menos invasiva e pode ser
utilizada para qualquer situação.
O swab é um bastão tipo de cotonete,
que será imerso na boca de cada
participante afim de retirar células na
mucosa da boca que irão fixar na parte
de algodão do swab.
 REPETIÇÕES EM TANDEM
(MICROSSATÉLITES)
Os microssatélites são regiões
polimórficas do DNA e possuem uma
grande taxa de variabilidade entre os
seres vivos. Além de serem bastante
explorados para identificar paternidade,
são também utilizados para identificar
regiões polimórficas que predispõe câncer

Fonte: slideplayer
 POLIMORFISMO NO COMPRIMENTO DO
FRAGMENTO DE RESTRIÇÃO (RFLP)
Ao cortar os dois DNAs com uma
enzima de restrição, fragmentos de
tamanhos distintos, em locus
específicos, serão gerados e, quando
corridos em eletroforese, haverá a
discriminação das bandas, resultando
em duas bandas de um mesmo gene
em posições diferentes de peso
molecular Fonte:scielo
 PERÍCIA CRIMINAL
• A análise é feita da mesma forma que é feita para
identificar a paternidade, entretanto, as
nomenclaturas mudam, de suposto pai vai para
suspeito.
• O DNA é extraído, de diferentes amostras, assim
como na paternidade, mas se extraem mais de
swab e cartão FTA, por serem mais simples, já a
perícia vai utilizar as amostras disponíveis na
cena.
• Após a extração e o processamento, o DNA será
amplificado nos locus alvos para sequenciamento
ou para ser corrido em gel de eletroforese.
 DETECÇÃO DE MUTAÇÕES

As técnicas moleculares e
citogenéticas também são aplicadas
para a identificação de alterações
moleculares e cromossômicas.

Fonte: alvaroapoio
 MUTAÇÕES

• A manutenção do material genético

depende das taxas mínimas de
mutação e também da capacidade
de nossas células em identificar
erros e repará-los.
• Durante os processos replicativos
celulares pode haver alterações na
estrutura da nova cadeia a ser
gerada, essas alterações, podendo
ser prejudiciais ou não, são
chamadas de mutação.
 ERROS DE REPLICAÇÃO

As mutações incluem praticamente

todas as alterações permanentes
concebíveis nas sequências de DNA.
Existem mutações simples, onde
somente uma base é trocada, chamada
de mutação pontual
 LESÕES NO DNA

Os erros na molécula do DNA

também podem vir de fatores
externos, como radiação, fatores
químicos (agentes mutagênicos) e
pela água (já o DNA, para ficar em
sua conformação ideal, precisa estar
em meio aquoso).

Fonte: djalmasantos
 TIPOS DE MUTAÇÕES MOLECULARES

Além das mutações pontuais e as

silenciosas já mencionadas, há outros
tipos de mutações, como os
polimorfismos, mutação missense,
mutação nonsense e mutação frameshift.
Os polimorfismos são tipos de mutações
que alteram o tripleto de base (códon) a
ser codificado através do ribossomo e do
tRNA.
Fonte: Freepik
 TIPOS DE MUTAÇÕES MOLECULARES
• A mutação missense leva à alteração
de uma base no códon do mRNA,
levando à tradução de um
aminoácido incorreto
• Na mutação nonsense há troca de
uma base gerando um códon de
parada, ao invés de um códon de um
aminoácido
• A mutação frameshift interfere na
janela de leitura dos códons do Fonte: wikipedia

mRNA, devido a inserções ou

deleções
REPARO E RECOMBINAÇÃO
• Para os maus pareamentos ocorridos durante
a replicação, dois mecanismos de reparo
entram em ação. Um é o reparo por excisão,
onde um nucleotídeo pareado indevidamente
é retirando do DNA, formando uma lacuna
que será preenchida pelo nucleotídeo
correto;
• Outra forma de reparo é um pouco mais
complexa, devido às altas distorções do DNA
causadas pelos raios UV, por exemplo.
 REARRANJOS E ALTERAÇÕES
CROMOSSÔMICAS

• Rearranjos cromossômicos fazem parte das

mutações que abrangem os cromossomos
(duplicação de um alelo) ou até mesmo os
genomas (aneuploidia);
• Os rearranjos incluem translocações,
inserções, deleções, duplicações e inversões.

Fonte: mundoeducacao
 ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS

• A aneuploidia é uma aberração genômica

onde a célula acaba perdendo ou ganhando
um cromossomo.
• Por exemplo, no organismo humano, as
células somáticas (2n) possuem 46
cromossomos, sendo 23 vindos do pai e 23
da mãe.
• Quando um cromossomo é adicionado no
quadro geral do genoma humano (2n+1),
isso é chamado de trissomia.
 REARRANJOS CROMOSSÔMICOS
Os rearranjos fazem parte de outra
classe de mutações em larga escala,
onde grandes pedaços
cromossômicos, não eles por inteiro,
são afetados. Os rearranjos podem ser
divididos em duplicações, inserções,
deleções, inversões, transposições e
translocações.

Fonte: terceirobbiologia
 TÉCNICAS PARA DETECÇÃO DE MUTAÇÕES

Muitas das mutações são causadoras de

doenças altamente nocivas como os
cânceres ou alguma síndrome de caráter
cromossômica como a síndrome de Down.
Entretanto, para identifica-las é necessário
metodologias precisas para encontrar
mutações moleculares ou genômicas.
 PCR
• O RT-PCR é bastante utilizado para o
diagnóstico de câncer de estômago
através da amplificação dos genes
HER-2 e topisomerase IIα.
• Além disso, analisa múltiplos genes
de diversas doenças.
• Outra aplicação para o PCR é na
amplificação de regiões polimórficas
para sua posterior digestão
enzimática em RFLP.

Fonte: khanacademy
MICROARRANJOS (MICROARRAYS)

• Os microarranjos de DNA, ou chip de

DNA, é um arranjo de pontos, sendo
cada um uma sonda, distribuídos em
uma placa que é capaz de identificar
uma molécula alvo (DNA ou RNA)
através de processos de hibridização,
produzindo resultados quantitativos.

Fonte: researchgate
 FISH
Outro exame de citogenética baseado na
utilização de sondas fluorescentes capaz
de detectar mutações e rearranjos
cromossômicos como deleções. O
diferencial é que essa técnica não é
realizada em microchips. É um método
histoquímico que permite a enumeração,
identificação e localização simultânea de
regiões gênicas polimórficas.
Fonte: genoabiotec
 EXAMES DE CARIÓTIPO

O exame temo objetivo de identificar e analisar os

cromossomos e suas regiões. O teste é realizado mediante a
cultura de célula, para a obtenção do estágio do ciclo celular em
metáfase, onde encontrará os cromossomos formados e
conectados ao fuso mitótico, já prestes a se dividir, e sua
posterior coloração
 DETECÇÃO DE DOENÇAS
INFECTO-PARASITÁRIAS E IMUNOGENÉTICA

A biologia molecular também pode ser

utilizada para o diagnóstico de doenças
infecto-parasitárias e para a obtenção da
compatibilidade entre dois tecidos
sólidos diante de um transplante.
 DOENÇAS INFECCIOSAS
Além da importância da notificação, os
testes diagnósticos disponíveis têm que
ter eficiência e precisão na detecção
desses agentes patógenos, já que tem o
maior potencial de disseminação e de
elevadas taxas de mortalidade, caso
não sejam controlados. Principalmente
porque alguns não possuem uma cura
ou tratamento bem efetivo
(Creutzfeldt-Jakob, Ebola, HTLV e HIV,
por exemplo).
 RETROVÍRUS
Os retrovírus foram apresentados a
partir da descoberta do primeiro vírus
dessa família, o HTLV-1.
O Vírus da Imunodeficiência Humana
(HIV) foi o terceiro retrovírus
descoberto dentre a população
mundial. Assim como o HTLV-1, ele
tem tropismo forte pelas células T
auxiliares (CD4).
Existem testes sorológicos para ambas
doenças, porém, a forma mais
sensível de se diagnosticar esses vírus
é através da técnica de PCR, a qual irá
amplificar as regiões virais a partir de
um primer. Essa técnica é ainda mais
requisitada para os casos de infecção
por HTLV-1.
 HERPES VÍRUS
Herpes é uma doença que
normalmente está associada às
manifestações dérmicas, como
acontece com as pessoas infectadas
pelo Vírus Varicela-Zóster, o
causador da catapora (Varicela) e o
herpesvírus tipo 1 e 2, causador do
herpes simplex.
A técnica de PCR, mais uma vez, é capaz de
identificar, quantificar e discriminar os
tipos virais dos agentes pertencentes à
família herpes. Sendo assim, a técnica em
tempo real, que consegue amplificar mais
de uma região gênica de cada vírus e
quantificar em tempo real, é a melhor
técnica, de biologia molecular, para o
diagnóstico preciso.
 INFECÇÃO BACTERIANA E SEUS GENES DE
RESISTÊNCIA
Algumas bactérias que fazem parte
de um sistema corpóreo podem
causar doenças em partes diferentes
do corpo ou até mesmo na mesma
região de colonização, isso por conta
de sua característica oportunista,
esperando uma brecha do sistema
imune para gerar doença.
• Técnicas em biologia molecular,
sensíveis e rápidas, são usadas hoje
em dia para dar um diagnóstico
preciso e rápido.
• Em casos de sepse, por exemplo,
um diagnóstico rápido tem grandes
chances de salvar a vida de um
paciente.
• Um método muito eficiente é a
amplificação do gene 16S rDNA
diretamente da hemocultura.
 PROTOZOÁRIOS

Algumas espécies são muito importantes à

saúde pública, como as causadoras da
giardíase, toxoplasmose, doença de chagas,
leishmaniose, malária, tricomoníase e
amebíase, por exemplo.

O diagnóstico de todas essas infecções

parasitárias pode ser realizado via PCR ou
RT-PCR, para identificação e quantificação.

Fonte: tuasaude
 IMUNOGENÉTICA

A imunogenética é a área do
conhecimento voltada ao estudo
dos aspectos genéticos acerca das
interações antígeno-anticorpo,
envolvendo as características
genéticas que definem as
interações dos anticorpos com
antígenos considerados “nossos”
e antígenos considerados
estrangeiros.

Fonte:Freepik
 COMPLEXO PRINCIPAL DE
HISTOCOMPATIBILIDADE
O complexo principal de
histocompatibilidade humano (HLA),
descrito em 1958, define-se como um
conjunto de locus ligados intimamente no
braço curto do cromossomo 6.
A diversidade de genes, o polimorfismo, a
herança mendeliana simples e a participação
de genes HLA na resposta imune constituem
as principais características que tornam o
Fonte: UFMA
complexo HLA extremamente atraente sob o
ponto de vista de estudos de doenças
 PROVA CRUZADA

A prova cruzada é empregada

para identificar anticorpos
pré-formados, específicos para o
órgão doador, sendo assim
considerado uma simulação do
transplante in vitro.

Fonte: slideshare
 TIPAGEM HLA
• A tipagem HLA é parecida com a tipagem
ABO. É bastante comum que o HLA de uma
pessoa seja bem diferente da outra,
entretanto, com irmãos essa possibilidade é
diferente.
• Esse teste é mediado por uma técnica
diferencial de PCR, chamada de
Reação em Cadeia da
Polimerase-iniciador específico
(PCR-SSP) e Reação em Cadeia da
Polimerase-oligonucleotídeo
específico (PCR-SSO).
Fonte: wikipedia
Obrigada!